Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis eines
in einer Probe enthaltenen Antikörpers durch Bindung des nach
zuweisenden Antikörpers an ein bezüglich des nachzuweisenden
Antikörpers spezifisches Antigen.The invention relates to a method for the detection of a
Antibody contained in a sample by binding the
Antibody to be assigned to an antibody to be detected
Antibody specific antigen.
Verfahren der eingangs genannten Art werden als Immuntests be
zeichnet und sind im besonderen als Serumtests bekannt, bei
welchen immobilisierte Antigene nach einem Blocken mit dem
Serum, in welchem Antikörper nachgewiesen werden sollen, in
Kontakt gebracht werden. Ein bekannter Test, welcher unter die
Gruppen der sogenannten "Enzyme Linked Immunosorbent Assays
(ELISA) fällt, ist hiebei beispielsweise für den Nachweis einer
HIV-Infektion entwickelt worden. Analoge Tests sind naturgemäß
auch für andere virale Infektionen bereits bekannt, wobei je
weils der gegen den Virus gebildete Antikörper durch eine Anti
körper-Antigen-Reaktion nachgewiesen werden soll. Im bekannten
Fall wird hiebei auf eine Mikrotiterplatte immobilisiertes HIV-
Antigen aufgebracht, worauf ein erstmaliges Waschen erfolgt.
Nach einem Blocking mit Rinderserumalbumin wird ein
Patientenserum aufgetragen, worauf nach einer längeren Inkuba
tionszeit eine Bindung der gegen den Virus gebildeten
Antikörper am Antigen erfolgt. In der Folge ist wiederum ein
Waschen erforderlich, worauf die erfolgte Antikörper-Antigen-
Reaktion durch geeignete Mittel sichtbar gemacht werden muß. Zu
diesem Zweck werden bei dem bekannten Test durch einen zweiten
Antikörper oder ein weiteres Antigen, welche selbst wiederum
enzymmarkiert sind, die am immobilisierten Antigen gebundenen
Antikörper detektiert, wobei das Enzym gleichzeitig als Marker
und als Signalverstärker wirksam wird. Bei diesen bekannten
HIV-Tests erfolgt die im wesentlichen gleiche Antigen-
Antikörper-Reaktion zweifach, so daß eine Fehlreaktion stati
stisch entsprechend doppelt auftreten kann. Ein bedeutendes
Problem derartiger Tests ist immer ein hoher Anteil sogenannter
"falsch positiv" Reaktionen, bei welchen das Vorliegen einer
Infektion angezeigt wird, obwohl eine Infektion nicht vorliegt.
Derartige "falsch positiv" Reaktionen können zahllose Gründe
haben, wobei üblicherweise unspezifische Bindungen, wie sie
auch von anderen Antikörpern mit Antigenen bei entsprechend
hoher Konzentration auftreten können, für derartige "falsch
positiv" Resultate verantwortlich gemacht werden.Methods of the type mentioned are called immunoassays
records and are especially known as serum tests, at
which immobilized antigens after blocking with the
Serum in which antibodies are to be detected in
Be brought in contact. A well-known test, which under the
Groups of the so-called "Enzyme Linked Immunosorbent Assays
(ELISA) falls, for example for the detection of a
HIV infection has been developed. Analog tests are natural
also known for other viral infections, whereby each
because of the anti-virus formed by an anti
body-antigen reaction to be detected. In the known
Case is HIV-immobilized on a microtiter plate
Antigen applied, followed by a first wash.
After blocking with bovine serum albumin, a
Patient serum applied, after which a longer incubation
tion time a binding of those formed against the virus
Antibody on the antigen occurs. In the sequence is again a
Wash required, after which the antibody-antigen
Reaction must be made visible by suitable means. To
for this purpose in the known test by a second
Antibodies or another antigen, which in turn itself
are enzyme-labeled, those bound to the immobilized antigen
Antibodies are detected, with the enzyme simultaneously acting as a marker
and acts as a signal amplifier. With these known
HIV testing does the essentially the same antigen
Antibody reaction twice, so that a false reaction stati
stisch accordingly can occur twice. An important one
The problem with such tests is always a high proportion of so-called
"false positive" reactions in which the presence of a
Infection appears even though there is no infection.
Such "false positive" reactions can be for any number of reasons
have, usually non-specific bindings such as
also from other antibodies with antigens accordingly
high concentration can occur for such "wrong
positive "results are held responsible.
