DE19624624A1 - Process for improving the product yield in fermentation processes - Google Patents
Process for improving the product yield in fermentation processesInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft die Verbesserung von Fermenta tionsverfahren zwecks Erhöhung der Ausbeute der mit Hilfe von Mikroorganismen in diesen Fermentationsprozessen hergestell ten biologischen Produkte bzw. Wertstoffe.The invention relates to the improvement of fermenta tion method in order to increase the yield of with the help of Microorganisms produced in these fermentation processes biological products or valuable substances.
Die Fermentation von Mikroorganismen dient u. a. zur Produktion von biologischen Produkten oder Wertstoffen, wie beispielsweise Proteine, Enzyme oder auch andere chemische Wertstoffe, z. B. gegebenenfalls auch mit pharmazeutischer Wirkung. Hierbei benötigen die Mikroorganismen sowohl für die intrazelluläre als auch die extrazelluläre Bildung der Pro dukte bzw. Wertstoffe Nährstoffmedien, die in der Regel eine sogenannte Kohlenstoff-Quelle ("C-Quelle"), eine Stickstoff- Quelle ("N-Quelle") und sogenannte Suppline wie Salze und Vitamine enthalten. Als N-Quelle können niedermolekulare che mische Substanzen wie Ammoniumsalze bzw. Harnstoff oder aber hochmolekulare, stickstoffhaltige Substrate wie Proteine na türlicher Herkunft, z. B. Sojamehle, Baumwollsaatproteine, Getreideproteine, Proteine tierischer Herkunft wie Fischmehle usw. Verwendung finden. Insbesondere die N-Quellen pflanzli cher Herkunft können neben dem Proteingehalt mehr oder weni ger hohe Gehalte an Stärke aufweisen und so gleichzeitig als C-Quelle dienen. Als C-Quellen werden im Stand der Technik Kohlenhydrate, vor allem Mono-, Di-, Tri- und Oligosaccharide, aber auch polymere Kohlenhydrate wie Getreide, Kartoffelstär ken, Tapiokastärke oder Stärke der Yamswurzel verwendet. The fermentation of microorganisms u. a. to Production of biological products or recyclables, such as For example, proteins, enzymes or other chemical Recyclables, eg. B. optionally also with pharmaceutical Effect. In this case, the microorganisms need for both intracellular as well as the extracellular formation of the pro or valuable nutrient media, which is usually a so-called carbon source ("C source"), a nitrogen Source ("N-source") and so-called supplines such as salts and Contain vitamins. As an N source, low molecular weight che mixing substances such as ammonium salts or urea or else high molecular weight, nitrogen-containing substrates such as proteins of natural origin, z. Soybean flours, cottonseed proteins, Cereal proteins, proteins of animal origin such as fish meal etc. find use. In particular, the N-sources Pflanzli In addition to the protein content, more or less have high contents of starch and at the same time as Serve C source. C sources are known in the art Carbohydrates, especially mono-, di-, tri- and oligosaccharides, but also polymeric carbohydrates like cereals, potato starch ken, tapioca starch or yam starch are used.
Einige C-Quellen wie z. B. Glucose, Fructose, Dextrine werden durch die Mikroorganismen sehr leicht metabolisiert und führen daher zu einer explosionsartigen Vermehrung der Mikroorganismen, einhergehend mit rascher Sauerstoffverarmung in der Fermentationsnährlösung. Die Sauerstoffverarmung zieht eine Umstellung des Mikroorganismenstoffwechsels nach sich, so daß die gewünschten Fermentationsprodukte nicht mehr oder nur in ungenügender Menge produziert werden; im ungünstigsten Falle sterben die Mikroorganismen sogar wegen Sauerstoffman gel ab. Weiterhin behindern Glucose und andere Mono- oder Disacharide in der Mikroorganismenzelle sehr häufig die in trazelluläre Induktion von Enzymen zur Ausscheidung eines gewünschten Wertstoffes, von Enzymen zum Stärkeabbau (z. B. von Amlyase) oder von anderen Enzymen. Die erwünschte Produk tion des biologischen Produktes bzw. Wertstoffes geht in der Folge daher häufig auf geringe Mengen zurück und wird teil weise sogar gänzlich von den Mikroorganismen eingestellt.Some C sources, such as As glucose, fructose, dextrins are easily metabolized by the microorganisms and therefore lead to an explosion of the Microorganisms, accompanied by rapid oxygen depletion in the fermentation broth. The oxygen depletion pulls a change of microorganism metabolism, so that the desired fermentation products no longer or only be produced in insufficient quantity; in the worst case The microorganisms even die because of oxygen man gel off. Furthermore, hinder glucose and other mono- or Disaccharides in microorganism cells are very common in Tracellular induction of enzymes to excrete a desired valuable substance, from enzymes for starch degradation (eg of amylase) or other enzymes. The desired product tion of the biological product or valuable substance goes in the Therefore, often back to small amounts and will participate even completely adjusted by the microorganisms.
