AT400640B - METHOD FOR DETECTING AN ANTIBODY - Google Patents

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein verfahren zum Nachweis eines in einer Probe enthaltenen Antikörpers durch Bindung des nachzuweisenden Antikörpers an ein bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen.The invention relates to a method for detecting an antibody contained in a sample by binding the antibody to be detected to an antigen specific to the antibody to be detected.

Verfahren der eingangs genannten Art werden als Immuntests bezeichnet und sind im besonderen als 5 Serumtests bekannt, bei welchen immobilisierte Antigene nach einem Blocken mit dem Serum, in welchem Antikörper nachgewiesen werden sollen, in Kontakt gebracht werden. Ein bekannter Test, welcher unter die Gruppen der sogenannten "Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) fällt, ist hiebei beispielsweise für den Nachweis einer HlV-lnfektion entwickelt worden. Analoge Tests sind naturgemäß auch für andere virale Infektionen bereits bekannt, wobei jeweils der gegen den Virus gebildete Antikörper durch eine 10 Antikörper-Antigen-Reaktionnachgewiesen werden soll. Im bekannten Fall wird hiebei auf eine Mikrotiterplatte immobilisiertes HIV-Antigen aufgebracht, worauf ein erstmaliges Waschen erfolgt. Nach einem Blocking mit Rinderserumalbumin wird ein Patientenserum aufgetragen, worauf nach einer längeren Inkubationszeit eine Bindung der gegen den Virus gebildeten Antikörper am Antigen erfolgt. In der Folge ist wiederum ein Waschen erforderlich, worauf die erfolgte Antikörper-Antigen-Reaktion durch geeignete Mittel sichtbar 15 gemacht werden muß. Zu diesem Zweck werden bei dem bekannten Test durch einen zweiten Antikörper oder ein weiteres Antigen, welche selbst wiederum enzymmarkiert sind, die am immobilisierten Antigen gebundenen Antikörper detektiert, wobei das Enzym gleichzeitig ais Marker und als Signalverstärker wirksam wird. Bei diesen bekannten HIV-Tests erfolgt die im wesentlichen gleiche Antigen-Antikörper-Reaktion zweifach, sodaß eine Fehireaktion statistisch entsprechend doppelt auftreten kann. Ein bedeuten-20 des Problem derartiger Tests ist immer ein hoher Anteil sogenannter "falsch positiv" Reaktionen, bei welchen das Vorliegen einer Infektion angezeigt wird, obwohl eine Infektion nicht vorliegt. Derartige "falsch positiv" Reaktionen können zahllose Gründe haben, wobei üblicherweise unspezifische Bindungen, wie sie auch von anderen Antikörpern mit Antigenen bei ansprechend-hoher Konzentration auftreten können, für derartige "falsch positiv" Resultate verantwortlich gemacht werden. 25 Die bekannten, unter die Gruppe der Immunassays mit enzymmarkierten Antikörpern zu subsumierenden Tests haben eine relativ hohe Spezifität. Insbesondere für kritische Tests, bei welchen eine überaus große Nachweisempfindlichkeit und ein frühzeitiges Erkennen von Antikörpern gefordert wird, versagen bekannte Tests häufig sowohl durch "falsch positiv" Reaktionen als auch an der geforderten Empfindlichkeit, da überaus kleine Konzentrationen von Antikörpern nicht zuverlässig detektiert werden können. 30 Die Erfindung zielt nun darauf ab, Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß bei verbesserter Nachweisempfindlichkeit gleichzeitig die Anzahl der "falsch positiven" Resultate reduziert wird. Zur Lösung dieser Aufgabe besteht das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen darin, daß man die Probe in einem Reaktionsgemisch, welches mehr als 4 ug/ml eines enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Proteins oder eines enzymkonjugierten Fc 35 erkennenden Antikörpers enthalt, inkubiert und das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Protein oder das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem Fc erkennenden Antikörper an ein oberflächengebundenes bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen bindet, wobei die Reaktionen zwischen dem enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenz-40 enthaltenden Protein und dem Probenantikörper oder dem enzymkonjugierten Fc erkennenden Antikörper und dem Probenantikörper sowie dem bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifischen Antigen gleichzeitig oder in unmittelbarer Abfolge erfolgt. Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, daß bei gegenüber bekannten Verfahren wesentlich höheren Konzentrationen, nämlich Konzentrationen mit mehr als 4 ug/ml eines enzymkonjugierten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Proteins bzw. eines 45 enzymkonjugierten das konstante Ende eines Antigens erkennenden Antikörpers die Anzahl der unspezifischen Bindungen und damit die Anzahl der Fehlanzeigen wesentlich herabgesetzt werden kann, wenn gleichzeitig Probe- und enyzmkonjugiertes Markermolekül in Kompetition in relativ hohen Konzentrationen reagieren. Zu diesem Zweck können die Reaktionen gleichzeitig oder überlappend vorgenommen werden, wodurch sich zunächst der triviale Vorteil ergibt, daß ein mehrfaches Waschen entfallen kann. Überraschen-50 derweise und entgegen allen Erwartungen hat sich nun die wesentliche Erhöhung des insgesamt vorliegenden Porteins bzw. enzymkonjugierten Antikörpergehaltes dahingehend ausgewirkt, daß die Spezifität des Tests erhöht wird, daß die Empfindlichkeit gesteigert und daß die Anzahl von "falsch positiv" Reaktionen entsprechend reduziert wird. Eine derartige Verbesserung und Beschleunigung von immunbasierenden Antikörperdetektionssystemen ist insbesondere im Zusammenhang mit HIV-I und HIV-ll-Antikörpem in 55 keiner Weise zu erwarten gewesen, wobei die erfindungsgemäße Vorgangsweise gegenüber bekannten Testverfahren eine bis zu 10-fach verbesserte Empfindlichkeit bei gleichzeitig wesentlicher Verringerung der erforderlichen Inkubationszeit zur Folge hat. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens genügen Inkubationszeiten von weniger als 30 Minuten, wie dies einer bevorzugten Verfahrensweise entspricht.Methods of the type mentioned at the outset are referred to as immunoassays and are known in particular as 5 serum tests in which immobilized antigens are brought into contact with the serum in which antibodies are to be detected after blocking. A known test, which falls under the groups of the so-called " Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA), has been developed for example for the detection of HIV infection. Analog tests are of course already known for other viral infections, with the antibody raised against the virus being to be detected in each case by an antibody-antigen reaction. In the known case, immobilized HIV antigen is applied to a microtiter plate, followed by washing for the first time. After blocking with bovine serum albumin, a patient's serum is applied, after which the antibodies formed against the virus bind to the antigen after a longer incubation period. As a result, washing is again required, after which the antibody-antigen reaction that has taken place must be made visible by suitable means. For this purpose, the antibodies bound to the immobilized antigen are detected in the known test by a second antibody or a further antigen, which in turn is enzyme-labeled, the enzyme acting simultaneously as a marker and as a signal amplifier. In these known HIV tests, the essentially same antigen-antibody reaction takes place twice, so that a false reaction can statistically occur twice. A significant part of the problem of such tests is always a high proportion of so-called "false positive". Reactions in which the presence of an infection is indicated even though there is no infection. Such " false positives " Reactions can have any number of reasons, and usually non-specific bindings, as can also occur from other antibodies with antigens at an appropriately high concentration, for such " false positives " Results are held responsible. 25 The known tests to be subsumed under the group of immunoassays with enzyme-labeled antibodies have a relatively high specificity. In particular for critical tests, in which an extremely high detection sensitivity and early detection of antibodies are required, known tests often fail due to both " false positive " Reactions as well as the required sensitivity, since extremely small concentrations of antibodies cannot be reliably detected. The aim of the invention is now to further develop methods of the type mentioned at the outset such that, with improved detection sensitivity, the number of "false positive" Results is reduced. To achieve this object, the method according to the invention essentially consists in incubating the sample in a reaction mixture which contains more than 4 μg / ml of an enzyme-conjugated recombinant protein G or protein A sequence-containing protein or an enzyme-recognizing antibody which recognizes Fc 35 Coupling product of sample antibody and enzyme-conjugated recombinant protein G or protein A sequence-containing protein or the resulting coupling product of sample antibody and enzyme-conjugated Fc-recognizing antibody binds to a surface-bound antigen specific to the antibody to be detected, the reactions between the enzyme-conjugated recombinant protein G or protein A sequence-40 containing protein and the sample antibody or the enzyme-conjugated Fc-recognizing antibody and the sample