DE19549117A1

DE19549117A1 - Verfahren zum spezifischen Nachweisen von Enzymaktivität

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Publication number: DE19549117A1
Application number: DE1995149117
Authority: DE
Inventors: Thomas W Dr Stief
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1995-12-29
Publication date: 1997-07-03

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nach weisen von Enzymaktivität in Blutplasma oder anderen biologi schen Flüssigkeiten.

Die Hämostase ist das System, welches die Fließbarkeit des Blutes reguliert. Sie ist gekoppelt mit Immunantwort und Ent zündung. Störungen der Hämostase gehen einher mit Fehlregula tionen des enzymatischen Gerinnungs- und/oder Fibrinolyse-Systems. Diese Störungen sind oft lebensbedrohlich. Es ist daher von großem klinischen Interesse, wichtige Enzyme und Enzymregulatoren des menschlichen Blutes spezifisch und schnell funktionell zu erfassen.

Der Nachweis der Enzymaktivitäten von Thrombin, Faktor Xa, Protein Ca, Plasmin oder Elastase kann chromogen erfolgen, d. h. es ist möglich, die Aktivität dieser Enzyme über die amidoly tische Spaltung eines Peptid-para-Nitroanilid-Substrates zu bestimmen. In Blut und Plasma ergeben sich allerdings Unspezi fitäten, da 1. fortlaufend das Enzym prozessiert wird, d. h. die Pro-Enzym-Form des entsprechenden Enzyms in die aktive Enzym form und das aktive Enzym in die inaktive Enzymform überführt wird und da 2. das chromogene Substrat auch von anderen Protea sen gespalten werden kann, d. h. das chromogene Substrat ist mehr oder weniger selektiv für eine entsprechende Protease.

So wird bei Hämostaseaktivierung fortlaufend Prothrombin in Thombin, Faktor X in Faktor Xa, Protein C in Protein Ca, Prourokinase in Urokinase, Plasminogen in Plasmin umgewandelt und Elastase von aktivierten Phagozyten freigesetzt. Enzym erzeugend (Pro-Enzym-Aktivatoren) sind beispielsweise Prothrom binasekomplex für Prothrombin, Faktor IXa oder Faktor VIIa für Faktor X, Thrombin/Thrombomodulin für Protein C und Kallikrein für Urokinase, Plasminogen-Aktivator (wie Urokinase, t-PA oder Streptokinase) für Plasminogen.

Wenn die Enzymaktivität durch Bestimmen des aus der Enzymreak tion hervorgehenden Reaktionsprodukts nachgewiesen werden soll, können Protein/Protein-Interaktionen das Meßergebnis entschei dend verfälschen. Wird beispielsweise die Thrombinaktivität über die entstehende Fibrinkonzentration bestimmt, so stört eine Fibrinogen Fragment X/Fibrinogen Fragment X-Wechselwirkung die Nachweismethode.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver fahren bereitzustellen, wodurch die Enzymaktivität in Blut plasma oder einer anderen biologischen Flüssigkeit spezifisch nachgewiesen werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe muß die im vorstehend gezeigten Schema mit X gekennzeichnete Enzymprozessierungsreaktion und/oder eine Protein/Protein-Interaktion der entstehenden Reaktionsprodukte inhibiert werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren, bei dem die in der Probe vorhandene Enzymaktivität oder das Reaktionsprodukt einer Enzymaktivität in Gegenwart eines Enzym prozessierungs- und/oder eines Protein/Protein-Interaktions-In hibitors bestimmt wird.

Vorzugsweise wird durch das erfindungsgemäße Verfahren die Enzymaktivität eines Hämostase-Enzyms bestimmt.

Insbesondere kann erfindungsgemäß die Enzymaktivität von Thrombin, Faktor Xa, Protein Ca, Plasminogen-Aktivator, Plasmin oder Elastase bestimmt werden.

Als Enzymprozessierungs- und/oder Protein/Protein-Interaktions-In hibitor eignen sich chaotrope Lösungen, d. h. Lösungen, die die Protein-Protein-Interaktion stören, jedoch die Wechsel wirkung zwischen dem Enzym und dem chromogenen Substrat, wie Peptid-pNA, unbeeinflußt lassen. Erfindungsgemäß können bei spielsweise Guanidinogruppen-enthaltende Agenzien und/oder ionische Reagenzien eingesetzt werden.