Im Stand der Technik hat es nicht an Versuchen gefehlt, die vorstehenden Schwierigkeiten zu umgehen. Beispielsweise wurde versucht C-Quellen höherer Molekulargewichte einzuset zen, wie die bereits genannten Kohlenhydrate oder Stärken. Grundsätzlich können alle pflanzlichen Stärkequellen als po tentielle C-Quellen herangezogen werden. Häufig werden die Stärkeprodukte hierzu nicht aus den Pflanzen isoliert, son dern gleich die auch zur Stärkeherstellung dienenden pflanz lichen Ausgangsstoffe wie gemahlene Früchte oder Speicheror gane von Pflanzen wie Wurzelknollen oder Wurzelrhizome ver wendet. In der Regel handelt es sich bei solchen polymeren C-Quellen dann z. B. um Mehle von Getreiden, wie Weizenmehl oder Maismehl, von Kartoffelmehl oder Tapiokamehl verschiede ner Korngrößen. Die Mehle und Stärken werden aber vor der Fer mentation sehr häufig noch einer enzymatischen Behandlung unterzogen, um die Viskosität des Fermentationsmediums zu erniedrigen. Hierdurch soll einerseits die Neigung der Stär ken, in Wasser zu verkleistern und zu gelieren, vermindert und somit die Rührfähigkeit des Fermentationsmediums gewähr leistet werden, und andererseits auch der für die Fermenta tion der Mikroorganismen erforderliche Stofftransport von Sauerstoff und Kohlendioxid gesteigert werden. In der Regel sind die polymeren C-Quellen wie Stärke oder stärkehaltige Mehle somit nicht ohne Vorbehandlung verwendbar, da sie an sonsten zu hochviskosen Suspensionen oder Lösungen führen und gelegentlich auch gelieren. Um die damit einhergehenden Sau erstoff- und Durchmischungsprobleme zu beheben, werden die polymeren Kohlenhydrat-Quellen in der Regel daher mit Enzymen (beispielsweise mit Amylasen oder Glucoamylasen) soweit abge baut, daß zwar das rechte Maß an Viskosität im Fermentations medium eingestellt, eine nachteilige Substratrepression durch niedermolekulare Kohlenhydratefragmente aber vermieden wird.There has been no lack of attempts in the prior art to avoid the above difficulties. For example Attempts were made to use C sources of higher molecular weights like the already mentioned carbohydrates or starches. In principle, all plant sources of starch can be considered po tentative C sources are used. Often the Starch products not isolated from the plants, but son just like the plants that also serve to make starch starting materials such as ground fruits or Speicheror gans of plants such as root tubers or root rhizomes ver applies. As a rule, such polymers C sources then z. For example, flour of cereals, such as wheat flour or maize flour, from potato flour or tapioca flour ner grain sizes. The flours and starches are but before the Fer very often still an enzymatic treatment to increase the viscosity of the fermentation medium humiliate. As a result, on the one hand, the tendency of the starch to gelatinize and gelatinize in water, diminished and thus ensures the stirrability of the fermentation medium and on the other hand also for the Fermenta Transport of the microorganisms required mass transport of Oxygen and carbon dioxide are increased. Usually are the polymeric C sources such as starch or starchy Flours thus can not be used without pretreatment, as they are otherwise lead to highly viscous suspensions or solutions and occasionally also gel. To the accompanying sow to solve problems of substance and mixing, the polymeric carbohydrate sources therefore usually contain enzymes (For example, with amylases or glucoamylases) abge abge builds, that although the right level of viscosity in the fermentation medium, adverse substrate repression by low-molecular carbohydrate fragments but avoided.