antibody and the antigen specific to the antibody to be detected g takes place at the same time or in immediate succession. Surprisingly, it has now been shown that at concentrations which are substantially higher than known processes, namely concentrations with more than 4 µg / ml of an enzyme-conjugated protein G or protein A sequence-containing protein or of an enzyme-conjugated antibody which recognizes the constant end of an antigen, the number of non-specific bindings and so that the number of false indications can be significantly reduced if sample and enzyme-conjugated marker molecules react in competition at relatively high concentrations. For this purpose, the reactions can be carried out simultaneously or overlapping, which initially has the trivial advantage that multiple washing can be omitted. Surprisingly, and contrary to all expectations, the substantial increase in the total protein or enzyme-conjugated antibody content has now had the effect that the specificity of the test is increased, the sensitivity is increased and the number of "false positive" Reactions is reduced accordingly. Such an improvement and acceleration of immune-based antibody detection systems, in particular in connection with HIV-I and HIV-II antibodies, was in no way to be expected, the procedure according to the invention compared to known test methods being up to 10 times improved in sensitivity while at the same time substantially reducing the necessary incubation time. In the context of the method according to the invention, incubation times of less than 30 minutes are sufficient, as corresponds to a preferred procedure.

Claims (11)

AT 400 640 B wobei diese geringen Inkubationszeiten von inbesondere etwa 15 Minuten bei gleichzeitig erhöhter Spezifität der Tests durchaus als überraschend zu bezeichnen sind. In besonders vorteilhafter Weise wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, daß als Enzym für die Enzymkonjugate Peroxidasen, Phosphatasen oder Lipasen verwendet werden, wobei mit Vorteil als Enzymsubstrate für die Peroxidasen 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonate), Benzidin, Chlomaphtol, 3-Amino-9-ethyl-carbazol, o-Phenylendiamin sowie deren Derivate verwendet werden bzw. als Enzymsubstrate für die Phosphatasen ortho oder para Nitrophenylphosphat, Indolylphosphat sowie deren Derivate bzw. als Enzymsubstrate für die Lipasen ortho oder para Nitrophenylester, Indonesier sowie deren Derivate verwendet werden. Die Reaktionen werden bevorzugt in einem Puffer mit 1 bis 10 % IgG-armem oder IgG-freiem Serum vorgenommen, wobei eine relativ hohe Fremdproteinkonzentration durchaus wünschenswert ist und überraschenderweise die Spezifität erhöht und die Reaktionsgeschwindigkeit nicht wesentlich verringert, in besonders vorteilhafter Weise wird hiebei so vorgegangen, daß die Reaktionen in einem Puffer mit 1 bis 10 % Fremdprotein, wie z.B. Serumalbumin vorgenommen werden. Neben Rinderserumalbumin kann auch foetales Kalbsserum verwendet werden, wobei bevorzugt 2 bis 5 % der entsprechenden Proteine eingesetzt werden. Die Pozentangaben verstehen sich hiebei jeweils im Fall von Rinderserumalbumin als w/v und im Fall von foetalem Kälberserum als v/v %. Mit Vorteil wird die Reaktion in einem Puffer mit nichtionogenen Detergentien in einer Menge von < 2 v/v % vorgenommen. Prinzipiell sind für die Durchführung des Tests als Antigene gentechnisch gewonnene oder veränderte Proteine oder Peptide aus Viren geeignet, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens, entspricht. In besonders vorteilhafter Weise werden als Antigene Proteine, Peptide oder gentechnisch veränderte Proteine aus Bakterienhüllen sowie allergenen Proteinen verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren erfaßt somit in wesentlicher Vereinfachung gegenüber bekannten Verfahrensweise zunächst das übliche Coating einer Titerplatte mit einem Antigen, wobei hier in üblich«· Weise mit 0,1 bis 1 ug Antigen in 50 ul Coatingpuffer alkalisch inkubiert wird. Die Inkubation wird üblicherweise bei 37 ° und 2 bis 3 Stunden vorgenommen. Nach einem Waschen mit einem Dilutionspuffer ohne Protein, wie beispielsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung, erfolgt das Blocking in noch konventioneller Weise mit Rinderserumalbumin und/oder foetalem Kälberserum. Nach einem kurzen waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung erfolgt der einstufige Detektionsschritt, wobei eine Inkubation von 10 Minuten bei Raumtemperatur ausreicht. Die Enzymkonjugate werden gleichzeitig mit den Proben aufgegeben, wodurch die Immunreaktion und die Konjugataddition entsprechend