DE19643650A1

DE19643650A1 - Antikörper gegen Hepatitis G-Virus und deren Verwendung zum diagnostischen Nachweis von HGV sowie als Therapeutikum

Info

Publication number: DE19643650A1
Application number: DE19643650A
Authority: DE
Inventors: Susanne Dipl Biol Dr Schmolke; Michael Dipl Chem Dr Tacke; Christa Dipl C Huebner-Parajsz; Alfred Dipl Chem Dr Engel; Beatus Ofenloch-Haehnle
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1996-10-22
Publication date: 1998-03-19

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Hepatitis G-Viren und deren Fragmente. Die Erfindung betrifft außerdem ein Konjugat, welches diesen Antikörper oder ein Antikörper fragment gekoppelt an ein biologisches Molekül enthält. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Antikörpers zum diagnostischen Nachweis von Hepatitis G-Viren sowie Zellkulturen.

Neben Hepatitis A-Virus (HAV) und Hepatitis B-Virus (HBV), die schon seit langem bekannt sind, wurden in jüngerer Zeit wei tere Hepatitis-assoziierte Viren charakterisiert, die ver schiedenen Virusfamilien angehören. Sie verursachen eine Reihe zum Teil sehr schwerwiegender, aber durchaus unterschiedlicher Krankheiten, so daß eine möglichst frühzeitige und eindeutige Differentialdiagnose sehr wünschenswert ist. Die Hepatitis-Viren werden üblicherweise so benannt, daß ihnen ein fortlau fender Buchstabe des Alphabets zugeordnet wird. Alternativ dazu kann man neue Hepatitis-assoziierte Viren auch durch Ausschluß der bekannten Viren benennen. So wurde Hepatitis C-Virus (HCV) auch als NonA/NonB-Hepatitis-Virus bezeichnet (Choo et al., Science 244 (1989), 359-362). Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Virus, das in keine der von HAV-, HBV, HDV- und HEV vertretenen Virusfamilien eingeordnet werden kann. Die bislang über dieses neue Virus erhältlichen Informationen legen nahe, daß es wie HCV zur Familie der Fla viviridae gehört [Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44 (1990)], 649-688). Aus diesen Daten geht jedoch auch hervor, daß es sich signifikant von HCV unterscheidet, und somit einer eigenen Virusgruppe angehört. Deshalb wird dieses neue Virus als Hepatitis G-Virus (HGV) bezeichnet (Linnen et al., Science 271 (1996), 505-508).

In WO 94/18217 ist ein Hepatitis-assoziiertes Virus beschrie ben, das keiner der Gruppen HAV, HBV, HCV, HDV und HEV zuge ordnet werden kann. Dieses Virus weist jedoch in seiner Nuc leotidsequenz keinerlei Ähnlichkeit mit der in der vorliegen den Erfindung beschriebenen Sequenz auf.

In WO 95/21922 ist die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz von HGV beschrieben. In den Beispielen 13, 19 und 20 wird die rekombinante Expression von HGV-Polypeptiden in E.coli offen bart. Auf die in dieser Anmeldung offenbarten Sequenzen wird ausdrücklich Bezug genommen.

In WO 95/32291 ist ebenfalls die Nucleinsäure- und Aminosäure sequenz von HGV beschrieben. In Beispiel 16 wird die rekom binante Expression von HGV in E.coli, in Insektenzellen und in Vaccinia beschrieben. Auf die in dieser Anmeldung offenbarten Sequenzen wird ausdrücklich Bezug genommen.

Virale Infektionen werden üblicherweise durch das Vorhanden sein von Antigenen und/oder Antikörpern gegen diese Antigene in Körperflüssigkeiten, etwa dem Blutserum, nachgewiesen. Zum Nachweis der Antigene in einem Immunoassay werden Antikörper benötigt, welche spezifisch die viralen Antigene detektieren. Ebenso ist es für die Durchführung eines solchen immunologi schen Tests erforderlich, die geeigneten Antikörper in aus reichender Menge bereitzustellen.

Aus der deutschen Patentanmeldung 196 13 406.4 sind neue Ver fahren zur Herstellung von HGV-Antigenen und deren Verwendung zum diagnostischen Nachweis von HGV bekannt.

Dieser Stand der Technik stellt neue Verfahren zur Expression von HGV-Antigenen bereit. Als HGV-Antigene in diesem Sinne sind Polypeptide aus dem HGV-Genom geeignet, die mindestens eine antigene und/oder immunogene Determinante aufweisen. Aus dem HGV-Gesamtgenom sind die DNA-Sequenzbereiche bevorzugt, die für die putativen Hüllproteine E1 und E2 kodieren. Diese Hüllproteine sind zusammengesetzt aus einem aminoterminalen Hauptabschnitt, der an der Außenseite eines funktionellen Viruspartikels lokalisiert ist und eine entscheidende Rolle beim Andocken an den Wirtsorganismus spielt und einem kurzen carboxyterminalen hydrophoben Abschnitt, der in der Membran verankert ist.