Weiterhin ist es im Stand der Technik bekannt, daß die Ausbeute an Wertstoffen bei biologischen Prozessen, z. B. zur Herstellung von Enzymen, eng mit dem im Fermentationsmedium bereitgestellten Verhältnis von C- zu N-Quelle verknüpft ist. Bei Kenntnis dieses optimalen Verhältnisses kann dann in der Folge durch eine gezielte Steigerung der Menge an Substraten wie Stärke oder stärkehaltigen Mehlen im Fermentationsmedium die Ausbeute an Enzymen bzw. anderen Wertstoffen erhöht wer den. Die Steigerung der Menge des zur Verfügung gestellten Substrates findet aber ihre natürliche Grenze darin, daß die wäßrigen Fermentationsmedien die gelösten oder suspendierten Rohstoffe nur bis zu einem hantierbaren Grenzgehalt aufnehmen können. Über diesen Grenzgehalt hinaus ist eine weitere Aus beutesteigerung durch Erhöhung der C-Substratmenge nicht mög lich, da wiederum - auch bei vorangegangenem enzymatischen Abbau der C-Quellen - hochviskose Fermentationsmedien und mangelhafter Stofftransport bewirkt würden. Durch das damit einhergehende verringerte Wachstum der Mikroorganismen würde auch die Ausbeute an Wertstoffen, z. B. an Enzymen, außeror dentlich klein ausfallen. Um diese Schwierigkeiten zu umge hen, wurde im Stand der Technik versucht, C-Quellen (z. B. Glucose oder z. B. enzymatisch abgebaute Stärke) so nachzudo sieren, daß das Konzentrationsniveau im Fermentationsmedium niedrig gehalten und der Fermentationsprozeß stabilisiert werden kann. Die geeignete Dosierung über die Dauer des Fer mentationsprozesses erfordert jedoch eine komplizierte Tech nik; es muß eine aufwendige Meß- und Regeltechnik vorgehalten werden, und auch der analytische Aufwand für den Fermenta tionsprozeß, z. B. für die Kontrolle der Substrataufnahme durch die Mikroorganismen, steigt stark an. Auch nimmt der apparative Aufwand zu, da weitere Vorratsgefäße benötigt wer den. Weiterhin wird der Prozeß durch häufiges Nachdosieren von Rohstoff technisch aufwendiger, da die Rohstoffe satzwei se oder kontinuierlich sterilisiert werden müssen, wobei trotz dieser Maßnahmen das Kontaminationsrisiko mit Fremdkeimen dennoch wesentlich erhöht wird.Furthermore, it is known in the art that the Yield of valuable substances in biological processes, eg. B. for Production of enzymes, close to that in the fermentation medium provided ratio of C to N source is linked. With knowledge of this optimal relationship can then in the Result by a targeted increase in the amount of substrates such as starch or starchy flours in the fermentation medium the yield of enzymes or other recyclables increased who the. The increase in the amount of provided But substrate finds its natural limit in that the aqueous fermentation media, the dissolved or suspended Take up raw materials only up to a negotiable limit content can. Beyond this limit content is another out increase in prey by increasing the amount of C substrate not possible Lich, in turn - even with previous enzymatic Degradation of C sources - high viscosity fermentation media and poor mass transfer would be effected. By that accompanying reduced growth of the microorganisms would also the yield of valuable substances, eg. As to enzymes, exceptor really small. To overcome these difficulties In the prior art, C sources (eg. Glucose or z. B. enzymatically degraded starch) nachzudo so that the concentration level in the fermentation medium kept low and the fermentation process stabilized can be. The appropriate dosage over the duration of Fer However, the process of mentoring requires a complicated tech technology; it must be kept a complex measurement and control technology and also the analytical effort for the fermenta tion process, z. B. for the control of substrate uptake through the microorganisms, increases sharply. Also takes the Apparative effort, because more storage vessels needed who the. Furthermore, the process by frequent replenishment Of raw material technically more complex, since the raw materials Satzwei must be sterilized or continuously, despite These measures the risk of contamination with foreign germs nevertheless increased significantly.
