DE1943454A1 - New means and method for lipasc determination - Google Patents
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Description
AktiengesellschaftCorporation
Darmstadt ; . 25- August 1969Darmstadt ; . August 25, 1969
Neues-Mittel und Verfahren zur Lipasebestimmung (Zusatz zu DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3))New means and method for lipase determination (Addition to DBP ... (German patent application P 17 98 285.3))
Gegenstand des DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3) ist ein neues Mittel zur Bestimmung von Lipase in Körperflüssigkeiten mit wäßrigen Fett- "bzw. Öl emulsionen und pH-Farbindikatoren, das dadurch charakterisiert ist, daß als Farbindikator m-Kresolpurpur und/oder p-Xylenol3ulpb.oph.thal ein" und/oder Dibromthymolsulphophthalein und/oder Thymolsulphophthalein und/ oder a-Naphtholphthalein enthalten ist, und ein Verfahren zur Idpasebestiminung in Körperflüssigkeiten mit wäßrigen Fett- "bzw. Ölemulsionen und pH-Farbindikatoren, das darin "besteht, daß man der zu untersuchenden Probe das vorstehend definierte und im folgenden näher beschriebene Mittel zusetzt und die während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung bestimmt.The subject of the DBP ... (German patent application P 17 98 285.3) is a new agent for the determination of lipase in body fluids with aqueous fat or oil emulsions and pH color indicators, which is characterized in that m-cresol purple and / or p-xylenol3ulpb.oph.thal a "and / or dibromothymolsulphophthalein" as a color indicator and / or thymolsulphophthalein and / or a-naphtholphthalein is contained, and a method for Idpase determination in body fluids with aqueous fatty "resp. Oil emulsions and color pH indicators, which consists of "that the agent defined above and described in more detail below is added to the sample to be investigated and the during the change in color that has occurred during the incubation period is determined.
Die Nachteile, die bei Verwendung der vorbekannten Mittel für ' die Lipasebestimmung auftreten, insbesondere Schwierigkeiten bei der photometrisc.hen Messung und der Titration, lange Inkubationszeiten und Verwendung relativ großer Serummengen für jede Bestimmung, können bei Anwendung des Mittels nach DPB .-.. (deutsche Patentanmeldung P 17 98 285·3) weitgehend vermieden werden.The disadvantages of using the previously known means for 'The lipase determination occur, in particular difficulties with photometric measurement and titration, long incubation times and the use of relatively large amounts of serum for each determination, when using the agent according to DPB .- .. (German patent application P 17 98 285 · 3) largely avoided will.
Besonders vorteilhaft ist, daß in dem Verfahren nach DBP ... (deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3) nur eine sehr geringe Menge der zu bestimmenden Probe (ca. 0,2 nil bei einer Normalbestimmung bzw. 0,02 ml für eine, MikrobeStimmung) benötigt wird. Ferner bietet das Mittel bzw. Verfahren nach DBP ... (deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3) den Vorteil, daß - im Gegensatz zu den mit vorbekannten Mitteln und dem Titrator ar-It is particularly advantageous that in the method according to DBP ... (German patent application P 17 98 285.3) only a very small amount of the sample to be determined (approx. 0.2 nil for a normal determination or 0.02 ml for a micro determination) will. Furthermore, the means or method according to DBP ... (German patent application P 17 98 285.3) has the advantage that - in In contrast to the previously known means and the titrator
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beitenden Verfahren - keine aufwendigen Apparaturen und kein hierfür geschultes Personal erforderllq.li sind und daß das Verfahren nach OBP ... (deutsche Patentanmeldung P 17 98 785.3) im Vergleich zu den vorbekannten Verfahren, "bei denen unter Verwendung von Indikatoren die durch die Lipase freigesetzte Säuremenge durch Titration "bestimmt werden muß - erheblich rascher durchgeführt werden-kann. Außerdem wird eine mehrfache Pipettierung, wie sie für die "bekannten Verfahren erforderlich ist, durch Anwendung des Mittels nach DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3) vermieden. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Spezifität und Genauigkeit der Lipasebestiinmung mit dem Mittel nach.DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285-3).process - no expensive equipment and no trained personnel are required and that the procedure according to OBP ... (German patent application P 17 98 785.3) im Compared to the previously known method, "in those under Use of indicators to determine the amount of acid released by the lipase by titration "- considerably can be carried out more quickly. It also becomes a multiple Pipetting, as it is required for the "known methods, by using the agent according to DBP ... (German patent application P 17 98 285.3) avoided. Another advantage is the high specificity and accuracy of the lipase determination with according to DBP ... (German patent application P 17 98 285-3).
Die sehr guten Ergebnisse "bei einfacher Handhabung des Mittels nach DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 1798 285.3) waren aufgrund des Standes der Technik nicht vorauszusehen. Da Substrat und Indikator der Einwirkung der Lipase in einer eiweißhaltigen Lösung ausgesetzt sind, war mit einer Verschiebung des-Umschlag-bereiches für die nach DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3) einzusetzenden Farbindikatoren zu rechnen. Ferner ist bekannt, daß der Umschlagbereich des Indikators sich· im allgemeinen in einer eiweißhaltigen Lösung nicht nur verschiebt, sondern meist auch verbreitert, so daß genaue pH-Ablesungen. erschwert sind. Außerdem wird eine solche Verbreiterung des Umschlagbereiches auch durch Zusatz von emulsionsstabilisierenden Stoffen, wie z.B. Gummi'arabicum, hervorgerufen. Sofern ein Zusatz nicht völlig farblos ist, wie es z.B. bei Gummi arabicum der Fall ist, wird außerdem die Farbablesung erschwert. Aufgrund dieser Unsieherheitsfäktoren sind die guten Meßergebnisse, die mit dem Mittel nach DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3) zu erzielen sind, als überraschend anzusehen. :The very good results "with easy handling of the agent according to DBP ... (German patent application P 1798 285.3) not foreseeable due to the state of the art. As substrate and indicator of the action of lipase in a protein-containing Solution exposed was with a shift in the envelope area for the color indicators to be used according to DBP ... (German patent application P 17 98 285.3). Further it is known that the envelope area of the indicator generally not only shifts in a protein-containing solution, but mostly also widened so that accurate pH readings are possible. are difficult. In addition, such a widening of the envelope area is also achieved by adding emulsion-stabilizing Substances such as gum arabic. Unless an additive is completely colorless, as e.g. is the case with gum arabic, the color reading will also be difficult. Because of these uncertainty factors, the good ones are Measurement results that can be achieved with the agent according to DBP ... (German patent application P 17 98 285.3) are surprising to watch. :
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Es wurde nun gefunden", daß das Mittel und Verfahren nach DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 295.3) weiter verbessert werden kann durcn^ Zusatz- mindestens eines Ascorbyl- und/oder Tocopherolesters und/oderdurch Überschichtung mit einer filmbildenden Verbindung.It has now been found "that the means and method according to DBP ... (German patent application P 17 98 295.3) further improved can be achieved by adding at least one ascorbyl and / or tocopherol ester and / or by overlaying with a film-forming compound.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist demnach ein Mittel zur Lipasebestimmung in Körperflüssigkeiten mit wäßrigen Fettbzw. Ölemulsionen und m-Kresolpurpur und/oder p-Xylenolsulphophthaleiii und/oder Dibromthymolsulphophthalein und/oder Thymolsulphophthalein und/oder a-Naphtholphthalein als Farbindikator nach DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285.3), das durch einen Gehalt an mindestens einem Ascorbyl- und/oder Tocopherolester und/oder durch eine über das Mittel geschichte'te filmbildende Substanz gekennzeichnet ist.The subject of the present application is therefore a means for lipase determination in body fluids with aqueous Fettbzw. Oil emulsions and m-cresol purple and / or p-xylenolsulphophthaleiii and / or dibromothymolsulphophthalein and / or thymolsulphophthalein and / or a-naphtholphthalein as a color indicator according to DBP ... (German patent application P 17 98 285.3), through a content of at least one ascorbyl and / or tocopherol ester and / or is characterized by a film-forming substance storyed about the agent.