rasch und mit hoher Spezifität ablaufen. Ein bei bekannten Tests hier zwischen der Aufgabe von Proben und Marker erforderlicher Waschschritt entfällt. Offensichtlich erfolgt zunächst eine Markierung aller Antikörper, wobei gleichzeitig oder anschließend die selektive Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft, welche zur Festlegung der markierten und für den Test spezifischen Antikörper führt. Nach dem Auswaschen der Probelösung wird mit dem entsprechenden Enzymsubstrat 5 bis 10 Minuten bis zur Farbentwicklung inkubiert. Patentansprüche 1. Verfahren zum Nachweis eines in einer Probe enthaltenen Antikörpers durch Bindung des nachzuweisenden Antikörpers an ein bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe in einem Reaktionsgemisch, welches mehr als 4 ug/ml eines enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Proteins oder eines enzymkonjugierten Fc erkennenden Antikörpers enthalt, inkubiert und das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Protein oder das entstehende Kopplungsprodukt aus Proben-Antikörper und enzymkonjugiertem Fc erkennenden Antikörper an ein oberflächengebundenes bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifisches Antigen bindet, wobei die Reaktionen zwischen dem enzymkonjugierten rekombinanten Protein G oder Protein A sequenzenthaltenden Protein und dem Probenantikörper oder dem enzymkonjugierten Fc erkennenden Antikörper und dem Probenantikörper sowie dem bezüglich des nachzuweisenden Antikörpers spezifischen Antigen gleichzeitig oder in unmittelbarer Abfolge erfolgen.AT 400 640 B, whereby these short incubation times of in particular about 15 minutes combined with increased specificity of the tests can be described as surprising. In a particularly advantageous manner, the process according to the invention is carried out in such a way that peroxidases, phosphatases or lipases are used as the enzyme for the enzyme conjugates, advantageously with 2,2'-azino-di- (3-ethylbenzthiazoline sulfonates), benzidine, as enzyme substrates for the peroxidases. Chlomaphtol, 3-amino-9-ethyl-carbazole, o-phenylenediamine and their derivatives are used or as enzyme substrates for the ortho or para nitrophenyl phosphate phosphatases, indolyl phosphate and their derivatives or as enzyme substrates for the ortho or para nitrophenyl ester lipases, Indonesians and whose derivatives are used. The reactions are preferably carried out in a buffer with 1 to 10% IgG-poor or IgG-free serum, a relatively high foreign protein concentration being quite desirable and surprisingly increasing the specificity and not significantly reducing the reaction rate, and this is how it is carried out in a particularly advantageous manner that the reactions in a buffer with 1 to 10% foreign protein, such as Serum albumin can be made. In addition to bovine serum albumin, fetal calf serum can also be used, with 2 to 5% of the corresponding proteins preferably being used. The percentages are understood as w / v in the case of bovine serum albumin and as v / v% in the case of fetal calf serum. The reaction is advantageously carried out in a buffer with nonionic detergents in an amount of < 2 v / v%. In principle, genetically engineered or modified proteins or peptides from viruses are suitable for carrying out the test as antigens, as corresponds to a preferred development of the method according to the invention. In a particularly advantageous manner, proteins, peptides or genetically modified proteins from bacterial shells and allergenic proteins are used as antigens. The method according to the invention thus, in a substantially simplified manner compared to known procedures, initially captures the usual coating of a titer plate with an antigen, with alkaline incubation in the usual manner with 0.1 to 1 μg of antigen in 50 μl of coating buffer. The incubation is usually carried out at 37 ° and 2 to 3 hours. After washing with a dilution buffer without protein, such as, for example, phosphate-buffered saline, the blocking is carried out in a still conventional manner with bovine serum albumin and / or fetal calf serum. After a short wash with phosphate-buffered saline, the one-step detection step takes place, whereby an incubation of 10 minutes at room temperature is sufficient. The enzyme conjugates are applied at the same time as the samples, which means that the immune reaction and conjugate addition are correspondingly rapid and with high specificity. There is no washing step required between known samples and markers in known tests. Obviously, all of the antibodies are first labeled, with the selective antigen-antibody reaction taking place simultaneously or subsequently, which leads to the determination of the labeled antibodies specific for the test. After washing out the sample solution, incubation is carried out with the appropriate enzyme substrate for 5 to 10 minutes until the color develops. 