Es bestand daher die Aufgabe, ein einfaches und kosten günstiges Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die Substratausbeute bezüglich der C-Quelle verbes sert ist, ohne daß eine in der Produktion bereits bestehendes Fermentationstechnologie im Hinblick auf apparative Ausstat tung, Meß- und Regeltechnik bzw. analytischen Aufwand verän dert werden muß; das Fermentationsverfahren sollte gleichzei tig zu einer Erhöhung der Ausbeute der im Fermentationsprozeß hergestellten biologischen Produkte oder Wertstoffe, z. B. der hergestellten Enzyme, führen.It was therefore the task of a simple and cost to provide a favorable fermentation process, in which the substrate yield with respect to the C source verbes sert, without any pre-existing production Fermentation technology with regard to equipment Ausstat tion, measuring and control technology or analytical effort verän must be the fermentation process should be the same tiger to an increase in the yield of the fermentation process produced biological products or recyclables, eg. B. the produced enzymes lead.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Aufgabe durch die Verwendung von chemisch modifizierten Kohlenhydrat quellen gelöst werden kann. Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fermentation von Mikroorganismen zur Her stellung von biologischen Produkten oder Wertstoffen, bei dem man in der Fermentation ein Nährstoffmedium zur Verwertung durch die Mikroorganismen einsetzt, das als C-Quellen-Sub strat eine chemisch modifizierte Kohlenhydratquelle, insbe sondere eine chemisch modifizierte oligomere oder polymere Kohlenhydratquelle, enthält. Der chemisch modifizierten Koh lenhydratquelle können dabei alle an sich üblichen Kohlenhy drat-haltigen Substrate zugrundeliegen, die nach an sich be kannten chemischen Methoden modifiziert werden können. Solche zugrundeliegenden Kohlenhydrate sind daher Mono-, Di-, Tri- und Oligosaccharide und insbesondere aber polymere Kohlenhy drate, wobei grundsätzlich alle pflanzlichen Stärkequellen in Frage kommen; beispielsweise können Mehle aus Mais, Reis, Getreide, Kartoffeln, Tapioka oder Yamswurzel sowie die aus diesen Pflanzen gewonnen Stärken nach chemischer Modifizie rung im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden. Die im erfin dungsgemäßen Verfahren verwendete chemisch modifizierte Koh lenhydratquelle kann im Fermentationsverfahren sowohl als einzige Kohlenhydratquelle eingesetzt werden, oder anderer seits auch nur einen gewünschten Anteil einer an sich übli chen, nicht-modifizierten Kohlenhydratquelle ersetzen bzw. diese mengenmäßig ergänzen. Es besteht hierbei auch die Mög lichkeit, die erfindungsgemäß modifizierte Kohlenhydratquel le, inbesondere derivatisierte Stärke, sowohl zeitgleich mit der nicht-modifizierten Kohlenhydratquelle oder auch zu einem geeigneten späteren Zeitpunkt satzweise oder kontinuierlich in den Fermenter zu dosieren.Surprisingly, it was found that the task through the use of chemically modified carbohydrate sources can be solved. Accordingly, the invention relates a method for the fermentation of microorganisms for Her of biological products or recyclable materials in which in the fermentation a nutrient medium for recovery through the microorganisms used as C sources sub strat a chemically modified carbohydrate source, esp in particular a chemically modified oligomeric or polymeric Carbohydrate source. The chemically modified Koh lenhydratquelle can all conventional Kohlhy underlying drat-containing substrates, the be after knew chemical methods can be modified. Such underlying carbohydrates are therefore mono-, di-, tri- and Oligosaccharides and in particular but polymeric Kohlenhy In principle, all sources of vegetable starch in Come question; For example, corn, rice, Cereals, potatoes, tapioca or yam as well as those from Starches obtained after chemical modification tion can be used in the invention. The in the invent Chemically modified Koh used in the process according to the invention lenhydratequelle can be used in the fermentation process both as only carbohydrate source can be used, or other on the other hand, only a desired proportion of a itself übli replace, unmodified carbohydrate source or supplement these in terms of quantity. There is also the possibility probability, the inventively modified Kohlenhydratquel le, in particular derivatized starch, both at the same time the unmodified carbohydrate source or even to a appropriate later in one sentence or continuously into the fermenter to dose.
