DE19519250C1 - Chamber for microscopic counting of cellular elements in liq. - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft eine Zählkammer zur mikroskopischen Zählung zellulärer Elemente in Flüssigkeiten gemäß Patentanspruch 1. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer solcher Zählkammer zur mikroskopischen Zählung zellulärer Elemente in Flüssigkeiten.The invention relates to a counting chamber for microscopic counting cellular elements in liquids according to claim 1. The invention also refers to the use of such a counting chamber microscopic counting of cellular elements in liquids.
Zur Zählung zellulärer Elemente in Flüssigkeiten, insbesondere zur Zählung von Leukozyten in Blut oder Blutprodukten, aber auch von Erythrozyten sowie zur Untersuchung von Harn- oder Lumbalflüssigkeit finden häufig Zählkammern Verwendung. Dazu wird ganz allgemein die zu untersuchende Flüssigkeit auf eine Glasträgerplatte aufgebracht. In deren Mitte befindet sich zwischen zwei Seitenstegen ein (meist quadratisches) Zählnetz, das tiefer als die Seitenstege liegt. Durch Abdecken mit einem - zumeist planparallel geschliffenen und polierten - Deckglas wird von diesem Zählnetz ein exakt definiertes Volumen umgrenzt, in dem die verschiedenen zellulären Elemente unter dem Mikroskop ausgezählt werden.For counting cellular elements in liquids, especially for counting of leukocytes in blood or blood products, but also of erythrocytes as well for examining urinary or lumbar fluid are common Counting chambers use. For this purpose, the one to be examined is very general Liquid applied to a glass support plate. In the middle is a (mostly square) counting network between two side bridges that is deeper than the side bridges lies. By covering with a - mostly plane-parallel ground and polished - the cover slip becomes an exact from this counting network defines defined volume in which the various cellular elements be counted under the microscope.
In DIN 12 847 sind diese Zellenzählkammern genormt. Diese Norm legt insbesondere meßtechnisch wichtige Maße, Form- und Lagetoleranzen fest. Dazu wird die oben beschriebene Anordnung exakt beschrieben und definiert. Die eigentliche Zählkammer soll demnach eine Tiefe von 0,1 mm oder 0,2 mm besitzen und die Abstände der Netzeinteilung sollen 0,05 mm, 0,2 mm oder 0,25 betragen, so daß man also Einzelquadrate von 0,0025 mm², 0,04 mm² bzw. 0,0625 mm² Fläche erhält. Wie viele dieser Einzelquadrate in welcher Art und Weise zu Einheiten zusammengefaßt werden, um letztendlich zelluläre Bestandteile auszuzähen, wird von der DIN-Norm nicht vorgeschrieben, sondern den speziellen Ausführungen überlassen.These cell counting chambers are standardized in DIN 12 847. This norm sets dimensions, shape and position tolerances that are particularly important in terms of measurement technology. For this purpose, the arrangement described above is exactly described and defined. The actual counting chamber should therefore have a depth of 0.1 mm or 0.2 mm and the spacing of the network division should be 0.05 mm, 0.2 mm or 0.25, so that you have single squares of 0.0025 mm², 0.04 mm² or 0.0625 mm² area. How many of these single squares in what way to be grouped together to ultimately The DIN standard does not cut out cellular components prescribed, but left to the special versions.