Die o.g. Patentanmeldung offenbart weiterhin eine rekombinante Zelle, die an ihrer Oberfläche HGV-Antigene in membrangebunde ner Form präsentiert, insbesondere die Antigene E1 oder/und E2 oder immunologisch relevante Teilsequenzen davon.

Diese Zelle kann als diagnostisches Reagenz zum Nachweis von HGV, z. B. durch FACS-Analyse oder durch ELISA verwendet wer den. Hierzu wird die Reaktion einer Zelle, die ein HGV-Antigen an ihrer Oberfläche präsentiert, mit einer Probeflüssigkeit, z. B. Humanserum, bestimmt. Bei Auftreten einer Reaktion ist davon auszugehen, daß in der getesteten Probe Anti-HGV-Antikörper enthalten sind.

Es bestehen jedoch noch keine Antikörper gegen die HGV-Epitope.

Klassischerweise werden Antikörper durch Immunisierung von Mäusen oder anderen Tieren mit Antigenen gewonnen. Monoklonale Antikörper mit dem Vorteil unbegrenzter Produktion und genau definierter Spezifität lassen sich dann aus dem zunächst poly klonalen Pool durch die Hybridom-Technologie selektieren (Köh ler and Milstein, Nature 256 (1975), 495). Dabei werden Myelom zellen mit Milzzellen des immunisierten Tieres fusioniert.

Es war daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen - vorzugsweise monoklonalen - Antikörper gegen ein HGV-Oberflächenantigen herzustellen, insbesondere gegen das Hüllprotein E2 von HGV. Es war eine weitere Aufgabe der Erfindung, diesen Antikörper als diagnostisches Reagenz zum Nachweis von HGV zu verwenden.

Durch die Erfindung werden monoklonale und polyklonale Anti körper gegen HGV-Oberflächenantigene zur Verfügung gestellt.

Es wird außerdem ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen das HGV-E2 Oberflächenantigen zur Verfügung gestellt.

Als Immunogen zur Gewinnung der Antikörper sind Polypeptide und insbesondere Oberflächenantigene aus dem HGV-Genom (WO95/21922 und WO95/32291) oder Teilpeptidsequenzen davon, geeignet, die mindestens eine antigene oder/und immunogene Determinante aufweisen. Besonders bevorzugt ist das putative Hüllprotein E2 oder ein antigener oder/und immunogener Teil peptidabschnitt davon, insbesondere ein Teilpeptidabschnitt aus dem aminoterminalen Bereich. Ebenfalls geeignet als Immu nogen ist das putative Hüllprotein E1 oder ein antigener oder/und immunogener Teilpeptidabschnitt davon, der insbeson dere aus dem aminoterminalen Bereich stammt. Immunisierungs verfahren unter Verwendung viraler Hüllproteine sind bekannt, vgl. HBsAg (Michel et al., Bio/Technology 3 (1985), 561-566) und E2/NS1 von HCV (Lesniewski et al., J. Med. Virol. 45 (1995), 415-422).

Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Antikörper jedoch durch ein mehrstufiges Immunisierungsverfahren herge stellt, welches eine DNA-Immunisierung (Davies et al., Ann. NY Acad.Sci. 772 (1995), 21-29) beinhaltet. Auf diese Weise ge lingt es, die Oberflächenantigene dem tierischen Immunsystem möglichst authentisch, d. h. vorzugsweise in korrekter post translational prozessierter und gegebenenfalls glycosilierter und aus der Zelle exportierter Form, anzubieten. Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Immunisierungsverfahrens wird die für das Immunisierungsantigen kodierende DNA-Sequenz in einen eukaryontischen Expressionsvektor kloniert und dieses Konstrukt direkt in ein geeignetes Gewebe des Versuchstieres (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen etc.) wie etwa den Skelettmuskel, injiziert. Auf dem Expressionsvektor befindet sich die für das Antigen kodierende DNA-Sequenz unter Kontrolle eines Promo tors, von dem bekannt ist, daß er im jeweils verwendeten Ge webe des entsprechenden Versuchstieres aktiv ist.

Besonders bevorzugt wird eine für das Hüllprotein E2 oder einen Abschnitt davon kodierende DNA-Sequenz in einem Expres sionsvektor, z. B. pcDNA3, im richtigen Leserahmen an die für ein aminoterminales Signalpeptid sowie gegebenenfalls für ein Markerepitop, z. B. das sogenannte FLAG-Epitop, kodierenden DNA-Sequenzen kloniert und zusammen mit den beiden Elementen als Fusionsprotein exprimiert. Die Signalsequenz kann z. B. die Erythropoietinsignalsequenz (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806-810) sein. Das FLAG-Epitop ist ein Oktapeptid (Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210), gegen das ein mono klonaler Antiköper kommerziell erhältlich ist, welcher zur Identifizierung und gegebenenfalls zur Aufreinigung des ge wünschten Expressionsprodukts eingesetzt werden kann.