Die chemische Modifizierung erfolgt hierbei über die freien Hydroxygruppen der Glucosebausteine der jeweiligen Kohlenhydratquelle. Diese Hydroxygruppen erlauben beispiels weise Veretherungen, Veresterungen, Oxidationen und Querver netzungen mit bi- oder polyfunktionellen organischen Verbin dungen. Beispiele sind: für Veretherungen die Hydroxyethylie rung mit Ethylenoxid, für Veresterungen die Acetylierung z. B. mit Acetylchlorid oder Acetanhydrid, oder für Quervernetzun gen die Umsetzung mit Epichlorhydrin oder Phosphorsäure chloriden. Zur Erzielung der erfinderischen Effekte reichen bereits geringe Modifizierungsgrade, um die Ausbeute an fer mentativ herzustellenden Wertstoffen bzw. Enzymen wesentlich zu erhöhen. Als Modifizierungsgrad wird hierbei ganz allge mein die Anzahl der chemisch modifizierten Hydroxygruppen pro Glucoseeinheit der Kohlenhydratquelle in mol/mol verstanden. Zweckmäßigerweise beträgt der Modifizierungsgrad 0,005 bis 4 mol/mol, und insbesondere 0,01 bis 1 mol/mol. Den zweckmäßi gen Modifizierungsgrad kann der Fachmann in diesem Rahmen für den jeweiligen konkreten Fermentationsprozeß mit wenigen Ver suchen ermitteln.The chemical modification takes place via the free hydroxy groups of the glucose units of the respective Carbohydrate source. These hydroxy groups allow, for example etherification, esterification, oxidation and cross-linking bi- or polyfunctional organic compounds fertilize. Examples are: for etherifications hydroxyethyl with ethylene oxide, for esterification acetylation z. B. with acetyl chloride or acetic anhydride, or for crosslinking the reaction with epichlorohydrin or phosphoric acid chlorides. To achieve the inventive effects range already low degrees of modification to the yield of fer mentally produced recyclables or enzymes essential to increase. As a degree of modification here is quite general my the number of chemically modified hydroxy groups per Glucose unit of the carbohydrate source in mol / mol understood. Conveniently, the degree of modification is 0.005 to 4 mol / mol, and especially 0.01 to 1 mol / mol. The zweckmäßi The degree of modification can be understood by the person skilled in the art in this context the respective concrete fermentation process with few Ver to find a search.
Zweckmäßige, im erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren einsetzbare, chemisch modifizierte Kohlenhydratquellen sind daher insbesondere solche, bei denen die Kohlenhydratquelle chemisch umgewandelt und/oder derivatisiert ist. Vorzugsweise ist diese als C-Quellen-Substrat dienende Kohlenhydratquelle durch Veresterung oder Veretherung derivatisiert oder durch Oxidation oder Vernetzung chemisch umgewandelt. Hierbei zeichnen sich bevorzugte chemisch modifizierte Kohlenhydrat quellen dadurch aus, daß diese durch Veresterung, insbesonde re durch Acetylierung freier Kohlenhydrat-Hydroxygruppen, derivatisiert sind. Besonders günstige Ausbeuteerhöhungen bei der Enzymherstellung werden bei Verwendung von verester ter, insbesondere acetylierter Stärke erzielt, wobei schon relativ geringe Derivatisierungsgrade (Acetylisierungsgrade) ausreichen. Der Veresterungsgrad der veresterten bzw. acety lierten Kohlenhydratquellen, vorzugsweise der Veresterungs- bzw. Acetylierungsgrad erfindungsgemäß verwendeter Stärke, läßt sich bestimmen, indem man eine definierte Menge einer spezifizierten, veresterten bzw. acetylierten Kohlenhydrat quelle mit einem ebenfalls definierten Überschuß alkalischer Base, z. B. Natriumhydroxid, verseift und man danach die nicht verbrauchte Menge der Base quantitativ bestimmt. Der Substitutionsgrad (DS = degree of substitution), also der Veresterungs- bzw. Acetylierungsgrad kann dann aus der mola ren Menge an verbrauchter Base als Anzahl der Ester- bzw. Acetylgruppen