Insbesondere kann als ionisches Reagenz ein Kaliumsalz, wie Kaliumchlorid, vorzugsweise in einer Endkonzentration von 270 bis 1000 mmol/l, am meisten bevorzugt von 300 bis 800 mmol/l eingesetzt werden.

Als Enzymprozessierungs- und/oder Protein/Protein-Interaktions-In hibitor eignet sich auch ein Caesiumsalz, wie Caesiumchlorid, vorzugsweise in einer Endkonzentration von 200 bis 800 mmol/l.

Weiterhin sind für das erfindungsgemäße Verfahren Guanidino gruppen-enthaltende Agenzien, wie Guanidiniumcarbonat und Arginin, vorzugsweise in einer Endkonzentration von 20 bis 300 mmol/l, am meisten bevorzugt in einer Endkonzentration von 120 bis 250 mmol/l, bei vorzugsweise einem alkalischen pH-Wert, verwendbar.

Gute Ergebnisse werden auch bei der Verwendung von Harnstoff, vorzugsweise in einer Endkonzentration von 100 bis 1000 mmol/l, und Detergenzien, wie Triton X 100®, vorzugsweise in einer End konzentration von 0,5 bis 5%, und SDS (Natriumdodecylsulfat), vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1%, erzielt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für einen spezifischen Nachweis der Thrombinaktivität, wobei lösli ches Fibrin spezifisch nachgewiesen wird.

Besonders vorteilhaft ist es, den spezifischen Enzymaktivitäts nachweis bei einer Temperatur von 37 bis 55°C, vorzugsweise 45 ± 5°C durchzuführen, da bei dieser Temperatur die Enzym prozessierung unterbleibt und gleichzeitig die Reaktions geschwindigkeit der Farbstoffabspaltung gegenüber 37°C erhöht wird. Folglich führt auch eine Temperaturerhöhung zu einer Enzymprozessierungs- und/oder Protein/Protein-Interaktions-In hibition. Eine Reaktionstemperatur über 37°C wird somit ebenfalls als Enzymprozessierungs- und/oder Protein/Protein-Inter aktions-Inhibitor definiert.

Von klinischem Interesse ist besonders die Verwendung einer Kombination der vorstehend erwähnten Enzymprozessierungs-In hibitoren bzw. eine Kombination von Enzymprozessierungs-In hibitoren und erhöhter Reaktionstemperatur, da die Diagnose in diesen Fällen innerhalb weniger Minuten erstellt werden kann. Vorteilhaft ist eine Kombination aus Enzymprozessierungs-In hibitor und einem Serinproteaseninhibitor (Serpin)-In aktivator oder/und -Inhibitor, wie vorzugsweise Singulett-Sau erstoff oder eine omega-Aminocarbonsäure, letzteres falls das Serpin α2-Antiplasmin ist. Damit wird erreicht, daß das einmal generierte Enzym nicht wieder inhibiert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders schnell und effizient durchführen, wenn ein für den Enzymnachweis spezifi sches, chromogenes Substrat gleichzeitig mit dem Enzymprozes sierungs- und/oder Protein/Protein-Interaktions-Inhibitor zur Probe zugegeben wird. In Fällen, in denen das Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, erst durch einen voraus gehenden Prozessierungsschritt erzeugt wird, ist es vorteil haft, die Probe eine bestimmte Zeitdauer stehenzulassen, bevor eine weitere Enzymprozessierung bzw. Protein/Protein-Wechsel wirkung durch Zugabe des Inhibitors gehemmt wird. Der spezifi sche Enzymaktivitätsnachweis läßt sich durch ein Ein-Schritt-Ver fahren wie auch durch Mehr-Schritt-Verfahren durchführen.

Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn der Enzymaktivi tätsnachweis zusätzlich in Gegenwart eines Serpin-Inaktiva tors/Inhibitors, wie Singulett-Sauerstoff oder omega-Amino carbonsäure, durchgeführt wird. Als Singulett-Sauerstoff-Er zeuger kann Chloramin, vorzugsweise in Mengen von 1 bis 3 µmol/50 µl Plasma eingesetzt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Vergleichsversuche und Beispiele weiter erläutert.

