DE19600357C1

DE19600357C1 - DNA sequence encoding a phosphoenolpyruvate phosphate translocator, plasmids, bacteria, yeasts and plants containing this transporter

Info

Publication number: DE19600357C1
Application number: DE19600357A
Authority: DE
Inventors: Ulf-Ingo Prof Dr Fluegge; Andreas Dr Weber; Karsten Dr Fischer
Original assignee: Individual
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1996-01-08
Filing date: 1996-01-08
Publication date: 1997-02-13
Anticipated expiration: 2016-01-09
Also published as: AU1310897A; WO1997025346A1

Abstract

A DNA sequence from Brassica oleracea var. botrytis (cauliflower) is disclosed which contains the coding region of a phosphoenolpyruvate-phosphate transporter whose insertion into a plant genome modifies the formation and transmission of carbon basic structures for the synthesis of phenolic compounds in transgenic plants. Also disclosed are plasmides, yeast and bacteria which contain said DNA sequence, as well as transgenic plants in which changes in the activity of the phosphoenolpyruvate-phosphate transporter and thereby changes in the content of phenolic compounds, above all aromatic amino acids and flavonoids, are caused by the insertion of the DNA sequence. Also disclosed are transgenic plants whose defence response against plant pathogenic agents and UV radiation tolerance are influenced by increasing their content of phenolic compounds, the use of the disclosed sequence of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator to identify related translocators from other plants by low stringency hybridisation or PCR techniques, and the use of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator as target for herbicides.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz aus Brassca oleracea var. botrytis (Blumenkohl), die die Kodierregion eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Transporters enthält, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Synthese phenolischer Verbindungen in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenz, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenz Veränderungen der Aktivität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Transporters und somit Änderungen im Gehalt phenolischer Verbindungen, vor allem aromatischer Aminosäuren und Flavonoiden, hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die durch die Erhöhung des Gehaltes an phenolischen Verbindungen in ihrer Fähigkeit der Abwehr von pflanzlichen Pathogenen und der Toleranz gegenüber UV-Strahlung beeinflußt sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benutzung der beschriebenen Sequenz des Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus anderen Pflanzen durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators als Ziel ("Target") für Herbizide.The present invention relates to a DNA sequence from Brassica oleracea var. botrytis (cauliflower), which is the coding region of a phosphoenolpyruvate phosphate Transporters, whose introduction into a plant genome contains the formation and Transmission of carbon skeletons for the synthesis of phenolic compounds in transgenic plants, containing plasmids, yeasts and bacteria this DNA sequence, as well as transgenic plants, where by introduction the DNA sequence changes the activity of the phosphoenolpyruvate phosphate Transporters and thus changes in the content of phenolic compounds, before all aromatic amino acids and flavonoids. Farther The invention relates to transgenic plants by increasing the content on phenolic compounds in their ability to repel plant Pathogens and the tolerance to UV radiation are affected. As well the invention relates to the use of the described sequence of the phosphoenolpyruvate Phosphate translocator for identifying related translocators from other plants by low stringency or by hybridization PCR techniques, as well as the use of phosphoenolpyruvate phosphate translocator as a target for herbicides.

Neben den primären Metaboliten wie Zuckern, Aminosäuren etc. produzieren Pflanzen eine Fülle sogenannter sekundärer Metabolite, die zunächst keinen direkten Bezug zum Wachstum und zur Entwicklung der Pflanze zu besitzen scheinen. Obwohl erst für einige wenige Stoffklassen die Funktion dieser Metabolite bekannt ist, sind diese für die Pflanzen ohne Zweifel von außerordentlicher Bedeutung. Angeführt seien die Produktion von Blütenfarbstoffen, Duftstoffen, Alkaloiden und Giftstoffen (Phytoalexine), die der Pflanze einen Schutz gegen Tierfraß und Pathogenbefall verleihen. Gemäß ihrer Biosynthesewege lassen sich die sekundären Metabolite in drei Gruppen einteilen:Besides the primary metabolites like sugars, amino acids etc. produce Plants a wealth of so-called secondary metabolites, which initially no direct It seems that they are related to the growth and development of the plant. Although the function of these metabolites is only known for a few substance classes are undoubtedly of paramount importance to the plants. led be the production of flower dyes, fragrances, alkaloids and Toxins (phytoalexins) that give the plant protection against animal feeding and pathogens. According to their biosynthetic pathways, the secondary metabolites can be divide into three groups:

- Terpene (basic building block: isoprene),
nitrogenous compounds (such as alkaloids, basic building block: amino acids),
- Phenolic compounds, which via the Shikimat way and the Mevolonate / malonate metabolic pathway.

Gerade die phenolischen Verbindungen bilden eine große, sehr heterogene Gruppe von Substanzen mit unterschiedlichen Aufgaben in der Pflanze (Übersichtsartikel: Herrmann, 1995, Plant Cell 7, 907-919; Schmid und Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749). Hierzu zählen die folgenden Substanzklassen:The phenolic compounds in particular form a large, very heterogeneous group of substances with different functions in the plant (review article: Herrmann, 1995, Plant Cell 7, 907-919; Schmid and Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749). These include the following classes of substances:

I. The aromatic amino acids phenylalanine, tryptophan and tyrosine, wherein the first two amino acids are essential for humans and animals, d. H. from these can not be synthesized and therefore ingested with food Need to become.
II. Starting from tryptophan, the plant hormone auxin is synthesized, which participates in the regulation of a number of growth processes in the plant is.
III. Phenolcarbonsäuren as the cinnamic acid, which in turn the starting compounds for the synthesis of other classes of phenolic compounds are as z. B .:
IV. Lignin, a very complex polymer of various phenolic carboxylic acids, which is stored in the plant cell walls and their lignification leads (pulp), a process that gives the cells a high tensile and compressive strength gives. The proportion of lignin on the cell wall material can be up to 35%, d. H. Lignin accounts for a significant proportion of the total biomass.
Salicylic acid, which plays an important role in the induction of defense against Pathogens plays.
VI. Coumarins, which cause the characteristic odor of some plant species (Woodruff).
VII. Quinones, whose significance is mainly in their function as electron transfer agents in the electron transport chains of mitochondria and chloroplasts.
VIII. Tanning agents, simple and polymeric phenols, whose name is different from their use derives from leather tanning. In the plant tannins protect together with other substances against the infestation of microorganisms, in particular by incorporation into the cell walls.
IX. Flavonoids, a large group of substances with a flavan skeleton, which are increasingly formed under stress, z. B. to ward off pathogens and Predators and for protection against UV radiation. In addition, flavonoids are as Signaling substances identified in the formation of root nodules in legumes which plays an important role in the nitrogen supply of these plants play. This group also includes the anthocyanidins, which are used for staining of flowers and fruits in numerous plants are responsible.

Die phenolischen Verbindungen werden in Pflanzen im wesentlichen über den Shikimat-Weg synthetisiert, dessen Bedeutung schon dadurch ersichtlich wird, daß, global gesehen, 20% des im Chloroplasten fixierten Kohlenstoffs in diesen Stoffwechselweg einfließen können (Haslam, 1993, in Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites. (Chichester, John Willey and Sons)).The phenolic compounds are found in plants substantially above the Shikimate way synthesized, the meaning of which is already apparent from the fact that, globally, 20% of the chloroplast-fixed carbon in this pathway (Haslam, 1993, in Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites. (Chichester, John Willey and Sons)).

Der Shikimat-Syntheseweg beginnt mit der Synthese von 3-Desoxyarabinoheptulosonsäure- 7-phosphat, einem Kondensationsprodukt aus Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat. Das entsprechende Enzym, die DAHP-Synthase, wird durch Pathogenbefall oder auch mechanische Verwundungen der Pflanze induziert, was zu einer erhöhten Bereitstellung von Chorismat (dem Endprodukt des Shikimat-Weges) als Vorläufer der Biosynthese von Lignin führt. Die Lignifizierung von Zellwänden ist u. a. eine Strategie der Pflanzen zur Pathogenabwehr. Transgene Pflanzen, in denen die Aktivität der DAHP-Synthase über einen anti-sense Ansatz reduziert wurde, wiesen Defekte in der Ligninbiosynthese auf (Jones et al., 1995, Plant Physiol., im Druck).The shikimate pathway begins with the synthesis of 3-desoxyarabinoheptulosic acid 7-phosphate, a condensation product of erythrose-4-phosphate and Phosphoenolpyruvate. The corresponding enzyme, the DAHP synthase, is going through Pathogen infestation or even mechanical wounds of the plant induced, causing an increased provision of chorismate (the end product of the shikimate path) as a precursor of the biosynthesis of lignin. The lignification of cell walls is u. a. a strategy of plants for pathogen defense. Transgenic plants, in which reduces the activity of DAHP synthase via an anti-sense approach defects in lignin biosynthesis (Jones et al., 1995, Plant Physiol. in print).

