DE19607202A1

DE19607202A1 - Separation of RNA and DNA from cells by treatment with lytic solution

Info

Publication number: DE19607202A1
Application number: DE19607202A
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr Michel; Andreas Rau; Peter Dr Rieckmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-26
Filing date: 1996-02-26
Publication date: 1997-08-28

Abstract

Separation and isolation of RNA- and DNA-containing fractions from cells in biological samples comprises treatment with a lytic solution (A) that leaves cell nucleic intact, then centrifuging to separate the RNA-containing supernatant from the DNA-containing nuclei. Also claimed is a reagent kit for this process.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolie rung von DNA enthaltenden und RNA enthaltenden Fraktionen aus Zellen sowie einen Reagenzienkit zur Gewinnung und Auftrennung von RNA enthaltenden und DNA enthaltenden Fraktionen aus Zel len und Zellen enthaltenden biologischen Proben.The present invention relates to a method for isolation tion of fractions containing DNA and RNA Cells and a reagent kit for collection and separation of RNA-containing and DNA-containing fractions from cell biological samples containing cells and cells.

Die Entwicklung von Radioimmunoassays und ELISAs hat in den letzten Jahren eine umfangreiche Diagnostik auf Blutbasis ermöglicht. So konnten beispielsweise aus Blut von Patienten und Versuchstieren auf Proteinebene der Hormonstatus und Mar kermoleküle von Erkrankungen bestimmt werden. Da jedoch bei auf Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen basierenden Bestim mungsverfahren für jedes Antigen ein individuell abgestimmter Assay und zudem oftmals ein antigenspezifisches Extraktions verfahren erforderlich ist, ist die Entwicklung von Radio immunoassays (RIAs) und ELISAs aufwendig. Weiterhin können die antigenen Eigenschaften eines Analyten Ähnlichkeiten mit denen verwandter Antigene aufweisen, wodurch es zu unerwünschten Kreuzreaktionen kommen kann, die die Zuverlässigkeit und Sen sitivität von solchen Tests begrenzen. Zudem sind diese Nach weisverfahren zumeist nicht in der Lage, kurzzeitige Verände rungen oder frühe Stadien einer Entwicklung, in denen nur marginale Veränderungen gegenüber dem Ausgangszustand auftre ten, zu erfassen.The development of radioimmunoassays and ELISAs has in the extensive blood-based diagnostics in recent years enables. For example, from patients' blood and experimental animals at the protein level of hormone status and Mar core molecules are determined by diseases. However, since Determination based on antigen-antibody interactions an individually coordinated method for each antigen Assay and also often an antigen-specific extraction procedure is required is the development of radio immunoassays (RIAs) and ELISAs are complex. Furthermore, the antigenic properties of an analyte are similar to those have related antigens, making them undesirable Cross-reactions can occur, the reliability and sen Limit the sitivity of such tests. In addition, these are after wise procedures mostly not able to make short-term changes or early stages of development in which only marginal changes compared to the initial state occur ten.

Aufgrund der eingeschränkten Einsatzmöglichkeiten von Nach weisverfahren auf Peptidbasis wurden sowohl für die Diagnostik als auch für die klinische und grundlagenorientierte Forschung Diagnoseverfahren auf RNA-Basis entwickelt, die herkömmlichen Peptidnachweisverfahren an Sensitivität und Spezifität weit überlegen sind.Due to the limited use of Nach Peptide-based detection methods have been used both for diagnostics as well as for clinical and basic research Diagnostic methods based on RNA developed the conventional Peptide detection method wide in sensitivity and specificity are superior.

Solche auf RNA basierende Diagnoseverfahren beruhen im allge meinen auf der Verwendung von markierten sequenzspezifischen Sonden und setzen die Extraktion quantitativ und qualitativ bestimmbarer RNA aus einer Probe voraus. Aufgrund dieser not wendigen Voraussetzung konnte jedoch bisher die RNA-Diagnostik nicht routinemäßig für periphere mononukleäre Blutzellen (PMNB) angewendet werden, da kein ausreichend zuverlässiges, routinemäßig einsetzbares RNA-Extraktionsverfahren aus Voll blut bekannt war.Such diagnostic methods based on RNA are generally based mean on the use of labeled sequence-specific Probes and set the extraction quantitatively and qualitatively determinable RNA from a sample ahead. Because of this distress So far, however, RNA diagnostics has been a necessary prerequisite not routine for peripheral blood mononuclear cells (PMNB) can be used because there is no sufficiently reliable RNA extraction method from Voll that can be used routinely blood was known.

Die Diagnostik mittels RNA aus peripheren mononukleären Blut zellen wäre aber interessant, da damit u. a. hämatologische Erkrankungen, endogene Retroviren, Viren oder die Zytokinex pression von Blutzellen bei entzündlichen/immunologischen Erkrankungen nachgewiesen werden könnten.Diagnostics using RNA from peripheral mononuclear blood but cells would be interesting because a. hematological Diseases, endogenous retroviruses, viruses or the cytokinex pression of blood cells in inflammatory / immunological Diseases could be detected.

