DE1964247A1 - Method of stabilizing blood platelets - Google Patents
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Description
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Sch/61 M 1984Sch / 61 M 1984
APdiOUR PHAEMAGBUiIGAL COMPAHI9 Chicagos 111. ./ USAAPdiOUR PHAEMAGBUiIGAL COMPAHI 9 Chicago's 111th ./ USA
Vi3:cfalii*en ;sur Stabilisierimg von BlutplättehenVi3: cfalii * en; sur stabilization of blood platelets
Die Erfindung be tariff t ein diagnostisches Hilfsmittel und bezieht sich insbeaondare auf eine Verbindung, die nach einer Zugabe su einer Blutprobe oder au einem an Blutplättchen reichen Blutplasma eine stabilisierende Wirkung auf die Plättchen in der Probe ausiibt und die Plättchen daran hindert, Aggregate au bilden. Auf diese Vieise ißt eine genaue ]?ea.tstellung ihxer Anzahl möglich»The invention includes and relates to a diagnostic aid insbeaondare to connect to a Addition to a blood sample or to a blood platelet rich blood plasma has a stabilizing effect on the platelets in the sample and prevents the platelets from Form aggregates au. On this way there is an exact preparation any number possible »
Bei Störungen der Blutgerinnung ist es von Bedeutung, dass ώ3,η dazu in der Lage ist, genau die Anzahl der Blutplättehen in dom BIuI; eines Patienten bestimmen zn können» V/urde jedochIn the case of blood coagulation disorders, it is important that ώ3, η is able to precisely determine the number of platelets in dom BIuI; A patient can, however, be determined
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BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
bisher Blut abgezogen und stehengelassen dann lagerten sich die Blutblättchen zu Aggregaten zusamsnsa, ao dan ο ein exaktes Zählen ihrer genauen Zahl unmöglich ist.So far, blood has been withdrawn and left to stand, then the blood platelets accumulate to form aggregates, ao then ο an exact counting of their exact number is impossible.
Pie vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Zugabe einer bestimmten Menge Pyridazin zu einer Blutprobe kurz nach der Entnahme in erheblichem Maße eine "Verminderung der Oberflächenaktivierung bev/irkt und damit eine Aggregation der Blutplättchen verhindert, ao dass das Verhalten dieser Blutpläctchen leicht und sorgfältig beobachtet werden kann. Eine ähnliche Wirkung wird erzielt, wenn Pyridaain einem an Blutplättchen reichen Plasma zugesetzt wird. Durch Verhinderung der Aggregation der Blutplättchen ist es möglich, genau die Anzahl der Blutplättchen in einer Psoba zu bestimmen. ■ Die auf diese Weise entwickelte Methode ist bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten von Bedeutung, sie eignet sich, jedoch insbesondere für die Behandlung von myokardlalon Infarkten ρ bei deren Behandlung es wesentlich ist, das Ausmaß tier Blutplättehenoberflächenaktiviemmg zu kennen,, de, ö.ieses Ausmaß in einer kritischen Beziehung zu der I'hrombosa steht. Diese Aktivierung gibt sich durch eine strukturelle Veränderung der Blutplättchen zu erkennen. Hunde, ausgedehntem en tritisciie und frühreife dendritische Plättchen können mittels eines Elektronenmikroskop es gezählt v/erden, voraußgeßstät, dass die natürliche Neigung der Blutplättehen zu einer Aktririerimg und Aggregation unterbunden werden kann.The present invention is based on the finding that the Adding a certain amount of pyridazine to a blood sample shortly after removal, "causes a considerable reduction in surface activation and thus aggregation." The platelet prevents ao that the behavior of this Platelets can be easily and carefully observed. A similar effect is achieved when Pyridaain is on one Platelet rich plasma is added. By preventing platelet aggregation it is possible to be accurate determine the number of platelets in a psoba. ■ The method developed in this way is important in the treatment of a number of diseases, it is suitable however, especially for the treatment of myocardial infarction ρ, in the treatment of which it is essential to determine the extent of the animal To know platelet surface activity, de, this extent has a critical relationship with the thrombosa. This activation occurs through a structural change to recognize platelets. Dogs, extensive en tritisciie and precocious dendritic platelets can be counted by means of an electron microscope, provided that the natural tendency of the platelets to actuate and Aggregation can be prevented.
?iiel der Erfindung ist die Schaffung eines Re&geasse8 aas in einfacher Weise dazu verwendet werden 3caass eins Oberflächen™ aktivierung und Aggregation von Blutplättehen lierabsusetsen9 so dass auf diese Weise eine Blutdiagnose einschlieeslich eines Zähisns der Blutplättchen merklich erleichtert wird. Durch die Erfindung wird ein Blutplättchen-Aggregatioas-Ixihibitor ga-3chaf£enp der nach einer Shigabs su frischem Blut oder si* einem? iIEL of the invention is to create a Re & geasse 8 aas be used in a simple manner to s is one surfaces ™ activation and aggregation of Blutplättehen lierabsusetsen 9 so that in this way a blood diagnostic einschlieeslich a Zähisns platelet noticeably easier 3caas. The invention provides a platelet-Aggregatioas Ixihibitor ga-3chaf £ en su p of fresh blood after a Shigabs or si * is a
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mit Plättchen angereicherten Plasma eine Aggregation der Plättchen verhindert und damit ein einfaches und sorgfältiges Studium des BIutplättchen-Verhaltens ermöglicht. Bei Anwendung des erfindungegemässen Reagenses kann der Zustand des Blutes von Patienten, die an myokardialen Infarkten leiden, in einfacher Weise bestimmt werden, da eine Aggregation von BIutplättchen im wesentlichen vermieden wird. Durch die Erfindung wird ein diagnostisches Reagens zur Verfugung gestellt, das zum Bestimmen von Blut verwendet werden kann, da, wie Dereite erwähnt, eine Blutplättchen-Aggregation verhindert wird und damit eine genauere Zählung der einzelnen Plättchen und eine genauere Bestimmung der Plättehenstruktur möglich ist. Bei Verwendung den erfindungsgemässen Reagenses ist eine Zählung von Blutplättchen möglich, ohne dass dabei die Plättchen unmittelbar nach der Entnahme gezählt warden müssen, so dass auf diese Weise ein rationellerer Laborbetrieb möglich ist. Das erfindungsgemässe Reagens kann zur routinemässigen Zählung von Blutplättches verwendet werden. Es ist flüssig und lässt sich daher in einfacher Weifl« messen und handhaben.with platelet enriched plasma an aggregation of the Prevents platelets and thus enables a simple and careful study of platelet behavior. at Use of the inventive reagent can be the condition of the blood of patients suffering from myocardial infarction can be determined in a simple manner, since an aggregation of platelets is essentially avoided. Through the Invention, a diagnostic reagent is made available, which can be used to determine blood, because, as Dereite mentions, platelet aggregation is prevented and thus a more accurate count of each one Platelets and a more precise determination of the platelet structure is possible. When using the reagents according to the invention it is possible to count platelets without counting the platelets immediately after collection must, so that in this way a more rational laboratory operation is possible. The inventive reagent can be used for routine platelet counting can be used. It is liquid and can therefore be measured in a simple manner and handle.