Das erste Substrat der DAHP-Synthase-Reaktion, Erythrose-4-phosphat, ist ein Zwischenprodukt des im Plastiden stattfindenden oxidativen bzw. reduktiven Pentosephosphatweges. Phosphoenolpyruvat ist Substrat dieser und einer zweiten Reaktion innerhalb des Shikimat-Weges. In der von der 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphat Synthase (EPSP-Synthase) katalysierten Reaktion wird 3-Enolpyruvylshikimat- 5-phosphat aus Shikimat-3-phosphat und Phosphoenolpyruvat gebildet. Die EPSP-Synthase ist das am besten untersuchte Enzym des gesamten Shikimat- Weges und das Target für das häufig eingesetzte Herbizid Glyphosat (Round-up, Monsanto). Überexpression der EPSP-Synthase in transgenen Pflanzen bzw. das Einbringen einer bakteriellen und Glyphosat-unempfindlichen EPSP-Synthase bewirkt eine (weitgehende) Herbizid-Resistenz/Toleranz (Stalker et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 4724-4728; Smart et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 16338-16346). Die durch Glyphosat bewirkte Hemmung kann interessanterweise durch Phosphoenolpyruvat aufgehoben werden, das hier als Kompetitor in die Reaktion eingeht.The first substrate of the DAHP synthase reaction, erythrose 4-phosphate, is a Intermediate of taking place in the plastid oxidative or reductive Pentose phosphate pathway. Phosphoenol pyruvate is substrate of this and a second Reaction within the shikimate way. In the from the 5-enolpyruvylshikimate-3 phosphate synthase (EPSP synthase) catalyzed reaction is 3-enolpyruvylshikimat- 5-phosphate formed from shikimate-3-phosphate and phosphoenolpyruvate. EPSP synthase is the best studied enzyme in the entire shikimate Way and the target for the frequently used herbicide glyphosate (round-up, Monsanto). Overexpression of the EPSP synthase in transgenic plants or the introduction a bacterial and glyphosate-insensitive EPSP synthase causes (broad) herbicide resistance / tolerance (Stalker et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 4724-4728; Smart et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 16338-16346). The by glyphosate Interestingly, inhibition caused by phosphoenolpyruvate can be reversed become a competitor in this reaction.

Eukaryontische Zellen und deren Stoffwechsel sind stark kompartimentiert, wobei die einzelnen Kompartimente jeweils unterschiedliche Funktionen in der Zelle übernehmen. Die Enzyme des Shikimat-Weges sind im Chloroplasten lokalisiert. Diese Organelle sind von zwei Lipiddoppelschichtmembranen umschlossen, deren äußere Molekularsiebcharakter hat und Verbindungen bis zu einer Größe von ca. 10 kDa frei passieren läßt (Flügge und Benz, 1984, FEBS Lett. 169, 85-89). Die innere Membran ist permeabel für einige kleinere Verbindungen wie Wasser, Kohlendioxid, Sauerstoff und Nitrit, nicht jedoch für größere geladene Moleküle wie zum Beispiel Phosphoenolpyruvat. Eukaryotic cells and their metabolism are highly compartmentalized, with the individual compartments each take on different functions in the cell. The enzymes of the shikimate pathway are localized in the chloroplast. These Organelles are enclosed by two lipid bilayer membranes whose outer Molecular sieve character has and compounds up to a size of about 10 kDa free pass (Flügge and Benz, 1984, FEBS Lett. 169, 85-89). The inner membrane is permeable to some minor compounds such as water, carbon dioxide, oxygen and nitrite, but not for larger charged molecules such as phosphoenol pyruvate.

Ob der Shikimat-Weg auch in anderen Kompartimenten wie dem Cytosol vorkommt, ist bislang unklar. Die chloroplastidäre Lokalisation zeigt sich auch daran, daß alle bislang klonierten Enzyme des Shikimat-Weges N-terminale und für Plastiden charakteristische Präsequenzen aufweisen, welche die Informationen für den Eintransport der im Zellkern kodierten Proteine enthalten. Gleichwohl kann das Vorhandensein cytosolischer Isoformen nicht völlig ausgeschlossen werden (Mousdale und Coggins, 1985, Planta 163, 241-249; Schmid und Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749).Whether the shikimate path also occurs in other compartments such as the cytosol, is so far unclear. The chloroplastidary localization is also evident that all previously cloned enzymes of the shikimate path N-terminal and for Have plastid characteristic pre-sequences which provide the information for contain the transport of nuclear-encoded proteins. Nevertheless, that can Presence of cytosolic isoforms can not be completely ruled out (Mousdale and Coggins, 1985, Planta 163, 241-249, Schmid and Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749).

Die Herkunft des in den Plastiden benötigten Phosphoenolpyruvates ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Phopsphoenolpyruvat kann in der Zelle durch verschiedene Stoffwechselreaktionen bereitgestellt werden. Zum einen wird es in der Glykolyse aus 3-Phosphoglycerat gebildet (Phosphoglycerat-Mutase/Enolase) und kann andererseits, im anabolen Stoffwechselweg, über die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase aus Oxalacetat gebildet werden. In Pflanzen existiert noch eine dritte Möglichkeit, die Synthese ausgehend von Pyruvat durch die Pyruvat, Phosphat-Dikinase (PPDK). CAM-Pflanzen und C₄-Pflanzen besitzen eine chloroplastidäre PPDK, während in C₃-Pflanzen die PPDK, ebenso wie die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase, nur im Cytosol vorkommt.The origin of the Phosphoenolpyruvates needed in the plastids is still today not clearly clarified. Phopsphoenolpyruvate can be different in the cell Metabolic reactions are provided. For one, it is in glycolysis formed from 3-phosphoglycerate (phosphoglycerate mutase / enolase) and can on the other hand, in the anabolic metabolic pathway, via the phosphoenolpyruvate carboxykinase be formed from oxaloacetate. There is a third possibility in plants the synthesis starting from pyruvate by the pyruvate, phosphate dikinase (PPDK). CAM plants and C₄ plants have a chloroplastidäre PPDK, while in C₃ plants the PPDK, as well as the phosphoenolpyruvate carboxykinase, only occurs in the cytosol.

Phosphoenolpyruvat kann nicht, jedenfalls nicht in genügender Menge, von den Plastiden selbst bereitgestellt werden. Ursache hierfür ist zum einen die cytosolische Lokalisation von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und PPDK, zum anderen die offenbar nicht ausreichende Aktivität von Phosphoglyceratmutase, die die Umwandlung von 3-Phosphoglycerat in 2-Phosphoglycerat katalysiert (Stitt und apRees, 1979, Phytochemistry 18, 1905-1911), d. h. Plastiden besitzen keinen der für die Phosphenolpyruvat-Synthese verantwortlichen Stoffwechselwege, zumindest nicht in ausreichender Aktivität. Dieser Tatbestand wird durch Untersuchungen an intakten (belichteten) Chloroplasten bestätigt, die zeigten, daß die Synthese aromatischer Aminosäuren durch extern zugesetztes Phosphoenolpyruvat deutlich stimuliert wurde, was bedeutet, daß der Shikimat-Weg auf Phosphoenolpyruvat angewiesen ist, das im Cytosol bereitgestellt und in die Plastiden importiert werden muß (Schulze-Siebert et al., 1984, Plant Physiol. 76, 465-471).Phosphoenolpyruvate can not, at least not in sufficient quantity, from the Plastids themselves be provided. The reason for this is on the one hand the cytosolic Localization of phosphoenolpyruvate carboxykinase and PPDK, on the other hand apparently not sufficient activity of phosphoglycerate mutase, which is the conversion catalyzed by 3-phosphoglycerate in 2-phosphoglycerate (Stitt and apRees, 1979, Phytochemistry 18, 1905-1911), d. H. Plastids do not own one for the Phosphenol pyruvate synthesis responsible metabolic pathways, at least not in sufficient activity. This fact is intact through investigations (exposed) chloroplasts, which showed that the synthesis of aromatic Amino acids significantly stimulated by externally added Phosphoenolpyruvat meaning that the shikimate path relied on phosphoenolpyruvate which must be provided in the cytosol and imported into the plastids (Schulze-Siebert et al., 1984, Plant Physiol. 76, 465-471).