Je nach Verwendungszweck sind verschiedene Ausführungsformen bekannt. Am gebräuchlichsten sind Zählkammern nach Neubauer und nach Fuchs- Rosenthal. Die Neubauer-Kammer hat ein Zählnetz mit einer Seitenlänge von 3 mm, also eine Gesamtfläche von 9 mm², die sich aus 9 Einzelquadraten mit je 1 mm² Fläche zusammensetzt. Die Tiefe der Zählkammer beträgt 0,1 mm, so daß man über jedem dieser Einzelquadrate ein Volumen von 0, 1 µl erhält. Zur Zählung von Leukozyten werden die 4 Eckquadrate ausgezählt, also ein Gesamtvolumen von 0,4 µl. Üblicherweise wird mit verdünntem Blut (1 : 10) gearbeitet und zwei Kammern ausgezählt, so daß sich die Sensitivität der Methode (Anzahl der noch zählbaren Leukozyten pro µl) aus der Anzahl n der gezählten Leukozyten Verdünnungsfaktor F je zweifaches Volumenelement 2 · V ergibt:Different embodiments are known, depending on the intended use. The most common are counting chambers according to Neubauer and Fuchs Rosenthal. The Neubauer chamber has a counting network with a side length of 3 mm, ie a total area of 9 mm², which consists of 9 individual squares with each 1 mm² area. The depth of the counting chamber is 0.1 mm, see above that a volume of 0.1 µl is obtained over each of these individual squares. For Counting leukocytes, the 4 corner squares are counted, i.e. one Total volume of 0.4 µl. Usually with diluted blood (1:10) worked and counted two chambers, so that the sensitivity of the Method (number of leukocytes still countable per µl) from the number n of counted leukocyte dilution factor F per double volume element 2V gives:
Für die Neubauer-Kammer erhält man für n = 1, F = 10 und V = 0,4 µl (siehe oben) eine Sensitivität von 12,5 Leukozyten/µl, das entspricht einer Menge von 6,25 .106 Leukozyten pro Einheit Blut (eine Einheit = 500 ml). Eine höhere Sensitivität besitzt die Kammer nach Fuchs-Rosenthal. Hier werden bei einer Tiefe von 0,2 mm und einer Seitenlänge des Zählnetzes von 4 mm (16 mm² Fläche) 4 der 16 Einzelquadrate (jeweils 1 mm² Fläche bzw. 0,2 µl Volumen) ausgezählt, also ein Volumen von insgesamt 0,8 µl. Die Sensitivität der Zelle nach Fuchs-Rosenthal beträgt somit 6,25 Leukozyten/µl, d. h. die minimal auszählbare Leukozytenmenge beträgt 3,125 · 10⁶ Leukozyten pro Einheit.For the Neubauer chamber one obtains for n = 1, F = 10 and V = 0.4 µl (see above) a sensitivity of 12.5 leukocytes / µl, which corresponds to one Amount of 6.25.106 leukocytes per unit blood (one unit = 500 ml). The Fuchs-Rosenthal chamber is more sensitive. Here are at a depth of 0.2 mm and a side length of the counting network of 4 mm (16 mm² area) 4 of the 16 individual squares (each 1 mm² area or 0.2 µl volume) counted, i.e. a total volume of 0.8 µl. The The sensitivity of the cell according to Fuchs-Rosenthal is 6.25 leukocytes / µl, d. H. the minimum countable amount of leukocytes is 3.125 · 10⁶ Leukocytes per unit.
Im Zusammenhang mit den Fortschritten in der Transfusionsmedizin erkannte man zunehmend die Bedeutung der Leukozyten für verschiedene, bei Transfusionen auftretende Reaktionen, sowie deren Funktion als Wirt für verschiedene Viren. Daher steigt das Spektrum der Indikationen zur Applikation von "leukozytenfreien" Blutprodukten ständig an. Erweiterte Auflagen zur Qualitätssicherung und -kontrolle bedingen daher den Nachweis der Restkontamination in leukozytendepletierten Blutprodukten durch Zählung der Leukozyten. Detected in connection with advances in transfusion medicine one increasingly increases the importance of leukocytes for different Transfusions occurring reactions, as well as their function as host for different viruses. Therefore, the range of indications increases Application of "leukocyte-free" blood products constantly. Advanced Requirements for quality assurance and control therefore require proof the residual contamination in leukocyte-depleted blood products by counting of leukocytes.
Heutige moderne Leukozytenfilter erreichen bereits derart hohe Leukozyten- Entfernungswerte, daß die Restmenge an Leukozyten je Bluteinheit deutlich unter der Sensitivität sowohl der Neubauer-Kammer als auch der Kammer nach Fuchs-Rosenthal liegt.Today's modern leukocyte filters already reach such high leukocyte Distance values that the remaining amount of leukocytes per blood unit clearly under the sensitivity of both the Neubauer chamber and the chamber Fuchs-Rosenthal lies.