Ferner umfaßt der Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ein Verfahren zur Lipasebestimmung mit wäßrigen Fett- bzw. Ölemulsionen und m-Kresolpurpur und/oder p-Xylenolsulphophthalein und/oder Dibromthymolsulphophthalein und/oder Thymolsulphoplrthalein und/oder α-Naphtholphthalein als Farbindikator, dadurch gekennzeichnet, daß man der zu untersuchenden Probe/vorstehend angegebene und im folgenden näher beschriebene Mittel zusetzt und die während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung bestimmt.The subject matter of the present application also includes a method for determining lipase using aqueous fat or oil emulsions and m-cresol purple and / or p-xylenolsulphophthalein and / or dibromothymolsulphophthalein and / or thymolsulphophthalein and / or α-naphtholphthalein as a color indicator, thereby characterized in that one of the sample to be examined / means specified above and described in more detail below and the color change that occurred during the incubation period certainly.
/das/the
Die im Mittel nach der vorliegenden Erfindung enthaltenen Ascorbyl- und/oder Tocopherolester wirken als Stabilisatoren, insbesondere durch ihre reduzierende Wirkung. Sie verhindern eine Au tiOxydation und hierdurch bedingte unerwünschte Entmischung der Emulsion. Als-Ascorbylester werden in dem neuen Mittel vor allem Ascorbylfettsäureester, wie Ascorbylstearat, -laurat, oder -palmitat eingesetzt. Als Tocopherolester können ebenfalls die entsprechenden .Fettsäureester, z.B. Tocopherolpalmitat, -stearat oder -laurat oder auch Ester mit niederen Carbonsäuren, z.B. Tocopherolacetat oder -propionat verwendet werden. Bevorzugt sind Ascorbylpalmitat bzw. Tocopherolacetat.Those contained in the agent according to the present invention Ascorbyl and / or tocopherol esters act as stabilizers, in particular due to their reducing effect. You prevent Au tiOxydation and the undesired segregation caused by this the emulsion. As ascorbyl esters are used in the new Means mainly ascorbyl fatty acid esters, such as ascorbyl stearate, laurate or palmitate are used. The corresponding fatty acid esters, e.g. tocopherol palmitate, can also be used as tocopherol esters. stearate or laurate or esters with lower carboxylic acids, e.g. tocopherol acetate or propionate will. Ascorbyl palmitate and tocopherol acetate are preferred.
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Die Ascorbyl- bzw. Tocoplierolester sind zweclanäßigerweise in einer Konzentration bis zu etwa 1 ■ $, insbesondere bis zu 0,05'^:- in dem neuen Mittel enthalten.The ascorbyl and tocopier esters are used in a concentration up to about 1 $, in particular up to 0.05 '^: - included in the new remedy.
Die'Ester werden bei der Herstellung des Mittels vorteilhafterweise in das Substrat eingearbeitet, indem man z.B.. die Ester im Substrat auflöst und gegebenenfalls weiter mit Substrat verdünnt. -The esters are advantageous in the manufacture of the agent incorporated into the substrate, e.g. by dissolving the esters in the substrate and, if necessary, further with Diluted substrate. -
Ferner wurde gefunden, daß das Mittel nach DBP ...(deutsche Patentanmeldung P 17 98 285-3) auch verbessert werden kann,' durch eine über das Mittel geschichtete fUmbildende Substanz·. Insbesondere vorteilhaft ist eine solche Überschichtung der Ql/Viasser-Emulsion mit dem Indikator nach DBP ... (deutsche Patentanmeldung P 17 9.8 285.3), wenn die Emulsion vorab für jeweils eine Bestimmung in eine Küvette abgefüllt ist. Durch einen solchen Überzug wird verhindert, daß der Küvetteninhalt bei niedrigen Temperaturen und umgekehrt aufbewahrter Küvette unter Verschluß der Küvettenöffnung erstarrt und beim Öffnen durch einen in der Küvette entstehenden geringen Überdruck herausgepreßt wird.It was also found that the agent according to DBP ... (German Patent application P 17 98 285-3) can also be improved, 'by a layered fUmbildende substance ·. Such an overlay is particularly advantageous Ql / Viasser emulsion with the indicator according to DBP ... (German Patent application P 17 9.8 285.3) if the emulsion was previously used for each determination is filled into a cuvette. Such a coating prevents the cuvette contents at low temperatures and vice versa stored cuvette with the closure of the cuvette opening solidified and at Opening is pressed out by a slight overpressure created in the cuvette.