Vergleichsversuch 1 Enzymprozessierungs-Inhibitoren in einem plasmatischen Pro thrombin/Thrombin (II/IIa) und in einem reinen Plasmino gen/Plasmin-System

A) 25 µl normales Plasma wird mit 175 µl Kaninchenhirn-Throm boplastin mit 5,8 mmol/l CaCl₂ (Sigma Reagenz für die Pro thrombinzeit, 1 : 2 verdünnt in 0,9% NaCl) bei 37°C inku biert. Nach 5 Sekunden werden 50 µl einer 3 mmol/l Lösung des chromogenen Thrombinsubstrates HD-Phe-Pip-Arg-pNA in
B) 1 IU Urokinase wird mit 2,5 CTA-Einheiten Plasminogen/ml in 100 mmol/l Tris, 0,05% Triton X 100®, pH 8,0, 5 Minuten bei 37°C in einem Volumen von 200 µl inkubiert. Daraufhin wird 50 µl einer 3 mmol/l Lösung des chromogenen Plasmin substrats HD-Val-Leu-Lys-pNA in
1) aqua dest.
2) 0,5 mol/l CsCl
3) 1,0 mol/l CsCl
4) 1,5 mol/l CsCl
5) 0,5 mol/l KCl
6) 1,0 mol/l KCl
7) 1,5 mol/l KCl
8) 2,0 mol/l KCl
9) 2,5 mol/l KCl
10) 1,0 mol/l NaCl
11) 2,0 mol/l NaCl
12) 3,0 mol/l NaCl
13) 0,5 mmol/l ZnCl₂
14) 5 mmol/l ZnCl₂
15) 10 mmol/l ZnCl₂
16) 5% Triton X 100®
17) 0,25% Natriumdodecylsulfat
18) 2 mol/l Harnstoff
19) 250 mmol/l Guanidiniumcarbonat
20) 500 mmol/l Guanidiniumcarbonat
21) 750 mmol/l Guanidiniumcarbonat
22) 250 mmol/l Argininhydrochlorid
23) 500 mmol/l Argininhydrochlorid
24) 750 mmol/l Argininhydrochlorid
25) aqua dest. bei einer Endinkubationstemperatur von 45°C zugegeben.

Ergebnis

Wird das chromogene Substrat in aqua dest. zugegeben und die Endinkubationstemperatur nicht auf über 37°C eingestellt, so ergibt sich eine nichtlineare (hyperbelförmige) Zeit-Extink tionskinetik, d. h. die Enzymprozessierung wurde nicht inhi biert, fortlaufend wird neues Enzym nachgebildet, welches zusätzlich das chromogene Substrat spaltet.

Die Enzymprozessierung wird durch Inkubation bei < 40°C oder durch Anwesenheit von mindestens 300 mmol/l NaCl, oder 270 mmol/l KCl, oder 200 mmol/l CsCl, oder 0,5 mmol/l ZnCl₂ (bei der Plasminprozessierung), oder 1% Triton X 100®, oder 0,05% Natriumdodecylsulfat, oder 500 mmol/l Harnstoff, oder 100 mmol/l Guanidiniumcarbonat oder 100 mmol/l Argininhydro chlorid inhibiert.

Es resultiert jeweils eine lineare Zeit-Extinktionskinetik. Optimale lineare Extinktionsänderungen betragen etwa 0,100/min.

Vergleichsversuch 2 Verbesserung der Substratselektivität durch Enzymprozessie rungsinhibitoren

1. 50 µl humanes Thrombin (0,1 NIH-Einheiten/ml) in 150 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0
2. 50 µl humanes Plasmin (0,01 CTA-Einheiten/ml) in 150 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0
3. 50 µl 150 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0 (Kontrolle)

werden mit 150 µl 150 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0, und 50 µl

a) 3 mmol/l chromogenes Thrombinsubstrat HD-Phe-Pip-Arg-pNA in aqua dest.
b) 3 mmol/l chromogenes Thrombinsubstrat HD-Phe-Pip-Arg-pNA in 2 mol/l KCl
c) 3 mmol/l chromogenes Plasminsubstrat HD-Val-Leu-Lys-pNA in aqua dest.
d) 3 mmol/l chromogenes Plasminsubstrat HD-Val-Leu-Lys-pNA in 2 mol/l KCl

bei

I) Raumtemperatur
II) 37°C
III) 45°C
IV) 55°C

60 Minuten inkubiert. Daraufhin wird die entstandene Extink tionsänderung bei 405 nm durch einen Mikrotiterplatten-Leser (Organon, Turnhout, Belgien) bestimmt.