Es war bislang eine offene Frage, auf welche Weise Phosphoenolpyruvat in die Plastiden transportiert werden kann. Der in der inneren Hüllmembran lokalisierte chloroplastidäre Phosphattranslokator aus C₃-Pflanzen katalysiert den Austausch von Phosphat, Triosephosphaten und 3-Phosphoglycerat, hat aber nur eine sehr geringe Affinität gegenüber dem Substrat Phosphoenolpyruvat (Fliege et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 502, 232-247; Flügge und Heldt, 1991, Annu. Rev. Plant Physol. Plant Mol. Biol. 42, 129-144). Da alle Substrate um die gleiche Bindungsstelle am Translokator kompetitieren, erscheint es zudem fraglich, ob unter den gegebenen zellulären Metabolitspiegeln Phosphoenolpyruvat überhaupt von dem Translokator gebunden werden kann. Die Frage besteht, ob die Plastiden für den Transport von Phosphoenolpyruvat einen speziellen Transporter besitzen.So far, it has been an open question how phosphoenolpyruvate can be converted into the Plastids can be transported. The localized in the inner envelope membrane chloroplastid phosphate translocator from C₃ plants catalyzes the exchange Of phosphate, triose phosphates and 3-phosphoglycerate, but has only a very small Affinity towards the substrate phosphoenolpyruvate (Fliege et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 502, 232-247; Flügge and Heldt, 1991, Annu. Rev. Plant Physol. Plant Mol. Biol. 42, 129-144). Since all substrates around the same binding site Competing at the translocator, it also seems questionable whether under the given cellular metabolite phosphoenol pyruvate ever from the translocator can be tied. The question is whether the plastids for the transport of Phosphoenolpyruvate own a special transporter.

Zur Klärung dieser Frage wurde daher zunächst der bei Membranproteinen außerordentlich schwierige Weg der biochemischen Charakterisierung, Reinigung und Isolation einer Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität beschritten, da es nicht gelang, einen entsprechenden Klon mittels Hybridisierung mit der DNA für den chloroplastidären Phosphattranslokator zu isolieren. Es ist nun gelungen, das Translokator-Protein als Komponente der inneren Hüllmembran von Amyloplasten aus Blumenkohl mit einer apparenten molekularen Masse von 30 000 Dalton zu identifizieren. Der beschriebene Reinigungsprozedur ist jedoch nicht geeignet, für eine Proteinsequenzierung ausreichende Mengen Protein zu präparieren, zumal sich ergab, daß der N-Terminus des Proteins blockiert und somit einer N-terminalen Proteinsequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau nicht zugänglich war. Daher war es nötig, das Protein durch präparative SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in ausreichender Menge zu isolieren, enzymatisch zu spalten und interne Peptidsequenzen zu erhalten (siehe Ausführungsbeispiel 1).To clarify this question, therefore, the first in membrane proteins was extraordinary difficult way of biochemical characterization, purification and Isolation of a Phosphoenolpyruvat phosphate transport activity, as it did not succeeded, a corresponding clone by hybridization with the DNA for the Chloroplastidären phosphate translocator isolate. It has now succeeded that Translocator protein as a component of the inner envelope of amyloplasts from cauliflower with an apparent molecular mass of 30 000 daltons identify. However, the described cleaning procedure is not suitable for Protein sequencing to prepare sufficient amounts of protein, especially revealed that the N-terminus of the protein blocked and thus an N-terminal Protein sequencing was not accessible by automated Edman degradation. Therefore, it was necessary to prepare the protein by preparative SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in sufficient quantity to isolate, enzymatically split and internal To obtain peptide sequences (see Example 1).

Es konnten auf diese Weise drei Peptidsequenzen von 10, 12 und 15 Aminosäuren erhalten werden. Dadurch gelang es, durch Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek mit nach den erhaltenen Peptiden modellierten synthetischen Oligonukleotiden das Gen für den plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphate-Translokator zu isolieren. Es zeigte sich nach Sequenzierung des Klones, daß dieser nur eine ca. 30%ige Homologie zum chloroplastidären Phosphattranslokator aufweist. Es gelang, diesen Transporter in einem heterologen System (Hefezellen) zu exprimieren und seine Transporteigenschaften im rekonstruierten System (an künstlichen Membranen) zu charakterisieren. Wie aus der Abb. 1 ersichtlich, handelt es sich bei diesem Transporter um ein Gegentauschsystem für Phosphoenolpyruvat und anorganisches Phosphat. Dieser Translokator besitzt nur eine geringe Affinität gegenüber den Substraten des chloroplastidären Phosphattranslokators (Triosephosphate und 3-Phosphoglycerat), was sinnvoll erscheint, sollte dieser Transporter bevorzugt dem Transport von Phosphoenolpyruvat dienen. In this way three peptide sequences of 10, 12 and 15 amino acids could be obtained. As a result, by screening a cDNA library with synthetic oligonucleotides modeled for the peptides obtained, it was possible to isolate the gene for the plastidic phosphoenolpyruvate-phosphate translocator. It was found after sequencing of the clone that it has only about 30% homology to chloroplastidären phosphate translocator. It was possible to express this transporter in a heterologous system (yeast cells) and to characterize its transport properties in the reconstructed system (on artificial membranes). As can be seen in Fig. 1, this transporter is a reciprocal exchange system for phosphoenolpyruvate and inorganic phosphate. This translocator has only a low affinity for the substrates of the chloroplast phosphate translocator (triose phosphates and 3-phosphoglycerate), which makes sense if this transporter is preferred for the transport of phosphoenolpyruvate.

Fig. 1 Determination of substrate affinities of recombinant phosphate translocators from chloroplasts and non-green tissue Measurement of reconstructed phosphate transport activities

Die rekombinanten Translokatoren wurden über eine Ni²⁺-Affinitätssäule aus Hefezellen gereinigt und in Liposomen rekonstruiert, die mit den angegebenen Substraten vorbeladen worden waren. Gemessen wurde die Aufnahme von radioaktiv markiertem [³²P]Phosphat (Unveröffentlichte Daten).The recombinant translocators were purified on a Ni ²⁺ affinity column from yeast cells and reconstituted into liposomes preloaded with the indicated substrates. The uptake of radioactively labeled [32 P] phosphate (unpublished data) was measured.

Klone für den entsprechenden Transporter wurden dann mittels der Blumenkohlsonde aus Mais-Wurzeln und Mais-Endosperm isoliert. Mittlerweile konnten wir zeigen, daß der Phosphoenolpyruvat-(PEP-)Phosphat-Transporter auch in grünen Geweben exprimiert wird und es gelang, den entsprechenden cDNA-Klon aus Arabidopsis thaliana und Tabak (Nicotiana tabacum) zu isolieren. Damit verfügen wir aus mehreren Pflanzen über den Transporter, der Phosphoenolpyruvat als Substrat für den Shikimat-Weg (DAHP-Synthase und EPSP-Synthase) in die Plastiden zu transportieren vermag.Clones for the corresponding transporter were then removed using the cauliflower probe isolated from corn root and corn endosperm. Meanwhile we could show that the phosphoenolpyruvate (PEP) phosphate transporter also in green tissues is expressed and succeeded, the corresponding cDNA clone from Arabidopsis to isolate thaliana and tobacco (Nicotiana tabacum). We have several of them Plants via the transporter, the phosphoenolpyruvate as a substrate for the Shikimate pathway (DAHP synthase and EPSP synthase) into the plastids can.