Dieser Überzug wird nach der Erfindung vorteilhaft dadurch auf der Emulsion gebildet, daß man diese mit einer mit Wasser schlecht bzw. nicht mischbaren Flüssigkeit, die spezifisch ■■■"-. leichter ist als die Emulsion und die einige Zeit nach dem Aufbringen auf die Emulsion erstarrt, überschichtet.· Bevorzugt werden für die Überschichtung Lösungen von natürlichen, syn—■..-. thetischen oder halbsynthetischen Polymeren, z.B. einem Polyäthylenderivat, wie Polystyrol, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid oder■ Polymethacrylsäureester, oder einem Cellulosederivat, z.B. ..einer' nitrierten Cellulose, wie Kollodium, oder Celluloseacetat, oder Epoxydlacken oder Zweikomponenten-Urethan-Lacfce oder unter der Einwirkung von Feuchtigkeit härtende' "This coating is advantageous according to the invention The emulsion is formed by mixing it with a liquid which is difficult to mix or immiscible with water and which is specifically ■■■ "-. is lighter than the emulsion and some time after Application to the emulsion, solidified, overcoated. · Preferred are used for layering solutions of natural, syn— ■ ..-. synthetic or semi-synthetic polymers, e.g. a polyethylene derivative such as polystyrene, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride or ■ polymethacrylic acid ester, or a cellulose derivative, e.g. ... a 'nitrated cellulose, such as collodion, or Cellulose acetate, or epoxy lacquers or two-component urethane lacfce or hardening under the action of moisture '"
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TJrethanlacke in leicht verdunstenden organischen Lösungsmitteln. oder Lösungsmittelgemischen. Z.B. können hierfür Äther, z.E; Diäthyläther, niedere Alkohole wie Äthanol, niedere Ester wie Essigsäureäthylester oder niedrig siedende Kohlenwasserstoffe, die gegebenenfalls auch, z.B. durch Chlor, substituiert sein können, wie Dichlormethan, oder Ketone wie z.B. Aceton oder Cyclohexanon, verwendet werden. . - ·Methane lacquers in easily evaporating organic solvents. or mixed solvents. For example, ethers can be used for this purpose, e.g. Diethyl ether, lower alcohols such as ethanol, lower esters such as Ethyl acetate or low-boiling hydrocarbons, which may also be substituted, e.g. by chlorine can, such as dichloromethane, or ketones such as acetone or Cyclohexanone, can be used. . - ·
Gegebenenfalls kann auch ein Weichmacher wie z.B. Kampfer zugesetzt werden. Die filmbildenden festen Stoffe werden vorzugsweise in "jeweils solcher Konzentration angewandt, daß der'gebildete Überzug über der Emulsion bis zu 3 mm, vorzugsweise etwa 0,5 mm dick wird.If necessary, a plasticizer such as camphor can also be added will. The film-forming solid substances are preferably used in "such a concentration that the 'formed Coating over the emulsion up to 3 mm, preferably about 0.5 mm thick.
Nach dem Verdunsten des Lösungsmittels bildet sich auf der Emulsion eine dünne Membran, die fest an den Küvettenwänden haftet. Diese Membran verhindert, daß die Emulsion an die Öffnung der Küvette läuft, wenn die Küvette mit der Öffnung nach unten gelagert wird. Bewährt hat sich z.B. eine Membran, die durch Überschichten der Emulsion in einer Küvette mit ca. 0,05ml einer 2 folgen Collodiumlösung erhalten wird.After the solvent has evaporated, a thin membrane forms on the emulsion, which adheres firmly to the walls of the cuvette. This membrane prevents the emulsion from running to the opening of the cuvette when the cuvette is stored with the opening facing down. For example, has proven a membrane which is obtained by overcoating the emulsion in a cuvette with about 0.05 ml of a 2 follow collodion.
Im übrigen ist unter den oben aufgeführten Farbindikatoren, die in dem neuen Mittel enthalten sind, wie im Eauptpatent schon angegeben, das m-Kresolpurpur bzw. das p-Xylenolsulphophthalein bevorzugt. Die Indikatoren zeigen einen scharfen Farbumschlag, beispielsweise m-Kresolpurpur von violett nach gelb und p-X'yle— nolsulphophthalein von blau nach gelb. Bei der Herstellung des neuen Mittels wird das pH der Lösung zweckmäßigerweise so eingestellt, daß der Farbumschlag, schon durch Zugabe einer minimalen Menge Säure auftritt. Beispielsweise stellt man bei Verwendung von m-Kresolpurpur auf einen braunstichigen Violett-Ton, bei Verwendung von p-Xylenolsulphophthalein auf einen braunstichigen blauen Farbton ein. Die Einstellung des gewünschten pH führt man vorteilhafterweise durch, indem man eine alkalischeIncidentally, among the color indicators listed above, the As already stated in the main patent, the new agent contains m-cresol purple and p-xylenolsulphophthalein preferred. The indicators show a sharp color change, for example m-cresol purple from violet to yellow and p-X'yle— nolsulphophthalein from blue to yellow. When preparing the new agent, the pH of the solution is expediently adjusted so that that the color change occurs with the addition of a minimal amount of acid. For example, one puts in use from m-cresol purple to a brownish violet tone, when using p-xylenolsulphophthalein on a brownish tinge blue hue. The adjustment of the desired pH is advantageously carried out by using an alkaline
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lösung des Indikators, z.B. eine Lösung dos m-Kresolpurpur oder p-Xyleiiolsulphophtnalein, in verdünnter, bei spiel sweifj ο 0,1 F Natronlauge der Emulsion zufügt und anschließend oino Säure, z.B. verdünnte Salzsäure oder eine andere verdünnte Mineralsäure, zusetzt, "bis der gewünschte Farbton erreicht ist. Grundsätzlich kann man den Indikator auch in wäßriger"Säure, z.B. als Suspension oder als Lösung, zusetzen und anschließend durch Zusatz von Alkali, z.B. von verdünnter Natronlauge, den : gewür.schten Farbton einstellen. Im allgemeinen ist jedoch wegen der besseren Löslichkeit der Zusatz des Indikators in alkalischer Lösung vorzuziehen. Sofern das Mittel über längere Zeit vor der LipasebeStimmung aufbewahrt wird, empfiehlt es sich, zur Erhöhung der Haltbarkeit den Indikator erst kurz vor Gebrauch der Emulsion zuzusetzen. In "diesem Fall stellt man die Emulsion mit einem vorzugsweise neutralen bzw. nur schwach alkalischen bzw.'schwach sauren pH zunächst ohne Indikator und getrennt hiervon eine alkalische Indikatorlösung her. Beide Lösungen sind sehr gut auch über längere Zeit haltbar. Der Indikator ist in der gebrauchsfertigen Emulsion in einer Konzentration, von etwa 0,001 bis 1 fo, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 io, bezogen auf das Gewicht der gesamten Emulsion, enthalten,solution of the indicator, e.g. a solution dos m-cresol purple or p-xyleiiolsulphophtnalein, in dilute, for example sweifj ο 0.1 F sodium hydroxide solution, add to the emulsion and then add oino acid, e.g. dilute hydrochloric acid or another dilute mineral acid, "until the desired color is reached the indicator Basically, you can also in aqueous "acid as a suspension or as a solution, for example, enforce, and then by adding alkali, eg dilute sodium hydroxide solution, to:. set gewür.schten shade. In general, however, it is preferable to add the indicator in alkaline solution because of the better solubility. If the agent is stored for a longer period of time before the lipase determination, it is advisable to add the indicator to the emulsion shortly before use to increase the shelf life. In this case, the emulsion is produced with a preferably neutral or only weakly alkaline or weakly acidic pH, initially without an indicator and separately from an alkaline indicator solution. Both solutions can be kept very well even over a longer period of time ready-to-use emulsion in a concentration of about 0.001 to 1 fo, preferably 0.05 to 0.2 io, based on the weight of the entire emulsion,
Vorzugsweise enthält der Farbindikator in demjneuen Mittel, eine der oben aufgeführten Verbindungen (m-Kresolpurpur, p-Xylenolsulphophthalein, Dibromthymol sulpho phthalein,. Thymo!sulphophthalein oder α-Naphtholphthalein). Gegebenenfalls kann der Indikator jedoch auch aus einem Gemisch von.2 oder mehreren dieser Verbindungen bestehen. Insbesondere kann es in manchen Fällen zweckmäßig sein, neben einem Hauptindikator, z.B. m-Kresolpurpur oder p-Xylenolblau, einen weiteren der vorstehend genannten Indikatoren in geringer Konzentration zur genauen Einstellung der für den Umschlagbereich gewünschten Farbnuance des neuen Mittels anzuwenden. Eine solche Einstellung kann z.B. erforderlich sein, wenn zur besseren Vergleichsmöglichkeit mit einer vorgedruckten Farbskala der Farbton des Hauptindikators verschoben werden soll. Beispielsweise kann durch Zusatz einer geringen Menge des im alkalischen Bereich blauen a-Üaphtholphthalein zu einer als Hauptbestandteil des Farbindikators verwendeten Verbindung, wie m-Kresolpurpur oder p-Xyl©nolsulpho-Preferably the color indicator in the new agent contains one of the compounds listed above (m-cresol purple, p-xylenolsulphophthalein, Dibromothymol sulpho phthalein ,. Thymosulphophthalein or α-naphtholphthalein). If necessary, the However, the indicator can also consist of a mixture of 2 or more of these compounds. In particular, it can be in some In some cases it may be useful in addition to a main indicator, e.g. m-cresol purple or p-xylenol blue, another of the above mentioned indicators in low concentration for accurate Adjustment of the desired color nuance of the new agent for the envelope area. Such a setting can For example, this may be necessary if the color of the main indicator is to be compared with a preprinted color scale for a better comparison should be moved. For example, by adding a small amount of α-aphtholphthalein, which is blue in the alkaline range to a compound used as the main component of the color indicator, such as m-cresol purple or p-xyl © nolsulpho-
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phthalein, der Farbton des Mittels im alkalischen Bereich insgesamt nach blau verschoben werden.phthalein, the color of the product in the alkaline range shifted to blue overall.