Gemäss einer AuBführungsform der Erfindung wird eine ausreichende Menge des erfindungsgemässen Blntplättchen-Aggregations-Inhibitors, und zwar Pyridazin, Blut oder einem mit Blutplättchen angereicherten Plasma zur Steuerung der Oberflächenaktivierung und Aggregation der Blutplättchen in normalen und pathologischen Blutproben zugesetzt. Man nimmt an, dass die beobachtete Wirkung durch die Fähigkeit des PyricL-azins bewirkt wird, eine Blutplättchen-Aktivieriing zv. inhibieren und ausserdem eine Aggregation bewirkende Substanzen ssu hemmen, beispielsweise ABP, Thrombin, Kollagen, Serotonin, Epinephrin und Blutplättchen-Faktor III, wobei ein Mechanismus für die Stabilisierung der Blutplättchen geschaffen v/ird.According to one embodiment of the invention, a sufficient amount of the platelet aggregation inhibitor according to the invention, namely pyridazine, blood or a plasma enriched with platelets, is added to control the surface activation and aggregation of the platelets in normal and pathological blood samples. It is assumed that the observed effect is caused by the ability of PyricL-azine to activate blood platelets for example . inhibit and also inhibit aggregation-causing substances, for example ABP, thrombin, collagen, serotonin, epinephrine and platelet factor III, a mechanism for stabilizing the platelets being created.
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Anschliessend an diese Stabilisierung lassen flieh die Blutplättchon mit Leichtigkeit sehr genau zählen.Following this stabilization, the platelets let go count very accurately with ease.
Durch die Zugabe des erfindungsgeraäseen Blutplättchen-Aggregations-Inhibitors in einer ausreichenden Konzentrationf auf die nachstehend noch näher eingegangen wird, ist es möglich* die Blutplättchen-Öberflächenaktivität und die Aggregation in normalen und pathologiechen Proben von Blut oder einem mit Blutplättchen angereicherten Plasma zu steuern,, und dabei eine gesamte und genaue Zählung von Blutplättchen durchzuführen, die als "stabilisierte Blutplättchen" bezeichnet werden können«By adding the platelet aggregation inhibitor according to the invention in a sufficient concentration f , which will be discussed in more detail below, it is possible to control the platelet surface activity and the aggregation in normal and pathological samples of blood or a plasma enriched with platelets, , taking a total and accurate count of platelets, which can be called "stabilized platelets" «
Es ist darauf hinzuweisen, dass es einige bekannte Methoden zum Zählen von Blutplättchen gibt, beispielsv/eise das Zählen unter Anwendung der PhasenmikroBkopie,, die Zellgrössenbestimnrung auf elektronischem Wege sowie das Zählen mittels eines Elektronenmikroskop».It should be noted that there are a few well-known methods for counting platelets, for example counting using the phase microcopy, cell sizing electronically and counting using an electron microscope ».
Bei der Durchführung einer jeden Methode hat es sich herausgestellt, dass die Verwendung von Pyridaziß die Aggregation .in dem Maße inhibiert, wie es zur (&währleistung einer genauen und reproduzierbaren Zählung erforderlich ist. Für die W verschiedenen Methoden werden jedoch verschiedene Träger vorgeschlagen. Dabei ist jedoch die wirksame Pyridazin-Eonzentration im v/esentlichen in allen Fällen die gleiche, d.h. sie ist unabhängig von der ausgewählten Methode.In the implementation of each method, it has been found that the use of Pyridaziß aggregation .in inhibits the extent that it is to (a precise and reproducible counting währleistung required. However, different carriers are proposed for the W different methods. It is however, the effective pyridazine concentration is essentially the same in all cases, ie it is independent of the method selected.