Schwierigkeiten bei der Extraktion von RNA aus PMNB bereitet vor allem die Tatsache, daß der überwiegende Anteil (50-70%) der PMNB Granulozyten sind, die einen hohen RNAse-Gehalt und einen niedrigen RNA/DNA-Quotienten aufweisen. Die Verwen dung von herkömmlichen Extraktionsverfahren, in denen stark chaotrope Reagenzien wie z. B. Guanidiniumisothiocyanat einge setzt werden, führt bei der Extraktion von RNA aus PMNB zu unakzeptabel hohen DNA-Anteilen in der extrahierten RNA. Für Routineverfahren ist jedoch eine aufwendige Reinigung der mit DNA verunreinigten extrahierten RNA, beispielsweise über einen Cäsiumchloridgradienten, nicht praktikabel.Difficulty in extracting RNA from PMNB especially the fact that the vast majority (50-70%) The PMNB granulocytes are high in RNAse content and have a low RNA / DNA ratio. The use of conventional extraction processes in which strong chaotropic reagents such as B. guanidinium isothiocyanate results in the extraction of RNA from PMNB unacceptably high levels of DNA in the extracted RNA. For Routine procedures, however, involve laborious cleaning DNA contaminated extracted RNA, for example via a Cesium chloride gradient, not practical.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereitstel lung eines Verfahrens, das es ermöglicht, RNA und DNA weitge hend getrennt voneinander aus biologischen Proben und insbe sondere aus Blut zu extrahieren.The object of the present invention was therefore to provide a process that enables RNA and DNA to be widely separated from biological samples and esp extract from blood in particular.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Trennung und Isolierung von DNA enthaltenden und RNA ent haltenden Fraktionen aus in biologischen Proben enthaltenen Zellen, worin man die Zellen mit einer Lösung I behandelt, die eine Lyse der Zellen bewirkt, wobei die Zellkerne jedoch intakt bleiben und durch Zentrifugation die DNA enthaltenden Zellkerne von der überstehenden, RNA enthaltenden Lösung trennt. Bevorzugt umfaßt die Lösung I ein Detergenz, ein Reduktionsmittel, dazu optional einen RNAse-Inhibitor und einen Vanadylribonukleosidkomplex neben weiteren, gegebenen falls vorhandenen üblichen Puffersubstanzen und Hilfsstoffen. Zur Lyse wird bevorzugt eine Lösung I verwendet, die 5 bis 50 mM TRIS-HCl pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1% Nonidet-P-40 (NP-40), 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse-Inhibitor und 0 bis 50 mM Vana dylribonucleosidkomplex umfaßt. Besonders bevorzugt enthält die Lösung I 6 bis 14 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, 0,12 M bis 0,18 M NaCl, 1 bis 2 mM MgCl₂ und 0,3 bis 1% NP-40.According to the invention, this object is achieved by a method for the separation and isolation of DNA containing and RNA ent holding fractions from contained in biological samples Cells in which the cells are treated with a solution I which lysis of the cells causes, however, the cell nuclei remain intact and by centrifugation the DNA containing Nuclei from the supernatant solution containing RNA separates. Solution I preferably comprises a detergent Reducing agent, optionally an RNAse inhibitor and a vanadyl ribonucleoside complex in addition to other given if available usual buffer substances and auxiliary substances. A solution I which is 5 to 50 is preferably used for lysis mM TRIS-HCl pH 7 to 9, 0.1 to 1 M NaCl, 0.5 to 4 mM MgCl₂, 0.3 to 1% Nonidet-P-40 (NP-40), 0 to 200 mM dithiothreitol, 0 to 3000 U placental RNAse inhibitor and 0 to 50 mM Vana dylribonucleoside complex includes. Contains particularly preferably the solution I 6 to 14 mM Tris-HCl, pH 7 to 8, 0.12 M to 0.18 M NaCl, 1 to 2 mM MgCl₂ and 0.3 to 1% NP-40.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe extrahiert und in eine RNA- und eine DNA-Fraktion aufgetrennt werden. Es wird eine ausreichende Trennung von DNA und RNA auch ohne den Einsatz zusätzlicher arbeitsintensiver Reinigungsschritte erreicht. Es ist möglich, die RNA im wesentlichen frei von DNA-Verunreinigungen zu er halten. Mittels an den getrennten Fraktionen durchgeführter Konzentrationsbestimmungen, z. B. mittels optischer Dichtemes sungen, können die in einer biologischen Probe vorliegenden Mengen der jeweiligen Nukleinsäuren genau bestimmt werden. Dadurch wird eine quantitative Nukleinsäurediagnostik ermög licht.The method according to the invention allows nucleic acids a biological sample and extracted into an RNA and a DNA fraction can be separated. It will be sufficient Separation of DNA and RNA without the use of additional ones labor-intensive cleaning steps achieved. It is possible, the RNA is essentially free of DNA contaminants hold. By means of carried out on the separated fractions Concentration determinations, e.g. B. by means of optical density solutions that are present in a biological sample Amounts of the respective nucleic acids can be determined precisely. This enables quantitative nucleic acid diagnostics light.