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Gegebenenfalls können auch derartige Farbv.er Schiebung en in dem neuen Mittel durch Zusatz von geringen Mengen anderer als der oben aufgeführten Farbindikatoren, z.B. durch Zusatz von Diphenolpurpur (Rotverschiebung besonders im neutralen Bereich bei Verwendung von m-Kresölpurpur als Hauptbestandteil des Farbindikators) oder in manchen Fällen auch durch Zusatz geringer Mengen einer anderen farbigen Verbindung, wie Carotin, mit dem ein gelber Farbton erhalten wird, erzielt werden. Diese Verbindungen werden z.B. in einer Konzentration bis zu 0,05 fo (bezogen auf die Emulsion) zugesetzt.If necessary, such color shifts can also be achieved in the new agent by adding small amounts of other color indicators than those listed above, e.g. by adding diphenol purple (red shift especially in the neutral range when using m-kresoil purple as the main component of the color indicator) or in some Cases can also be achieved by adding small amounts of another colored compound, such as carotene, with which a yellow hue is obtained. These compounds are added, for example, in a concentration of up to 0.05 fo (based on the emulsion).
Im übrigen enthält das neue-Mittel, wie im Hauptpatent ... (deutsche Patentanmeldung P 1.7 98 285.3) beschrieben, als Lipasesubstrat natürliche oder synthetische Ester von Fettsäuren, insbesondere Fettsäureglycerinester. Allgemein sind Triglyceride oder gegebenenfalls auch Diglyceride von' Fettsäuren, wie Palmitin-, Stearin-, Öl-, Linol- oder Laurylsäure, zu verwenden. So sind natürliche Öle und Fette, z.B. auch Cocosfett, als Lipasesubstrat für das neue Mittel geeignet. Besonders bevorzugt ist Olivenöl. Es empfiehlt sich, aus den Ölen und Fetten vor der Verwendung als Lipasesubstrat die freien Fettsäuren, beispielsweise durch chromatographysehe Reinigung des Öles oder Fetts über einem basischen Adsorptionsmittel wie Aluminiumoxid, zu entfernen. Gegebenenfalls können die Öle und Fette auch anderweitig gereinigt oder auch hydriert werden. Beispielsweise ist hydriertes Rapsöl als Lipasesubstrat ebenfalls geeignet.Incidentally, the new agent contains, as in the main patent ... (German patent application P 1.7 98 285.3), natural or synthetic esters of fatty acids as lipase substrate, especially fatty acid glycerol esters. In general, triglycerides or possibly diglycerides of 'fatty acids, such as palmitic, stearic, oleic, linoleic or lauric acid, to use. Natural oils and fats, e.g. coconut fat, are suitable as lipase substrates for the new product. Olive oil is particularly preferred. It is best to take out the oils and fats before using them as a lipase substrate see free fatty acids, for example by chromatography Purification of the oil or grease over a basic adsorbent such as aluminum oxide. If necessary, can the oils and fats also otherwise cleaned or hydrogenated will. For example, hydrogenated rapeseed oil is also suitable as a lipase substrate.
Zur Erhöhung der Haltbarkeit der Emulsion enthält das Mittel einen emulsionsstabilisierenden Zusatz. Dieser Zusatz kann aus einer oder mehreren Verbindungen der im folgenden beschriebenen Stoffgruppen bestehen. "To increase the shelf life of the emulsion contains the agent an emulsion stabilizing additive. This addition can consist of one or more of the compounds described below Substance groups exist. "
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■ . :■■■■■ · :■. % , ■.".■.-■; ■■■ ■■ ■; .;■ ;.-; Als emulsionsstabilisierender Zusatz haben sich vor allem Verbindungen mit Scbutzkolloidwirkung, insbesondere Gummi arabi— cum,; bewährt,. Gegebenenfalls kann auch Polyvinylpyrrolidon als Schutzkolloid eingesetzt werden. Die Emulsionsstabilisatoren mit Schutzkolloidwirkung, insbesondere das Gummi arabicum, sind Xn der Emulsion in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 30 fo, vorzugsweise 10 - 25 fo, enthalten. Heben der Schutzkolloidwirkung übt das Gummi arabicum einen aktivierenden Einfluß auf die Lipase aus.■. : ■■■■■ ·: ■. % , ■. ". ■ .- ■; ■■■ ■■ ■;.; ■ ; .-; Compounds with a protective colloid effect, in particular gum arabic; . be used as a protective colloid, the emulsion stabilizers having a protective colloid action, in particular arabic rubber, Xn are the emulsion fo in a concentration of about 0.5 to 30, preferably 10 to 25 fo, lifting contain the protective colloid effect exerts the gum arabic is an activating effect on. the lipase off.