Ergebnis

I) Raumtemperatur

II) 37°C

III) 45°C

IV) 55°C

Die Quotienten geben die Unselektivität des chromogenen Substrates an, d. h. inwieweit das chromogene Thrombinsubstrat von Plasmin bzw. das chromogene Plasminsubstrat von Thrombin gespalten wird. Ihre Größe ist indirekt proportional zur Inku bationstemperatur. (3,3-6,7-9,2-10) und zur Anwesenheit von < 300 mmol/l KCl. Daraus ergibt sich, daß die Enzymprozes sierungs-Inhibition bei 45° ± 5°C und/oder in Anwesenheit eines weiteren Enzymprozessierungs-Inhibitors erfolgen sollte.

Der Enzymprozessierungs-Inhibitor führt folglich auch zu einer verbesserten Substratselektivität, er unterdrückt unspezifische Substratspaltung.

Vergleichsversuch 3 Wirkung von Guanidinogruppen-enthaltende Enzymprozessierungs-In hibitoren auf die amidolytische Enzymaktivität

50 µl humanes Thrombin (0,1 NIH-Einheiten/ml) in 150 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0 oder 50 µl humanes Plasmin (0,01 CTA-Einheiten/ml) in 150 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0 werden mit 50 µl einer Arginin-Lösung unter schiedlicher Konzentration (0 bis 700 mmol/l) und a) 50 µl 3 mmol/l chromogenes Thrombinsubstrat HD-Phe-Pip-Arg-pNA in aqua dest. oder b) 50 µl 3 mmol/l chromogenes Plasminsubstrat HD-Val-Leu-Lys-pNA in aqua dest. 60 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.

Daraufhin wird die entstandene Extinktionsänderung bei 405 nm durch einen Mikrotiterplatten-Leser (Organon, Turnhout, Belgien) bestimmt.

Ergebnis

Das Guanidinogruppen-enthaltende Agens führt bei Konzentratio nen unter 100 mmol/l Arginin im Test zu keiner Inhibition der amidolytischen Enzymaktivität von Thrombin oder Plasmin, selbst eine Konzentration von 233 mmol/l im Test führt nur zu einer etwa 20%-igen Hemmung der amidolytischen Thrombinaktivität. Die amidolytische Plasminaktivität bleibt unbeeinflußt bei dieser Argininkonzentration, Arginin bei etwa 50 mmol/l im Test erzeugt sogar eine etwa 30%-ige Stimulation der amidolytischen Plasminaktivität.

Beispiel 1 Spezifischer Nachweis von Thrombinaktivität

25 µl Plasma wurden mit 25 µl Cephalin in 0,1 mmol/l Ellagsäure (Sigma Reagenz für aktivierte partielle Thromboplastinzeit) 3 Minuten bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden 125 µl 4 mmol/l CaCl₂, 20 mmol/l Hepes, 50 mmol/l NaCl, 0,5 g/l NaN₃ zugegeben und 15 Sekunden bei 37°C inkubiert. Der Zusatz von 60 µl 3 mmol/l chromogenem Thrombinsubstrat Tosylglycyl-L-prolyl-arginyl-5-amino-2-nitrobenzoesäure-isopropylami-d (Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA)

in a) aqua dest.

b) 1,5 mol/l CsCl
c) 2 mol/l KCl
d) 3 mol/l NaCl
e) aqua dest., Endinkubation bei 45°C

startet die Nachweisreaktion. Die entstehende Extinktions zunahme pro Minute bei 405 nm wird in einem automatischen Mikrotiterplatten-Leser (Organon, Turnhout, Belgien) bestimmt und ist ein direktes Maß für die entstandene Thrombinaktivität.

Ergebnis

Chromogene APTT (aktivierte partielle Thromboplastinzeit)
Gepooltes normales Plasma delta A/min = 0,067 linearer Anstieg
Pathol. oder antikoagul. Plasma A/min < 0,040 linearer Anstieg.