Weiterhin ist die Qualität sowie die Quantität der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen RNA gegenüber RNA aus herkömmlichen Verfahren mit ähnlichem Zeit- und Arbeitsaufwand deutlich verbessert.Furthermore, the quality and quantity of the with the RNA obtained according to the inventive method from RNA conventional processes with a similar amount of time and effort clearly improved.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zudem die Extraktion und Trennung und Isolierung von RNA und DNA in kurzer Zeit und schafft somit die Voraussetzungen für eine routinemäßige Nukleinsäurediagnostik. The method according to the invention also enables extraction and separation and isolation of RNA and DNA in a short time and thus creates the conditions for a routine Nucleic acid diagnostics.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Gewinnung von Nu kleinsäuren aus Zellen biologischer Proben. Die Zellen können dabei aus Körperflüssigkeiten isoliert werden, oder es werden Zellen aus Zellkulturen oder Zellsuspensionen verwendet. Be vorzugt werden als Proben Blut, Blutzellen oder Zellkulturen und besonders bevorzugt Vollblut verwendet.The method according to the invention allows the extraction of nu small acids from cells of biological samples. The cells can thereby be isolated from body fluids, or will be Cells from cell cultures or cell suspensions are used. Be blood, blood cells or cell cultures are preferred as samples and particularly preferably whole blood used.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die zellulären Bestandteile einer biologischen Probe, z. B. die Zellen von Vollblut, aus der Probe abgetrennt. Man geht dabei von Blut aus oder verwendet die Blutzellen nach einer Plasma separation, die nach an sich bekannten Methoden ausgeführt werden kann. Die Abtrennung kann beispielsweise durch Zentri fugation in einer gekühlten Zentrifuge bei 1000 bis 2000 × g für 1 bis 5 Minuten erfolgen. Der Überstand wird dann abge trennt, und die zellulären Bestandteile werden vorzugsweise in einer Pufferlösung gewaschen. Dazu werden die zellulären Be standteile zunächst in einer Pufferlösung, die bevorzugt 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM Na-EDTA umfaßt, resuspendiert. Besonders bevorzugt enthält die Puffer lösung 135 bis 175 mM NH₄Cl, 8 bis 14 mM KHCO₃ und 0,8 bis 1,3 mM Na-EDTA. Diese Lösung bewirkt, daß rote Blutkörperchen, die für die RNA-Isolierung unbrauchbar sind, lysiert werden und nach erneuter Zentrifugation lediglich die weißen Blutzellen für die weiteren Verfahrensschritte verbleiben. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch möglich, kleine Blut mengen (bis ca. 500 µl) direkt mit dieser Pufferlösung (Ver hältnis ca. 1 : 2 bis 1 : 50) zu versetzen, wobei ebenfalls der Effekt erzielt wird, daß rote Blutzellen lysieren und bei einer nachfolgenden Zentrifugation lediglich die RNA- und DNA-haltigen weißen Blutzellen als Pellet erhalten werden.In a preferred embodiment of the invention, the cellular components of a biological sample, e.g. B. the Whole blood cells separated from the sample. You go there from blood or uses the blood cells after a plasma separation, which is carried out according to known methods can be. The separation can be done, for example, by centri fugation in a cooled centrifuge at 1000 to 2000 × g for 1 to 5 minutes. The supernatant is then removed separates, and the cellular components are preferably in a buffer solution. For this purpose, the cellular loading initially in a buffer solution, preferably 100 to 200 mM NH₄Cl, 5 to 20 mM KHCO₃ and 0.5 to 2 mM Na-EDTA includes, resuspended. The buffer particularly preferably contains solution 135 to 175 mM NH₄Cl, 8 to 14 mM KHCO₃ and 0.8 to 1.3 mM Na EDTA. This solution causes red blood cells to die are unusable for RNA isolation, are lysed and after centrifugation only the white blood cells remain for the further process steps. It is in Within the scope of the present invention also possible small blood quantities (up to approx. 500 µl) directly with this buffer solution (Ver Ratio approx. 1: 2 to 1: 50), also the Effect is achieved that red blood cells lyse and a subsequent centrifugation only the RNA and DNA-containing white blood cells can be obtained as a pellet.