Ferner können in dem neuen Mittel auch die üblichen Emulgatoren für Öl- bzw. Eett/Wasser-Emulsionen, z.B. Polyathylenglykol- . !Fettalkoholäther, insbesondere auch Polyäthylenderivate von Sorbitanhydriden wie Polyäthylensorbitan-Oleate, -Palmitate, -Stearate beispielsweise Polyäthylensprbitan-monopalmitat, -monooleat, ^monostearat oder -trioleafc oder -tristearat, Poly— äthylenglykolalkylphenoläther, SuIfonsä-uresalze oder Schwefel-." säureester, z.B. Isopropylnaphthaleinsulfonsäuresalze, oder Cetyl-, Stearylschwefelsäureester, zur Stabilisierung der Emulsion enthalten sein. Die Konzentration dieser Emulgatoren liegt beispielsweise bei bis zu 20 fo, vorzugsweise bis zu 1 .-■$..The usual emulsifiers for oil or oil / water emulsions, for example polyethylene glycol, can also be used in the new agent. Fatty alcohol ethers, in particular also polyethylene derivatives of sorbitan anhydrides such as polyethylene sorbitan oleates, palmitates, stearates, for example polyethylene sprbitan monopalmitate, monooleate, monostearate or trioleafc or tristearate, polyethyleneglycolic acid alkylphenol ethers, eg Isopropylnaphthalenesulfonic acid salts, or cetyl-, stearylsulfuric acid esters, may be contained to stabilize the emulsion. The concentration of these emulsifiers is, for example, up to 20 %, preferably up to 1 .- ■ $ ..
Als Zusatz, der die Emulsion stabilisiert und gleichzeitig aktivierend auf die zu messende Lipase im !Fall einer Pankreaslipasebestimmung wirkt, können außerdem Salze von Gallensäuren, z.B. Alkalicholate, -desoxycholate, -taurocholate, -glykocholate u.a. Gallensäurensalze, in dem neuen Mittel enthalten sein. Diese Salze werden in einer Konzentration bis zu etwa 2 p/o, insbesondere bis zu 0,5 %, angev/andt.As an additive that stabilizes the emulsion and at the same time activates the lipase to be measured in the case of a pancreatic lipase determination, the new agent can also contain salts of bile acids, e.g. alkali cholates, deoxycholates, taurocholates, glycocholates and other bile acid salts. These salts are used in a concentration of up to about 2 p / o, in particular up to 0.5 % .
Als weiterer geeigneter Zusatz kann die Emulsion zur Stabilisierung Stoffe enthalten, die das Absetzen verhindern, bei spiel ίί-weise die Geliermittel auf Montmorillonit-Basis, insbesondere; Erdalkali- oder quartäre Ammoniumsalze von Montmorilloiiit-Pett-As a further suitable additive, the emulsion can be used for stabilization Contain substances that prevent settling, for example ίί-wise the gelling agents based on montmorillonite, in particular; Alkaline earth or quaternary ammonium salts of Montmorilloiiite-Pett-
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säuren. Z.B. können insbesondere die üblicherweise als Imulsionsslabilisatoren für Ql-in-Wasser-Systeme angewandten feinstverteilten Magnesium-montmorillonite von einer Dichte von 2j4 g/cm und einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 6 fo oder ein Dimethyl-dioctadecyl-ammonium-Montmorillonit von einer Dichte von 1,80 g/cm und einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 3 io als Zusatz für die Emulsion verwendet werden. Diese Antiabsetzmittel werden in einer Konzentration "bis zu etwa 3 $, insbesondere bis zu 2 ·%, angewandt.acids. For example, in particular the finely divided magnesium montmorillonite, usually used as an emulsion stabilizer for Ql-in-water systems, with a density of 2j4 g / cm and a moisture content of about 6 % or a dimethyl-dioctadecyl-ammonium-montmorillonite with a density of 1, 80 g / cm2 and a moisture content of less than 3 io can be used as an additive for the emulsion. These anti-settling agents are used in a concentration of up to about 3%, especially up to 2%.
Ferner kann das neue Mittel emulsionsstabilisierende Stoffe enthalten, die die Viskosität von Emulsionen bei niedrigen Temperaturen erhöhen. Hierfür kommen z.B. gelbildende, höhermolekulare Verbindungen, die von Esterasen nicht gespalten werden, in Frage. Insbesondere Agar hat sich als Zusatz zur Erhöhung der Viskosität und damit zur Stabilisierung der Emulsion bewährt. ·The new agent can also contain emulsion-stabilizing substances contain that the viscosity of emulsions at low Increase temperatures. For example, gel-forming, higher molecular weight compounds that are not cleaved by esterases are used for this purpose be in question. In particular, agar has proven to be an additive to increase the viscosity and thus to stabilize the emulsion proven. ·
Außerdem kann das Mittel der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung einer Autoxydation und der hierdurch bedingten Entmischung der Emulsion die üblicherweise für eine sdche Stabilisierung angewandten reduzierenden Verbindungen, insbesondere Mercaptoäthanol bzw. Cystein, in Konzentrationen bis zu etwa. -1 fo, vorzugsweise bis zu 0,05 %, enthalten.In addition, the agent of the present invention for preventing autoxidation and the resulting segregation of the emulsion can contain the reducing compounds usually used for stabilization, in particular mercaptoethanol or cysteine, in concentrations of up to about. -1 fo, preferably up to 0.05 % .
Zur Stabilisierung der Emulsion können in dem neuen Mittel auch biostatische Stoffe enthalten sein, die die Einwirkung von Mikroorganismen auf das verwendete Substrat verhindern. Hierfür kommen beispielsweise quecksilberorganische Verbindungen, wie p-Chlormercuribenzoat, Phenylquecksilberacetat, Äthylmercurithiobenz-3,4--oxazol-1-carbonsäure bzw. deren 'Natriumsalz , Ithylquecksilberthiosalicylate, Äthylque'cksilberthiophenolsulfonsäuren, p-Hydroxybenzoesäureester, insbesondere der Methyl- bzw, Äthyl- bzw. Isopropylester, Hexamethylentetramin, Jodacetate und/oder Azide in Frage. Bevorzugt werden hierfür Natrium-Jodacetat und Natriumäthylmercurithiosalicylat ein-To stabilize the emulsion, the new agent can also contain biostatic substances that prevent the action of Prevent microorganisms on the substrate used. For example, organic mercury compounds are used, such as p-chloro mercury benzoate, phenyl mercury acetate, ethyl mercurithiobenz-3,4-oxazole-1-carboxylic acid or their 'sodium salt, ethylmercury thiosalicylate, ethylmercury thiophenol sulfonic acids, p-Hydroxybenzoic acid ester, in particular the methyl or ethyl or isopropyl ester, hexamethylenetetramine, Iodine acetates and / or azides are possible. Sodium iodine acetate and sodium ethyl mercurithio salicylate are preferred for this purpose.
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gesetzt. Die biostatischen Stoffe sind vorzugsweise in einer' Konzentration bis zu etwa 1 %-, insbesondere in einer Konzentration bis zu etwa 0,1 $, enthalten. set. The biostatic substances are preferably in a ' Concentration up to about 1%, in particular in a concentration up to about 0.1 $.