Die bekannten, unter die Gruppe der Immunassays mit enzymmar
kierten Antikörpern zu subsumierenden Tests haben eine relativ
hohe Spezifität. Insbesondere für kritische Tests, bei welchen
eine überaus große Nachweisempfindlichkeit und ein frühzeitiges
Erkennen von Antikörpern gefordert wird, versagen bekannte
Tests häufig sowohl durch "falsch positiv" Reaktionen als auch
an der geforderten Empfindlichkeit, da überaus kleine Konzen
trationen von Antikörpern nicht zuverlässig detektiert werden
können.The well-known, among the group of immunoassays with enzymmar
Antibodies to be subsumed have a relative one
high specificity. Especially for critical tests where
an extremely high detection sensitivity and an early
Known antibodies fail to recognize antibodies
Tests often through both "false positive" reactions as well
in the required sensitivity, since extremely small concentrations
trations of antibodies can not be detected reliably
can.
Die Erfindung zielt nun darauf ab, Verfahren der eingangs ge
nannten Art dahingehend weiterzubilden, daß bei verbesserter
Nachweisempfindlichkeit gleichzeitig die Anzahl der "falsch
positiven" Resultate reduziert wird. Zur Lösung dieser Aufgabe
besteht das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen darin,
daß man die Probe in einem Reaktionsgemisch, welches mehr als
4 µg/ml eines enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder
Protein A sequenzenthaltenden Proteins oder eines enzymkonju
gierten Fc erkennenden Antikörpers enthält, inkubiert und das
entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzym
konjugiertem rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzent
haltenden Protein oder das entstehende Kopplungsprodukt aus
Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem Fc erkennenden Anti
körper an ein oberflächengebundenes bezüglich des nachzuwei
senden Antikörpers spezifisches Antigen bindet, wobei die Reak
tionen zwischen dem enzymkonjugierten rekombinanten Protein G
oder Protein A sequenzenthaltenden Protein und dem Proben
antikörper oder dem enzymkonjugierten Fc erkennenden Antikörper
und dem Probenantikörper sowie dem bezüglich des
nachzuweisenden Antikörpers spezifischen Antigen gleichzeitig
oder in unmittelbarer Abfolge erfolgt. Überraschenderweise hat
sich nun gezeigt, daß bei gegenüber bekannten Verfahren
wesentlich höheren Konzentrationen, nämlich Konzentrationen mit
mehr als 4 µg/ml eines enzymkonjugierten Protein G oder Protein
A sequenzenthaltenden Proteins bzw. eines enzymkonjugierten das
konstante Ende eines Antigens erkennenden Antikörpers die
Anzahl der unspezifischen Bindungen und damit die Anzahl der
Fehlanzeigen wesentlich herabgesetzt werden kann, wenn
gleichzeitig Probe- und enyzmkonjugiertes Markermolekül in
Kompetition in relativ hohen Konzentrationen reagieren. Zu
diesem Zweck können die Reaktionen gleichzeitig oder
überlappend vorgenommen werden, wodurch sich zunächst der
triviale Vorteil ergibt, daß ein mehrfaches Waschen entfallen
kann. Überraschenderweise und entgegen allen Erwartungen hat
sich nun die wesentliche Erhöhung des insgesamt vorliegenden
Proteins bzw. enzymkonjugierten Antikörpergehaltes dahingehend
ausgewirkt, daß die Spezifität des Tests erhöht wird, daß die
Empfindlichkeit gesteigert und daß die Anzahl von "falsch
positiv" Reaktionen entsprechend reduziert wird. Eine derartige
Verbesserung und Beschleunigung von immunbasierenden
Antikörperdetektionssystemen ist insbesondere im Zusammenhang
mit HIV-I und HIV-II-Antikörpern in keiner Weise zu erwarten
gewesen, wobei die erfindungsgemäße Vorgangsweise gegenüber
bekannten Testverfahren eine bis zu 10fach verbesserte
Empfindlichkeit bei gleichzeitig wesentlicher Verringerung der
erforderlichen Inkubationszeit zur Folge hat. Im Rahmen des
erfindungsgemäßen Verfahrens genügen Inkubationszeiten von
weniger als 30 Minuten, wie dies einer bevorzugten
Verfahrensweise entspricht, wobei diese geringen
Inkubationszeiten von inbesondere etwa 15 Minuten bei
gleichzeitig erhöhter Spezifität der Tests durchaus als über
raschend zu bezeichnen sind.The invention now aims to methods of the ge
mentioned type to the extent that with improved
Detection sensitivity at the same time the number of "wrong
positive "results is reduced. To solve this task
the method according to the invention essentially consists in
that the sample in a reaction mixture which more than
4 µg / ml of an enzyme-conjugated recombinant protein G or
Protein A sequence-containing protein or an enzyme conjugate
contains Fc-recognizing antibody, incubated and the
resulting coupling product from sample antibody and enzyme
conjugated recombinant Protein G or Protein A sequentially
holding protein or the resulting coupling product
Sample antibody and enzyme-conjugated Fc-recognizing anti
body to a surface-bound with respect to the proof
send antibody binds specific antigen, the Reak
ions between the enzyme-conjugated recombinant protein G.