Bedient man sich beispielsweise der Phasonmikroskopmethode, dann besteht erfirtduagsgemäss der Träger aus 1 % Ammoniumoxylat, während bei der Durchführung einer elektronischen Grössenbestimarung odör bei Verwendung eines Elektronenmikroskops der eingesetzte Träger aus 0s1m tris-(Hydrosymethyl)-If, for example, the phason microscope method is used, then according to the invention the carrier consists of 1 % ammonium oxylate, while when carrying out an electronic sizing or when using an electron microscope the carrier used consists of 0 s 1m tris (hydrosymethyl) -
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BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
^ j 9 6 4 2 4^ j 9 6 4 2 4
- 5 arainomethan (tri»«!?uff er) salt einem pH von 706 !©s^kt»- 5 arainomethane (tri »«!? Uff er) salt a pH of 7 0 6 ! © s ^ kt »
Zur Durchführung aer Erfindung wird, falls wsm bmS eine elektronische ZallengrSsseBbestimmung oder auf ©ine Elektronenmikroskopmethode ssurtlckgreift, eine Blutprobe von dem Patienten in üblicher Weise abgenommen, wobei nsn sich üblicher Methoden uad Ausrüstungen bedlsnt, Di© B?©ä3© wird anschliessend antikoagnliert, beispielsweise dm'eh Eigabe voa Matriunieitrat, Heparin, Dlcussarol oder dergleichen. Am™ smhliessend wird Pyrida^in in ®Iuqt tris»Biff©rXÖ@iiag d©r I»e2ia^delten Probe sugesetst, imd a*/ar in einer solch©» ¥eia©, öass 9 ml Blut pro 1 ml der tris-Pufferlösung (O9II aiolarj pH T9S) zur Verfügung gestellt werden» Diese lösung 8 mg Pyridaain, I)is auf dieoe Weise präparierte Prob© boißeite gestellt werden. Später können die Bliitplättchen in der stabilisierten Probe routinemässig gesohlt und zxmr beispielm^eise mittels ©iner elektronischen bestimmung oder einer El@ktronenmikroekopm3thoda9 da eine .ÄJstivierung und Aggregation der BiutplättehQsi In der Blut» prob® vermieden worden ist.To carry aer invention if wsm BMS an electronic ZallengrSsseBbestimmung or ssurtlckgreift on © ine electron microscope method, a blood sample from the patient in the usual manner, is removed leaving nsn to conventional methods bedlsnt uad equipment, Di © B? © ä3 © is antikoagnliert then, for example, dm'eh Eigabe voa Matriunieitrat, heparin, Dlcussarol or the like. At the end of the day, Pyrida ^ in is in ®Iuqt tris »Biff © rXÖ @ iiag d © r I» e2ia ^ delten sample sugesetst, imd a * / ar in such a © »¥ eia ©, there are 9 ml of blood per 1 ml of the tris buffer solution (O 9 II aiolarj pH T 9 S) are made available. This solution 8 mg Pyridaain, I) is to be made available on the sample side prepared in this way. Later, the Bliitplättchen can gesohlt routinely in the stabilized sample and zxmr beispielm ^ else iner means © electronic specifications or El @ ktronenmikroekopm3thoda 9 because a .ÄJstivierung and aggregation has been the BiutplättehQsi In the Blood "prob® avoided.
Die vorstehend angegebenen MengenverliältBisse liefern op ti= Esa!© 2örgebnis8© „ Me gamesseae Menge an Pyridasin kann von l'jß? 4 mg "him ssu ungefähr 10 ml pro ml um'ü PufferlösungThe quantity relationships given above provide op ti = Esa! 4 mg "him ssu about 10 ml per ml of buffer solution um'ü
Bei öinem ähnlichen Yersuch hat sich ein Verhältnis Ton 1 Esil P^idäsin-enthaltender Pufferlösung zu 9 Seilen Blut als optimal erwiesen. Dennoch kann daa Gewicht d®s Pyriclasias (a>g) 2ii dem Volumen der gepufferten Blutlöstmg {in ml) vor« 400 - 5000In öinem similar Yersuch a ratio Ton 1 Esil P ^ has idäsin-containing buffer solution to 9 ropes blood proved to be optimal. Nevertheless, the weight of the Pyriclasias (a> g) 2ii the volume of the buffered blood solution {in ml) can be before «400 - 5000
Bedient man sieh einer Phas©nmilo?o@koplef dazm wirdIf you use a phase © nmilo? O @ kople f dazm becomes
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Durchführung der Erfindung die Blutprobe enimomaen und in der vorstellend beschriebenen Weise antikoaguliert. Das Inhi bitorreagens wird jedoch unter Verwendung von 1 $> Ammonium-oxy lab (pH 6,3) als Träger für Pyridazin anstelle des tria-Puffers hergestellt. Die Menge des Pyridazine, das in das Ammoniumoxylat eingemischt wird, kann von 4 mg bis ungefähr 10 mg pro ml des Oxy late schwanken, wobei ungefähr 8 mg bevorzugt werden.Carrying out the invention, the blood sample is enimomed and anticoagulated in the manner described above. However, the inhibitor reagent is prepared using 1 $> ammonium oxy lab (pH 6.3) as a carrier for pyridazine instead of the tria buffer. The amount of pyridazine mixed into the ammonium oxylate can vary from 4 mg to about 10 mg per ml of the oxy late, with about 8 mg being preferred.
Das Inhibitor reagens wird der antikoagulierten Blutprobe zu gesetzt, die beiseite gestellt und später amter Vervrendung eines Phasenmikroskops gemessen w.s&en kann.The inhibitor reagent is added to the anticoagulated blood sample which can be set aside and measured later using a phase microscope.
Durch die Erfindung ist es möglich» genau Blut plättchen zu messen, wobei die Notwendigkeit entfällt» dietje Plättchen sofort zu zählen. Brfindungsgemäss wird ein neues diagnosti sches Heagens zur Verfügung gestellte cLaa leicht gehandhabu und schnell verwendet werden kann.The invention makes it possible »to precisely add blood platelets measure, whereby the need is no longer applicable »dietje platelets to count immediately. According to the invention, a new diagnosti Sches Heagens provided cLaa easily handled and can be used quickly.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindimg, olme sie zu beschranken.The following examples illustrate the invention to limit.
EIa Blutplättchen-inhibierendee Reagens, das Proben aus Blut oder eteeia mit Blutplättchan angereicherten Plasma zugesetst wird, die entweder mittels eines Elektronenmikroskops oder unter Anwendung einer elektronischen ZellsänluBg gezahlt werden sollen, wobei ein Coulter Electronic Counter verwendet wird, wird dureh Vermischen von 80 mg Pyridazin mit 10 ml eines 0,1 molaren tris-CBydro3^methyl)--siainometha5is (tris-Puffer) (pH « 7,6) hergestellt. Es wird geriihrt, um das Pyridasin gleichmässig in der Pufferlösung zu verteilen.A platelet-inhibiting reagent added to samples of blood or platelet-enriched plasma to be counted using either an electron microscope or an electronic cell counter using a Coulter Electronic Counter is obtained by mixing 80 mg of pyridazine with 10 ml of a 0.1 molar tris-CBydro3 ^ methyl) - siainometha5is (tris buffer) (pH 7.6) are prepared. Stir in order to distribute the pyridasine evenly in the buffer solution.