Anschließend werden die zellulären Bestandteile abgetrennt. Dies geschieht bevorzugt dadurch, daß die Suspension für 1 bis 10 Minuten auf Eis gelagert wird und anschließend bei 1000 bis 2000 × g zentrifugiert wird. Der wäßrige Überstand wird daraufhin entfernt, ohne das Zellpellet zu zerstören. The cellular components are then separated. This is preferably done in that the suspension for 1 to Is stored on ice for 10 minutes and then at 1000 to 2000 × g is centrifuged. The aqueous supernatant becomes then removed without destroying the cell pellet.

Die auf diese Weise aus Blut erhaltenen Zellen oder Zellen aus Zellkulturen werden dann mit einer Lösung behandelt, die eine Lyse der Zellen bewirkt, bei der die Zellkerne intakt bleiben. Anschließend können DNA und RNA getrennt werden, da sich die DNA in den bei der Lyse intakt gebliebenen Zellkernen befin det, während die RNA in der Lösung vorliegt. Die Abtrennung erfolgt bevorzugt in einer gekühlten Zentrifuge bei 500 bis 3000 × g, vorzugsweise 1000-1500 × g für 3 bis 5 Minuten. Das Pellet der Zentrifugation, das die Zellkerne der Zellen (z. B. Blutzellen) und somit die DNA enthält, kann direkt wei terverarbeitet werden oder bei 20°C oder -80°C gelagert wer den.The cells or cells obtained from blood in this way Cell cultures are then treated with a solution that is one Lysis of the cells causes the cell nuclei to remain intact. Then DNA and RNA can be separated because the DNA in the cell nuclei that remained intact during lysis det while the RNA is in the solution. The separation preferably takes place in a cooled centrifuge at 500 to 3000 × g, preferably 1000-1500 × g for 3 to 5 minutes. The pellet of centrifugation that contains the cell nuclei of the cells (e.g. blood cells) and thus contains the DNA, can be directly white be processed or stored at 20 ° C or -80 ° C the.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird nach der Trennung von DNA ent haltenden Zellkernen und RNA enthaltender Lösung die letztere mit einer Lösung II versetzt, welche ein Denaturierungsmittel, ein Detergens und weitere übliche Pufferkomponenten umfaßt. Der die RNA enthaltende Überstand wird bevorzugt mit etwa dem gleichen Volumen an Lösung II versetzt. Die Lösung II kann beispielsweise 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdo decylsulfat (SDS), 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 10 mM TRIS-HCl pH 7 bis 8 umfassen. Bevorzugt enthält die Lösung II 6 bis 8 M Harnstoff, 0,5 bis 2% SDS, 0,3 bis 0,5 M NaCl, 5 bis 15 mM Na-EDTA und 5 bis 10 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8.According to the invention, preference is given to separating DNA holding cell nuclei and RNA containing solution the latter mixed with a solution II, which is a denaturing agent, a detergent and other conventional buffer components. The supernatant containing the RNA is preferably about equal volume of solution II added. Solution II can for example 5 to 8.5 M urea, 0.1 to 3% sodium do decyl sulfate (SDS), 0.2 to 1 M NaCl, 2 to 20 mM EDTA and 5 up to 10 mM TRIS-HCl pH 7 to 8. Preferably contains the Solution II 6 to 8 M urea, 0.5 to 2% SDS, 0.3 to 0.5 M NaCl, 5 to 15 mM Na-EDTA and 5 to 10 mM Tris-HCl, pH 7 to 8th.