Als emulsionsstabilisierender Zusatz enthält das neue Mittel ' mindestens eine Verbindung aus den vorstehend aufgeführten Stoffkla.ssen. Vorzugsweise ist als Eniulsionsstabilisator Gummi arabicum enthalten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind biostatische Stoffe, gegebenenfalls zusammen mit Gummi arabicum, als emulsionsstabilisierende Zusätze enthalten. Allgemein sind Emulsionsstabilisatoren besonders ge- * eignet, die durch Esterasen, insbesondere durch andere Esterasen als Lipase, im schwach alkalischen Bereich nicht verändert werden. As an emulsion-stabilizing additive, the new agent contains' at least one compound from those listed above Substance classes. Is preferred as an emulsion stabilizer Contains gum arabic. In a further preferred embodiment, biostatic substances are optionally combined with gum arabic as emulsion stabilizing additives. In general, emulsion stabilizers are particularly * suitable that by esterases, especially by other esterases as lipase, cannot be changed in the weakly alkaline range.
Bei der ,Zubereitung des neuen Mittels wird im allgemeinen eine Lösung mindestens einer emulsionsstabilisierenden Verbindung, z.B. von G-ummi arabicum, in Wasser vorgelegt. In manchen Fällen ist es zweckmäßig, diese Lösung vor der Zubereitung der Emulsion zu filtrieren oder zu zentrifugieren, um Rückstände aus den Zusätzen, z.B. aus dem Gummi arabicum, zu entfernen. Anschließend wird durch Zugabe des Substrats, z.B.. des Olivenöls, unter Turbinleren die Emulsion gebildet. Die \ -weiteren für das Mittel verwendeten Zusätze, z.B. weitere emulsionsstabilisierende, insbesondere biostatische Stoffe, können der Mischung vor oder nach Zugabe des Substrats beigemengt werden. · ■When preparing the new agent, a solution of at least one emulsion-stabilizing compound, for example of gum arabic, in water is generally provided. In some cases it is advisable to filter or centrifuge this solution before preparing the emulsion in order to remove residues from the additives, for example from the gum arabic. Subsequently, by adding the substrate, for example. of the olive oil, the emulsion is formed under turbines. The \ -weiteren for the additives used, for example, more emulsion-stabilizing, especially biostatic substances can be added to the mixture of the substrate before or after addition. · ■
Der Indikator kann zweckmäßigerweise in Form einer Lösung .tier Emulsion zugefügt werden. Man erhält so die gebrauchsfertige Emulsion. Man kann auch den Indikator getrennt von der Emulsion in Form einer Lösung aufbewahren und erst vor der je- . weiligen LipasebeStimmung der Emulsion zufügen. Diese Ausführungsform des neuen Mittels ist bevorzugt, wenn eine lange Haltbarkeit erforderlich ist.The indicator can expediently .tier in the form of a solution Emulsion can be added. This gives the ready-to-use one Emulsion. You can also keep the indicator separately from the emulsion in the form of a solution and only before each. add the occasional lipase determination to the emulsion. This embodiment of the new agent is preferred when a long shelf life is required.
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Insbesondere günstig ist es, die Ql/Wasser-Emulsion in der jeweils für eine LipasebcStimmung erforderlichen Menge in einem geeigneten Behälter, vorzugsweise in einer Kunststoffküvette mit insbesondere rechteckiger Grundfläche, abzufüllen. Gegebenenfalls kann auch hierbei der erforderliche Indikator getrennt vor der Emulsion in einer gesonderten Lösung bereitgestellt werden. Die abgefüllte Menge der Emulsion wird hierbei so bemessen, daß sie für eine Mpasebestimmung ausreicht. Z.B. werden in dieser Ausführungsform jeweils 1 oder 2 ml Emulsion in die Küvette abgefüllt. In der gegebenenfalls von der Emulsion getrennten Indikatorlösung wird die Konzentration des Indikators zweckmäßigerweise so eingestellt, daß ein einfach abzumessender aliquoter Teil, beispielsweise ein Tropfen, der Indikatorlösung der vorab bereitgestellten Öl/Wasser-Emulsion, z.B. in der Kunststoffküvette, für eine Bestimmung zugefügt wird. Eine Öl/Wasser-Emulsion, die den Indikator enthält, ist etwa 4 Wochen haltbar, wobei sich ein Umschütteln der Emulsion vor dem Gebrauch empfiehlt.It is particularly favorable to fill the Ql / water emulsion in the amount required in each case for a lipase determination in a suitable container, preferably in a plastic cuvette, in particular with a rectangular base area. If necessary, the required indicator can also be provided separately before the emulsion in a separate solution. The amount of emulsion filled is measured in such a way that it is sufficient for an Mpase determination. For example, in this embodiment, 1 or 2 ml of emulsion are filled into the cuvette. In the separated, where appropriate, of the emulsion indicator solution, the concentration of the indicator is advantageously so adjusted that a simple abzumessender aliquot T e il, for example a drop, of the indicator solution of the oil / water emulsion provided in advance, for example, added in the plastic cuvette, for determining will. An oil / water emulsion containing the indicator has a shelf life of about 4 weeks, whereby it is advisable to shake the emulsion before use.
Das Verfahren zur IdpasebeStimmung mit dem neuen Mittel wird durchgeführt, indem das vorstehend beschriebene Mittel mit der zu untersuchenden Lipase-haltigen Probe vereinigt wird und die während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung des Indicators bestimmt wird. Man gibt hierzu ein kleines abgemessenes Volumen, vorzugsweise 0,1 ml, der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z.B.-des Serums bzw. Plasmas, in ein abgemessenes Volumen, z.B. 1 ml, der gebrauchsfertigen Emulsion. Hierauf wird wie üblich durchgemischt und die Farbänderung gemessen. Die Farbänderung kann durch Vergleich des jeweiligen Farbtons der Mischung mit dem entsprechenden Farbton auf einer geeichten Farbskala oder einem geeichten Farbband gemessen werden. Hierzu wird z.B. die auf der Farbskala bzw. dem Farbband abgelesene Eichzahl für den Farbton, der unmittelbar nach Zugabo der Probe zu der Emulsion vorliegt, aufgezeichnet. Anschließend läßt man den Ansatz für eine bestimmte Inkubationszeit, z.B. 1 StundeThe procedure for idpase determination with the new agent is carried out by the means described above is combined with the lipase-containing sample to be examined and the Change in color of the indicator during the incubation period is determined. For this purpose, a small measured volume, preferably 0.1 ml, of the body fluid to be examined is given, e.g.-of the serum or plasma, into a measured Volume, e.g. 1 ml, of the ready-to-use emulsion. On that is mixed as usual and the color change is measured. The color change can be calibrated by comparing the respective color shade of the mixture with the corresponding color shade on a Color scale or a calibrated ribbon can be measured. For this purpose, e.g. the reading on the color scale or the color ribbon is used Calibration number for the color tone, which is immediately after adding the sample to the emulsion is recorded. The mixture is then left for a certain incubation time, e.g. 1 hour
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lang, vorzugsweise "bei einer Standardtemperatur, z.B. Zimmer-, temperatur oder 37 C, stehen und liest erneut die dem jetzt entstandenen Farbton zugeordnete Zahl auf der geeichten Farbskala bzw. dem geeichten Farbband ab. Die Differenz ergibt den Lipäsegehalt in den der Farbskala- bzw. Farbbandeichung zugrunde liegenden Einheiten.long, preferably "at a standard temperature, e.g. room, temperature or 37 C, stand and read the now again Number assigned to the resulting color tone on the calibrated color scale or the calibrated ribbon. The difference is the lipase content in the color scale or color band calibration underlying units.