Wird das chromogene Substrat in aqua dest. nicht zusammen mit einem Enzymprozessierungs-Inhibitor gegeben, so ergibt sich eine nichtlineare Zeit-Extinktionskinetik. Dieser hyperbel förmige Anstieg der Enzymaktivität ergibt sich, da fortlaufend weiter Enzym gebildet wird und die Enzymprozessierung nicht inhibiert wurde. Eine Endinkubation bei 45°C führt auch zu einem linearen Anstieg der gemessenen Extinktion bei 405 nm, d. h. bei Temperaturen < 37°C wird die Enzymprozessierung zuneh mend inhibiert ohne zunächst die amidolytische Aktivität des Enzyms negativ zu beeinflussen.

Beispiel 2 Spezifischer Nachweis von Plasminaktivität Bestimmung der Urokinase-induzierten, fibrinolytischen Aktivi tät von Plasma

50 µl Plasma wurden mit 50 µl Testreagenz, welches aus 12 IU/ml Urokinase, 3 mmol/l Tranexamsäure, 150 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0 besteht, 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden 50 µl 3 mmol/l HD-Val-Leu-Lys-pNA in 1,2 mol/l KCl, 180 mmol/l Arginin, pH 8 (oder in aqua dest. zur Kontrolle) zugesetzt und die entstehende Extinktionsänderung bei 405 nm verfolgt.

Ergebnis

Normales gepooltes Plasma ergibt eine delta A/min von 0,042, charakterisiert durch einen linearen Anstieg.

Wird das chromogene Plasminsubstrat in aqua dest. zugegeben, so ist der Anstieg der Extinktion gegen die Zeit hyperbelförmig, da fortlaufend Plasmin erzeugt wird, d. h. die Enzymprozes sierung nicht inhibiert wird.

Bestimmung der Kontaktaktivator-induzierten fibrinolytischen Aktivität von Plasma

50 µl Arginin/EDTA-Plasma (120 mmol/l Arginin) wird mit 50 µl 15 mmol/l Chloramin T® und 150 µl Testreagenz, bestehend aus 50 µg/ml Ellagsäure in 100 mmol/l Tris, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0, 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann werden 50 µl 3 mmol/l HD-Val-Leu-Lys-pNA in 2 mol/l KCl, 300 mmol/l Arginin, 10 mmol/l Tranexamsäure zugegeben, bei 45°C inkubiert und die Extinktionsänderung/15 Minuten bei 405 nm bestimmt. Ergebnis: Der Normalbereich der Kontaktphasen-aktivierten, fibrinoly tischen Aktivität liegt bei 100% ± 30% (Mittelwert ± Stan dardabweichung) (100% = ca. 0,100 Extinktionsein heiten/15 Minuten).

Beispiel 3 Nachweis amidolytischer Enzymaktivität in Blut und Plasma

Von n = 23 normalen Blutspendern wurden 50 µl Plasma (mit 120 mmol/l Arginin und 7 mmol/l EDTA antikoaguliert), außerdem 50 µl Thrombinstandard (0,1 NIH-Einheiten (100 mU)/ml in 150 mmol/l Tris, 120 mmol/l Arginin, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0), 50 µl Plasminstandard (0,01 CTA-Einheiten (10 mU)/ml in 150 mmol/l Tris, 120 mmol/l Arginin, 0,1% Triton X 100®, pH 8,0) mit 100 µl 75 mmol/l Tris, 600 mmol/l KCl, 150 mmol/l Arginin, pH 8,0, enthaltend

a) 1.5 mmol/l chromogenes Substrat für Thrombin HD-Phe-Pip-Arg-pNA
b) 1.5 mmol/l chromogenes Substrat für Faktor Xa Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA
c) 1.5 mmol/l chromogenes Substrat für Protein Ca <Glu-Pro-Arg-pNA
d) 1.5 mmol/l chromogenes Substrat für Plasmin HD-Val-Leu-Lys-pNA
e) 1.5 mmol/l chromogenes Substrat für PMN Elastase <Glu-Pro-Val-pNA