pro Glucoseeinheit der jeweiligen veresterten bzw. acetylierten Kohlenhydratquelle berechnet werden. In bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung beträgt der Ver esterungsgrad bzw. Acetylierungsgrad, bestimmt durch Versei fung der veresterten Kohlenhydratquelle als Anzahl der Sub stitutionsgruppen pro Glucoseeinheit (DS) hierbei 0,005 bis 4 mol/mol, und insbesondere 0,01 bis 1 mol/mol. Besonders be vorzugt sind Veresterungs- bzw. Acetylierungsgrade von 0,02 bis 0,15 mol/mol.Appropriate, in the fermentation process according to the invention usable, chemically modified carbohydrate sources are therefore, especially those in which the carbohydrate source chemically converted and / or derivatized. Preferably is this source of carbohydrate C-source substrate derivatized by esterification or etherification or by Oxidation or cross-linking chemically converted. in this connection stand out preferred chemically modified carbohydrate swell by the fact that this esterification, insbesonde by acetylation of free carbohydrate hydroxy groups, are derivatized. Particularly favorable yield increases in the enzyme production are using ester ter, in particular acetylated starch achieved, although already relatively low degrees of derivatization (degree of acetylation) suffice. The degree of esterification of the esterified or acety carbohydrate sources, preferably the esterification or Acetylierungsgrad according to the invention used starch, can be determined by giving a defined amount of one specified, esterified or acetylated carbohydrate source with a likewise defined excess of alkaline Base, e.g. As sodium hydroxide, saponified and then the Unused amount of base quantified. The Degree of substitution (DS = degree of substitution), ie the Esterification or acetylation can then from the mola amount of consumed base as number of ester or Acetyl groups per glucose unit of the respective esterified or acetylated carbohydrate source can be calculated. In preferred embodiments of the invention is the Ver degree of esterification or degree of acetylation, determined by Versei the esterified carbohydrate source as the number of sub groups of residues per glucose unit (DS) here 0.005 to 4 mol / mol, and especially 0.01 to 1 mol / mol. Especially be esterification or acetylation degrees of 0.02 are preferred to 0.15 mol / mol.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfin dungsgemäßen Fermentationsverfahrens wird eine chemisch modi fizierte Kohlenhydratquelle eingesetzt, der eine (isolierte) Stärke oder eine natürliche Stärkequelle, insbesondere reine Stärke oder stärkehaltiges Mehl, zugrundeliegt. Als chemisch derivatisierte, insbesondere veresterte bzw. acetylierte Stärke ist Acetylstärke zu nennen, beispielsweise der unter "FARAZYM T®" im Handel (z. B. von der Firma AVEBE Deutsch land, Meerbusch, geliefert; produziert von Avebe B.A., Fox hol, NL) erhältliche Tapiokastärke-Acetylester mit einem Sub stitutionsgrad DS von 0,025 bis 0,032 mol/mol, oder eine ent sprechende, von Avebe erhältliche acetylierte Kartoffelstärke ("FARAZYM 76®").In a particularly preferred embodiment of the invention The fermentation process according to the invention is a chemically modi fied carbohydrate source used, which is a (isolated) Starch or a natural source of starch, especially pure Starch or starchy flour, underlying. As a chemical derivatized, in particular esterified or acetylated Starch is called acetyl starch, for example, the lower "FARAZYM T®" in the trade (eg from the company AVEBE Deutsch land, Meerbusch, delivered; produced by Avebe B.A., Fox Hol, NL) available tapioca starch acetyl esters with a sub DS degree of 0.025 to 0.032 mol / mol, or an ent speaking acetylated potato starch available from Avebe ("FARAZYM 76®").