Eine bei der Messung verwendete geeichte Farbskala bzw. ein geeichtes Farbband kann, wie im französischen Patent.1 516 beschrieben, hergestellt werden. Für die Eichung der Skala bzAV. ^ des Bandes wird der Zeitabschnitt zugrunde gelegt, der bei der nachfolgenden lipasebestimmung für die Inkubation angewandt wird, ^z.B. 1 Stunde.A calibrated color scale or a calibrated color ribbon used in the measurement can, as in French patent 1,516 are described. For the calibration of the bzAV scale. ^ of the volume is based on the period of time at which subsequent lipase determination is used for the incubation, e.g. 1 hour.
In einer anderen Ausführungsforin wird die Farbänderung ,durch Vergleich "der untersuchten Proben untereinander nach der Inkubationszeit von z.B. einer Stunde bestimmt. Bei dieser Methode wird der - nach der Inkubationszeit nahezu unveränderte - Farbton von Proben mit normalem Lipäsegehalt als Standard benutzt. Diese Durchführung der Lipasebestimmung nach der Erfindung ist ■ insbesondere für. Serienaiialysen geeignet, da meist über"90 % In another embodiment, the color change is determined by comparing the samples examined with one another after the incubation time of, for example, one hour. In this method, the color of samples with normal lipase content - which is almost unchanged after the incubation time - is used as the standard According to the invention, it is particularly suitable for series analyzes, since usually over 90 %
der in den Kliniken untersuchten Blutseren normalen Lipäsegehalt -' ■ . ■ aufweisen und damit als Standard dienen können. Die wenigen \ -Proben mit pathologisch erhöhtem Lipäsegehalt erkennt man dann an einem nach der Inkubationszeit von der nahezu unveränderten Farbe der Mehrzahl der untersuchten Proben abweichenden Farbton. Bei Verwendung der Indikatoren m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein zeigen die pathologischen Proben eine hellbraune bis hellgelbe Farbe. Sofern eine genauere Bestimmung . erforderlich ist, können die als pathologisch erkannten Proben nochmals durch Vergleich mit dem geeichten Farbband bzw. der : geeichten Farbskala genauer gemessen werden.the blood sera examined in the clinics normal lipase content - '■. ■ have and can therefore serve as a standard. The few \ samples with pathologically elevated Lipäsegehalt it recognizes different hue at a after the incubation period of the almost unchanged color of the majority of the studied samples. When using the indicators m-cresol purple or p-xylenol sulphophthalein, the pathological samples show a light brown to light yellow color. Provided a more precise determination. is required, the recognized as pathological samples again by comparison with the calibrated ribbon or: measured calibrated color scale in more detail.
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Im folgenden werden zur Erläuterung einige Beispiele für dun Mittel nach der vorliegenden Erfindung gegeben: Beispiel 1In the following some examples of dun Means according to the present invention given: Example 1
Zu 480 ml Wasser werden im Mischgerät bei hoher Drehzahl 30 mg Äthylquecksilberthiosalicylat und 90 mg Gummi arabicum zugefügt. . '30 mg of ethyl mercury thiosalicylate and 90 mg of gum arabic are added to 480 ml of water in a mixer at high speed. . '
Anschließend wird die Mischung durch Zusatz von 2 Έ wäßriger Hatronlauge auf pH 10 eingestellt. Hierauf wird zentrifugiert und der Überstand zur Entfernung von Verunreinigungen durch einen Wattebausch filtriert. Das Filtrat wird-danach im Mischgerät bei hoher Drehzahl mit 120 ml Olivenöl (gereinigt über basischem Aluminiumoxid), gegebenenfalls unter Zusatz eines Emulgators, z.B. eines Polyoxyäthylensorbitan-oleats, -palmitats oder -stearats, versetzt.The mixture is then adjusted to pH 10 by adding 2 aqueous hydroxide solution. It is then centrifuged and the supernatant is filtered through a cotton ball to remove impurities. The filtrate is then mixed with 120 ml of olive oil (cleaned over basic aluminum oxide) in a mixer at high speed, optionally with the addition of an emulsifier, for example a polyoxyethylene sorbitan oleate, palmitate or stearate.
Anschließend wird erneut 5 Minuten gemischt und mit 600 mg m-Kresolpurpur, gelöst in 60 ml 0,1 Έ Natronlauge, versetzt. Durch Zusatz verdünnter Säure, z.B. verdünnter Salzsäure, wird das pH der Mischung auf 8,8 (Farbe: braunstichiges Violett) eingestellt.5 minutes then re-mixed and dissolved in 60 ml of 0.1 Έ sodium hydroxide solution, treated with 600 mg m-cresol purple. The pH of the mixture is adjusted to 8.8 (color: brownish violet) by adding dilute acid, for example dilute hydrochloric acid.
In Abänderung der vorstehend angegebenen Vorschrift werden anstelle von 600 mg m-Kresolpurpur die folgenden Indikatoren eingearbeitet: -·■-..In a modification of the above specification, the following indicators are used instead of 600 mg of m-cresol purple incorporated: - · ■ - ..
600 mg Dibromsulphophthalein (Einstellung des pH auf 8,8,600 mg dibromosulphophthalein (adjustment of the pH to 8.8,
Farbe blau)Colour blue)
550 mg Thymolsulphophthalein (Einstellung auf pH 8,8, Farbe550 mg thymolsulphophthalein (adjustment to pH 8.8, color
grünstichiges Blau)greenish blue)
600 mg a-Naphtholphthalein (Einstellung auf pH 9, Farbe hellblau) 600 mg a-naphtholphthalein (adjustment to pH 9, color light blue)
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■■:■■■■■■ ■ ft ■, : ■■■: ■■■■■■ ■ ft ■: ■
Die so hergestellte Emulsion wird maschinell zu je 1 ml ...in ■■-■-■„ verschließbare Kunststoffküvetten abgefüllt. Die Emulsion in jeder Kunststoffküvette wird mit ca. 0,05 ml einer 2 ^igen Colloidiumlösung überschichtet. Nach dem Verdunsten des Lösungsmittels bildet sich auf der Emulsion eine dünne Membran,The emulsion produced in this way is automatically added to 1 ml each ... in ■■ - ■ - ■ " closable plastic cuvettes filled. The emulsion in Each plastic cuvette is filled with approx. 0.05 ml of a 2 ^ igen Colloidium solution layered. After the Solvent forms a thin membrane on the emulsion,
23 g Gummi-arabicum
4 mg Hatrium-äthylquecksilber-thiosalicylat und · 25 mg Natriumazid v/erden in23 g gum arabic
4 mg sodium ethylmercury thiosalicylate and 25 mg sodium azide v / earth in
··
W" 120 ml Wasser gelöst W "dissolved 120 ml of water
Diese Lösung gibt man in einen Homogenisator. Anschließend läßt man bei laufendem Motor eine Lösung vonThis solution is placed in a homogenizer. Afterward leave a solution of with the engine running
5-mg α-Tocopherolacetat und .5 mg α-tocopherol acetate and.