Transportprozesse sind in vielen Fällen der für einen Stoffwechselweg begrenzende Faktor. In neueren Publikationen wurde gezeigt (Riesmeier et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6160-6164; Heineke et al., 1994, Planta 193, 174-180), daß die Effektivität der photosynthetischen Kohlenstoffreduktion (Lichtreaktion und Calvinzyklus) ganz wesentlich durch die Verfügbarkeit eines Substrats der Lichtreaktion, des anorganischen Phosphats, und dem Abtransport des in der Reaktionsfolge entstandenen reduzierten, organisch gebundenen Kohlenstoffs (Triosephosphat) beeinflußt werden kann. Auch diese Reaktionen finden in den Chloroplasten der Pflanze statt und der Ein- bzw. Austransport der Substrate über die innere Chloroplastenhüllmembran wird durch das oben erwähnte spezifische Translokatorprotein katalysiert (Triosephosphat/Phosphat-Translokator, Flügge et al., 1989, EMBO J. 8, 39-46; Flügge et al., 1991, Nature 353, 364-367) und limitiert. Dieses Translokatorprotein stellt demzufolge eine Engstelle im Kohlenstoffwechsel dar. Wie oben beschrieben, nimmt der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator der Plastidenhüllmembran eine Schlüsselstellung bei der Versorgung des Plastiden mit der Ausgangsverbindung des Shikimat-Weges ein. Es sollte also möglich sein, mit Hilfe der erhaltenen Sequenz die Aktivität des Translokators in Pflanzen zu steigern und dadurch die Konzentration von Phosphoenolpyruvat in den Plastiden zu erhöhen. Dies sollte bei Bedarf zu einem erhöhten Fluß von fixiertem Kohlenstoff in den Shikimatweg führen und damit zu einem erhöhten Gehalt an phenolischen Verbindungen. Da diese Verbindungen, wie oben ausgeführt, eine entscheidende Rolle bei der Abwehr pflanzlicher Pathogene wie Bakterien und Pilzen spielen und solche Infektionen jährlich zu großen Ernteausfällen führen, sollte eine höhere Kapazität zur Synthese solcher Verbindung einen verbesserten Schutz der Pflanzen bewirken. Zum anderen sind diese phenolischen Verbindungen an dem Schutz der Pflanzen gegen schädliche UV- Strahlung beteiligt, ein Mechanismus, der angesichts ständig ansteigender UV- Strahlung infolge des Ozon-Abbaues in der Atmosphäre immer wichtiger werden könnte.Transport processes are in many cases the limiting for a metabolic pathway Factor. Recent publications have shown (Riesmeier et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6160-6164; Heineke et al., 1994, Planta 193, 174-180) that the Effectiveness of photosynthetic carbon reduction (light reaction and calvary cycle) essentially by the availability of a substrate of the light reaction, of the inorganic phosphate, and the removal of the resulting in the reaction sequence reduced organically bound carbon (triose phosphate) can be. These reactions also occur in the chloroplasts of Plant instead of and the ingress or egress of the substrates on the inner chloroplast envelope membrane is by the above-mentioned specific Translokatorprotein catalyzes (triose phosphate / phosphate translocator, Flügge et al., 1989, EMBO J. 8, 39-46; Flügge et al., 1991, Nature 353, 364-367) and limited. This translocator protein thus represents a bottleneck in the carbon change. As above described, the phosphoenolpyruvate phosphate translocator takes the plastid envelope membrane a key position in the supply of the plastid with the output connection of the Shikimat way. So it should be possible with the help of the obtained Sequence to increase the activity of the translocator in plants and thereby the Increase concentration of phosphoenolpyruvate in the plastids. This should be included Need to lead to an increased flux of fixed carbon in the Shikimatweg and thus to an increased content of phenolic compounds. Because these compounds, As stated above, a crucial role in the defense of plant Pathogens such as bacteria and fungi play and such infections annually leading to large crop failures, should have a higher capacity for synthesizing such compound improve the protection of plants. For another, these are phenolic compounds to protect plants against harmful UV Radiation, a mechanism which, in the face of ever-increasing UV Radiation due to the ozone depletion in the atmosphere are becoming increasingly important could.

An Pflanzen mit derart verbesserten Schutzmechanismen besteht dringender Bedarf, denn der überwiegende Teil der Menschen auf der Erde ist auf pflanzliche Ernährung angewiesen. There is an urgent need for plants with such improved protective mechanisms because the vast majority of people on earth is on plant nutrition reliant.

Bislang sind aus anderen, nicht pflanzlichen Organismen keine Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokatoren isoliert worden, die für diesen Zweck eingesetzt werden könnten. Zudem müßten diese Translokatoren einen Gegentausch mit Phosphat durchführen, um das im Shikimatweg freigesetzte Phosphat aus dem Chloroplasten zu exportieren. Die zweite auftretende Schwierigkeit wäre der korrekte Einbau dieser Fremdproteine in die innere Plastidenhüllmembran, da die authentischen Proteine dieser Membran neben der für die "Plastiden-Adressierung" nötigen Präsequenz im reifen Teil (der Teil des Proteins, der nach der Abspaltung der Präsequenz durch eine spezifische Protease verbleibt) noch weitere Informationen für die Integration in die Membran besitzen (eigene, unveröffentlichte Beobachtungen; Li et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 18999-19004). Die genaue Lokalisation dieser Informationen im reifen Teil der bisher bekannten Proteine der inneren Hüllmembran (37 kDa-Protein: Dreses- Werringloer et al., 1991, Eur. J. Biochem. 195: 361-368; Triosephosphat-Phosphat- Translokator: Flügge et al., 1989, EMBO J. 8: 39-46; Willey et al., 1991, Planta 183, 451-461; Fischer et al., 1994, Plant J. 5(2), 215-226; Ca²⁺-ATPase: Huang et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10066-10070) gelang bisher nicht. Eigene Untersuchungen am Beispiel eines mitochondrialen Carriers, des ADP/ATP-Transporters zeigten, daß dieses Protein nicht oder nur mit einer sehr geringen Effizienz zu den Chloroplasten dirigiert und dort in die Hüllmembran eingebaut werden. Selbst ein Hybridprotein, bestehend aus einer chlorplastidären Präsequenz (die Information für die Chloroplasten- Adressierung enthaltend) und diesem mitochondrialen Carrier, zeigte gegenüber dem authentischen Protein einen kaum erhöhten Einbau in die Chlorplasten- Hüllmembran (unveröffentlichte Beobachtungen). Da für eine korrekte Insertion die Protein/Lipid-Wechselwirkung von Bedeutung ist und sich die chlorplastidäre Hüllmembran in ihrer Lipidzusammensetzung grundlegend von der anderer Membranen unterscheidet (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199, 489-509), ist es sehr unwahrscheinlich, daß eine, wenn auch gerinfügige Insertion, eines fremden Proteins, dann auch funktionell ist, d. h. daß ein Transporter aus anderen Organellen überhaupt in einer seiner Funktion entsprechenden Konformation und Orientierung in die Chloroplasten-Hüllmembran eingebaut werden kann.So far no phosphoenolpyruvate phosphate translocators have been isolated from other non-plant organisms that could be used for this purpose. In addition, these translocators would have to exchange phosphate with phosphate in order to export the phosphate released in the shikimate pathway from the chloroplast. The second difficulty encountered would be the correct incorporation of these foreign proteins into the inner plastid envelope membrane, since the authentic proteins of this membrane, in addition to the pre-sequence required for "plastid addressing" in the mature part (the part of the protein which after cleavage of the pre-sequence by a specific Protease) have further information for integration into the membrane (own, unpublished observations; Li et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 18999-19004). The precise localization of this information in the mature part of the previously known proteins of the inner envelope membrane (37 kDa protein: Dreses-Werringloer et al., 1991, Eur. J. Biochem 195: 361-368; Triosephosphate-phosphate translocator: Flügge et 1989, EMBO J. 8: 39-46; Willey et al., 1991, Planta 183, 451-461; Fischer et al., 1994, Plant J. 5 (2), 215-226; Ca ²⁺ ATPase: Huang et al., 1993, Proc Natl. Acad Sci., USA 90, 10066-10070) has not been successful. Our own investigations using the example of a mitochondrial carrier, the ADP / ATP transporter, showed that this protein is not or only with very low efficiency directed to the chloroplasts and incorporated into the envelope membrane. Even a hybrid protein consisting of a chloroplast presequence (containing the information for the chloroplast addressing) and this mitochondrial carrier showed a barely increased incorporation into the chloroplast envelope membrane compared to the authentic protein (unpublished observations). Since protein / lipid interaction is important for proper insertion and the chloroplast polyimide membrane is fundamentally different in lipid composition from other membranes (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199, 489-509) it is very unlikely that a, albeit minor insertion, of a foreign protein will be functional as well, ie that a transporter from other organelles can ever be incorporated into the chloroplast envelope membrane in a conformation and orientation corresponding to its function.