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Ein Blutplättchen-inhibierendeß Reag-ens, das Proben puj; Blut oder einem mit Blutplättchen angereicherten Planjaa ζν.ζ&,ίνϊζϊ wird, die durch Phasenmikroskopie gezählt werden sollen,, v/lr-ü durch Vermischen von 800 mg Pyriöazin in 1OO ml ©.!pkw 1 ^ Ammoniumoxylats hergestellt, Eg i*ird gerührts um au &ewa leisten, dass die Dispersion des Pyridazine in der lösung verteilt ist. Der pH der erhaltenen Löoung vrird 6,3 durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure eingestelltA platelet-inhibiting reagent that samples puj; Blood or a planjaa enriched with platelets ζν.ζ &, ίνϊζϊ , which are to be counted by phase microscopy ,, v / lr-ü by mixing 800 mg pyrioazine in 1OO ml ©.! Pkw 1 ^ ammonium oxylate, Eg i * is stirred s to ensure that the pyridazine dispersion is distributed in the solution. The pH of the obtained Löoung v r ird 6.3 by addition of hydrochloric acid adjusted
Zur Untersuchung der neuen Reagentlen wird die bestimmt, die dassu erforderlich iat, die in Aggregation au inhibieren, wenn bekannte Aggregationemittelj, wie beiepielswaise Kollagen odex^ AdesosindiphoBph^t. de?-, nu untersuchenden System eugesetst /srden.To examine the new reagents, the determines that u required that in Inhibit aggregation if known aggregation agents such as collagen odex ^ AdesosindiphoBph ^ t. de? -, nu examining system eugesetst / srden.
In dem System wird 1,0 ml eines es !Eies?- ,der plättchen angereicherten Plasma*? mit bekaüJiter sahl verwendet, Auseerdem werden 0,3 ml eines 0ti in fers (pH 7» 6), 0,1 ml der Blutplättchen-aggregierendei. νϋΐΐτ.ΐ Kollagen oder Adenosindiphosphat und 0,1 ml eines i-vip ferten Pyridazine (8 mg/0,1 ml) verwendet. Ites Eeagono dahingehend untersucht, ob es optisch frei von eiii-ar l ist, und Bwar -mittels eines spelctrophotometrischen Yer mit Vergleiohsproben mit 1 $> Aiamoniuraoxylat oder O1. ■> r. "vriß-Puffer (pH 7,6).In the system, 1.0 ml of an es! Egg? - the platelet-enriched plasma *? Used with a well-known sahl, 0.3 ml of a 0 t i in fer (pH 7 »6), 0.1 ml of the platelet aggregating i. νϋΐΐτ.ΐ collagen or adenosine diphosphate and 0.1 ml of an i-vip ferten pyridazine (8 mg / 0.1 ml) are used. Ites Eeagono investigated whether it is optically free from egg-ar l, and Bwar -by means of a spectrophotometric yer with comparison samples with 1 $> Aiamoniuraoxylat or O 1 . ■> r. "vriß buffer (pH 7.6).
Bas untersuchte System wird quantitativ in der Welse untersucht. dass die Veränderungen der optischen Dichte bestimmt die mit der Induktion einer Blutplättchen-Aggregation vThe system under investigation is quantitatively investigated in the catfish. that determines the changes in optical density those associated with the induction of platelet aggregation v
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-s--s-
den sind e und zwar vergleichend zwischen einer Probe 9 der Aggregationsmittel zugesetzt worden sind, wie beispielsweise Kollagen oder AHP, und einer Probe, der sowohl ein Aggregationsmittel als auoh der Inhibitor ssugemischt worden ist. Der Inhibierungsgrad der Blutplättchen-Aggregation wird in der Weise bestimmt, dass der Unterschied der optischen Dichte zwischen den Proben ermittelt wird.are to have been added and e while comparing between a sample 9 of the aggregating agents such as collagen or AHP, and a sample of both an aggregation agent has been ssugemischt AUOH as the inhibitor. The degree of inhibition of platelet aggregation is determined by determining the difference in optical density between the samples.
Beim Sammeln von Blutproben zum Zählen der Blutplättchen durch Phasenmikroskopie zqusq man vorsichtig verfahrenP da bei einer unvorsichtigen Einsammlung eine Klumpenbildung auftreten kann, welche die Genauigkeit verfälscht, und swar unabhängig von den verwendeten Reagens.When collecting blood samples for counting the platelets by phase microscopy can occur which distort the accuracy and swar independent of the reagent used zqusq careful for P since with a careless collection clumping.
Eine geeignete Methode zur Gewinnung einer Blutprobe besteht darin, die Probe durch Venenpunktion au entnehmen und anschliessend die Probe zu koagulieren, wobei die Zeitspanne zwischen der Entnahme und der Antikoagulierung auf einem Minium gehalten werden muss. Ausgezeichnet© Ergebnisse werden erhalten, wenn das Blut unter Verwendung einer 5t0 mra (20 gauge)-Nadel gesaiamelt wird, wobei eine mit tSilikon ausgekleidete SpritsQ verwendet wird. Die Blutprobe wird ansehliees end in ein mit Silikon ausgekleidetes Reagensglas überführt,, bei 250C geh&Xtan und unmittelbar danaoh durch Zugabe von Äthylendiamintstraaoetat (Al)IA) in einer Konzentration von 1 mg pro 1 ral des Blutes antikoagullert. Das Reagensglas wird anschliessend mit Paraffin bedeckt und zehraoal umgedreht*A suitable method for obtaining a blood sample is to take the sample by venipuncture and then to coagulate the sample, whereby the time span between the collection and the anticoagulation must be kept to a minimum. Excellent results are obtained when the blood is collected using a 5t0 mra (20 gauge) needle using a silicone-lined SpritsQ. The blood sample is transferred ansehliees end in a test tube lined with silicone ,, at 25 0 C and GeH xTAN by adding Äthylendiamintstraaoetat (Al) IA) directly danaoh mg at a concentration of 1 per 1 ral blood antikoagullert. The test tube is then covered with paraffin and turned upside down *
Eine andere anerkannte Methode zur Gewinnung der Blutprobe besteht darin, das Blut von einer Kapillarfingernadel nach einer Punktur eines sauberen Pingers abzunehmen. In diesemAnother accepted method of obtaining the blood sample is to look for the blood from a capillary finger needle a puncture of a clean pinger. In this
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falle kann das Blut direkt in eine rote Zellenpipette aufgezogen werden.If necessary, the blood can be drawn directly into a red cell pipette.