Während vor wenigen Jahren nach Filtration zur Entfernung von Leukozyten noch Leukozytenrestmengen von 2 · 10⁷ Leukozyten pro Einheit (40 Leukozyten/µl) als sehr guter Wert galten (das entspricht bei einer Ausgangskonzentration von rund 2 · 10⁹ Leukozyten pro Einheit einer Entfernungsrate von 99%), betragen heute die Leukozytenrestmengen nach Filtration weniger als 2 · 10⁵ Leukozyten pro Einheit (0,4 Leukozyten/µl) (was einer Entfernungsrate von 99,99% entspricht). Dies ist um einen Faktor 10 weniger als mit den beiden oben beschriebenen Zählkammern nachweisbar ist.During a few years after filtration to remove leukocytes still leukocyte residues of 2 · 10⁷ leukocytes per unit (40 leukocytes / µl) were considered a very good value (this corresponds to one Initial concentration of around 2 · 10⁹ leukocytes per unit one Removal rate of 99%), the residual leukocyte amounts today Filtration less than 2 · 10⁵ leukocytes per unit (0.4 leukocytes / µl) (which corresponds to a removal rate of 99.99%). This is by a factor 10 less than with the two counting chambers described above is detectable.
Um nun eine höhere Sensitivität zu erreichen, muß - gleiche Verdünnung vorausgesetzt - das Volumenelement V, in welchem gezählt wird, vergrößert werden.In order to achieve a higher sensitivity, the same dilution must be used provided - the volume element V in which counting is increased will.
Eine einfache Möglichkeit besteht darin, in allen vorhandenen Flächenelementen (anstatt nur einer Auswahl) zu zählen, was aber einen stark erhöhten Zeitaufwand bedeutet. Zum Beispiel bei der Kammer nach Fuchs- Rosenthal führt dies jedoch bereits zu einer Verbesserung der Sensitivität auf 1,5625 Leukozyten pro µl!An easy way is in all existing ones Counting surface elements (instead of just a selection), which is strong means increased expenditure of time. For example, in the Fuchs Chamber However, Rosenthal already lists this as an improvement in sensitivity 1.5625 leukocytes per µl!
Weitere Verbesserungen können erreicht werden durch:Further improvements can be achieved by:
- - eine größere Grundfläche des Zählnetzes- a larger footprint of the counting network
- - eine größere Tiefe der Kammer.- a greater depth of the chamber.
Eine größere Grundfläche hat allerdings einen nochmals sehr stark erhöhten Zeitaufwand bei der Auszählung der Zellen mit dem Mikroskop zur Folge. Bei etwa 100- bis 400facher Vergrößerung, wie zur Zählung üblicherweise verwendet, ist nur ein geringer Ausschnitt des Zählnetzes zu überblicken. Vergrößert man nun die Fläche des Zählnetzes, so dauert es länger, bis man die ganze Fläche mit dem Mikroskop kontrolliert hat. Eine Kantenlänge des Zählnetzes von etwa 1 cm stellt eine Grenze dar, bis zu welcher der Zeitaufwand noch vertretbar erscheint. Auch mit solchen Abmessungen ist aber die Sensitivität, die zur Bestimmung der Leukozytenrestmenge in mit modernen Filtern leukozytendepletierten Blutprodukten notwendig ist, noch nicht zu erreichen.However, a larger footprint has a very large increase Time spent counting the cells with a microscope. At about 100 to 400 times magnification, as is customary for counting only a small section of the counting network can be seen. If you now increase the area of the counting network, it takes longer to get checked the whole area with the microscope. An edge length of the Counting network of about 1 cm represents a limit up to which the Time expenditure still seems reasonable. But even with such dimensions the sensitivity required to determine the amount of leukocytes in modern Filtering leukocyte-depleted blood products is not yet necessary to reach.
In der Frage der Tiefe der Kammer waren bisher 0,1 mm Standard, die 0,2 mm der Kammer nach Fuchs-Rosenthal bereits extrem viel.When it came to the depth of the chamber, 0.1 mm was standard, the 0.2 mm of the Fuchs-Rosenthal chamber is already extremely large.