5 mg Ascorbylpalmitat in
30 ml Olivenöl -5 mg ascorbyl palmitate in
30 ml olive oil -
zufließen. ■flow in. ■
In einer abgeänderten Ausführungsform werden zu der vorstehend beschriebenen Emulsion noch ·In a modified embodiment to that above described emulsion still
-4-5 mg Uatriumdesoxycholat oder Natriumtaurocholat zugegeben--4-5 m g Uatriumdesoxycholat or sodium taurocholate zugegeben-
Eine Indkatorlösung, hergestellt durch Auflösen vonAn indicator solution made by dissolving
1g Kresolpurpur, gegebenenfalls zusammen mit 100 mg Methylenblau in '. . .'. 100 ml 0,05 N-Fatronlauge1g cresol purple, optionally together with 100 mg methylene blue in '. . . '. 100 ml of 0.05 N fat hydroxide solution
wird mit der vorstehend angegebenen Emulsion im Volumenverhältnis 1 : 1.0 gemischt, so daß z.B. jeweils 2 ml Emulsion mit 0,2 ml Indikatörlösung in Mischung vorliegen.is mixed with the above emulsion in a volume ratio of 1: 1.0, so that e.g. 2 ml of emulsion with 0.2 ml indicator solution is available in a mixture.
Das so hergestellte Reagenz, wird analog der Mischungen von Beispiel 1 eingesetzt.The reagent prepared in this way is analogous to the mixtures of Example 1 used.
1098137 0 73 61098137 0 73 6
Beispiel 3 IS"Example 3 IS "
3 g Gummi arabicum
20 ml Natriumjodacetat
1 g Magnesiuin-montmorillonit bzw. Dimethyl-di-octadecyl-3 g gum arabic
20 ml of sodium iodine acetate
1 g Magnesiuin-montmorillonite or dimethyl-di-octadecyl-
ammoniummontmorillon.it und
0,5 g Agar werden in
100 ml Wasser gelöst bzw. auf ge schwemmt,. Die Lösung wird in
einem Mixer mitammoniummontmorillon.it and
0.5 g of agar are put into
100 ml of water dissolved or washed up. The solution is in a blender using
25 ml gereinigtem Triolein, das
10 mg Tocopherollaurat gelöst■enthält, homogenisiert.25 ml of purified triolein that
10 mg tocopherol laurate dissolved, ■ contains, homogenized.
Jeweils 100 Volumenteile der so hergestellten Emulsion werden mit einem Volumenteil einer Lösung,·erhalten ausIn each case 100 parts by volume of the emulsion produced in this way are obtained with one part by volume of a solution from
1 g Kresolpurpur und
100 ml 0,05 N-Hatronlauge gemischt.1 g of cresol purple and
100 ml of 0.05 N hydroxide solution mixed.
Das so hergestellte Reagenz wird analog den Mischungen der Beispiele 1-2 eingesetzt.The reagent prepared in this way is analogous to the mixtures of Examples 1-2 used.
Die nähere Durchführung des Verfahrens zur LipasebeStimmung ist im Hauptpatent schon beschrieben und wird durch die folgenden Beispiele nochmals erläutert.The detailed implementation of the procedure for lipase determination is already described in the main patent and is explained again by the following examples.
Beispiel A . ·■ ■Example A. · ■ ■
Man gibt 0,1 ml Serum in die mit 1 ml der nach Beispiel 1 hergestellten Emulsion gefüllte Küvette. Der Küvetteninhalt wird hierauf mit einem G-lasstab homogenisiert, .wobei die ; · Membran über der Emulsion zerstört wird. Anschließend wird der entstandene !Farbton mit einer geeichten Farbskala verglichen. Die auf der Skala dem Farbton zugeordnete Zahl, z.B. 150, wird abgelesen. Anschließend läßt man die Probe 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen und erhält durch Vergleich des entstandenen Farbtons mit demselben Farbton auf der geeichten, Farbskala die Zahl 350. Der Lipasegehalt der gemessenen Probe ist dann 200 mU/ml.0.1 ml of serum is added to the 1 ml of that according to Example 1 produced emulsion-filled cuvette. The contents of the cuvette is then homogenized with a G-let rod, where the; · The membrane over the emulsion is destroyed. The resulting color is then compared with a calibrated color scale. The number assigned to the color on the scale, e.g. 150, is read off. The sample is then left for 1 hour stand at room temperature and obtain by comparing the resulting color shade with the same color shade on the calibrated, Color scale shows the number 350. The lipase content of the measured sample is then 200 mU / ml.
1098 13/07361098 13/0736
In: einer Wiederholnng der vorstehend beschriebenen Messungen werden die Proben nach Bestimmung des Ausgangsfarbtons 20 Minuten bei .370C stehengelassen. Der hierbei bestimmte Iiipasegehalf ist derselbe wie der oben erhaltene.In: a Wiederholnng the measurements described above the samples after determination of the initial color tone are allowed to stand for 20 minutes at 0 C .37. The lipase half determined here is the same as that obtained above.
In einer Serienuntersuchung werden jeweils 0,1.ml Serum mit 1 ml der nach den Beispielen 2 bzw. 3 hergestellten Emulsionen gemischt und anschließend 1 Stunde stehengelassen. In der Mehrzahl der Proben ist der gebildete Farbton gegenüber dem · Ausgangsfarbton kaum verändert. Die Seren mit pathologisch erhöhtem Lipasegehalt zeigen eine abweichende Parbe. Der genaue Lipasegehalt kann in diesen pathologischen Seren entsprechend Beispiel A exakt bestimmt werden. ' ■ In a serial examination, 0.1 ml of serum is used in each case 1 ml of the emulsions prepared according to Examples 2 and 3, respectively mixed and then left to stand for 1 hour. In the majority of the samples, the color shade formed is compared to the Original shade hardly changed. The sera with pathologically increased lipase content show a different color. The exact lipase content can be exactly determined in these pathological sera according to Example A. '■
109813/0736109813/0736
Claims (1)
das Mittel für die LipasebeStimmung in einer Kunststoffküvette angewandt wird. 1. The method according to claim 6, characterized in that
the agent for lipase determination is applied in a plastic cuvette.
Proben untereinander 'bestimmt wird.10, method according to claims 6 to 8, characterized. That the color change by comparing .the examined
Samples among themselves' is determined.
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