Aus dem gegebenenfalls mit Lösung II versetzten Überstand kann die RNA nach an sich bekannten Methoden gewonnen werden. Dazu wird beispielsweise das gesamte Flüssigkeitsvolumen mit einer geeigneten RNA-bindenden Matrix zusammengebracht, von der die RNA dann selektiv wieder abgewaschen werden kann. Es ist auch möglich, die RNA auf herkömmliche Weise mit einem etwa glei chen Volumen eines Lösungsmittels, bestehend aus Phenol/Chlo roform/Isoamylalkohol, beispielsweise mit einem Volumenver hältnis von etwa 25/24/1, und anschließend mit einem etwa gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol, beispielsweise mit einem Volumenverhältnis von etwa 24/1 zu extrahieren. Die RNA kann dann in einem 2- bis 2½fachen Volumen 100%igen Ethanol oder in einem etwa gleichen Volumen Isopropanol gefällt wer den. Die Konzentrierung des Präzipitats kann durch Zentrifuga tion bei 10 000 bis 100 000 × g für 5 bis 30 Minuten erfolgen.From the supernatant, which may have been mixed with solution II the RNA can be obtained by methods known per se. To for example, the total volume of liquid with a suitable RNA-binding matrix, of which the RNA can then be selectively washed off again. It is also possible to use the RNA in a conventional manner with an approximately equal Chen volume of a solvent consisting of phenol / chloro roform / isoamyl alcohol, for example with a volume ver Ratio of about 25/24/1, and then with about equal volume of chloroform / isoamyl alcohol, for example with a volume ratio of about 24/1. The RNA can then in a 2 to 2½ times volume 100% ethanol or who is precipitated in an approximately equal volume of isopropanol the. The concentration of the precipitate can be determined by centrifugation tion at 10,000 to 100,000 × g for 5 to 30 minutes.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Gewinnung von Nukleinsäuren aus Probenvolumen zwischen 10 µl und 10 ml, ohne daß ihre Integrität beeinträchtigt wird, und ermöglicht eine anschließende enzymatische biochemische und molekularbiolo gische Verarbeitung der extrahierten Moleküle. Bevorzugt wird ein Probevolumen zwischen 50 µl und 5 ml verwendet.The method according to the invention enables the extraction of Nucleic acids from sample volumes between 10 µl and 10 ml, without that their integrity is compromised and enables one subsequent enzymatic biochemical and molecular biolo processing of the extracted molecules. Is preferred a sample volume between 50 µl and 5 ml is used.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung einen Reagenzienkit zur Auftrennung von DNA enthaltenden und RNA enthaltenden Fraktion aus Zellen oder Zellen enthaltenden biologischen Proben, wobei der Reagenzienkit eine Lösung I enthält, umfas send ein Detergens, ein Reduktionsmittel, optional einen RNAse-Inhibitor und einen Vanadylribonucleosidkomplex. Bevor zugt umfaßt die Lösung I 5 bis 20 mM TRIS-HCl, pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1% Nonidet-P-40, 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse- Inhibitor und 0 bis 50 mM Vanadylribonucleosidkomplex. Beson ders bevorzugt enthält die Lösung I 6 bis 14 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, 0,12 M bis 0,18 M NaCl, 1 bis 2 mM MgCl₂ und 0,3 bis 1% NP-40.The present invention further comprises a reagent kit for the separation of DNA containing and RNA containing Fraction from cells or biological containing cells Samples, wherein the reagent kit contains a solution I send a detergent, a reducing agent, optionally one RNAse inhibitor and a vanadyl ribonucleoside complex. Before solution I comprises 5 to 20 mM TRIS-HCl, pH 7 to 9, 0.1 to 1 M NaCl, 0.5 to 4 mM MgCl₂, 0.3 to 1% Nonidet-P-40, 0 up to 200 mM dithiothreitol, 0 to 3000 U placental RNAse Inhibitor and 0 to 50 mM vanadyl ribonucleoside complex. Especially more preferably, the solution I contains 6 to 14 mM Tris-HCl, pH 7 up to 8.0, 0.12 M to 0.18 M NaCl, 1 to 2 mM MgCl₂ and 0.3 to 1% NP-40.

Bevorzugt enthält der Reagenzienkit zusätzlich eine Lösung II, umfassend 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdodecyl sulfat, 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 20 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, mit der die abgetrennte RNA behandelt werden kann. Bevorzugt enthält die Lösung II 6 bis 8 M Harn stoff, 0,5 bis 2% SDS, 0,3 bis 0,5 M NaCl, 5 bis 15 mM Na- EDTA und 5 bis 10 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8. Weiterhin kann eine Pufferlösung, die bei der Gewinnung von Zellen aus Blut vor teilhaft verwendet werden kann, umfassend 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM EDTA enthalten sein. Diese Pufferlösung bewirkt eine Lyse von roten Blutzellen, weiße Blutzellen bleiben intakt. Besonders bevorzugt enthält die Pufferlösung 135 bis 175 mM NH₄Cl, 8 bis 14 mM KHCO₃ und 0,8 bis 1,3 mM Na-EDTA.The reagent kit preferably additionally contains a solution II, comprising 5 to 8.5 M urea, 0.1 to 3% sodium dodecyl sulfate, 0.2 to 1 M NaCl, 2 to 20 mM EDTA and 5 to 20 mM Tris-HCl, pH 7 to 8, with which the separated RNA is treated can be. Solution II preferably contains 6 to 8 M urine substance, 0.5 to 2% SDS, 0.3 to 0.5 M NaCl, 5 to 15 mM Na- EDTA and 5 to 10 mM Tris-HCl, pH 7 to 8. Furthermore, one Buffer solution used in the extraction of cells from blood can be used in part, comprising 100 to 200 mM NH₄Cl, 5 to 20 mM KHCO₃ and 0.5 to 2 mM EDTA may be included. This Buffer solution causes lysis of red blood cells, white ones Blood cells remain intact. The contains particularly preferably Buffer solution 135 to 175 mM NH₄Cl, 8 to 14 mM KHCO₃ and 0.8 to 1.3 mM Na-EDTA.