1. Method for detecting an antibody contained in a sample by binding the antibody to be detected to an antigen specific to the antibody to be detected, characterized in that the sample in a reaction mixture containing more than 4 µg / ml of an enzyme-conjugated recombinant protein G or Contains protein A sequence-containing protein or an enzyme-conjugated Fc-recognizing antibody, incubated and the resulting coupling product from sample antibody and enzyme-conjugated recombinant protein G or protein A-sequence-containing protein or the resulting coupling product from sample antibody and enzyme-conjugated Fc-recognizing antibody to a surface-bound with respect to the surface to be detected Antibody-specific antigen binds, the reactions between the enzyme-conjugated recombinant protein G or protein A sequence-containing protein and the sample antibody or the enzyme conjugate ized Fc-recognizing antibody and the sample antibody as well as the antigen specific to the antibody to be detected are carried out simultaneously or in immediate succession. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß als Enzym für die Enzymkonjugate Peroxidasen, Phosphatasen oder Lipasen verwendet werden. 3 AT 400 640 B2. The method according to claim 1, characterized in that peroxidases, phosphatases or lipases are used as the enzyme for the enzyme conjugates. 3 AT 400 640 B 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrate für die Peroxidasen 2,2’-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsuIfonate), Benzidin, Chlornaphtol, 3-Amino-9-ethyl-car-bazol, o-Phenylendiamin sowie deren Derivate verwendet werden.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that as enzyme substrates for the peroxidases 2,2'-azino-di- (3-ethylbenzthiazolinsuIfonate), benzidine, chloronaphtol, 3-amino-9-ethyl-car-bazole, o -Phenylenediamine and their derivatives are used. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrate für die Phosphatasen ortho oder para Nitrophenylphosphat, Indolylphosphat sowie deren Derivate verwendet werden.4. The method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that ortho or para nitrophenyl phosphate, indolyl phosphate and their derivatives are used as enzyme substrates for the phosphatases. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrate für die Lipasen ortho oder para Nitrophenylester, Indonesier sowie deren Derivate verwendet werden.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that ortho or para nitrophenyl esters, Indonesians and their derivatives are used as enzyme substrates for the lipases. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit weniger als 30 Minuten beträgt.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the reaction time is less than 30 minutes. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen in einem Puffer mit 1 bis 10 % IgG-armem oder IgG-freiem Serum vorgenommen werden.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the reactions are carried out in a buffer with 1 to 10% IgG-poor or IgG-free serum. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet daß die Reaktionen in einem Puffer mit 1 bis 10 % Fremdprotein, wie z.B. Serumalbumin vorgenommen werden.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the reactions in a buffer with 1 to 10% foreign protein, such as Serum albumin can be made. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen in einem Puffer mit nichtionogenen Detergentien in einer Menge von < 2 Gew% vorgenommen werden.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the reactions in a buffer with nonionic detergents in an amount of < 2% by weight. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigene gentechnisch gewonnene oder veränderte Proteine oder Peptide aus Viren verwendet werden.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that genetically derived or modified proteins or peptides from viruses are used as antigens. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet daß als Antigene Proteine, Peptide oder gentechnisch veränderte Proteine aus Bakterienhüllen sowie allergenen Proteinen verwendet werden. . 411. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that proteins, peptides or genetically modified proteins from bacterial shells and allergenic proteins are used as antigens. . 4th
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