Pas Blut wird anschllessend gründlich mit einem Verdünnungsmittel vermischt, das durch Vermischen mit dem Reagens gernäss Beispiel 2 hergestellt worden ist. Sie Inhalte einer jeden Pipette werden anschliessend in eine Haniazytometerkammer eingefüllt und darin 15 Minuten lang gehalten, wobei ein Stück eines feuchten Filterpapiers auf die Kammer gelegt wird, um eine gewisse Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten.The blood is then thoroughly mixed with a diluent which can be obtained by mixing with the reagent Example 2 has been prepared. You content each The pipette is then placed in a haniacytometer chamber filled in and held for 15 minutes with a piece of damp filter paper placed on the chamber is used to maintain a certain level of moisture.
Sie Blutplättohen werden anschliessend duroh Phasenkontrastmikroskopie unter Verwendung eines langarbeitenden Kondensors mit einem 43-fachen Ringraum, einem 43-fachen Phasenobjektiv (mitteldunkler Kontrast) und 10-faohen Okularen gezählt.The platelets are then subjected to phase contrast microscopy using a long-working condenser with a 43-fold annulus, a 43-fold phase objective (medium-dark contrast) and 10-fold eyepieces counted.
Sie Blutplättohen sind als einzelne runde oder ovale Körper zu erkennen, die einen rosaroten oder purpurnen Sohimmer "besitzen. Beim Fokussieren sieht man, dass die Plättchen einen oder mehrere feine Vorspränge aufweisen. Sie Plättchen in den vier Eokquadraten sowie In dem zentralen Quadrat des grossen Vergleichsquadrates, das beispielsweise zum Zählen . der roten Zellen verwendet wird, werden in jeder Sammer gezählt.The platelets are recognizable as individual round or oval bodies with a pinkish-red or purple color When you focus, you can see that the platelets make you or have several fine projections. They are placed in the four eok squares and in the central square of the large comparison square, for example for counting. of the red cells used are counted in each sammer.
Ist die Anzahl der Plättchen, die in allen zehn Quadraten gezählt werden, niedriger als 100, dann können weitere Quadrate solange gezählt werden, bis wenigstens 100 Plättchen gezählt worden sind. Sie Anzahl der Plättchen pro ecm Blut wird ansohliessend durch Multiplizieren der Alanin der gezählten Zellen mit der Verdünnung und duroh Teilen dieses Werts duroh das 0,004-fache der Zahl der gezählten Quadrate gefunden.If the number of tiles counted in all ten squares is less than 100, additional squares can be added counted until at least 100 tiles have been counted. The number of platelets per cm of blood is then subsequently counted by multiplying the alanine Cells found at the dilution and dividing this value by 0.004 times the number of squares counted.
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Unter Verwendung von Proben, die aus einem Finger entnommen worden sind, sowie mittels einer Phasenmikroskopie gemäsa Beispiel 4 werden zwei Proben von jeweils 5 Patienten zubereitet und untersucht. Einer Probe eines jeden Patienten wird kein Inhibitor zugesetzt, während der anderen Probe 8 mg Pyriaazin pro ml der Probe zugegeben werden. Die Ergebnisse der Blutplättchen-Zählungen pro mm pro Probe ^erclön sofort, nach. 4 Stunden und nach 24 Stunden ermittelt. S.le sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.Using samples taken from a finger have been, as well as by means of a phase microscopy gemäsa Example 4, two samples from 5 patients each are prepared and examined. A sample from each patient no inhibitor is added, while 8 mg pyriaazine per ml of the sample are added to the other sample. The results the platelet counts per mm per sample ^ erclön immediately, after. 4 hours and determined after 24 hours. S.le are summarized in the following table.
Ur.patient
Ur.
InhibitorAdded
Inhibitor
Stundenafter 4
hours
Stundenafter 24
hours
YN
Y
245 000252 500
245,000
280 000215,000
280,000
252 500212 500
252 500
YU
Y
140 000140,000
140,000
147 000142 500
147,000
142 500110,000
142 500
YIT
Y
280 000287 500
280,000
270 000272 500
270,000
265 000247 500
265,000
YH
Y
300 000307 500
300,000
300 000247 500
300,000
290 000287 500
290,000
YΝ
Y
275 000262 500
275,000
272 500197 5000
272 500
280 000132 500
280,000
Y= ja K β no
Y = yes
Von fünf an einem myokardialen Infarkt leidenden Patienten werden Blutproben entnommen, und zwar mittels einerOf five patients suffering from a myocardial infarction blood samples are taken using a
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BAD ORiGfNALBAD ORiGfNAL
Venenpunkturmetlioäe, wie sie in Beispiel 4 beschrieben wird. Die Blutplättchen-Zählung pro nmr erfolgt durch Phasenmikroskopie. Die Plättohenzählungen erfolgen sofort, nach 4 Stunden und nach 24 Stunden unter Verwendung von Proben, denen kein Pyridazin ("-A"), 1,6 mg Pyridazin pro ml Probe (n-Bn) und 4,0 mg Pyridazin pro ml Probe zugesetzt worden sind ("-0").Venipuncture Metals as described in Example 4. The platelet count per nmr is done by phase microscopy. Plateau counts are done immediately, after 4 hours, and after 24 hours using samples that do not contain pyridazine ("-A"), 1.6 mg pyridazine per ml sample ( n -B n ), and 4.0 mg pyridazine per ml sample have been added ("-0").