Bei Expression des Antigens im Gewebe des Versuchstieres fin det die Proteinbiosynthese an den Ribosomen im Cytosol statt. Bei Expression der HGV-Antigene in operativer Verknüpfung mit aminoterminalen Signalsequenzen, z. B. 20 bis 30 Aminosäuren langen hydrophoben Sequenzen, die während der Proteinbiosyn these im Cytosol von sogenannten Signalerkennungsteilchen erkannt werden, werden die Ribosomen zum endoplasmatischen Reticulum (ER) dirigiert. Dort werden die entstehenden Poly peptidketten durch die ER-Membran geschleust, bis sie durch Stop-Transfersequenzen in der Membran arretiert werden. Im Lumen des ER werden die Proteine gegebenenfalls glycosiliert und anschließend im Golgi-Apparat weiter modifiziert. Schließ lich werden sie für den Export in Richtung Plasmamembran sor tiert. Auf diese Weise wird das Antigen dem Immunsystem in möglichst authentischer Form angeboten und kann zur Bildung von qualitativ hochwertigen Anti-HGV-Antikörpern führen.

Vorzugsweise beinhaltet das erfindungsgemäße Immunisierungs verfahren noch eine Auffrischungsimmunisierung, wobei dem Versuchstier eukaryontische Zellen injiziert werden, welche das entsprechende HGV-Oberflächenantigen membranständig ex primieren. Bezüglich der Herstellung solcher Zellen wird auf DE 196 13 406.6 verwiesen.

Aus dem immunisierten Versuchstier lassen sich nun polyklonale Antikörperzusammensetzungen oder monoklonale Antikörper gegen HGV-Oberflächenantigene gewinnen. Zur Herstellung einer poly klonalen, für HGV spezifischen Antikörperzusammensetzung fin det vorzugsweise eine Reinigung des Serums statt, z. B. eine Affinitätschromatographie über eine mit dem entsprechenden Antigen, z. B. dem E2-Antigen beschichtete Säule.

Zur Gewinnung monoklonaler Antikörper wird auf die Hybridom technologie von Köhler und Milstein oder deren Weiterentwick lungen zurückgegriffen. Geeignete Antikörper-produzierende Hybridomzellen lassen sich beispielsweise durch Fusion von Milzzellen aus den immunisierten Tieren mit Myelomzellen in Anlehnung an Galfr´ and Milstein, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3-46 erfolgen. Die Primärkulturen der Fusionszellen werden dann auf Synthese spezifischer Antikörper getestet. Spezi fische Primärkulturen können mittels fluorescence activated cell sorting (FACS) in Mikrotiterplatten kloniert werden.

Somit betrifft die Erfindung einen polyklonalen oder monoklo nalen Antikörper gegen ein Hepatitis G-Virus-Oberflächenanti gen, der herstellbar ist durch ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- Immunisierung von Versuchstieren mit einem Expressions vektor, umfassend: einen Promotor, eine eukaryontische Signalsequenz, eine für das Hepatitis G-Virus-Oberflä chenantigen kodierende DNA-Sequenz und gegebenenfalls eine Markersequenz,
- gegebenenfalls Auffrischungsimmunisierung der Versuchs tiere mit Zellen, welche das HGV-Oberflächenantigen mem branständig exprimieren und
- Gewinnung von für das Hepatitis G-Virus-Oberflächenantigen spezifischen polyklonalen oder monoklonalen Antikör pern aus dem immunisierten Versuchstier.

Der Antikörper, der gegen das HGV-E2-Oberflächenantigen zur Verfügung gestellt wird, richtet sich vorzugsweise gegen ein Polypeptid, welches kodiert ist von

(a) der zwischen Position 127 und 1290 von SEQ ID NO. 1 ange gebenen Nucleotidsequenz,
(b) einer der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz oder/und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter strin genten Bedingungen hybridisierenden Nucleotidsequenz.

Es ist ein weiteres Charakteristikum des Antikörpers gegen das HGV-E2-Oberflächenantigen, daß er gegen ein Polypeptid gerich tet ist, das

(a) die zwischen Position 39 und 426 von SEQ ID NO. 2 angege bene Aminosäuresequenz oder
(b) eine mit der Sequenz aus (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz umfaßt.