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht mit einfachen Mitteln eine bessere Substratausnutzung bei Verwendung von chemisch modifizierten Kohlenhydratquellen (C-Quellen), um zu einer Ausbeuteerhöhung an fermentativ hergestellten Wertstof fen, z. B. biologische Produkte wie Enzyme, zu gelangen. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet darüber hinaus den Vorteil, daß es in bestehenden Fermentationsanlagen ohne Veränderung der Technologie oder des apparativen bzw. analytischen oder Kontroll- und Meßaufwandes eingesetzt werden kann. Schwierige Dosiertechnologien werden vermieden. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß es bei beliebigen Fermentationen eingesetzt werden kann, und somit für eine Vielzahl der übli cherweise für Fermentationen eingesetzten Mikroorganismen die Verwendung der vorteilhaften, chemisch modifizierten Kohlen hydratquellen erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher insbesondere bei Mikroorganismen der Familien Fungus und Bakterien, insbesondere bei Mikroorganismen, die zur Pro duktion von Enzymen herangezogen werden, vielfältig einge setzt werden. Beispiele für einsetzbare Mikroorganismen sind z. B. die Gattungen Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Peni cillium und Bacillus. Spezielle Beispiele für die Gattung Bacillus sind insbesondere Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, die in der Technologie zur Enzymherstel lung hinreichend beschrieben sind. Die Vorteile der Erfindung lassen sich auch mit optimierten, z. B. gentechnisch veränder ten, Mikroorganismen, insbesondere auch solchen, die zur Pro duktion von Enzymen im industriellen Maßstab eingesetzt wer den, erzielen.The inventive method allows with simple Means a better substrate utilization when using chemically modified carbohydrate sources (C sources) to an increase in yield of fermentatively produced recyclables fen, z. B. biological products such as enzymes to arrive. The inventive method also has the advantage that it is in existing fermentation plants without change the technology or the apparatus or analytical or Control and Meßaufwandes can be used. difficult Dosing technologies are avoided. Another advantage of Invention is that it in any fermentations can be used, and thus for a variety of übli chemically used for fermentations microorganisms the Use of the advantageous, chemically modified carbon hydrate sources allowed. The inventive method can therefore especially in microorganisms of the families Fungus and bacteria, especially microorganisms belonging to Pro production of enzymes, varied be set. Examples of usable microorganisms are z. As the genera Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Peni cillium and bacillus. Specific examples of the genus Bacillus are especially Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, which are used in enzyme manufacturing technology sufficiently described. The advantages of the invention can also be optimized, z. B. genetically modified microorganisms, in particular also those which belong to the Pro industrial scale production of enzymes that, achieve.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch in ihrem Umfange zu beschränken.The following examples are intended to further the invention without restricting their scope.
Unter den Standardbedingungen zur Herstellung einer hochalka lischen Protease vom Subtilisin-Typ 309 wurden im Vergleich als C-Quelle einerseits Kartoffelstärke und native Tapioka stärke (nicht erfindungsgemäß als Standard) sowie anderer seits acetylierte Tapiokastärke bei pH-Werten von 6,0 oder 7,0 mittels eines Bacillus alcalophilus Stammlinie HAI (be schrieben in der publizierten EP-A 415 296), durch herkömm liche Mutation und gentechnische Veränderung optimiert, fer mentiert. Nachfolgend wurde in an sich üblicher Weise die erzielte Aktivitätsausbeute an Protease in DU/ml ermittelt. Unter "DU" wird dabei die enzymatische Aktivität in Delft Units verstanden, wobei 1.000 DU der proteolytischen Aktivi tät entsprechen, die bei einem Volumen von 1 ml einer 2-W/W-%igen Enzymlösung nach Abbau von Kasein eine Extink tionsdifferenz (1 cm Lichtweg; 275 nm; Bestimmung gegen Blindprobentest) von 0,4000 ergibt.Under the standard conditions for producing a hochalka The subtilisin type 309 protease was compared on the one hand potato starch and native tapioca as C source starch (not according to the invention as standard) and others on the one hand acetylated tapioca starch at pH values of 6.0 or 7.0 using a Bacillus alcalophilus strain HAI (be in published EP-A 415 296), by conven optimized mutation and genetic modification, fer mented. Subsequently, in a conventional manner the achieved activity yield of protease in DU / ml. Under "DU" is thereby the enzymatic activity in Delft Units understood, with 1,000 DU of the proteolytic Aktivi corresponding to a volume of 1 ml 2-W / W% enzyme solution after degradation of casein a Extink difference (1 cm light path, 275 nm; Blank test) of 0.4000.
Die eingesetzten nativen und chemisch modifizierten Stärken wiesen folgende Eigenschaften auf:The used native and chemically modified starches had the following characteristics:
Die vorstehenden handelsüblichen Stärken, Kartoffelstärke und Tapiokastärke (nativ oder acetyliert), können beispielsweise bei der Firma AVEBE Deutschland (in Meerbusch) bezogen wer den.The above commercial starches, potato starch and Tapioca starch (native or acetylated), for example at the company AVEBE Germany (in Meerbusch) related who the.