Die Ergebnisse von Proben, die jeweils von einem Patienten abgenommen worden sind, sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. The results of samples taken from each patient are summarized in the following table.
Sine andere anerkannte Methode zur Zählung von Blutplättchen besteht darin, einen Coulter Electronic Counter zu verwenden,Another popular way to count platelets is to use a Coulter Electronic Counter,
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Bas Prinzip einer derartigen Zählung "beruht darauf, dassp falls Teilchen oder Zellen durch eine sehr schmale öffnung zusammen mit einem elektrischen Strom geschickt werden, jedes Teilchen oder ^ede Zelle dem Stromfluss einen temporären Widerstand bietet, wenn es bzw. sie vorübergehend die Öffnung einnimmt. Je grosser dae Volumen der Zelle, desto grosser ist der Widerstand. Dieser Widerstand kann in ein proportionales Signal umgewandelt werden, das sich elektronisch feststellen lässt. Wird daher ein bekanntes Volumen einer !Teilchensuspension oder einer Zellensuspension durch die Öffnung geschickt, dann ist es möglich, elektronisch die Anzahl der Zellen oder Teilchen in dem Volumen au sählen. Gkcosse Zellen, wie beispielsweise rote Zellen und weisoe Zellen, erzeugen relativ grosse Signale und werden nach dieser Methode unter Verwen~ ■ dung einer Öffnung mit einem Durchmesser von 100 tt gezählt. Da das Volumen der Plättchen von 2 - 30 u oder 1/40 bis 1/30 einer roten Zelle schwankt, ist der von diesen Plättchen erzeugte Widerstand kleiner. Um daher das Signal9 das von den Plättchen erzeugt wird, zu VQrgröBsem0 ist es erforderlich,, sowohl die Grosse ■ der öffnung auf 50 u zu reduzieren als auch den Stromfluss durch die öffnung zu erhöhene Bas principle of such a counting "based on the fact that p, if particles or cells are sent through a very narrow opening together with an electric current, each particle or ^ ny cell provides the current flow to a temporary resistance when it or they temporarily opening occupies The greater the volume of the cell, the greater the resistance. This resistance can be converted into a proportional signal which can be determined electronically. If a known volume of a particle suspension or a cell suspension is sent through the opening, then it is possible Electronically count the number of cells or particles in the volume. Small cells, such as red cells and white cells, generate relatively large signals and are counted by this method using an opening with a diameter of 100 t the volume of the platelets varies from 2 - 30 u or 1/40 to 1/30 of a red cell, is t the resistance generated by these platelets is smaller. In order to get the signal 9 generated by the platelets to VQrsem 0 it is necessary to reduce both the size of the opening to 50 u and to increase the current flow through the opening e
Eine Probe aus einem mit Blutplä'fctchaa aagereicherten Plasma wird nach der Zweispritsen-Methode orlmlten,, worauf 9 ml Venenblut durch sorgfältige Venoapunkjut goeanmelt werden. Die I31utprobe wird schnell in ein mit Silikon ausgekleidetes ßeagensglas gegeben und mit 1 ml einer 3r8 $igen Natriumcitratlösung vermischt. AxxschlieseeM an üie Aatikoagulierung mit dem Citrat wird die Probe in zwei 10 ml-Seile aufgeteilt. Einem Seil worden 081 ml tris-Pu£fer ftris-CHydroxymethjl)-aminomethan, 0, imp pH 7» 6) und dam änderen 051 ml trie~Pa£fer, der 80 mg Pyridazin enthält, zugesetzt« Das Blut wird mit 900 üpm (60 g) während einer Zeitspanne von 15 Minuten zssn-A sample from a plasma enriched with blood cells is prepared according to the two-fuel method, whereupon 9 ml of venous blood are grafted by careful venous tapping. The I31utprobe is quickly transferred to a lined with silicone ßeagensglas with 1 ml of a 3 r 8 $ sodium citrate solution mixed. In addition to coagulating with the citrate, the sample is divided into two 10 ml ropes. A rope contains been 0 8 1 ml tris-fer Pu £ ftris-CHydroxymethjl) aminomethane, 0, p in pH 7 »6) and dam änderen 0 5 1 ml trie ~ Pa £ fer containing 80 mg pyridazine, added" The Blood is fed at 900 rpm (60 g) for a period of 15 minutes.
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trifugiert, worauf die überstehende Pliiseigkeitj d.h. das an Blutplättchen reiche Plasma, von den susaismengeballten roten Zollen abgetrennt wird.trifuged, whereupon the protruding liquidity, i.e. the Platelet-rich plasma, from the susaismen-clenched red ones Zollen is severed.
Das an Blutplättchön reich© Plasma wird anschliessend elektronischen Zählung verdünnt, und awar durch Zugabe von 20 lambda eines an Blutplättchen reichen Plasmas zu 100 ml einer teilchenfreien 0,85 $igen Salslösuag, so dass eine 1/^000-Verdünnung erzielt wird.The plasma is then rich in blood platelets electronic counting diluted, and awar by adding 20 lambda of a platelet-rich plasma to 100 ml of a particle-free 0.85% saline solution, so that a 1 / ^ 000 dilution is achieved.
Die 1/5000-Verdünnung wird anschliessend unter Verwend^mg des Coulter-Zählers mit eiaer 50 u-Öffnung, einer Öffnungsstromeinstellung von 7 und einem Schwellwerk von 25 gewählt. · Die von Blutplättchen freie Salzlösung wird ebenfalls gezählt, um den Untergrundwert infolge eines elektronischen Geräusches sowie von Bruchstücken su bestimmen. Dieser Viert wird von den Zählungen subtrahiert, di© bei Verwendung der Blutplättchen~enthaltend©n Probe ermittelt \*erden.The 1/5000 dilution is then used using ^ mg of the Coulter counter with a 50 u opening, an opening current setting chosen out of 7 and a swell of 25. · The saline solution free of platelets is also counted, the background value as a result of an electronic Determine noise as well as fragments see below. This fourth is subtracted from the counts, ie © when using the Ground platelets containing a sample.