or Protein A sequence containing protein and the sample
antibody or the enzyme-conjugated Fc-recognizing antibody
and the sample antibody as well as that regarding the
Antibody-specific antigen to be detected simultaneously
or in immediate succession. Surprisingly
it has now been shown that in comparison with known processes
much higher concentrations, namely concentrations with
more than 4 µg / ml of an enzyme-conjugated protein G or protein
A sequence-containing protein or an enzyme-conjugated that
constant end of an antigen-recognizing antibody
Number of non-specific bindings and thus the number of
False reports can be significantly reduced if
simultaneously sample and enzyme-conjugated marker molecule in
Competitive reactions in relatively high concentrations. To
the reactions can be done simultaneously or
be made overlapping, whereby the
trivial advantage means that repeated washing is not necessary
can. Surprisingly and against all expectations
now the substantial increase in the total available
Protein or enzyme-conjugated antibody content in this regard
affected that the specificity of the test is increased, that the
Sensitivity increased and that the number of "wrong
positive "reactions are reduced accordingly. One such
Improvement and acceleration of immune-based
Antibody detection systems are particularly related
with HIV-I and HIV-II antibodies in no way expected
been, the procedure according to the invention compared
known test methods improved up to 10 times
Sensitivity while reducing the
necessary incubation time. As part of the
Incubation times of
less than 30 minutes like this one preferred
The procedure corresponds to this low
Incubation times of in particular about 15 minutes
at the same time increased specificity of the tests is definitely over
are surprising.
In besonders vorteilhafter Weise wird das erfindungsgemäße Ver
fahren so durchgeführt, daß als Enzym für die Enzymkonjugate
Peroxidasen, Phosphatasen oder Lipasen verwendet werden, wobei
mit Vorteil als Enzymsubstrate für die Peroxidasen 2,2′-Azino
di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonate), Benzidin, Chlornaphtol, 3-
Amino-9-ethyl-carbazol, o-Phenylendiamin sowie deren Derivate
verwendet werden bzw. als Enzymsubstrate für die Phosphatasen
ortho oder para Nitrophenylphosphat, Indolylphosphat sowie
deren Derivate bzw. als Enzymsubstrate für die Lipasen ortho
oder para Nitrophenylester, Indolylester sowie deren Derivate
verwendet werden.In a particularly advantageous manner, the Ver
drive so performed that as an enzyme for the enzyme conjugates
Peroxidases, phosphatases or lipases can be used, whereby
with advantage as enzyme substrates for the peroxidases 2,2'-azino
di- (3-ethylbenzthiazoline sulfonates), benzidine, chloraphtol, 3-
Amino-9-ethyl-carbazole, o-phenylenediamine and their derivatives
are used or as enzyme substrates for the phosphatases
ortho or para nitrophenyl phosphate, indolyl phosphate and
their derivatives or as enzyme substrates for the lipases ortho
or para nitrophenyl esters, indolyl esters and their derivatives
be used.
Die Reaktionen werden bevorzugt in einem Puffer mit 1 bis 10%
IgG-armem oder IgG-freiem Serum vorgenommen, wobei eine relativ
hohe Fremdproteinkonzentration durchaus wünschenswert ist und
überraschenderweise die Spezifität erhöht und die Reaktionsge
schwindigkeit nicht wesentlich verringert. In besonders vor
teilhafter Weise wird hiebei so vorgegangen, daß die Reaktionen
in einem Puffer mit 1 bis 10% Fremdprotein, wie z. B. Serum
albumin vorgenommen werden. Neben Rinderserumalbumin kann auch
foetales Kalbsserum verwendet werden, wobei bevorzugt 2 bis 5%
der entsprechenden Proteine eingesetzt werden. Die Pozentanga
ben verstehen sich hiebei jeweils im Fall von Rinderserum
albumin als w/v und im Fall von foetalem Kälberserum als v/v %.The reactions are preferably in a buffer with 1 to 10%
IgG-poor or IgG-free serum, with a relative
high foreign protein concentration is quite desirable and
Surprisingly, the specificity is increased and the reaction gene
speed not significantly reduced. In particular before
Partially, the procedure is such that the reactions
in a buffer with 1 to 10% foreign protein, such as. B. Serum
albumin can be made. In addition to bovine serum albumin, too
fetal calf serum are used, preferably 2 to 5%
of the corresponding proteins are used. The Pozentanga
ben understand each other in the case of bovine serum
albumin as w / v and in the case of fetal calf serum as v / v%.
