DE19525281C1

DE19525281C1 - Prodn. of riboflavin for e.g. fodder additive

Info

Publication number: DE19525281C1
Application number: DE19525281A
Authority: DE
Inventors: Bruno Kaesler; Georg Schmidt; Klaus-Peter Stahmann; Hermann Sahm
Original assignee: BASF SE; Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: BASF SE; Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1995-07-13
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2015-07-14

Abstract

Microbial prodn. of riboflavin comprises culturing microorganisms with resistance to substances that inhibit the enzyme isocitrate lyase. Also claimed are microorganisms with resistance to isocitrate lyase-inhibiting substances.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 sowie Mikroorganismen- Stämme gemäß den Ansprüchen 5 bis 8.The invention relates to a method for microbial production of riboflavin according to claims 1 to 4 and microorganism Strains according to claims 5 to 8.

Das Vitamin B₂, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin-B₂-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten u.ä. Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme eintreten. Das Vitamin B₂ hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc., eingesetzt.The vitamin B₂, also called riboflavin, is for humans and animals essential. If vitamin B₂ deficiency occurs, inflammation of the mouth and Throat mucous membranes, cracks in the corners of the mouth, itching and Inflammation in the skin folds etc. Skin damage, Conjunctivitis, decreased visual acuity and cloudiness of the Cornea on. In infants and children can Growth stagnation and weight loss occur. The vitamin B₂ therefore has economic importance especially as Vitamin preparation for vitamin deficiency and as a feed additive. It is also used as a food coloring, for example in Mayonnaise, ice cream, pudding etc. used.

Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei allerdings auch relativ kostspielige Ausgangsprodukte - wie beispielsweise D-Ribose - eingesetzt werden müssen. Daher kommt die chemische Synthese des Riboflavins nur für solche Anwendungszwecke in Betracht, für die reines Riboflavin notwendig ist, wie z. B. in der Humanmedizin. Riboflavin is produced either chemically or microbial. In the chemical manufacturing process, this is Riboflavin usually in multi-step processes than pure End product won, although also relatively expensive Starting products - such as D-Ribose - can be used have to. Hence the chemical synthesis of riboflavin comes only for such uses into consideration for the pure riboflavin is necessary, such as B. in human medicine.

Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavins bietet die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. So ist bekannt, daß Riboflavin beispielsweise von Ascomyceten, wie Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii, gebildet wird; aber auch Hefen, wie z. B. Candida, und Bakterien, wie Clostridium, sind zur Flavinproduktion geeignet. Die mikrobielle Herstellung des Riboflavins eignet sich insbesondere für solche Fälle, in denen eine hohe Reinheit dieser Substanz nicht erforderlich ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn das Riboflavin als Zusatz zu Futtermittelprodukten eingesetzt werden soll. In solchen Fällen bat die mikrobielle Herstellung des Riboflavins den Vorteil, daß diese Substanz in einem einstufigen Prozeß gewinnbar ist. Auch können als Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese nachwachsende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Öle, eingesetzt werden.It offers an alternative to the chemical production of riboflavin the production of this substance by microorganisms. So is known that riboflavin, for example, from Ascomycetes, such as Ashbya gossypii or Eremothecium ashbyii, is formed; but also Yeasts such as B. Candida, and bacteria such as Clostridium are used Suitable for flavin production. The microbial production of the Riboflavins is particularly suitable for those cases where a high purity of this substance is not necessary. This is the case, for example, when the riboflavin is added to be used for feed products. In such cases asked the microbial production of riboflavin the advantage that this substance can be obtained in a one-step process. Also can be used as starting materials for microbial synthesis renewable raw materials, such as vegetable oils, be used.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin zu schaffen, durch das ein erhöhter Anteil an Riboflavin gebildet wird.It is an object of the invention to provide a method for microbial Production of riboflavin to create an increased Proportion of riboflavin is formed.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mikroorganismen kultiviert werden, die resistent gegenüber auf die Isocitratlyase, einem wichtigen anaplerotischen Enzym beim Einsatz von pflanzlichen Ölen als Rohstoff, hemmend wirkenden Substanzen sind. Kulturen solcher Mikroorganismen-Stämme produzieren überraschenderweise einen höheren Anteil an Riboflavin als die entsprechenden Wildtyp-Stämme.This object is achieved in that Microorganisms are cultivated that are resistant to the Isocitrate lyase, an important anaplerotic enzyme when used of vegetable oils as raw material, inhibitory substances are. Produce cultures of such microorganism strains Surprisingly, a higher proportion of riboflavin than that corresponding wild-type strains.