Somit ist es nach gegenwärtigem Stand der Technik nicht möglich, mit Hilfe bekannter Plastiden-"Targeting"-Sequenzen nicht-plastidäre Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Transporter, so diese denn existieren, funktionell in die innere Plastidenhüllmembran zu integrieren. Beim gegenwärtigen Stand der Technik ist es erfolgversprechender, für die Konstruktion der oben geschilderten Pflanzen auf die pflanzeneigenen Translokatoren zurückzugreifen. Thus, it is not possible in the current state of the art, with the aid of known Plastid "targeting" sequences non-plastid phosphoenolpyruvate phosphate Transporters, if they exist, functionally in the inner plastid envelope membrane to integrate. In the current state of the art, it is more promising for the construction of the above-described plants on the plant's own To resort to translocators.

Die vorliegende Erfindung stellt nun DNA-Sequenzen zur Verfügung, die aus einem pflanzlichen Genom stammen und für einen plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator kodieren, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Einführung und Expression in pflanzlichen Zellen zur Bildung einer Ribonukleinsäure führt und über diese Ribonukleinsäure eine Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator Aktivität in die Zellen eingeführt werden kann oder eine endogene Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokator Aktivität unterdrückt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere eine DNA-Sequenz aus Brassica oleracea mit der folgenden Nukleotidabfolge (Seq ID No. 1):The present invention now provides DNA sequences consisting of a derived from a plant genome and a phosphoenolpyruvate phosphatidyl phosphat translocator encode, wherein the information contained in the nucleotide sequence at introduction and expression in plant cells to form a ribonucleic acid and, via this ribonucleic acid, a phosphoenolpyruvate-phosphate translocator activity into the cells or an endogenous phosphoenolpyruvate Phosphate translocator activity can be suppressed. Subject of the invention in particular, is a DNA sequence from Brassica oleracea with the following Nucleotide sequence (Seq ID No. 1):

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die mit der unter Seq.-ID No. 1 genannten DNA-Sequenz oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators besitzt.Another object of the invention are DNA sequences with the under Seq. ID no. 1 DNA sequence or parts thereof or derivatives by Insertion, deletion or substitution derived from these sequences hybridize and encode a plastidic protein that has the biological activity of a Phosphoenolpyruvat phosphate translocator possesses.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen. Um die Expression des Phosphoenolpyruvat-phosphat- Translokators in transformierten Zellen zu gewährleisten, kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Plasmide eingebracht werden und dabei mit Steuerelementen für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen kombiniert werden (siehe Ausführungsbeispiele 3, 5). Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions-Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer übersetzbaren Botenribonukleinsäure (RNA), die die Synthese eines plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators in den transformierten Zellen erlaubt, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht übersetzbaren, invers orientierten ("anti-sense"), Botenribonukleinsäure, die die Synthese der endogenen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatoren verhindert. Zu diesem Zweck könnten auch kürzere Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen mit einem relativ hohen Grad an Homologie (mehr als ca. 65% Homologie) verwendet werden. Ebenso kann die Expression von endogenen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatoren durch die Expression eines für diesen Zweck konstruierten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen inhibiert werden. Durch die Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators wird eine Veränderung des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels, in diesem Falle der Synthese phenolischer Verbindungen, die über den Shikimat-Weg hergestellt werden, ermöglicht, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß eine Verbesserung der Weiterleitung von Phosphoenolpyruvat aus dem Cytosol in die Plastiden zu einer Erhöhung des Gehaltes an diesen phenolischen Verbindungen führt. Es können somit Pflanzen erzeugt werden, die eine höhere Resistenz gegen Befall von Pathogenen und eine gesteigerte Toleranz gegen UV-Bestrahlung aufweisen. Diese Modifikation senkt den Ernteausfall und steigert damit deren wirtschaftlichen Wert. Weiterhin ermöglicht die heterologe Expression der beschriebenen Sequenz in Spalthefen (Ausführungsbeispiele 3, 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2155-2159) Struktur-Funktionsstudien des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators, die letztendlich zur Entwicklung eines spezifischen Hemmstoffs für dieses Protein führen könnten. Insbesondere ist hier an die Herbizidentwicklung zu denken, da die Hemmung eines Proteins mit Schlüsselfunktion im Stoffwechselgeschehen zwangsweise letal für die Pflanze wäre.Moreover, the present invention relates to the use of the invention DNA sequences or parts thereof or derivatives obtained by insertion, Deletion or substitution derived from these sequences, for transformation pro- and eukaryotic cells. To control the expression of the phosphoenolpyruvate-phosphate To ensure translocators in transformed cells, the inventive DNA sequence can be inserted into plasmids while using controls for expression in prokaryotic or eukaryotic cells be combined (see embodiments 3, 5). Such controls are on the one hand transcription promoters and on the other hand transcription terminators. With the plasmids eukaryotic cells can be transformed with the aim the expression of a translatable messenger ribonucleic acid (RNA), the synthesis a plastid phosphoenolpyruvate phosphate translocator in the transformed cells allowed, or with the aim of expressing an untranslatable, inverse oriented ("anti-sense"), messenger ribonucleic acid, the synthesis of the endogenous Phosphoenolpyruvate phosphate translocators prevented. For this purpose could also shorter fragments of the DNA sequence according to the invention or DNA sequences with a relatively high degree of homology (more than about 65% homology) used become. Similarly, the expression of endogenous phosphoenolpyruvate phosphate translocators by the expression of a ribozyme constructed for this purpose be inhibited using the DNA sequences of the invention. By the expression of an RNA according to the sequence according to the invention of a plant phosphoenolpyruvate phosphate translocator, a change in the secondary metabolism of plants, in this case the synthesis of phenolic compounds, which are produced via the Shikimat way, allows their economic Meaning is that an improvement of the forwarding of Phosphoenolpyruvate from the cytosol into the plastids to increase the Content of these phenolic compounds leads. It can thus plants which are more resistant to attack by pathogens and a have increased tolerance to UV radiation. This modification lowers the Crop failure and thus increases their economic value. Furthermore possible the heterologous expression of the described sequence in fission yeasts (embodiments 3, 4 and Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2155-2159) Structure-function studies of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator, which ultimately could lead to the development of a specific inhibitor for this protein. In particular, the development of herbicides is to be considered, since the inhibition of a Protein with key function in the metabolic process forcibly lethal for the Plant would be.

Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244, 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42, 205-225). Zur Expression von kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind bekannt (u. a. Koster-Topfer et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219, 390-396). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elemente sind ebenfalls beschrieben (Gielen et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und -terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanze das Ti oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend beschrieben (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerÿ Kanters B-V. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Critic. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4, 277-287). Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen eine Resistenz gegenüber Bioziden oder Antibiotika wie Kanamycin, Bleomycin oder Hygromycin verleiht. Der individuell eingeführte Marker wird daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. There are already methods of genetic modification dicotyler and monocot Plants (Gasser and Fraley, 1989, Science 244, 1293-1299, Potrykus, 1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42, 205-225). For expression of coding In plants, these sequences must be transcriptionally regulatory Be linked to elements. Such elements, called promoters, are known (et al., Koster-Topfer et al., 1989, Mol. Gen. Genet., 219, 390-396). Furthermore, the Coding regions are provided with a Transkriptionsterminations signal, so that they can be transcribed correctly. Such elements are also described (Gielen et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29). The transcriptional start area can be both native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant his. Termination areas are interchangeable with each other. The DNA sequence of the transcription start and termination regions can be synthetic be made or obtained naturally or a mixture of synthetic and contain natural DNA components. To prepare the introduction of foreign Genes in higher plants have a large number of cloning vectors available a replication signal for E. coli and a marker containing a selection of the transformed cells allowed. Examples of vectors are pBR322, pUC series, M13 mp series, pACYC 184, etc. Depending on the introduction method of desired genes in the Plant further DNA sequences may be required. Are z. B. for the Transformation of the plant using the Ti or Ri plasmid must be at least the right boundary, but often the right and left boundaries of the Ti and Ri plasmid T-DNA can be added as flanking region to the genes to be introduced. The use of T-DNA for the transformation of plant cells is intense investigated and sufficiently described (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, offset drukkerÿ Kanters B-V. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al. Critic. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4, 277-287). Is the introduced Once integrated into the genome, DNA is usually stable there and stays in place the progeny of the originally transformed cell. It contains usually a selection marker that gives the transformed plant cells a Resistance to biocides or antibiotics such as kanamycin, bleomycin or Hygromycin confers. The individually introduced marker therefore becomes the selection transformed cells to cells that lack the introduced DNA allow.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mit gängigen molekularbiologischen Methoden auf die Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.For the introduction of DNA into a plant host cell stand next to the transformation With the help of Agrobacteria many other techniques are available. These Techniques include the transformation of protoplasts, the microinjection of DNA, electroporation and ballistic methods. From the transformed Plant material can then whole in a suitable selection medium Plants are regenerated. The plants thus obtained can then be used with common molecular biological methods tested for the presence of imported DNA become. These plants can be grown normally and with plants, who have the same transformed hereditary or other genes, crossed become. The resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Teile dieser Sequenz oder Derivate dieser Sequenz (können auch in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für die Expression in Zellen von Spalthefen versehen werden (siehe Ausführungsbeispiel 3). Die Einführung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators führt zu einer erheblichen Zunahme der durch Rekonstitution in künstliche Liposomen meßbaren Aktivität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators in den rekombinanten Hefezellen. Dieser in Hefezellen exprimierte Translokator kann zur Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen und zur Entwicklung von spezifischen Hemmstoffen, welche als Herbizide zur Anwendung kommen können, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Derivate oder Teile dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators verändert werden. Ebenso könnte eine Unempfindlichkeit gegenüber für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator spezifischer Herbizide erreicht werden. Mit Hilfe von Standardverfahren (Sambrock et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche und/oder Basendeletionen vorgenommen und/oder synthetische oder natürliche Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können Adapter oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die nicht benötigte DNA entfernen, eingesetzt werden. Dort wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen oder Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethoden werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden wie z. B. die Expression des modifizierten Proteins in Spalthefe und die Messung der modifizierten Transporteigenschaften in artifiziellen Liposomen (siehe Ausführungsbeispiel 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2155-2159; sowie Fischer et al., 1994, Plant Journal 5, 215-226) oder die Messung der modifizierten Transporteigenschaften am in transgenen Pflanzen exprimierten Protein mit Hilfe einer kürzlich von uns zu diesem Zweck entwickelten Methode (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194, 181-185) angewandt.The DNA sequences according to the invention (or parts of this sequence or derivatives This sequence (can also be introduced into plasmids and thereby with controls be provided for expression in cells of fission yeasts (see embodiment 3). The introduction of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator leads to a significant increase in the measurable by reconstitution in artificial liposomes Activity of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator in the recombinant yeast cells. This translocator expressed in yeast cells can be used to study Structure-function relationships and the development of specific inhibitors, which can be used as herbicides used. The DNA sequences according to the invention (or derivatives or parts of this sequence) can also be introduced into plasmids that have a mutagenesis or a Sequence modification by recombination of DNA sequences in prokaryotic or eukaryotic systems. This allows the specificity of the Phosphoenolpyruvate phosphate translocator can be changed. Likewise, an insensitivity could opposite to the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator specific herbicides be achieved. Using standard methods (Sambrock et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) may undergo base changes and / or base deletions and / or synthetic or natural sequences are added. For the connection the DNA fragments with each other can be adapter or left attached become. Furthermore, manipulations can provide the appropriate restriction sites or removing the unneeded DNA. There where Insertions, deletions or substitutions such. Transitions or transversions may be eligible for in vitro mutagenesis, "primerrepair", restriction or ligation can be used. As analysis methods are generally a Sequence analysis, a restriction analysis and further biochemical-molecular biological Methods such. B. the expression of the modified protein in fission yeast and the measurement of modified transport properties in artificial liposomes (See Example 4 and Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2155-2159; and Fischer et al., 1994, Plant Journal 5, 215-226) or the Measurement of modified transport properties expressed in transgenic plants Protein with the help of a recently developed by us for this purpose Method (Flügge and Weber, 1994, Planta, 194, 181-185).

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz (oder Teile oder Derivate dieser Sequenz) kann dazu genutzt werden, nach Standardverfahren (insbesondere Hybridisierungs- Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken mit niedriger Stringenz unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teilen der DNA-Sequenz als Sonde oder die Erstellung von Sonden für stringente und niedrig stringente Durchmusterungs- Strategien durch Ableitung von degenerierten und/oder nicht degenerierten Primern aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für PCR-Experimente mit DNA oder cDNA von Spinat oder anderen Pflanzen) aus dem Genom von Pflanzen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Phosphoenolpyruvat transportieren.The DNA sequence according to the invention (or parts or derivatives of this sequence) may be used according to standard methods (in particular hybridization Screening of low stringency cDNA libraries using the DNA sequence according to the invention or parts of the DNA sequence as Probe or the creation of probes for stringent and low-stringency screening Strategies by derivation of degenerate and / or non-degenerate Primers from the DNA sequence according to the invention for PCR experiments with DNA or cDNA of spinach or other plants) from the genome of plants isolating similar sequences that also carry phosphoenolpyruvate.

Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrunde liegenden Ausführungsbeispiele werden die wichtigsten eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.For a better understanding of the embodiments underlying this invention the main methods used are explained below.

1. Cloning method

Zur Klonierung wurden der Phage Lambda gt10 sowie der Vektor pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 7583-7600) verwendet.For cloning, the phage were lambda gt10 and the vector pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 7583-7600).

Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pEVP11 (Russel und Nurse, 1986, Cell 45, 145-153) verwendet.For the transformation of yeasts, the vector pEVP11 (Russel and Nurse, 1986, Cell 45, 145-153).

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66, 221-230) kloniert.For plant transformation, the gene constructions in the binary Vector pBinAR (Hofgen and Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66, 221-230).

2. Bacterial and yeast strains

Für den pBluescriptKS (pBSC) Vektor sowie für pEVP11- und pBinAR-Konstrukte wurden die E. coli Stämme DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) und TG1 (Gibson, 1984, Ph. D. Thesis, Cambridge University, England) verwendet.For the pBluescriptKS (pBSC) vector as well as pEVP11 and pBinAR constructs E. coli strains DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) and TG1 (Gibson, 1984, Ph. D. Thesis, Cambridge University, England).

Die Transformation der pBinAR-Konstrukte in Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12, 8711- 8720) durchgeführt.The transformation of the pBinAR constructs into tobacco plants was carried out with the help of the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12, 8711- 8720).

3. Transformation of Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch auf Richtigkeit und Orientierung analysiert. The transfer of the DNA into the agrobacteria was carried out by direct transformation according to the method of Hofgen and Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877). The Plasmid DNA of transformed agrobacteria was prepared by the method of Birnboim and Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) and, as appropriate Restriction cleavage analyzed by gel electrophoresis for correctness and orientation.

4. Plant transformation

Pro Transformation wurden 15 kleine mit Schmirgelpapier und Skalpell verwundete Blätter einer Tabak-Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 100 µl einer unter strenger Selektion gewachsenen, transformierten Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 15minütigem leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg Giberellinsäure, 500 mg/l Betabactyl®, 15 mg/l Hygromycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux Beleuchtungsstärke wurde die Betabactylkonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.Per transformation, 15 small were wounded with emery paper and scalpel Leaves of a sterile tobacco culture placed in 10 ml MS medium with 2% sucrose, which 100 μl of a rigorously grown, transformed Agrobacterium tumefaciens overnight culture. After 15 minutes of gentle shaking were the leaves on MS medium with 1.6% glucose, 2 mg / l zeatinribose, 0.02 mg / l naphthylacetic acid, 0.02 mg gibberellin acid, 500 mg / l betabactyl®, 15 mg / L hygromycin and 0.8% Bacto agar. After a week's incubation at 25 ° C and 3000 lux illuminance, the betabactyl concentration in the Medium reduced by half.

deposits

Am 14. 11. 1995 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide in Form von E. coli Stämmen, enthaltend diese Plasmide, hinterlegt.On 14. 11. 1995 at the German Collection of Microorganisms (DSM) in Braunschweig, Federal Republic of Germany, the following plasmids in the form of E. coli strains containing these plasmids deposited.

pictures

1.) Abb. 1: Rekonstruktion der Transportaktivität des in Hefe exprimierten rekombinanten Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators.1.) Fig. 1: Reconstruction of the transport activity of the expressed in yeast recombinant phosphoenolpyruvate phosphate translocator.