Weiterhin werden Hybridomzellinien zur Verfügung gestellt, die erfindungsgemäße monoklonale Anti-E2-Antikörper produzieren. Diese Hybridomzellinien wurden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga nismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D- 38124 Braunschweig, hinterlegt. Die Hinterlegungsdaten sind wie folgt:

Die Erfindung betrifft auch einen aus den vorstehend angegebe nen Zellinien gewinnbaren monoklonalen Antikörper sowie Anti körper mit äquivalenter Bindespezifität, welche vorzugsweise daßelbe Epitop wie die hinterlegten Antikörper erkennen.

Die Erfindung umfaßt außerdem jedes Fragment eines der oben beschriebenen Antikörper.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Konjugat, welches einen der oben beschriebenen Antikörper oder ein entsprechendes Antikörperfragment enthält, das gekop pelt ist an ein biologisches Molekül.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das biologische Molekül im Konjugat eine Markierungsgruppe. Als Markierungs gruppe kommen alle bekannten Markierungsgruppen in Frage, die in einem Testsystem nachgewiesen werden können, d. h. direkt oder indirekt nachweisbare Markierungsgruppen. Dabei ist unter einer direkt nachweisbaren Markierungsgruppe eine solche Gruppe zu verstehen, die ein direkt nachweisbares Signal er zeugt, z. B. eine radioaktive Gruppe, eine Enzymgruppe oder eine Lumineszenzgruppe. Besonders bevorzugt sind Enzymgruppen und Lumineszenzgruppen, insbesonders Elektrochemilumineszenz gruppen. Andererseits kann die Markierungsgruppe auch eine indirekt nachweisbare Gruppe sein, z. B. eine Biotin- oder Hapten-Gruppe, die durch Reaktion mit einem geeigneten Binde partner (Streptavidin, Avidin bzw. Anti-Hapten-Antikörper), der wiederum eine signalerzeugende Gruppe trägt, nachweisbar ist. Hapten- oder Biotin-Gruppen können auch als Festphasen bindegruppen zur Immobilisierung der Antikörper an einer Fest phase eingesetzt werden. Die Markierungs- bzw. Festphasenbin degruppe kann mit dem Antikörper auf bekannte Weise gekoppelt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der Antikörper als diagnostische Reagenzien zum Nachweis von HGV, z. B. durch FACS-Analyse oder durch ELISA. Hierzu wird die Reaktion der Antikörper mit einer Probeflüssigkeit, z. B. Humanserum, bestimmt. Bei Auftreten einer Reaktion ist davon auszugehen, daß in der getesteten Probe HGV-Antigene enthalten sind.

Zur Verwendung in einem diagnostischen Test werden die Anti körper vorzugsweise mit mindestens einer Markierungsgruppe oder Festphasenbindungsgruppe versehen, wie oben beschrieben.

Der Nachweis von HGV erfolgt insbesondere durch immunologische Bestimmung von HGV-Antigenen in einer Probeflüssigkeit, wobei man die Probeflüssigkeit mit mindestens einem erfindungsgemä ßen Antikörper inkubiert und die Bindung nachweist. Dieses immunologische Bestimmungsverfahren kann an sich nach jedem bekannten Testformat erfolgen, z. B. in einem homogenen Immuno assay mit einer einzigen Reaktionsphase oder in einem hetero logen Immunoassay mit mehr als einer Reaktionsphase. Vorzugs weise wird ein heterogenes Testformat verwendet, bei dem das Vorhandensein des Antigens in Anwesenheit einer Festphase nachgewiesen wird.

Eine Ausführungsform dieses Testformats ist der sog. Brücken test (siehe Beispiel 5). Dabei wird die Probeflüssigkeit mit mindestens zwei erfindungsgemäßen Antikörpern A1 und A2 inku biert, wobei A1 an eine Festphase gebunden ist oder in einer an eine Festphase-bindefähigen Form vorliegt (sog. Fang-Anti körper) und A2 eine Markierungsgruppe trägt (sog. Nachweis-Antikörper). Das Antigen in der Probeflüssigkeit wird durch Bestimmung in der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase, vorzugsweise in der Festphase, über einen immobilisierten, d. h. an die Festphase gebundenen Immunkomplex nachgewiesen. Die Testdurchführung beinhaltet vorzugsweise ein Mischen der Probeflüssigkeit mit einem markierten A2 sowie mit einem festphasenseitigen A1, um einen markierten immobilisier ten Komplex aus markiertem Antikörper, Antigen und festphasen gebundenem Antikörper zu erhalten.

Ein weiteres Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Antikörper ist die therapeutische Anwendung. Hierzu werden die erfin dungsgemäßen Antikörper vorzugsweise in gereinigter Form her gestellt und dann in Form von injizierbaren Flüssigkeiten gebracht, wobei es sich um Lösungen oder Suspensionen handeln kann. Weitere Bestandteile sind z. B. Wasser, Salzlösungen, Glucose oder Glycerin. Die Antikörper können auch in Liposomen eingeschlossen sein. Die Antikörper werden üblicherweise pa renteral durch Injektion, vorzugsweise subkutan oder intra muskulär appliziert.

Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch die nachfolgen den Beispiele, Sequenzprotokolle und Abbildungen beschrieben. Es zeigen:
SEQ ID NO. 1: eine DNA-Nucleotidsequenz, die für HGV-E2 ko diert plus aminoterminalem Fusionsanteil
SEQ ID NO. 2: eine Aminosäuresequenz des HGV-E2 plus amino terminalem Fusionsanteil

Fig. 1 Färbung von FLAG-E2 exprimierenden CHO Zellen mit Anti-FLAG-M1 und Anti-E2 MAKs 3, 5, 6, 11, 13, 17, 19, 30,

Fig. 2 Färbung von CHO-Zellen (ausgefüllter Bereich) und FLAG-E2 exprimierenden CHO-Zellen (offener Bereich) mit den Anti-E2-MAKs 3, 5, 6, 11, 13, 17, 19, 30.

BEISPIELE Beispiel 1 Klonierung des Expressionskonstruktes HGV-E2

Zur Manipulation der DNA wurden Standardmethoden benutzt, wie sie bei Sambrook et al. (1989) in Molecular cloning: A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York und Aus ubel et al. (1989) in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York beschrieben sind.

Die Manipulation von DNA wurde im E. coli K12-Stamm DH5α durchgeführt.

Als Expressionsvektor zur DNA-Immunisierung wurde ein Derivat des Vektors pcDNA3 mit CMV-Promotor und BGH poly-Adenylie rungssignal (Invitrogen BV, NV Leek, Niederlande) verwendet. Hierzu wurde der Vektor pcDNA3 durch den Austausch des Neomy cin-Resistenzgens gegen ein Dehydrofolatreduktase (DHFR)-Gen modifiziert. Dies erfolgte durch Restriktionsspaltung von pcDNA3 mit AvrII/Bst1107I, Isolierung des ca. 4 kBp langen Vektorfragments und Insertion eines ca. 700 Bp langen AvrII/ Bst1107I DHFR-Fragments [Setzer et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 5143-5147; Crouse et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 7887-7897].

Die für das Hüllprotein E2 kodierende DNA-Sequenz wurde in den resultierenden Vektor pcDNA3-DHFR in operativer Verknüpfung an eine Signalpeptidsequenz sowie an eine für ein sog. FLAG-Epi top kodierende DNA-Sequenz kloniert. Als Signalsequenz wurde die Erythropoietinsignalsequenz [Jacobs et al. (1985) Nature 313, 806-810] als 93 Bp langes EcoRI/EheI-Fragment (Posi tion 1 bis 93 von SEQ.ID.No. 1) eingesetzt. Das FLAG-Epitop ist ein kurzes Achterpeptid [Hopp et al. (1988) Bio/Technology 6, 1204-1210], gegen das ein monoklonaler Antikörper Anti-Flag-M1, Kodak Eastman) erhältlich ist, welcher zur Aufreini gung und Identifizierung des gewünschten Expressionsproduktes eingesetzt werden kann. Zur Darstellung der für das FLAG-Epi top kodierenden DNA-Sequenz wurden zwei Oligonukleotide mit einander hybridisiert und nach Kinasierung als Linker einge setzt (entsprechend Position 94-126 von SEQ ID NO. 1).

Zur Herstellung des E2-Expressionsvektors wurde das Plasmid pcDNA3-DHFR mit EcoRI und NotI verdaut, das ca. 5,9 kBp lange Vektorfragment isoliert und in einer 3-Wege-Ligation mit dem EcoRI/EheI-Signalsequenzfragment und dem FLAG-Linker ligiert.

Die verwendete HGV-cDNA stammte von Genelabs Technologies Inc., Redwood City, CA, USA (WO 95/32291). Das fast vollstän dige HGV Genom lag als ca. 9,3 kBp langes XbaI/EcoRI-Fragment vor, welches in die entsprechenden Restriktionsstellen des Vektors pGEM-3Z (Promega Corp., Madison, WI, USA) kloniert worden war. Die für E2 kodierenden DNA-Sequenzen (Position 127-1290 von SEQ.ID.NO. 1) wurden mit geeigneten Oligonu kleotiden mittels PCR amplifiziert und als NotI/XbaI-Fragmente in frame an die für Signalpeptid und FLAG-Epitop kodierenden DNA-Sequenzen kloniert.