Größere Tiefen galten als problematisch, da zum einen die Durchsicht durch die dickeren Schichten durch die in den zu untersuchenden Flüssigkeiten anwesenden großen Mengen an Substanzen mit zunehmender Schichtdicke immer schlechter wird, das Blickfeld also immer dunkler und kontrastärmer wird und zum anderen bei großen Schichtdicken Fokussierungsprobleme auftreten. Durch das Mikroskop betrachtet läßt sich hier nicht mehr die gesamte Schichtdicke scharf stellen, sondern es können nur noch einzelne Ebenen innerhalb der Schicht fokussiert werden. Da die Schwerkraft auf die in den Flüssigkeiten vorhandenen zellulären Bestandteile wirkt, sedimentieren diese ständig aus dem Schärfebereich, so daß nachreguliert werden muß und man nicht sicher sein kann, ob ein im Gesichtsfeld gerade scharfgestelltes Teilchen bereits gezählt ist oder nicht.Greater depths were considered problematic because, on the one hand, the view through the thicker layers due to the liquids to be examined present large amounts of substances with increasing layer thickness is getting worse, so the field of vision is getting darker and less contrasting and on the other hand with focusing problems with large layer thicknesses occur. When viewed through a microscope, it is no longer possible focus the entire layer thickness, but only a few can Layers can be focused within the layer. Because gravity is on the in the cellular components present in the liquids act, sediment these constantly out of focus, so that must be readjusted and one cannot be sure whether one is in focus in the field of view Particle is already counted or not.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Zählkammer zur Verfügung zu stellen, mit der zelluläre Bestandteile in Flüssigkeiten in Konzentrationen von unter 1 · 10⁵ Leukozyten pro Einheit, bevorzugt bis zu 5 · 10⁴ Leukozyten pro Einheit, entsprechend einer Sensibilität von 0,1 Leukozyt/µl bestimmt werden können.The object of the invention is to provide a counting chamber with the cellular components in liquids in concentrations below 1 · 10⁵ Leukocytes per unit, preferably up to 5 · 10⁴ leukocytes per unit, can be determined according to a sensitivity of 0.1 leukocyte / µl.
Dies wird durch die erfindungsgemäße Zellkammer gemäß Anspruch 1 gelöst.This is solved by the cell chamber according to the invention according to claim 1.
Überraschenderweise treten diese Probleme bei der erfindungsgemäßen Zählkammer nicht auf, obwohl dort die Tiefe erfindungsgemäß mehr als 0,4 mm, bevorzugt etwa 0,5 mm beträgt.Surprisingly, these problems occur with the invention Not counting chamber, although according to the invention the depth there is more than 0.4 mm, preferably about 0.5 mm.
Trotz der großen Tiefe ist die Durchsicht durch die Zählkammer noch sehr gut möglich, der Kontrast zur Unterscheidung der zellulären Bestandteile gut.Despite the great depth, the view through the counting chamber is still very good possible, the contrast to differentiate the cellular components well.
Auch die Sedimentationsgeschwindigkeit der zellulären Bestandteile bereitete überraschenderweise nicht die erwarteten Probleme, so daß trotz der Notwendigkeit des Nachfokussierens exakte Zählungen vorgenommen werden können.The sedimentation rate of the cellular components also prepared Surprisingly not the expected problems, so that despite the Precise counts need to be refocused can.
Die erfindungsgemäße Zählkammer weist eine Glasträgerplatte mit einem Zählnetz in der Mitte zwischen zwei Seitenstegen auf. Das Zählnetz liegt dabei tiefer als die beiden Seitenstege, so daß sich zwischen dem Zählnetz und einem auf die Seitenstege aufgelegten, bevorzugt planparallel geschliffenen und polierten Deckglas ein Raum ergibt, der eine definierte Tiefe besitzt.The counting chamber according to the invention has a glass carrier plate with a Counting net in the middle between two side bars. The counting network is there deeper than the two side webs, so that there is between the counting network and one placed on the side webs, preferably plane-parallel ground and polished cover glass results in a space that has a defined depth.
Das erfindungsgemäße Zählnetz wird mit geeigneten Methoden in die Glasoberfläche eingebracht. Bevorzugt wird es mit einem Diamanten eingeritzt.The counting network according to the invention is integrated into the Glass surface introduced. It is preferably carved with a diamond.