Weiterhin kann der Reagenzienkit Mittel zur Extraktion von RNA aus wäßrigen Flüssigkeiten, z. B. eine RNA-bindende Matrix oder geeignete Lösungsmittelgemische, wie beispielsweise ein Ge misch aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol mit einem Volumen verhältnis von 25/24/1 und ein Gemisch aus Chloroform/Iso amylalkohol mit einem Volumenverhältnis von 24/1 enthalten.Furthermore, the reagent kit can be used to extract RNA from aqueous liquids, e.g. B. an RNA-binding matrix or suitable solvent mixtures, such as a Ge mix of phenol / chloroform / isoamyl alcohol with one volume ratio of 25/24/1 and a mixture of chloroform / iso Contain amyl alcohol with a volume ratio of 24/1.

Die Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung eines solchen Reagenzienkits in einem wie oben beschriebenen Verfahren.The invention further includes the use of such Reagent kits in a procedure as described above.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläu tert:The invention is illustrated by the following examples tert:

example 1 Obtaining plasma, nuclear pellets with genomic DNA and cytoplasmic RNA from 5 ml whole blood

5 ml EDTA-Vollblut wurden für 3 min bei 1200 × g bei 4°C in 15 ml-Röhrchen zentrifugiert und der plasmatische Überstand entfernt. Dieser kann bei -20°C zur weiteren Verarbeitung, z. B. zur Proteinbestimmung, gelagert werden.5 ml of EDTA whole blood were in for 3 min at 1200 × g at 4 ° C. 15 ml tubes centrifuged and the plasmatic supernatant away. This can be used at -20 ° C for further processing, e.g. B. for protein determination, stored.

Das das Pellet enthaltende Röhrchen wurde auf 14 ml mit einer Pufferlösung, umfassend 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM EDTA, aufgefüllt, gut durchmischt und für 5 min auf Eis gestellt. Der Überstand wurde vollständig abdekan tiert und das verbleibende Zellpellet wurde in 1 ml einer Lösung I, umfassend 5 bis 20 mM TRIS-HCl, pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1% Nonidet-P-40, 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse-Inhibi tor und 0 bis 50 mM Vanadylribonucleosidkomplex resuspendiert. Die Suspension wurde für 5 min bei 1700 × g zentrifugiert. Das Zellkernpellet und der Überstand wurden getrennt. Das Zell kernpellet enthält die genomische DNA und kann bis zur weite ren Verarbeitung, z. B. für DNA-Analysen, bei -20°C gelagert werden.The tube containing the pellet was made up to 14 ml with a Buffer solution comprising 100 to 200 mM NH₄Cl, 5 to 20 mM KHCO₃ and 0.5 to 2 mM EDTA, filled up, mixed well and for 5 min put on ice. The supernatant was completely decanted and the remaining cell pellet was in 1 ml of a Solution I comprising 5 to 20 mM TRIS-HCl, pH 7 to 9, 0.1 to 1 M NaCl, 0.5 to 4 mM MgCl₂, 0.3 to 1% Nonidet-P-40, 0 to 200 mM dithiothreitol, 0 to 3000 U placental RNAse inhibi tor and 0 to 50 mM vanadyl ribonucleoside complex resuspended. The suspension was centrifuged for 5 min at 1700 x g. The Nuclear pellet and the supernatant were separated. The cell Kernpellet contains the genomic DNA and can extend up to ren processing, e.g. B. for DNA analysis, stored at -20 ° C. will.

Der Überstand wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben, das 1 ml Lösung II, umfassend 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdodecylsulfat, 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 20 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, enthielt. Die so entstandene Lösung wurde zur RNA-Gewinnung den üblichen Extraktions- und Fällungsverfahren mit organischen Lösungsmitteln unterzogen.The supernatant was placed in a reaction vessel containing 1 ml Solution II comprising 5 to 8.5 M urea, 0.1 to 3% Sodium dodecyl sulfate, 0.2 to 1 M NaCl, 2 to 20 mM EDTA and 5 to 20 mM Tris-HCl, pH 7-8. The resulting one Solution was the usual extraction and for RNA extraction Precipitation processes with organic solvents.

Alternativ dazu kann der Überstand von Lösung I, gegebenen falls zusammen mit Lösung II zur RNA-Gewinnung auch mit einer geeigneten RNA-bindenden Matrix zusammengebracht werden, von der die RNA durch Waschschritte wieder eluiert wird.Alternatively, the supernatant from solution I can be given if together with solution II for RNA extraction also with a appropriate RNA binding matrix are brought together by which the RNA is eluted again by washing steps.

Example 2 Extraction of nuclear pellets with genomic DNA and cyto plasmatic RNA from 100 µl whole blood and isolation of the RNA from here

Durch dieses Beispiel soll gezeigt werden, daß das erfindungs gemäße Verfahren auch die Verwendung von Mikromengen an Blut als Ausgangsmaterial erlaubt.This example is intended to show that the invention procedures also include the use of microns of blood allowed as starting material.