Beispiel 2 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen HGV-E2 2.1. DNA-Immunisierung

Für die Immunisierung wurden weibliche BALB/c-Mäuse verwendet. Zur Steigerung der Effizienz der DNA-Aufnahme, die im regene rierenden Muskel etwa zehnfach höher sein soll als im unbehan delten Muskel, wurden die Tiere vor der ersten Immunisierung mit dem Schlangengift Latoxan (Rosans, Frankreich) behandelt. Dazu wurden jeweils 80 µl einer 10 µM Lösung des Gifts in beide Schienbein-Muskel der Maus injiziert. Fünf Tage später wurde mit der Immunisierung begonnen, jeder Maus wurde fünfmal (Woche 0, 5, 10, 11, 12) Plasmid-DNA gespritzt. Dabei wurden 50 µg DNA in jeden Schienbeinmuskel injiziert, d. h. 100 µg pro Tier und Immunisierung. Die Aufreinigung der Plasmid-DNA er folgte über Qiagen-Säulen gemäß den Herstellerangaben.

Vor der Milzentnahme in Woche 20 wurden die Tiere geboostet. Dazu wurden pro Tier 10⁷ CHO-Zellen, die das HGV-E2 membran ständig exprimieren, intravenös injiziert.

2.2. Fusion und Klonierung

Die Fusion von Milzzellen der immunisierten Mäuse mit Myelom zellen erfolgte in Anlehnung an Galfr´ and Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73, 3-46. Dabei wurden ca. 10⁸ Milzzellen der immunisierten Maus mit 2×10⁷ Myelomzellen (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580) gemischt und abzentrifugiert. Die Zellen wurden dann einmal in RPMI 1640-Medium w/o FKS gewaschen und bei 400 g erneut abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt, das Zellsediment durch Klopfen leicht aufgelockert, 1 ml PEG (Mo lekulargewicht 4000, Life Technologies, Kat. Nr. 14030035) innerhalb einer Minute dazugegeben und durch vorsichtiges Schwenken in einem 37°C warmen Wasserbad mit den Zellen ge mischt. Anschließend wurden 5 ml RPMI 1640-Medium w/o FKS innerhalb von 5 min. zugetropft und durch dauerndes Schwenken in einem 37°C warmen Wasserbad gemischt. Nach der Zugabe von 25 ml RPMI 1640 Medium w/o FKS wurden die Zellen 10 min bei 400 g abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in RPMI 1640-Medi um, 10% FKS aufgenommen und in Hypoxanthin-Azaserin Selek tionsmedium (100 mmol/l Hypoxanthin, 1 µg/ml Azaserin in RPMI 1640, 10% FKS) eingesät. Als Wachstumsfaktor wurde dem Medium Interleukin-6 (Boehringer Mannheim, Kat.Nr. 1444 581) zugege ben. Nach ca. 10 Tagen wurden die Primärkulturen auf Synthese E2-spezifischer Antikörper getestet (siehe Beispiel 3). E2-spezifische Primärkulturen wurden mittels fluorescence activated cell sorting (FACS) in Mikrotiterplatten kloniert. Hierbei wurde dem Medium als Wachstumszusatz Interleukin-6 zugegeben. Die Reinigung der Antikörper aus Ascites-Flüssig keit von Mäusen und die Derivatisierung mit Biotin oder Dig oxigenin erfolgte gemäß proteinchemisch üblichen Methoden.

Beispiel 3 Bestimmung der Spezifität der produzierten Antikörper

Um die Spezifität der Antikörper im Kulturüberstand der Hybri domzellen zu bestimmen, wurde in zwei parallelen ELISA-Ansät zen die Reaktivität mit CHO-Zellen bestimmt, die membranstän dig entweder das FLAG-E2-Fusionsprotein oder den ebenfalls mit einer NH₂-terminalen FLAG-Sequenz versehenen humanen Urokina se-Rezeptor exprimieren. Dazu wurden die Zellen am Vortag des Versuchs in einer Dichte von ca. 4×10⁴ pro well einer Mikro titerplatte ausgesät. Am nächsten Tag wurden zunächst unspezi fische Bindungsstellen durch zweistündige Inkubation mit 200 µl RPMI 1640-Medium, 10% FKS, 1% BycoC pro well blockiert. Anschließend wurden 100 µl der Zellkulturüberstände in das jeweilige well pipettiert und 60 min. bei Raumtemperatur inku biert. Nach dreimaligem Waschen mit Dulbecco′s PBS, 0,02% Tween 20, wurde Anti-Maus IgG-Peroxidase-Fab-Fragment (Boeh ringer Mannheim Kat.Nr. 1500 686), in einem Volumen von 100 µl und einer Konzentration von 50 mU/ml zu den Zellen gegeben. Nach 60 min. Inkubation bei Raumtemperatur und dreimaligem Waschen mit Dulbecco′s PBS, 0,02% Tween 20 wurde ABTS^R als Substrat eingesetzt und die Farbänderung nach 30-60 min. im ELISA-Reader bei 405/490 nm gemessen.