35 Minuten bei 45°C (Erhitzungsblock für Mikrotiterplatten, Turnhout, Belgien) inkubiert. Daraufhin wurde die spezifische Extinktionsänderung bei 405 nm (und gegebenenfalls ein Trübungsausgleich bei 490 nm) bestimmt. Als Nullwert diente die Messung nach 5 Minuten Inkubation. Alternativ dazu kann das Substrat-Reagenz in 50 µl 2 × konzentriert und zusätzlich 50 µl 40 mmol/l Chloramin T® zugesetzt oder 600 mmol/l KCl, 150 mmol/l Arginin, pH 8, beispielsweise durch 300 mmol/l eines Guanidinogruppen-tragenden Enzymprozessierungs-Inhibitors, pH 7 bis 11, vorzugsweise pH 8 bis 10, ersetzt werden. Vorteilhaft ist ein Reaktionsgemisch-Reagenz aus Enzymprozessierungs- Inhibitor und Singulett-Sauerstoff-Erzeuger. Falls α2-Antiplasmin inhibiert werden soll, kann statt (oder in Kombination mit) dem Singulett-Sauerstoff-Freisetzer Chloramin auch eine omega-Aminocarbonsäure, vorzugsweise Tranexamsäure, in einer Konzentration von 5 mmol/l, oder die vierfache Menge an epsilon-Aminocapronsäure, oder die 40fache Menge an Lysin, zugesetzt werden.

Ergebnis

In normalem menschlichen Plasma ist amidolytische Enzymaktivi tät nachzuweisen. Dabei handelt es sich zum größten Teil um durch α2-Makroglobulin komplexiertes Enzym. 3,1 ± 1,46 (NIH) mU/ml Thrombin, 2,6 ± 0,62 (CTA) mU/ml Plasmin und 16,2 ± 7,4 ng/ml aktive Elastase konnten bei Gesunden (Mittelwert ± Standardabweichung) nachgewiesen werden.

Eine Bestimmung dieses Parameters ist von großem klinischen Interesse, da er eine Gerinnungs-(Thrombin, Faktor Xa, Protein Ca), Fibrinolyse-(Plasmin) oder Entzündungs-(Elastase)Akti vierung anzeigt. Krankheiten wie Thrombose und Präthrombose, Hyperfibrinolyse, Sepsis oder Transplantatabstoßungskrisen können so einfach und schnell diagnostiziert werden. Die Inku bation bei < 37°C ist von Vorteil, da sie die Reaktionsgeschwin digkeit beschleunigt und die Enzymprozessierung inhibiert.

Beispiel 4 Spezifischer Nachweis von löslichem Fibrin durch Protein/Protein-Interaktions-Inhibitor

25 µl a) normales (Arginin/EDTA) Plasma, welches mit 34 µg/ml löslichem Fibrin (Kabi, Mölndal, Schweden) supplemen tiert wurde, und

b) normales (Arginin/EDTA) Plasma, welches mit 1000 µg/ml BrCN-Fibrinogenspaltprodukten (Boehringer Mannheim, Deutschland) supplementiert wurde,
wurden inkubiert wie in folgender Aufstellung angegeben. Die zusammen mit dem t-PA-Substrat Plasminogen (oder alternativ dem t-PA) zugesetzte Konzentration an Arginin (oder Guanidinium) wurde variiert (13 bis 90 mmol/l Endkonzentration). Die erhaltenen Extinktionswerte für b) wurden durch die bei a) erhaltenen geteilt.
25 µl Plasma (120 mmol/l Arginin, 7 mmol/l EDTA)
+ 100 µl 9 CTA-Einheiten Lys-Plasminogen/ml in 100 mmol/l Tris, 0,05% Triton X 100®, 125 mmol/l Arginin, pH 8
+ 50 µl 12 mmol/l Chloramin T®
+ 50 µl 2,5 µg t-PA/ml in 30 mmol/l Natriumacetat, pH 4,2, 0.05% Triton 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
+ 25 µl 3 mmol/l HD-Val-Leu-Lys-pNA in 3,6 mol/l KCl delta A/min bei 405 nm ablesen

Bestimmungen bei 0 mmol/l Arginin (Endkonz.) erfolgten ohne Zusatz von Arginin in Plasma und Test. Zur Nullwertkontrolle wird dem Plasminogen-Reagenz 10 mmol/l Tranexamsäure (Aminomethylcyclohexansäure → Inhibition der t-PA Stimulation durch lösliches Fibrin) zugesetzt. Der erhaltene Wert wird vom Hauptwert abgezogen.