Es wurden die gleichen Lösungen I, II und Pufferlösung wie in Beispiel 1 verwendet.The same solutions I, II and buffer solution as in Example 1 used.

In ein geeignetes Reaktionsgefäß auf Eis oder bei Raumtempera tur wurden 1,5 ml Pufferlösung eingebracht, zu der 100 µl EDTA-Vollblut pipettiert wurden. Das Blut wurde sorgfältig mit der Lösung durchmischt und das Gemisch 5 Minuten auf Eis gela gert. Die Zellsuspension wurde anschließend für 3 min 1000 × g bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde abgetrennt und in 700 µl Lösung I (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,65% NP-40) resuspendiert. Die Suspension wurde bei 1700 × g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand und das Zell kernpellet wurden getrennt und das Zellkernpellet bei -80°C zur weiteren Verarbeitung, z. B. für DNA-Analyse, gelagert. Der Überstand wurde in ein Reaktionsgefäß mit dem gleichen Volumen wassergesättigtes Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol mit einem Volumenverhältnis von 25/24/1 gegeben, 1 Minute geschüttelt (Vortex) und für 3 Minuten bei 12 000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde anschließend mit dem gleichen Volu men Chloroform/Isoamylalkohol mit einem Volumenverhältnis von 24/1 zusammengegeben, 30 Sekunden geschüttelt und 5 Minuten bei 15 000 × g zentrifugiert. Der wäßrige Überstand wurde mit gleichem Volumen Lösung II (7 M Harnstoff, 1% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) versetzt, gevortext und sofort nach Zugabe des 2½fachen Volumens an 100%igem Ethanol 20 Minuten lang bei 15 000 × g und 4°C zentrifugiert.In a suitable reaction vessel on ice or at room temperature 1.5 ml of buffer solution were added, to which 100 μl EDTA whole blood were pipetted. The blood was carefully with the solution is mixed and the mixture is left on ice for 5 minutes device. The cell suspension was then 1000 × g for 3 min Centrifuged at 4 ° C. The pellet was separated and in 700 µl solution I (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.65% NP-40) resuspended. The suspension was at Centrifuged 1700 × g for 5 min. The supernatant and the cell nuclear pellet were separated and the nuclear pellet at -80 ° C for further processing, e.g. B. for DNA analysis, stored. Of the The supernatant was placed in a reaction vessel with the same volume water-saturated phenol / chloroform / isoamyl alcohol with a Given volume ratio of 25/24/1, shaken for 1 minute (Vortex) and centrifuged for 3 minutes at 12,000 × g. Of the The supernatant obtained was then in the same volume chloroform / isoamyl alcohol with a volume ratio of Combined 24/1, shaken for 30 seconds and 5 minutes Centrifuged at 15,000 x g. The aqueous supernatant was with equal volume of solution II (7 M urea, 1% SDS, 0.35 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) added, vortexed and immediately after adding 2½ times the volume of 100% Centrifuged ethanol at 15,000 xg and 4 ° C for 20 minutes.

Example 3 Extraction of cytoplasmic RNA from cell cultures

Eine in 6-Well-Platten wachsende Zellkultur wurde mit einer geeigneten Waschlösung gewaschen, von der gesamten Flüssigkeit befreit und anschließend mit 200 µl Lösung I überschichtet. Die Zellkulturplatten wurden für 10 Minuten auf einem Rota tionsschüttler geschüttelt und die Flüssigkeit anschließend vollständig abpipettiert. Die weitere Verarbeitung erfolgte, wie in Beispiel 2 beschrieben.A cell culture growing in 6-well plates was mixed with a suitable washing solution, washed from all the liquid freed and then covered with 200 ul solution I. The cell culture plates were placed on a Rota for 10 minutes shaker and then the liquid completely pipetted off. The further processing took place as described in Example 2.

Claims

1. A process for the separation and isolation of DNA containing the and RNA-containing fractions from cells contained in biological samples, characterized in that the cells are treated with a solution I which brings about a lysis of the cells, but the cell nuclei remain intact, and by centrifugation the DNA containing the cell nuclei is separated from the supernatant containing RNA.

2. The method according to claim 1, characterized, that solution I is a detergent and a reducing agent in addition to any other usual pufs that may be present substances and auxiliaries and optionally an RNAse Contains inhibitor and a vanadyl ribonucleoside complex.

3. The method according to claim 2, characterized, that the solution I 5 to 20 mM Tris-HCl, pH 7 to 9, 0.1 to 1 M NaCl, 0.5 to 4 mM MgCl₂, 0.3 to 1 & Nonidet- P-40, 0 to 200 mM dithiothreitol, 0 to 3000 U placental RNAse inhibitor and 0 to 50 mM vanadyl ribonucleoside contains complex.