Die Plättchenaählusjg unter Verwendung eines blutplättohanreichen Plasma entspricht der elektronischen Zählung mal ^/ * Dieser ¥ert kann für ein blutplättchenreiches PlasmaThe platelet count using a platelet accumulator Plasma equals electronic counting times ^ / * This can be used for a platelet-rich plasma
in einen Wert für ein normales Blut gemäss folgender formel umgerechnet werden:into a value for normal blood according to the following formula are converted:
BXutsählimgen enfe3ps?gcfcsa der Zäaltmg eine© ■fc-lutplättohenreichsn Plasmas mal CiOO«=«g©paoktes Zlll des Bluts).BXutsählimgen enfe3ps? Gcfcsa derzaaltmg a © ■ fc-lutplättohenreichsn plasmas times CiOO «=« g © paoktes Zlll of the blood).
In der folgenden Tabelle Λ eind Pl&ttensäliluiag@n angegeben, die unter Verwendung des ersten Seils der blutplättchön« reichen Plasmaproben bei 0,6 und 24 Stunden gemacht worden sind. In der Säbel!e B sind ähnliche AblesungenIn the following table Λ and Pl & ttensäliluiag @ n specified, the platelet-rich plasma samples were taken at 0.6 and 24 hours using the first rope are. There are similar readings in saber B
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fasst s v/eiche unter Verwendung der zweiten Teile der Mutplättchenreichen Plasmenproben ermittelt wurden (diesen Proben wurden 8 mg Pyridaain pro ml der Probe zugesetzt). Die Ablesungen erfolgen in den gleichen Intervallen.grasp s v / eiche using the second parts of the mutplate realms Plasma samples were determined (8 mg pyridaain per ml of the sample were added to these samples). The readings are taken at the same intervals.
Tabelle A An Blutplättchen reiches Plasma Table A Platelet rich plasma a
Blutplättchen-Zählung/inm Zeit in StundenPlatelet count / inm Time in hours
Hr5 0 6Hr 5 0 6
Durch" 207 000 165 000 106 schnittCut through "207 000 165 000 106
Tabelle B Zugesetztes diagnostisches ReageasTable B Additional Diagnostic Reagea s
Duroh-Duroh-
echüitt 253 000 255 000 255echüitt 253 000 255 000 255
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Ea wird eine weitere in vitro-TJntersuchung durchgeführt, wobei man eich einer Elektronenmikroskopmethode bedient, um sowohl die quantitative Aktivierung als auch die Aggregationskapazität von Blutplättchen gesunder Patienten sowie von Patienten zu bestimmen, deren klinische Diagnose einen 8\yokardialen Infarkt ergeben hat.A further in vitro test is carried out, with an electron microscope method is used to detect both the quantitative activation as well as the aggregation capacity of blood platelets of healthy patients as well as of patients to determine whose clinical diagnosis is an 8 \ yocardial Infarct.
Bei dieβor Untersuchung wird eine Blutprobe unter Anwendung einer Zweispritzen-Hämorepellant-Hethode abgenommen. DJe Proben werden ansohlieseend durch Zugabe von Heparin oder Natriumeitrat antikoaguliert. Die antlkoagulierte Probe wird als nächstes in zwei gleiche Seile aufgeteilt, wobei die Vergleiohsprobe auß 9 Teilen Blut pro 1 Teil 0,1m trie-Puffer (pH 7,6) besteht. Die Testprobe besteht aus 9 Teilen Blut pro 1 Teil der trie-Pufferlösung, die eine gemessene Menge Pyridazin enthält. Die Konzentration an Pyridazln schwankt von 0,075 mg/iol des Blutes bis: 1,0 mg/ml des Blutes« Die Proben, und zwar sowohl die Vergleichsprobe alo auch die Testprobe f werden unter standardisierten Bedingungen einer Oberflächenaktivierung unterzogen.During this examination, a blood sample is taken using a dual-syringe hemorepellant method. All samples are initially anticoagulated by adding heparin or sodium citrate. The anti-coagulated sample is next divided into two equal ropes, the comparison sample consisting of 9 parts of blood per 1 part of 0.1m trie buffer (pH 7.6). The test sample consists of 9 parts of blood per 1 part of the trie buffer solution, which contains a measured amount of pyridazine. The concentration of pyridazin varies from 0.075 mg / iol of the blood to: 1.0 mg / ml of the blood. The samples, namely both the comparison sample alo and the test sample f, are subjected to surface activation under standardized conditions.
Die Blutplättchen in den Proben erleiden eine Reihe von morphologischen Aktivierungen, die quantitativ mittels des Elektronenmikroskops erkannt und klaseifisiert werden kennen. Eine quantitative Klassifizierung dor Blutplättchen-Typen beruht auf der Zählung von 100 einzelnen Plättchen in einem Elektronenmikroskop-Gitterfeld. Die Plattetenaggregate werden ebenfalls gezählt und als Anzahl von Aggregaten von 100 gesählten Plättchen angegeben.The platelets in the samples undergo a number of morphological conditions Know activations that are quantitatively recognized and classified by means of the electron microscope. A quantitative classification is based on platelet types on the count of 100 individual platelets in an electron microscope grid field. The plate aggregates are also counted and counted as the number of aggregates out of 100 Plate indicated.