Das erfindungsgemäße Zählnetz besteht aus Quadraten mit Kantenlängen von etwa 0,35 bis 0,65 mm, bevorzugt etwa 0,4 bis 0,6 mm, besonders bevorzugt etwa 0,5 mm. Über diesen Quadraten werden durch das auf die Stege aufgelegten Deckglas Volumenelemente aufgespannt, deren Tiefe mehr als 0,4 mm, bevorzugt etwa 0,5 mm beträgt. Diese Volumenelemente haben somit Kantenlängenverhältnisse von etwa 1 : 1 : 0,8 bis etwa 1 : 1 : 1,2, bevorzugt etwa 1 : 1 : 1. Die Quadrate bilden wiederum ein größeres Quadrat mit einer Kantenlänge von etwa 7 bis 13 mm, bevorzugt etwa 8 bis 12 mm, besonders bevorzugt etwa 10 mm. Dieses Quadrat umgrenzt die Gesamtfläche des Zählnetzes. Das von Zählnetz, Deckglas und Glasträgerplatte umgrenzte Kammervolumen beträgt mehr als 40 µl, bevorzugt etwa 45 bis 55 µl, besonders bevorzugt etwa 50 µl.The counting network according to the invention consists of squares with edge lengths of about 0.35 to 0.65 mm, preferably about 0.4 to 0.6 mm, particularly preferred about 0.5 mm. Above these squares are on the bridges put on cover glass volume elements stretched, their depth more than 0.4 mm, preferably about 0.5 mm. These volume elements therefore have Edge length ratios of about 1: 1: 0.8 to about 1: 1: 1.2, preferably about 1: 1: 1. The squares in turn form a larger square with a Edge length of about 7 to 13 mm, preferably about 8 to 12 mm, particularly preferably about 10 mm. This square defines the total area of the Counting network. That bordered by counting net, cover glass and glass carrier plate Chamber volume is more than 40 µl, preferably about 45 to 55 µl, particularly preferably about 50 ul.
Die erfindungsgemäße Zählkammer kann zur Zählung zellulärer Elemente in Flüssigkeiten verwendet werden. Besonders geeignet ist die erfindungsgemäße Zählkammer zur Zählung von Leukozyten in Blut oder Blutprodukten, ganz besonders zur Zählung der Leukozytenrestmenge in Blut oder Blutprodukten nach Leukozytenentfernung.The counting chamber according to the invention can be used to count cellular elements in Liquids are used. The one according to the invention is particularly suitable Counting chamber for counting leukocytes in blood or blood products, whole especially for counting the amount of leukocytes in blood or blood products after removal of leukocytes.
Gemäß der oben beschriebenen besonders bevorzugten Ausführung der Zählkammer besitzt die Zählkammer bei der üblichen Art der Zählung von Leukozyten eine Sensibilität von 0, 1 Leukozyt/µl bzw. 5 · 10⁴ Leukozyten pro Einheit.According to the particularly preferred embodiment of the Counting chamber has the counting chamber in the usual way of counting Leukocytes a sensitivity of 0, 1 leukocyte / µl or 5 · 10⁴ leukocytes per Unit.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Zählnetz der erfindungsgemäßen Zählkammer eine quadratische Grundstruktur. Dies ist Voraussetzung dafür, daß die erfindungsgemäße Zählkammer gemäß der deutschen Eichordnung eichbar ist. Dies wiederum ist Voraussetzung für die Zulassung und damit für die Verwendung zur Erhebung diagnostischer Daten von zellulären Bestandteilen in Flüssigkeiten. Zählkammern, deren kleinste Grundflächen nicht quadratisch, sondern beispielsweise rechteckig sind, dürfen hiernach nicht für diagnostische Zwecke, sondern allenfalls für wissenschaftliche Untersuchungen verwendet werden.In a preferred embodiment, the counting network has counting chamber according to the invention a square basic structure. This is Prerequisite for the counting chamber according to the invention German calibration regulations is verifiable. This in turn is a requirement for Approval and therefore for use in the collection of diagnostic data of cellular components in liquids. Counting chambers, their smallest Base areas are not square, but are, for example, rectangular hereafter not for diagnostic purposes, but at most for scientific studies are used.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist die erfindungsgemäße Zählkammer auf der in Arbeitsstellung oben liegenden Seite der Glasträgerplatte mit einer aufgedampften Rhodiumschicht versehen, in die das Zählnetz eingebracht, bevorzugt mit einem Diamanten eingeritzt, ist. Der Vorteil dieser Ausführung ist eine verbesserte Zellerkennung bei guter Linienausleuchtung im Phasenkontrastmikroskop.In a further preferred embodiment, the invention is Counting chamber on the side of the top in the working position Glass plate with a vapor-deposited layer of rhodium, in which the Counting network introduced, preferably carved with a diamond. Of the The advantage of this design is an improved cell recognition with good Line illumination in a phase contrast microscope.
Die erfindungsgemäße Zählkammer genügt allen Anforderungen, die von einer modernen, praktischen, schnellen und empfindlichen Meßmethode entsprechend der Aufgabenstellung gefordert werden.The counting chamber according to the invention meets all the requirements of one corresponding to modern, practical, fast and sensitive measuring methods the task.
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Non-Patent Citations (1)
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