Insgesamt wurden 8 Hybridom-Klone identifiziert (Anti-HGV-E2 Klone 3, 5, 6, 11, 13, 17, 19, 30), deren monoklonale Antikör per spezifisch EGV-B2 exprimierende CHO-Zellen erkennen (MAKs 3, 5, 6, 11, 13, 17, 19, 30).

Beispiel 4 FACS-Analytik mit HGV-E2 exprimierenden CHO-Zellen

Bei diesem Verfahren wurden CHO-Zellen, die das FLAG-E2-Fu sionsprotein membranständig exprimieren, nacheinander mit einem der E2-spezifischen MAKs und dem Anti-FLAG-M1 gefärbt. Da beide Epitope auf einem Molekül lokalisiert sind, erlaubt dieser Versuch eine Aussage über mögliche Epitopüberlappungen und somit über den Einfluß des FLAG-Epitops auf die Bindung von E2-spezifischen Antikörpern.

Die Zellen wurden von dem Kulturgefäß mit 0,02% EDTA in PBS abgelöst und in PBS gewaschen. Je 2×10⁵ Zellen wurden in 100 µl Dulbecco′s PBS, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,02% NaN₃ re suspendiert und mit den MAKs 3, 5, 6, 11, 13, 17, 19 oder 30 (je 2 µg/ml) für 15 min. auf Eis inkubiert, mit dem gleichen Puffer zweimal gewaschen und für weitere 15 min mit Anti-Maus Ig-Fluorescein-(Fab′)₂-Fragment (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1295 750), inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen zur Blockierung freier Anti-Maus-IgG Bindestellen mit Maus-IgG (Sigma) in einer Konzentration von 10 µg/ml für 15 min. auf Eis inkubiert. Anschließend wurde biotinylierter Anti-FLAG-M1 in einer Konzentration von 0,35 µg/ml zum Ansatz gegeben. Nach 15 min. Inkubation auf Eis wurde zweimal gewa schen und der zweite, diesmal mit Streptavidin-R-Phycoerythrin (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1428 560) fluoreszenzmarkierte MAK für 15 min. auf Eis zugegeben. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen im Durchflußzytometer analysiert (Fig. 1). Die Doppelfärbung ergab jeweils eine Gerade, die in unter schiedlicher Neigung vorliegt. Eine Steigung von 45°, wie sie bei den MAKs 5, 17 und 30 vorliegt, ist typisch für die Erken nung zweier, voneinander unabhängiger Epitope. Eine von 45° abweichende Steigung wie im Falle der MAKs 3, 11, 13 und 19 könnte auf eine gegenseitige sterische Behinderung bei der Bindung hinweisen.

Um eine unspezifische Bindung der Anti-E2-MAKs an CHO-Zellen auszuschließen, wurden zusätzlich CHO-Zellen als Negativ-Refe renz gefärbt. Die Färbung mit Anti-FLAG-M1 wurde in diesem Fall weggelassen (Fig. 2). Dabei zeigte nur MAK 30 eine leicht unspezifische Reaktion mit CHO-Zellen, während bei den anderen sieben MAKs keine Hintergrundfärbung detektierbar war.

Beispiel 5 Untersuchung der Epitopüberlappung

Der Test wurde als Brückentest durchgeführt, dabei wurde iso liertes HGV-E2 als Antigen zur Charakterisierung der E2-spezi fischen MAKs benutzt. Das Antigen wurde dabei über einen bio tinylierten, E2-spezifischen Fang-Antikörper gebunden, welcher seinerseits an eine Streptavidin-beschichtete ELISA-Platte gekoppelt war.

a) Vorbereitung der ELISA-Platten

Streptavidin-beschichtete ELISA-Mikrotiterplatten (Microcode, Streptavidin MTP F8) wurden 60-120 min mit 50 µl biotiny liertem MAK (2 µg/ml in Dulbecco′s PBS, 0,2% Rinderserumalbu min) inkubiert und anschließend dreimal mit 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20 gewaschen.

b) Zellyse

Die HGV-E2 exprimierenden Zellen wurden von dem Kulturgefäß in 0,02% EDTA in PBS abgelöst und in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in PBS, 0,5% Nonidet P 40, Protease-Mix (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1206 893) lysiert. Dazu wurden je 10⁷- Zellen/ml Solubilisierungslösung für zwei Stunden auf Eis inkubiert. Ungelöstes Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt.

c) Kopplung der Antigene und Assay

Mit dem Zellysat (verdünnt in PBS, 0,1% Nonidet P40) wurden die nach a) präparierten ELISA-Platten 60 min. bei Raumtempe ratur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, 0,1% Noni det P40 wurde der zweite, diesmal Digoxigenin-markierte MAK zugegeben und 90 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehr maligem Waschen mit PBS, 0,1% Nonidet P40 wurde anschließend eine Stunde mit anti-Digoxigenin IgG-POD inkubiert. Nach in tensivem Waschen mit PBS, 0,1% Nonidet P40 wurde ABTS^R als Substrat eingesetzt und die Farbänderung nach 30-60 min im ELISA-Reader bei 405/490 nm gemessen.