Bei der Verwendung von normalen Vergleichsproben zeigen die Plättehen nur eine geringe Oberflächesaktivierung und eine When normal comparative samples are used, the platelets show only a small amount of surface activation and only one
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leichte Neigung zur Aggregation. Die durchschnittlichen Ein-· zelplättchen besitzen zu ungefähr 5 $> eine runde Form, au 9 $> eine .frühreife dendritisch© Form, zu 75 # eine dentritische Form, zu 3 # eine Zwischenf orm und au 6 # eine aus». gebreitete Form« Ungefähr 5 $> der Plättchen liegen in der Aggregatform vor.slight tendency to aggregate. The average single platelets have a round shape of about 5 $ , an 'prematurely dendritic' shape for 9 $, a dendritic shape for 75 #, an intermediate shape for 3 # and an intermediate shape for 6 #. Broadened form «About 5 $> of the platelets are in the aggregate form.
Demgegenüber zeigen Plättchen von Patienten,, bei denen klinisch ein myokardialer Infarkt nachgewiesen wurde 8 aine extreme Oberflächenaktivierung,, wobei grosse und zahlreiche Plättchenaggregate entwickelt v/erden 0 Der überwiegende Plättchentyp ist in diesem Falle der Zwischen typ und der lyp der ausgebreiteten Plättchen. Ferner atellt man eJ.ne erhebliche Abnahme der Anzahl an Plättchen festp die als frühreif den» dritisch, dendritisch und rund eingestuft v/erden„ Die iäuletzt genannten Sypen sind die normalen Plättchentypen.In contrast, show platelets from patients ,, where clinically a myocardial infarction was detected 8 aine extreme surface activation ,, with large and numerous platelet aggregates developed v / ground 0 The predominant platelet type in this case is the intermediate type and lyp the outstretched platelets. Furthermore, one atellt eJ.ne significant decrease in the number of platelets fixed p the precocious the "dritisch, dendritic and some classified v / Ground" The Sypen iäuletzt mentioned are the normal platelet types.
Wird entweder Heparin oder Goumadin (short term coumadin) an diese letzteren Patienten verabreicht, dann bleibt der aktivierte Zustand ihrer Plättchen urverändert, wobei mittlereWill either heparin or goumadin (short term coumadin) administered to these latter patients, the activated state of their platelets remains unchanged, with average
Plättchen und ausgebreitete Plättchen bei den verschiedenen Zählungen dominieren. Es wurde jedoch festgestellt^ dass die Heparintherapie teilweise die Kapazität der Plättchan blockiert, Aggregate zu bilden, \/ährencl Couioadin keine Wir-=· kung auf die Herabsetzung der Anzahl der Plättohsn&ggregate austtbt.Tiles and expanded tiles at the various Counts dominate. It was found, however, ^ that the heparin therapy partially increases the capacity of the platelets blocked from forming aggregates, Couioadin no we- = · Attention to the reduction in the number of plates exerts.
Wird Pyridazin in vitro Bl'atplättchen normaler Patienten zugesetzt, dann wird der Grad der Oberflächena&tivierung herabgesetzt, wobei die Ansah! der gebildeten Plättehenaggregate ebenfalls msrlclich verminclsrt wird*Becomes pyridazine in vitro platelets of normal patients then the degree of surface activation is added reduced, with the Ansah! of the platelet aggregates formed is also reduced by a minimum *
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Wird Pyrid&ssin den Blutplättchen solcher Patienten zugesetzt, die einen rayokardialen Infarkt erlitten haben, dann liefert die Plättchenauszählung ein umgekehrtes Ergebnis. Diese Zählung kann nicht von derjenigen eines normalen Patienten unterschieden werden. In siner derartigen Zählung überwiegen die dendritischen Plättchen vor den Zwischenplättchen und den ausgebreiteten Plättchen.When Pyrid & ssin is added to the platelets of such patients, who have suffered a rayocardial infarction, then the platelet count gives the opposite result. This count cannot differ from that of a normal patient can be distinguished. In this count, the dendritic platelets predominate over the intermediate platelets and the spread out platelets.
inhiMsrt Pyridasln merklich dia Bildung von Plätfcckenaggregaten wid ist wesentlich, "besser al3 Heparin hinaichtlioh des Vermögens, die Plättehönaggregatbildung au heuamen. Pyridaain setzt ferner die JTeigung von roten Zellen und Kjöukoaytön lierab» &n der aktivi©rend®n Oberfläche aniSiA tesi.inhiMsrt Pyridasln noticeably dia formation of Plätfcckenaggregaten is wid significantly "better al3 heparin hinaichtlioh property, heuamen the Plättehönaggregatbildung au. Pyridaain also sets the JTeigung of red cells and Kjöukoaytön lierab"& n the aktivi © rend®n surface Anisia tesi.
ist £&btsue"Gellenp ömm& än:sah die vorlie geacl® E??fixidimg Reagontien s%r Koramlen klJLnlachen öueiwsag vo» Patienten si\r ¥©rf!igmsg gestallt v/s;ed3Si9 h&Bon&QSQ 8iir Unter Eichung von Patienten s «11© vor einest Operation 8telisn„ öowis τοη Patiezites, di.e Koagulierungsprobleme bjab-sn, J)iess Reagan ti en stabilisieren die Plättchen un:l er- !©.lclitern ctabsi die Sönauigksil; md. die Siiofachheit deris £ & b Tsue "yells p ömm & än: saw of the products contained geacl® E ?? fixidimg Reagontien s% r Koramlen klJLnlachen öueiwsag vo" patients si \ r ¥ © rf igmsg gestallt v / s; ed3Si 9 h & Bon & QSQ 8iir Under calibration of patients! s «11 © before an operation 8telisn" öowis τοη Patiezites, di.e coagulation problems bjab-sn, J) iess Reagan ti en stabilize the platelets and: l er! © .lclitern ctabsi the Sönauigksil; md. the Siofachheit the
Xn normalem Blut oder in einem salt Plätt- Xn normal blood or in a salt plateau
ten Plasma. Auf diese Weise Tiird erfindungsdie Magaoss von solcliea KxanlcheitsstistSisäen erleichtert j bai iiöHon sine Plättch©naggregatios3 in kritischer Walesth plasma. In this way, the invention is made Magaoss of solcliea KxanlcheitsstistSissame facilitates j bai iiöHon sine platch © naggregatios3 in critical Wales
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