Ergebnis

70 mmol/l (Endkonz.) Arginin

a) delta A/min = 0,053
b) delta A/min = 0,0036

Ein hoher Quotient zeigt hohe Spezifität für Fibrin an, ein tiefer Wert zeigt an, daß der Test nicht zwischen Fibrin und Fibrinogenspaltprodukten diskriminiert. Je höher die zugesetzte Argininkonzentration, desto spezifischer wird Fibrin nachgewie sen. Die t-PA-Stimulation durch Flbrinogenspaltprodukte wird durch Arginin unterdrückt. So kann zwischen Thrombin- und Plasmin-Wirkung auf Blut unterschieden werden. Kovalent ver netztes Fibrin wird vom Protein/Protein-Interaktions-Inhibitor nicht entpolymerisiert, im Gegensatz zu polymerisiertem Frag ment X. Arginin oder Guanidinium inhibiert allerdings auch die Plasminogen-Aktivierung des zugefügten t-PA. Deswegen ergibt sich beim enzymatischen Test ein Optimum an Arginin zwischen 50 und 100 mmol/l Endkonz. Lösliches Fibrin oder polymerisiertes Fragment X kann auch über Antikörper nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Agens würde die Antikörperspezifität beträcht lich erhöhen.

Claims

1. Verfahren zum spezifischen Nachweisen von Enzymaktivität in Blutplasma oder einer anderen biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Probe vorhandene Enzymaktivität oder das Reaktionsprodukt einer Enzymakti vität in Gegenwart eines Enzymprozessierungs- und/oder eines Protein/Protein-Interaktions-Inhibitors bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymaktivität eines Hämostase-Enzyms und/oder einer Serinprotease bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymaktivität von Thrombin, Faktor VIIa, Faktor IXa, Faktor Xa, Protein Ca, Plasminogen-Aktivator, Plasmin, Elastase, Subtilisin oder Limulus-Endotoxin-aktivierbarer Protease bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymprozessierungs- und/oder Protein/Protein-Interaktions-Inhibitor ein Guanidino gruppen-enthaltendes Agens eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymprozessierungs- und/oder Protein/Protein-Interaktions-Inhibitor ein ionisches Reagenz eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als ionisches Reagenz ein Kaliumsalz, ein Caesiumsalz und/oder ein Guanidinogruppen-enthaltendes Agens eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Kaliumsalz Kaliumchlorid, als Caesiumsalz Caesiumchlorid und als Guanidinogruppen-enthaltendes Agens Arginin einge setzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Kaliumsalz in einer Endkonzentration von 270 bis 1000 mmol/l eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Kaliumsalz in einer Endkonzentration von 300 bis 800 mmol/l eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Caesiumsalz in einer Endkonzentration von 200 bis 800 mmol/l eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Guanidinogruppen-enthaltende Agens in einer End konzentration von 20 bis 300 mmol/l, vorzugsweise 120 bis 250 mmol/l, eingesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion der Enzymaktivi tät bei einer Temperatur von 37 bis 55°C bestimmt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion der Enzymaktivität bei einer Tempera tur von 45 ± 5°C bestimmt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion der Enzymaktivi tät bei einem pH-Wert von 7 bis 11, vorzugsweise von 8 bis 10, durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß lösliches Fibrin, Fibrinogendegrada tionsprodukte oder polymerisierte Fibrinogenderivate spe zifisch nachgewiesen werden.

16. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeich net, daß der Enzymprozessierungs- und/oder Protein/Pro tein-Interaktions-Inhibitor eine solche Temperatur aufweist, daß dessen Zugabe zu Blutplasma oder einer anderen biologischen Flüssigkeit zu einer Endtemperatur gemäß Anspruch 12 oder 13 führt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß zusammen mit dem Enzymprozessierungs und/oder Protein/Protein-Interaktions-Inhibitor ein Enzym substrat eingesetzt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Serinproteasen inhibitor-Inaktivator und/oder -Inhibitor, vorzugsweise Singulett-Sauerstoff und/oder omega-Aminocarbonsäure, eingesetzt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Singulett-Sauerstoff-Er zeuger, vorzugsweise Chloramin, eingesetzt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Chloramin in Mengen von 1 bis 3 µmol/50 µl Plasma einge setzt wird.