Embodiment 1 Isolation of peptide fragments of the translocator and creation of probes for the Hybridization screening of cDNA libraries

Gereinigtes Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatorprotein wurde ein präparativen SDS- Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685) von verbleibenden Verunreinigungen getrennt und nach Detektion des Proteins durch Anfärbung mit Kupfersulfat (Lee et al., 1987, Anal. Biochem. 166, 308-312) aus dem Gel ausgeschnitten und in der Gelmatrix mit Endoproteinase LysC verdaut (Eckerskorn und Lottspeich, 1989, Chromatographia 28, 92-94). Die resultierenden Peptide wurden aus dem Gel und mittels HPLC getrennt. Die Aminosäuresequenz der gereinigten Peptidfraktionen wurde durch automatisierten Edman-Abbau in der Gasphase bestimmt (Eckerskorn et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176, 509-519). Aus der Aminosäuresequenz von drei Peptiden wurden degenerierte Oligonukleotidsequenzen, kodierend diese Aminosäuresequenzen, abgeleitet und die respektiven Oligonukleotide durch in vitro DNA-Synthese hergestellt. Für den Einsatz als Sonde wurden die Oligonukleotide durch Anhängen einer ³²P-Phosphatgruppe an das 5′-Ende mittels einer Oligonukleotidkinase radioaktiv markiert.Purified phosphoenolpyruvate-phosphate translocator protein became a preparative SDS Polyacrylamide gels (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685) of remaining contaminants separated and after detection of the protein by staining with copper sulfate (Lee et al., 1987, Anal. Biochem., 166, 308-312) were excised from the gel and digested in the gel matrix with endoproteinase LysC (Eckerskorn and Lottspeich, 1989, Chromatography 28, 92-94). The resulting peptides were removed from the gel and separated by HPLC. The amino acid sequence of the purified peptide fractions was determined by automated Edman degradation in the gas phase (Eckerskorn et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 509-519). From the amino acid sequence of three peptides became degenerate oligonucleotide sequences encoding these Amino acid sequences derived and the respective oligonucleotides by in vitro DNA synthesis produced. For use as a probe, the oligonucleotides by attaching a 32 P-phosphate group to the 5 'end by means of an oligonucleotide kinase radioactively marked.

Embodiment 2 Cloning of the cauliflower phosphoenolpyruvate phosphate translocator

Aus Blumenkohlköpfen wurde poly-A⁺-RNA isoliert und ausgehend hiervon eine cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda gt10 angelegt. Ca. 300.000 Klone dieser Bibliothek wurden mit nach Endoproteinase LysC-Peptidfragmenten des gereinigten Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators modellierten synthetischen Oligonukleotiden sondiert (siehe Ausführungsbeispiel 1). Positiv reagierende Klone wurden nach Standardverfahren gereinigt und nach Präparation der amplifizierten Phagen-DNA aus den gereinigten Plaques wurde durch EcoRI-Restriktionsverdau die Insertion kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator erhalten und durch Southern- Blot Analyse, mit den oben erwähnten Oligonukleotiden als Sonde, verifiziert. Nach Umklonierung der Insertionen der Phagen-DNA in den Vektor pBluescript (pBSC) wurden die Klone durch Bestimmung der DNA-Sequenz analysiert (Didesoxymethode: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) und aus dieser DNA-Sequenz die Primärstruktur des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators abgeleitet. Die Sequenz der zum Sondieren der cDNA-Bibliothek benutzten Oligonukleotide bzw. Peptide konnte wiedergefunden werden.From cauliflower heads poly-A⁺-RNA was isolated and starting from a cDNA library created in vector lambda gt10. Approximately 300,000 clones of this library were purified with purified endoproteinase LysC peptide fragments Phosphoenolpyruvate-phosphate translocator modeled synthetic oligonucleotides probed (see Example 1). Positive clones were detected Standard procedure purified and after preparation of the amplified phage DNA from the purified plaques, the insertion was made by EcoRI restriction digestion coding for the phosphoenolpyruvate phosphate translocator and by Southern Blot analysis, verified with the above-mentioned oligonucleotides as a probe. To Cloning of the phage DNA insertions into the vector pBluescript (pBSC) the clones were analyzed by determination of the DNA sequence (dideoxymethod: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) and from this DNA sequence derived from the primary structure of the phosphoenolpyruvate phosphate translocator. The sequence of oligonucleotides used to probe the cDNA library or peptides could be found again.

Embodiment 3 Expression of the cauliflower phosphoenolpyruvate phosphate translocator in fission yeast Schizosaccharomyces pombe

Die Insertion in dem oben erwähnten Plasmid pBluescript (pBSC), kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, wurde mit den Endonucleasen PstI und SspI herausgeschnitten und durch Elektrophorese isoliert. Die Überhänge des so erhaltenen Fragmentes wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA Polymerase geglättet. Das Insert, kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, wurde dann in den Vektor pQE32 (Quiagen), der mit BamHI linearisiert und dessen Überhänge mit T4- DNA-Polymerase geglättet wurden, kloniert. Das Insert inklusive des 6x His-tags wurde wiedergewonnen, indem der Vektor pQE32, enthaltend das Insert, mit EcoRI linearisiert, die Enden mit T4-DNA-Polymerase geglättet und anschließend mit HindIII gespalten wurde. Das so gewonnene Fragment wurde in den Hefe-Expressionsvektor pEVP11, der mit SacI gespalten, mit T4-DNA-Polymerase geglättet und mit HindIII gespalten wurde, gerichtet eingesetzt und nach Amplifikation des Konstrukts in E. coli in durch LiCl/PEG kompetent gemachte (Ito et al., 1983, J. Bact. 153, 163-168) Leucinsynthese-defiziente S. pombe Zellen transformiert. Transformanten wurden durch Selektion auf Minimalmedium ohne Leucin selektiert, da das pEVP11-PEP Konstrukt den Hefezellen die Fähigkeit zum Wachstum auf leucinfreiem Medium verleiht.The insertion in the abovementioned plasmid pBluescript (pBSC), coding for the Phosphoenol pyruvate phosphate translocator, was probed with the endonucleases PstI and SspI excised and isolated by electrophoresis. The overhangs of the thus obtained Fragments were smoothed with the aid of the enzyme T4-DNA polymerase. The insert encoding the phosphoenolpyruvate phosphate translocator was then added to the Vector pQE32 (Quiagen) linearized with BamHI and its overhangs with T4- DNA polymerase were smoothed, cloned. The insert including the 6x His-tag was recovered by the vector pQE32 containing the insert with EcoRI linearized, the ends with T4 DNA polymerase smoothed and then with HindIII was cleaved. The fragment thus obtained was added to the yeast expression vector pEVP11 cleaved with SacI, blunted with T4 DNA polymerase and HindIII digested, and after amplification of the Construct in E. coli in LiCl / PEG competent (Ito et al., 1983, J. Bact. 153, 163-168) transformed leucine synthesis-deficient S. pombe cells. Transformants were selected by selection on minimal medium without leucine, since the pEVP11-PEP helps yeast cells to grow leucine-free medium confers.

Embodiment 4 Measurement of Phosphoenolpyruvate Phosphate Transport Activity in Recombinant Yeast Lines

Mit dem pEVP11-PEP Plasmid transformierte Hefezellen wurden in Minimalmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1.0 angezogen und durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 5 min geerntet. Anschließend wurden die Zellen durch kräftiges Schütteln mit 1/2 vol (bezogen auf die Zellen) Glasperlen aufgebrochen und Glasperlen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation (600 g für 1 min) abgetrennt. Der Überstand wurde auf eine Konzentration von 0.5% Triton X-100 eingestellt, mit dem gleichen Volumen Liposomen versetzt und die resultierenden Proteoliposomen sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Liposomen wurden zuvor durch Beschallen von Sojabohnen-Phospholipid (20 mg/ml) für 10 min bei 4°C in Gegenwart von 100 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 20 mM Phosphoenolpyruvat und 30 mM Kaliumglukonat hergestellt. Nach dem Auftauen der Proteoliposomen und erneutem Beschallen der Suspension mit 10 Pulsen à 1 s wurden die Proteoliposomen vom umgebendem Medium durch Größenausschlußchromatographie auf Sephadex G-25, das zuvor mit 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 100 mM Natriumglukonat und 50 mM Kaliumglukonat äquilibriert worden war, abgetrennt. Die eluierten Proteoliposomen wurden für die Messung der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität eingesetzt. Die Messung wurde nach der von Menzlaff und Flügge (1993, Biochim. Biophys. Acta 1147, 13-18) beschriebenen "Inhibitor-Stop" Methode durchgeführt.Yeast cells transformed with the pEVP11-PEP plasmid were in minimal medium up to an optical density at 600 nm of 1.0 and attracted by Centrifugation at 3,000 × g for 5 min. Subsequently, the cells were by vigorous shaking with 1/2 vol (based on the cells) broken glass beads and glass beads and cell debris by centrifugation (600 g for 1 min) separated. The supernatant was adjusted to a concentration of 0.5% Triton X-100 adjusted, mixed with the same volume of liposomes and the resulting Proteoliposomes immediately frozen in liquid nitrogen. The liposomes were previously by sonicating soybean phospholipid (20 mg / ml) for 10 min at 4 ° C in the presence of 100 mM tricine-NaOH (pH 7.6), 20 mM phosphoenolpyruvate and 30 mM potassium gluconate. After thawing the proteoliposomes and Renewed sonication of the suspension with 10 pulses of 1 s were the proteoliposomes from the surrounding medium by size exclusion chromatography Sephadex G-25 previously treated with 10mM Tricine-NaOH (pH 7.6), 100mM sodium gluconate and 50 mM potassium gluconate had been equilibrated, separated. The eluted proteoliposomes were used for the measurement of phosphoenolpyruvate phosphate transport activity used. The measurement was made by Menzlaff and Flügge (1993, Biochim., Biophys. Acta 1147, 13-18) described "inhibitor-stop" method carried out.