Die MAKs 3, 5, 11, 13, 17, 19, 30 wurden in allen möglichen Kombinationen als biotinylierte Fang-Antikörper und als Digoxigenin-markierte Nachweis-Antikörper eingesetzt. Da im oben beschriebenen ELISA-Format alle Reaktionsschritte sequenziell verlaufen, ist für einen guten Fang-Antikörper eine niedrige Dissoziationskonstante essentiell. Diese Voraussetzung erfüll ten die MAKs 5, 11, 17 und 30. Demgegenüber ließen sich die MAKs 3, 13 und 19 nur als Nachweis-Antikörper einsetzen. Die gleichzeitige Verwendung eines MAK als Fang- und Nachweis-Antikörper war bei diesem Test nicht möglich, was auf eine monovalente Konformation des Antigens hinweist.

Der Test ermöglicht auch die Untersuchung einer möglichen Epitopüberlappung der einzelnen MAKs. Offensichtlich erkennen die MAKs 5 und 17 dasselbe Epitop, da diese Kombination im Brückentest zu keinem Signal führte. Demgegenüber kompetitier ten die MAKs 5 und 17 nicht mit den MAKs 11 oder 30. Dies zeigt, daß von diesen MAKs mindestens drei verschiedene Epi tope auf HGV-E2 erkannt werden.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Monoklonaler Antikörper gegen ein Hepatitis G-Virus Ober flächenantigen.

2. Polyklonale Antikörperzusammensetzung gegen Hepatitis G-Virus Oberflächtenantigene.

3. Monoklonaler Antikörper gegen das Hepatitis G-Virus-E2- Oberflächenantigen.

4. Polyklonale Antikörperzusammensetzung gegen das Hepatitis G-Virus-E2-Oberflächenantigen.

5. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Polypeptid gerichtet ist, welches ko diert ist von

(a) der zwischen Position 127 und 1290 von SEQ ID NO. 1 angegebenen Nucleotidsequenz,
(b) einer der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz oder/und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nucleotid sequenz.

6. Antikörper nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Polypeptid gerichtet ist, das

(a) die zwischen Position 39 und 426 von SEQ ID NO. 2 angegebene Aminosäuresequenz oder
(b) eine mit der Sequenz aus (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz umfaßt.

7. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen ein Hepa titis G-Virus-Oberflächenantigen, der herstellbar ist durch ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

- Immunisierung von Versuchstieren mit einem Expres sionsvektor, umfassend: einen Promotor, eine eukary ontische Signalsequenz, eine für das Hepatitis G-Virus-Oberflächenantigen kodierende DNA-Sequenz und gegebenenfalls eine Markersequenz,
- gegebenenfalls Auffrischungsimmunisierung der Ver suchstiere mit Zellen, welche das HGV-Oberflächenantigen membranständig exprimieren und
- Gewinnung von für das Hepatitis G-Virus-Oberflächen antigen spezifischen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern aus dem immunisierten Versuchstier.

8. Antikörper nach Anspruch 3, 5, 6 oder 7, der aus der Zellinie "11" (DSM ACC 2280) gewinnbar ist oder ein Anti körper mit äquivalenter Bindespezifität.

9. Antikörper nach Anspruch 3, 5, 6 oder 7, der aus der Zellinie "17" (DSM ACC 2284) gewinnbar ist oder ein Anti körper mit äquivalenter Bindespezifität.

10. Antikörper nach Anspruch 3, 5, 6 oder 7, der aus der Zellinie "30" (DSM ACC 2285) gewinnbar ist oder ein Anti körper mit äquivalenter Bindespezifität.

11. Fragment eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

12. Konjugat, welches einen Antikörper oder ein Antikörper fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekoppelt an ein biologisches Molekül, enthält.

13. Konjugat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Molekül eine Markierungsgruppe um faßt.

14. Verwendung eines der Antikörper, Antikörperfragmente oder Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 13 als Diagnos tikreagenz zum Nachweis von HGV.

15. Verwendung nach Anspruch 14 in einem heterologen Immuno assay.

16. Verwendung nach Anspruch 15 in einem homologen Immuno assay.

17. Verwendung nach Anspruch 15 in einem Doppelbrückentest.

18. Zellkultur mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2280.

19. Zellkultur mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2284.

20. Zellkultur mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2285.