Mit Vorteil wird die Reaktion in einem Puffer mit nicht
ionogenen Detergentien in einer Menge von < 2 v/v %
vorgenommen.The reaction is advantageously not in a buffer
ionogenic detergents in an amount of <2 v / v%
performed.
Prinzipiell sind für die Durchführung des Tests als Antigene
gentechnisch gewonnene oder veränderte Proteine oder Peptide
aus Viren geeignet, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung
des erfindungsgemäßen Verfahrens entspricht. In besonders
vorteilhafter Weise werden als Antigene Proteine, Peptide oder
gentechnisch veränderte Proteine aus Bakterienhüllen sowie
allergenen Proteinen verwendet.In principle, the test is carried out as antigens
genetically derived or modified proteins or peptides
suitable from viruses, as is a preferred further training
corresponds to the method according to the invention. Especially
Proteins, peptides or are advantageously used as antigens
genetically modified proteins from bacterial shells as well
allergenic proteins used.
Das erfindungsgemäße Verfahren erfaßt somit in wesentlicher
Vereinfachung gegenüber bekannten Verfahrensweise zunächst das
übliche Coating einer Titerplatte mit einem Antigen, wobei hier
in üblicher Weise mit 0,1 bis 1 µg Antigen in 50 µl Coating
puffer alkalisch inkubiert wird. Die Inkubation wird üblicher
weise bei 37° und 2 bis 3 Stunden vorgenommen. Nach einem
Waschen mit einem Dilutionspuffer ohne Protein, wie beispiels
weise phosphatgepufferter Kochsalzlösung, erfolgt das Blocking
in noch konventioneller Weise mit Rinderserumalbumin und/oder
foetalem Kälberserum. Nach einem kurzen Waschen mit phosphat
gepufferter Kochsalzlösung erfolgt der einstufige Detektions
schritt, wobei eine Inkubation von 10 Minuten bei Raum
temperatur ausreicht. Die Enzymkonjugate werden gleichzeitig
mit den Proben aufgegeben, wodurch die Immunreaktion und die
Konjugatadition entsprechend rasch und mit hoher Spezifität
ablaufen. Ein bei bekannten Tests hier zwischen der Aufgabe von
Proben und Marker erforderlicher Waschschritt entfällt. Offen
sichtlich erfolgt zunächst eine Markierung aller Antikörper,
wobei gleichzeitig oder anschließend die selektive Antigen-
Antikörper-Reaktion abläuft, welche zur Festlegung der mar
kierten und für den Test spezifischen Antikörper führt. Nach
dem Auswaschen der Probelösung wird mit dem entsprechenden
Enzymsubstrat 5 bis 10 Minuten bis zur Farbentwicklung
inkubiert.The method according to the invention thus essentially covers
Simplification compared to known procedures first
usual coating of a titer plate with an antigen, here
in the usual way with 0.1 to 1 µg antigen in 50 µl coating
buffer is incubated alkaline. Incubation is becoming more common
made at 37 ° and 2 to 3 hours. After one
Wash with a dilution buffer without protein, such as
blocking phosphate buffered saline
in a conventional manner with bovine serum albumin and / or
fetal calf serum. After a short wash with phosphate
buffered saline is used for single-stage detection
step, incubating at room for 10 minutes
temperature is sufficient. The enzyme conjugates are simultaneously
with the samples, causing the immune response and the
Conjugate tradition correspondingly quickly and with high specificity
expire. A known test here between the task of
Samples and markers required washing step is omitted. Open
all antibodies are first marked,
where the selective antigen or
Antibody reaction takes place, which is used to determine the mar
Antibodies specific for the test. To
washing out the sample solution with the appropriate
Enzyme substrate 5 to 10 minutes until color development
incubated.