Die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität in den pEVP11-PEP Transformanten wurde mit der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität von Transformanten verglichen, die lediglich mit dem Vektor pEVP11 transformiert waren. Es zeigte sich, daß die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität in den pEVP11-PEP Transformanten (gemessen in pmol transportiertes ³²P-Phosphat/mg Protein×Stunde) 100fach höher war als in pEVP11 Kontroll-Transformanten. Zudem konnte gezeigt werden, daß das rekombinante Translokatorprotein im Vergleich zu dem authentischen Protein der Plastidenmembran identische Transportcharakteristika aufweist.The phosphoenolpyruvate phosphate transport activity in the pEVP11-PEP transformants was compared to the phosphoenolpyruvate phosphate transport activity of transformants, which were transformed only with the vector pEVP11. It was found, that the phosphoenolpyruvate phosphate transport activity in the pEVP11-PEP transformants (measured in pmol transported ³²P phosphate / mg protein × hour) 100 times higher was as in pEVP11 control transformants. In addition, it could be shown that the recombinant translocator protein compared to the authentic protein of the Plastidmembran has identical transport characteristics.

Embodiment 5 Transformation of plants with a construction to overexpress the coding region of the phosphoenolpyruvate phosphate translocator

Aus dem Vektor pBluescript-(pBSC-), der als Insertion die cDNA für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator aus Blumenkohl enthielt (siehe Ausführungsbeispiel 2) wurde die Insertion durch Restriktionsverdau mit SalI und SmaI isoliert und in den Vektor pBinAR (Höfgen u. Willmitzer, 1990, Plant Sci 66, 221-230) der zuvor mit den Enzymen SalI und SmaI geschnitten worden war, kloniert. Nach Amplifikation des resultierenden Konstrukts pBinAR-PEP in E. coli wurden das Konstrukt in Agrobakterien transformiert und diese dann zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.From the vector pBluescript- (pBSC-), which contained as insertion the cDNA for the phosphoenolpyruvate phosphate translocator from cauliflower (see Example 2) The insert was isolated by restriction digestion with SalI and SmaI and inserted into the Vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990, Plant Sci 66, 221-230) of the previously with the Enzyme SalI and SmaI had been cloned. After amplification of the resulting construct pBinAR-PEP in E. coli were the construct in agrobacteria transformed and then this infection of leaf segments of tobacco and potato used.

Die erhaltenen Transformanten wurden mit Hilfe von Southern-Blot Analysen auf die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens untersucht. Mit Hilfe der "Gesamtblatt-Rekonstitutionsmethode" (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194, 181-184) wurde die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität im Vergleich zu Kontrolltransformanten (transformiert mit Vektor pBinAR ohne Insertion) untersucht, ebenso die Photosyntheserate, Transpiration und Wachstum.The obtained transformants were analyzed by Southern blot analysis investigated the presence of the intact, non-rearranged chimeric gene. With help the "total sheet reconstitution method" (Flügge and Weber, 1994, Planta, 194, 181-184), the phosphoenolpyruvate phosphate transport activity was compared to Control transformants (transformed with vector pBinAR without insertion), as well as the photosynthesis rate, transpiration and growth.

SEQ ID NO.:SEQ ID NO .: 11 Art der Sequenz:Type of sequence: Nukleotid mit entsprechendem ProteinNucleotide with corresponding protein Sequenzlänge:Sequence length: 1402 Basenpaare1402 base pairs Strangform:Stranded form: Einzelstrangsingle strand Topologie:Topology: linearlinear Art des Moleküls:Type of molecule: cDNAcDNA Ursprüngliche Herkunft @Original origin @ Organismus:Organism: Brassica oleraceaBrassica oleracea Herkunft:Ancestry: cDNA-Bibliothek in Phage Lambda gt10cDNA library in phage lambda gt10 Merkmale:Characteristics: von Nukleotid 14 bis 1219 kodierende Regionfrom nucleotide 14 to 1219 coding region Eigenschaften:Properties: Phosphoenolpyruvat-Phosphat-TranslokatorPhosphoenolpyruvate phosphate translocator

Claims

1. DNA sequences which contain the coding region of a phosphoenolpyruvate phosphate translocator, characterized in that these DNA sequences have the following nucleotide sequence (Seq-ID No .: 1):

2. DNA sequences linked to the DNA sequence according to claim 1 or parts thereof or derivatives obtained by insertion, deletion or substitution of these sequences are derived, hybridize and encode a plastidic protein, the has the biological activity of a phosphoenolpyruvate phosphate translocator.

3. Plasmids containing DNA sequences according to claim 1 or 2 or parts thereof or derivatives obtained by insertion, deletion or Substitution derived from this sequence.

4. Plasmid pEVP11-PEP deposited as E. coli strain TG1 pEVP11-PEP under the DSM number DSM 10326 containing this plasmid.

5. Plasmid pBinAR-PEP deposited as E. coli strain TG1 pBinAR-PEP under the DSM number DSM 10327 containing this plasmid.

6. Bacteria containing a DNA sequence according to claim 1 or 2 or parts thereof or derivatives obtained by insertion, deletion or Substitution derived from these sequences.

7. Yeasts containing a DNA sequence according to claim 1 or 2 or parts thereof or derivatives by insertion, deletion or substitution derived from these sequences.

8. Bacteria containing plasmids according to claims 3 to 6.

9. yeasts containing plasmids according to claims 3 or 4.

10. Plant cells containing plasmids according to claims 3 or 5.

11. Transformed plant cells and from these regenerated transgenic plants containing a DNA sequence according to claim 1 or 2, wherein this sequence as part of a recombined DNA molecule in the Plant cells was introduced.

12. Use of DNA sequences according to claim 1 or 2 or parts or derivatives obtained by insertion, deletion or substitution of derived from these sequences for introduction into prokaryotic or eukaryotic Cells, using these sequences with controls that facilitate transcription and Ensuring translation in the cells are linked and used to express a translatable mRNA representing the synthesis of a phosphoenolpyruvate-phosphate translocator causes, lead.

13. Use of DNA sequences according to claim 1 or 2 or parts or derivatives obtained by insertion, deletion or substitution of derived from these sequences, for the expression of a non-translatable RNA, which by means of an "antisense" effect or a Ribozymaktivität the synthesis of a or more endogenous phosphoenolpyruvate phosphate translocators in the cells.

14. Use of DNA sequences according to claim 1 or 2 or parts or derivatives obtained by insertion, deletion or substitution of derived from these sequences, for the production of DNA sequences for a plant plastidic phosphoenolpyruvate phosphate translocator with an altered Encode specificity.

15. Use of DNA sequences according to claim 1 or 2 or parts or derivatives obtained by insertion, deletion or substitution of derived from these sequences, for the isolation of DNA sequences that are suitable for a Polypeptide encoding the biological activity of a phosphoenolpyruvate phosphate Translocator owns.

16. Use of DNA sequences according to claim 1 or 2 or parts or derivatives obtained by insertion, deletion or substitution of derived from these sequences, for the identification of substances containing a inhibitory effect on the transport of phosphoenolpyruvate via the inner Have plastid envelope membrane.