Für die Fermentation mit den vorstehend angegebenen Stärken bzw. Stärkederivaten wurden folgende Ergebnisse im Hinblick auf die jeweilige maximal erzielte Aktivitätsausbeute (bei einer Fermentationsdauer von 72 h) gefunden:For the fermentation with the strengths given above or starch derivatives were the following results in terms on the respective maximum achieved activity yield (at a fermentation period of 72 h) found:
Die erfindungsgemäß eingesetzte, acetylierte Tapiokastärke zeigte in der Aktivitätsbildung eine herausragende Verbesse rung, die deutlich über dem Ergebnis der als Standard aufge führten Kartoffelstärke und auch der nativen Tapiokastärke liegt.The inventively used, acetylated tapioca starch showed an outstanding improvement in the activity formation significantly higher than the result of the standard led potato starch and also the native tapioca starch lies.
Das Verfahren ist für andere Fermentationen, z. B. zur Her stellung von Enzymen wie Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellu lasen, Glucosidasen, Amyloglucosidasen u. a. gleichfalls vor teilhaft anwendbar und wird im nachfolgenden Beispiel noch weiter erläutert.The method is for other fermentations, eg. B. to Her Position of enzymes such as proteases, lipases, amylases, Cellu lases, glucosidases, amyloglucosidases and the like. a. also before partially applicable and will in the following example still further explained.
Unter den Standardbedingungen zur Herstellung einer alkali schen Protease von BPN′-Typ wurden im Vergleich als C-Quelle einerseits Kartoffelstärke (als Standard wie in Beispiel 1, nicht erfindungsgemäß) sowie andererseits acetylierte Tapio kastärke in zwei Fermentationsversuchen mit zwei unterschied lichen Bacillus licheniformis-Stämmen fermentiert und nach folgend in an sich üblicher Weise die erzielte Aktivitätsaus beute an Protease in DU/ml ermittelt (zur Einheit 1 DU/ml siehe Beispiel 1). Es wurden die im Beispiel 1 näher be schriebene Kartoffelstärke (als Standard) bzw. erfindungsge mäß acetylierte Tapiokastärke verwendet. Für die Fermentatio nen mit diesen Stärken bzw. Stärkederivaten wurden die fol genden Ergebnisse im Hinblick auf die jeweilige maximal er zielte Aktivitätsausbeute (bei einer Fermentationsdauer von 77 h bzw. 72 h bei Kartoffelstärke, gegenüber einer Fermenta tionsdauer von nur 56 h bei acetylierter Tapiokastärke) ge funden:Under the standard conditions for producing an alkali In comparison, a protease of BPN'-type was used as a C source on the one hand potato starch (as standard as in example 1, not according to the invention) as well as on the other hand acetylated Tapio cask starch in two fermentation trials with two differences Fermented and after Bacillus licheniformis strains following in usual manner the activity obtained pre-protease in DU / ml (to unit 1 DU / ml see Example 1). It was the closer be in Example 1 be written potato starch (as standard) or erfindungsge used according to acetylated tapioca starch. For the fermentation With these starches or starch derivatives, the fol results in terms of the respective maximum he aimed at activity yield (at a fermentation period of 77 h or 72 h with potato starch, compared with a fermenta duration of only 56 h with acetylated tapioca starch) found:
Die erfindungsgemäß eingesetzte, acetylierte Tapiokastärke zeigte in der Aktivitätsbildung eine herausragende Verbesse rung, die deutlich über dem Ergebnis der hier in Analogie zum Beispiel 1 als Standard aufgeführten Kartoffelstärke liegt, bei gleichzeitig vorteilhafter Verkürzung der Fermentations dauer bei Verwendung von acetylierter Tapiokastärke als C-Quellen-Substrat.The inventively used, acetylated tapioca starch showed an outstanding improvement in the activity formation tion, which is significantly above the result of the analogy here Example 1 is potato starch listed as standard, at the same time advantageous shortening of the fermentation duration when using acetylated tapioca starch as C-source substrate.
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