Für die Selektion von Mikroorganismen-Stämmen mit erhöhter Riboflavin-Produktion können zunächst die auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen durch Einwirkung auf das Enzym in einem spezifischen Aktivitätstest identifiziert werden. Dies kann durch Einwirkung möglicher Hemmstoffe auf eine isolierte und gereinigte Isocitratlyase oder in einem Rohextraktassay erfolgen. Derartige, als Hemmstoffe durchgetesteten Substanzen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Es zeigte sich, daß eine Reihe von Stoffwechselmetaboliten die Isocitratlyase signifikant hemmen, wie beispielsweise Phosphoenolpyruvat (PEP), 6-P-Gluconat, Maleat, insbesondere aber Itaconat und Oxalat. Werden nunmehr Riboflavin produzierende Mikroorganismen-Stämme in Gegenwart solcher Hemmstoffe kultiviert, zeigt sich überraschenderweise, daß die Riboflavinbildung gehemmt ist. Dies äußert sich auf Kulturplatten in der Ausbildung von Kolonien, die nicht gelb werden, sondern weiß bleiben. Mit diesem System sind daher Stämme erkennbar, die gegen eine Isocitratlyase-Hemmung resistent sind, da solche Stämme auch in Gegenwart von Hemmstoff Riboflavin bilden und daher gelb gefärbte Kolonien ausbilden. Derartige Stämme können entweder durch Spontanmutation entstehen oder indem entsprechende Mutationen durch gängige Methoden, wie beispielsweise chemisch oder durch UV-Bestrahlung, induziert werden. Es können somit Mikroorganismen-Stämme gewonnen werden, die einen erhöhten Anteil an Riboflavin in das Kulturmedium ausscheiden.For the selection of microorganism strains with increased Riboflavin production can initially be based on the isocitrate lyase inhibitory substances by acting on the enzyme in a specific activity test. This can by the action of possible inhibitors on an isolated and purified isocitrate lyase or in a crude extract assay. Such substances, tested as inhibitors, are in Table 2 summarized. It turned out that a number of Metabolic metabolites that significantly inhibit isocitrate lyase, such as for example phosphoenolpyruvate (PEP), 6-P-gluconate, maleate, but especially itaconate and oxalate. Now become riboflavin producing microorganism strains in the presence of such Cultivated inhibitors surprisingly shows that the Riboflavin formation is inhibited. This manifests itself on culture plates in the formation of colonies that do not turn yellow, but stay white. With this system, therefore, strains are recognizable that are resistant to isocitrate lyase inhibition since such strains form riboflavin even in the presence of inhibitor and therefore yellow form colored colonies. Such strains can either arise from spontaneous mutation or by corresponding Mutations by common methods, such as chemical or induced by UV radiation. So it can Microorganism strains are obtained that have an increased proportion excrete into the culture medium on riboflavin.

Erfindungsgemäß wird zur Kultivierung als resistenter Mikroorganismen-Stamm vorzugsweise der als Riboflavin-Produzent gut bekannte Pilz Ashbya gossypii eingesetzt. Als resistenter Stamm mit erhöhter Riboflavinbildung wurde insbesondere der bei der DSM unter der Nr. 10067 hinterlegte Ashbya gossypii-Stamm erhalten.According to the invention, cultivation is considered to be more resistant Microorganism strain preferably as the riboflavin producer well-known mushroom Ashbya gossypii used. As more resistant Strain with increased riboflavin formation was especially the case of the Ashbya gossypii strain deposited by DSM under number 10067 receive.

Embodiment 1. Purification of an Isocitrate Lyase (ICL)

Zur Identifizierung von auf ICL hemmend wirkenden Substanzen wurde zunächst die ICL aus Ashbya gossypii gereinigt. Die Isolierung und Reinigung des Enzyms erfolgte nach Wachstum des Pilzmycels auf Pflanzenöl. Die einzelnen Reinigungsschritte sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt: Demgemäß enthält ein typischer, aus ca. 25 g Mycel hergestellter Rohextrakt, der durch Zellaufschluß mit einer French-Press gewonnen wurde, 220 Einheiten ICL-Aktivität. Etwa 78% davon sind nach Zentrifugation bei 40 000 g gelöst im Überstand wiederzufinden. Eine anschließende fraktionierte Ammoniumsulfatfällung führt zu einer dreifachen Anreicherung des Enzyms. Nach einer Gelfiltration mit einer Sephacryl S-300 Säule wird die ICL an den Kationenaustauscher Mono S-Sepharose gebunden und mit NaCl eluiert. Das so erhaltene Präparat ist homogen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und hat eine spezifische Aktivität von 18,4 U/mg.For the identification of ICL inhibiting substances first cleaned the ICL from Ashbya gossypii. The insulation and Purification of the enzyme took place after growth of the fungal mycelium Vegetable oil. The individual cleaning steps are in Table 1 summarized: Accordingly, a typical, from about 25 g contains mycelium prepared crude extract, which by cell disruption with a French Press was won, 220 units of ICL activity. About 78% of which, after centrifugation at 40,000 g, are dissolved in the supernatant to find again. A subsequent fractional Ammonium sulfate precipitation leads to a three-fold enrichment of the Enzyme. After gel filtration with a Sephacryl S-300 column the ICL is bound to the Mono S-Sepharose cation exchanger and eluted with NaCl. The preparation thus obtained is homogeneous in the SDS polyacrylamide gel electrophoresis and has a specific Activity of 18.4 U / mg.