4. The method according to claim 3, characterized, that the solution I 6 to 14 mM Tris-HCl, pH 7 to 8, 0.12 to 0.18 M NaCl, 1 to 2 mM MgCl₂ and 0.3 to 1% NP-40 contains.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that after the separation of DNA-containing cell nuclei and RNA containing solution, the latter with a solution II, which is a denaturing agent, a detergent contains gens and other common buffer components.

6. The method according to claim 5, characterized, that a solution II containing 5 to 8.5 M urea, 0.1 to 3% sodium dodecyl sulfate, 0.2 to 1 M NaCl, 2 to Use 20 mM EDTA and 5 to 20 mM TRIS-HCl, pH 7 to 8 det.

7. The method according to claim 6, characterized, that solution II 6 to 8 M urea, 0.5 to 2% SDS, 0.3 to 0.5 M NaCl, 5 to 15 mM Na-EDTA and 5 to 10 mM Contains Tris-HCl, pH 7 to 8.

8. The method according to claim 5, 6 or 7, characterized, that the RNA-containing supernatant solution with about added the same volume of solution II.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the supernatant solution or the supernatant solution, which is mixed with solution II was brought together with an RNA binding matrix by the RNA can be washed off selectively, and on this way isolated the RNA.

10. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized, that the supernatant solution or the supernatant solution, which is mixed with solution II was extracted in a manner known per se.

11. The method according to claim 10, characterized, that with phenol / chloroform / isoamyl alcohol and closing with chloroform / isoamyl alcohol, namely each with approximately the same volume, extracted.

12. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that cells are isolated from body fluids were, or cells from cell cultures or cell suspension used.

13. The method according to claim 12, characterized, that one starts from blood and according to known Me plasma and the blood cells len used.

14. The method according to claim 13, characterized, that after the plasma separation the blood cells with a buffer solution washes.

15. The method according to claim 14, characterized, that the buffer solution 100 to 200 mM NH₄Cl, 5 to 20 mM Contains KHCO₃ and 0.5 to 2 mM EDTA.

16. The method according to claim 12, characterized, that you start with whole blood and this with a puf fer solution containing 100 to 200 mM NH₄Cl, 5 to 20 mM KHCO₃ and 0.5 to 2 mM EDTA, added and then by Centrifugation isolated the white blood cells and continued used.

17. The method according to claim 15 or 16, characterized, that the buffer solution 135 to 175 mM NH₄Cl, 8 to 14 mM Contains KHCO₃ and 0.8 to 1.3 Na-EDTA.

18. Reagent kit for the extraction and separation of DNA ent holding and RNA containing fractions from from biolo cells obtained from samples, characterized, that a solution I comprising a detergent, a reduc tion agent and optionally an RNAse inhibitor and / or a vanadyl ribonucleoside complex is included.

19. Reagent kit according to claim 18, characterized, that the solution I 5 to 20 mM Tris-HCl, pH 7 to 9, 0.1 up to 1 M NaCl, 0.5 to 4 mM MgCl₂, 0.3 to 1% nonidet P-40, 0 to 200 mM dithiothreitol, 0 to 3000 U placental RNAse inhibitor and 0 to 50 mM vanadyl ribonucleoside contains complex.

20. reagent kit according to claim 19, characterized, that the solution I 6 to 14 mM Tris-HCl, pH 7 to 8, 0.12 to 0.18 M NaCl, 1 to 2 mM MgCl₂ and 0.3 to 1% NP-40 contains.

21. reagent kit according to one of claims 18 to 20, characterized, that it further comprises a solution II, which 5 to 8.5 M urea, 0.1 to 3% sodium dodecyl sulfate, 0.2 to 1 M NaCl, 2 to 20 mM EDTA and 5 to 20 mM Tris-HCl, pH 7 contains up to 8.

22. Reagent kit according to claim 21, characterized, that solution II 6 to 8 M urea, 0.5 to 2% SDS, 0.3 to 0.5 M NaCl, 5 to 15 mM Na-EDTA and 5 to 10 mM Contains Tris-HCl, pH 7 to 8.

23. reagent kit according to one of claims 18 to 22, characterized, that it additionally comprises a buffer solution which is 100 to 200 mM NH₄Cl, 5 to 20 mM KHCO₃ and 0.5 to 2 mM EDTA contains.

24. reagent kit according to claim 23, characterized, that the buffer solution 135 to 175 mM NH₄Cl, 8 to 14 mM Contains KHCO₃ and 0.8 to 1.3 Na-EDTA.

25. reagent kit according to one of claims 18 to 24, characterized, that it additionally contains an RNA-binding matrix.

26. Use of a reagent kit according to claims 18 to 25 in a process according to claims 1 to 17.