2. Identification of ICL inhibitors

Mit dem gereinigten Enzym lassen sich in einem colorimetrischen Test (Dixon, H. und Kornberg, H.L. (1959), Biochem. J. 72, 3: Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle) Einflüsse von Substanzen auf die Aktivität messen. In Tabelle 2 und Fig. 1 sind die Effekte der getesteten Substanzen auf das Enzym zusammengefaßt bzw. dargestellt. Untersucht wurden zum einen Substanzen, die als Metaboliten in der Pilzzelle einen hemmenden Effekt auf das Enzym haben könnten. Darunter zeigten 6-P-Gluconat und Phosphoenolpyruvat die deutlichsten Hemmwirkungen mit über 50% bei einer Konzentration von 10 mM. Erheblich besser wirkten jedoch Itakonat und Oxalat, die vermutlich nicht im Stoffwechsel des Pilzes vorkommen. Bereits eine Konzentration von 1 mmol führte zu 78% bzw. 95% Hemmung.With the purified enzyme, the effects of substances on the activity can be measured in a colorimetric test (Dixon, H. and Kornberg, HL (1959), Biochem. J. 72, 3: Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle). The effects of the substances tested on the enzyme are summarized or shown in Table 2 and FIG. 1. On the one hand, substances that could have an inhibitory effect on the enzyme as metabolites in the fungal cell were examined. Among them, 6-P-gluconate and phosphoenolpyruvate showed the most significant inhibitory effects with over 50% at a concentration of 10 mM. However, itaconate and oxalate, which are probably not found in the metabolism of the fungus, worked considerably better. Already a concentration of 1 mmol led to 78% or 95% inhibition.

3. Characterization of a mutant selected with itaconate

Durch UV-Bestrahlung von isolierten Sporen des Pilzes lassen sich Mutationen im Erbmaterial erzeugen. Mit einer Strahlendosis, bei der 10-20% der eingesetzten Sporen überleben, erhält man Mutanten, die gegen eine Hemmung der Riboflavinbildung durch Itakonat resistent sind. Eine so isolierte Mutante zeigt bei Wachstum auf Sojaöl eine 25fache Riboflavinbildung im Vergleich zum Ausgangsstamm (Fig. 2). Die spezifische ICL-Aktivität ist während der Riboflavinbildungsphase um bis zu 15% erhöht (Fig. 2). Mit Antikörpern läßt sich zeigen, daß die Proteinmenge erhöht ist. Die ICL aus der Mutante zeigt das gleiche Hemmverhalten durch Itakonat wie der Ausgangsstamm.Mutations in the genetic material can be generated by UV radiation from isolated spores of the fungus. With a radiation dose in which 10-20% of the spores used survive, mutants are obtained which are resistant to inhibition of riboflavin formation by itaconate. A mutant isolated in this way shows a 25-fold riboflavin formation when grown on soybean oil compared to the starting strain ( FIG. 2). The specific ICL activity is increased by up to 15% during the riboflavin formation phase ( FIG. 2). Antibodies show that the amount of protein is increased. The ICL from the mutant shows the same inhibitory behavior by itaconate as the parent strain.

4. Correlation between riboflavin formation and specific ICL activity

Einen überraschenden Hinweis auf einen kausalen Zusammenhang zwischen ICL und Riboflavinbildung liefert die Beobachtung, daß der Pilz, wenn Glucose als Substrat angeboten wird, erst nach Verbrauch der Glucose mit der Produktion beginnt. Genau dann wird auch die ICL, die zuvor durch Glucose reprimiert ist, im Rohextrakt meßbar und steigt bis zu Aktivitäten, wie sie bei Wachstum auf Öl gefunden werden, an (Fig. 3).A surprising indication of a causal relationship between ICL and riboflavin formation is the observation that the fungus, when glucose is offered as a substrate, only begins to produce after the glucose has been consumed. It is precisely then that the ICL, which is previously repressed by glucose, becomes measurable in the crude extract and rises to the level of activities which are found when growing on oil ( FIG. 3).

Claims

1. Process for the microbial production of riboflavin Cultivation of microorganisms with resistance to substances that inhibit isocitrate lyase.

2. The method according to claim 1, characterized, that the substances which inhibit isocitrate lyase by acting on the enzyme in a specific Activity test can be identified.

3. The method according to claim 1 or 2, marked by Cultivation of microorganisms with resistance to the Inhibitors itaconate or oxalate.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that to cultivate the fungus Ashbya gossypii with resistance against substances that inhibit isocitrate lyase is used.

5. Microorganisms resistant to isocitrate lyase inhibitory substances.

6. Microorganisms according to claim 5 with resistance to the Inhibitors itaconate or oxalate.

7. microorganism strain according to claim 5 or 6, characterized, that this is the mushroom Ashbya gossypii.

8. microorganism strain according to claim 7, marked by the Ashbya gossypii DSM 10067 strain.