DE1935711A1

DE1935711A1 - Water-insoluble, carrier-bound protein

Info

Publication number: DE1935711A1
Application number: DE19691935711
Authority: DE
Inventors: Jaworek Dr Phil Nat Dieter; Bergmeyer Dr Rer Nat Ha Ulrich; Gruber Dr Phil Nat Wolfgang
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1969-02-19
Filing date: 1969-02-19
Publication date: 1970-08-20
Also published as: DE1935711B2; DE1935711C3

Description

Wasserunlösliches, trägergebundenes Protein Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches, trägergebundenes Protein.Water Insoluble Carrier Bound Protein The invention relates to a water-insoluble, carrier-bound protein.

Grundsätzlich muß zwischen unlöslichen Proteinen und gebundenen unlöslichen Proteinen unterschieden werden.Basically, there must be a distinction between insoluble proteins and bound insoluble ones Proteins can be distinguished.

Es ist bekannt, daß unlösliche Proteine durch Kondensations-, Kupplungs, und Polymerisationsreaktionen mit dem Protein selbst entstehen können. Die auf diese Weise erhaltenen Proteine sind Produkte unkontrollierbarer Reaktion; es lassen sich keine definierten Produkte erhalten. Ein großer Teil des Proteins wird durch die harten Reaktionsbedingungen der Polymerisation, der Kupplung mit bis-Diazo-Verbindungen und durch die für die Kondensation eingesetzten Komponenten, wie Formaldehyd, Chlor-Ameisensäureäthylester, u.a., denaturiert und dadurch biologisch inaktiviert. Er ,e¼t für die hauptsächlichen Anwendungsbereiche unlöslicher Proteine verloren.It is known that insoluble proteins by condensation, coupling, and polymerization reactions can occur with the protein itself. The on this Well-obtained proteins are products of uncontrollable reactions; let it no defined products received. Much of the protein is made by the harsh reaction conditions of the polymerization, the coupling with bis-diazo compounds and by the components used for the condensation, such as formaldehyde, ethyl chloroformate, i.a., denatured and thereby biologically inactivated. He, e¼t for the main ones Applications of insoluble proteins lost.

Als unlösliche, biologisch aktive Proteine haben allein die an Trägermaterialien fixierten Proteine Bedeutung, da sie definierte Materialien darstellen, die sich universell für Enzyme, Inhibitoren, Antigene bzw. Antikörper, für Eiweißstoffe allgemein anwenden lassen.The only insoluble, biologically active proteins are those on carrier materials Fixed proteins meaning as they defined Represent materials, which are universal for enzymes, inhibitors, antigens or antibodies, for proteins generally apply.

Die Bindung der Proteine an die Trägermaterialien kann heteropolar oder auch homöopolar erfolgen. Die heteropolar gebundenen Proteine sind weniger von Interesse, da sie in Abhangigkeit von Ionenkonzentration und pE-Wert wieder ablösbar sind.The binding of the proteins to the carrier materials can be heteropolar or homeopolar. The heteropolar bound proteins are less of interest since it depends on the ion concentration and pE value are removable.

Folgende Versuche, Proteine durch reaktive Gruppen an unlösliche Träger zu fixieren, sind bekannt: 1. Umsetzung von Cellulose mit p Witrobenzylchlorid zu dem entsprechenden Cellulose-Derivat, das zur Aminoverbindung reduziert und diazotiert, mit Proteinen gekuppelt werden konnte.Following attempts to transfer proteins through reactive groups to insoluble carriers to fix are known: 1. Reaction of cellulose with p nitrobenzyl chloride to the corresponding cellulose derivative, which reduces to the amino compound and diazotizes, could be coupled with proteins.

2. Die reaktive Gruppe nach 1) wurde durch m-Aminobenzyloxymethyl ersetzt. Später wurden Versuche mit 3. Polyamino-polystyrol - einem vollsynthetischen Träger - unternommen.2. The reactive group according to 1) was replaced by m-aminobenzyloxymethyl replaced. Later attempts were made with 3. polyamino-polystyrene - a fully synthetic one Carrier - undertaken.

4. d,l-p-Aminophenylalanin, d , l-Leucin u.a. Aminosäuren werden zu einem synthetischen Träger polykcndensiert, dessen diazotierte Amino-Gruppen mit Proteinen zu kuppeln vermögen.4. d, l-p-aminophenylalanine, d, l-leucine and other amino acids become a synthetic carrier polycondensed, whose diazotized amino groups with Able to couple proteins.

5. Nach den Methoden der Peptidchemie wurde Carboxymethyl-Cellulose mit Proteinen und di-Cyclohexyl-carbodiimid als Kondensationsmittel umgesetzt.5. According to the methods of peptide chemistry, carboxymethyl cellulose was made reacted with proteins and di-cyclohexyl-carbodiimide as condensing agents.

6. Aus Carboxymethyl-Oellulose wurde über das Hydrazid das Aziä hergestellt, das mit Proteinen zu -reagieren -vermag.6. From carboxymethyl cellulose the azaia was produced via the hydrazide, capable of reacting with proteins.

7. Mit Bromacetylcellulose werden Proteine gut gebunden.7. With bromoacetyl cellulose, proteins are well bound.

8. Aus Isothiocyanat-Derivaten des Dextrangelß "Sephadex" und der Cellulose wurden mit Proteinen wasserunlösliche Enzym-Verbindungen hergestellt; 9. Unter den Bedingungen der Acrylamid-Polymerisation lassen sich Proteine in gut quellbarem Material fixieren. Das Enzym wird dabei radikalisch an die Ketten gebunden.8. From isothiocyanate derivatives of Dextran® "Sephadex" and the Cellulose were made with proteins, water-insoluble enzyme compounds; 9. Proteins can be swelled well under the conditions of acrylamide polymerization Fix the material. The enzyme is bound to the chains in a free-radical manner.

10. Weitere wurden Proteine an Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA) und 11. Styrol-Maleinsäureanhydrid-copolymere gebunden.10. Further proteins were bound to ethylene maleic anhydride (EMA) and 11. Styrene-maleic anhydride copolymers bound.

Die bisher bekannten Methoden sind nicht befriedigend und nicht allgemein für Proteine anwendbar. So werden weniger als 50 % Protein bei Methode 1, 2 und 4 gebunden, ein Großteil des Proteins verliert unter diesen Bedingungen die biologische Aktivität. Methode 3 erwies sich als noch ungünstiger.The previously known methods are unsatisfactory and not general applicable to proteins. Method 1, 2 and 4 bound, a large part of the protein loses the biological under these conditions Activity. Method 3 turned out to be even worse.

Methode 5 läßt sich nur in nichtwässrigem Iledium ausführen und darum nur zum Teil für Antikörperprobleme und niedermolekulare Inhibitoren anwenden.Method 5 can only be carried out in non-aqueous iledium and therefore use only partially for antibody problems and small molecule inhibitors.

Nach Methode 6 werden nur etwa 10 % des eingesetzten Proteine gebunden, wovon nur 10 bis 43 ffi enzyrnatische Aktivität behalten. According to method 6, only about 10% of the proteins used are bound, of which only 10 to 43 retain enzymatic activity.

Die Methode 7 ergibt eine hohe Austeute an gebundenen Protein (80 bis 90 %); für viele Proteine bedeuten diese Reaktionsbedingungen aber einer Verlust der biologischen Aktivität.Method 7 results in a high yield of bound protein (80 up to 90%); for many proteins, however, these reaction conditions mean a loss biological activity.

Mit Methode 8 werden nur ganz wenige Prozent des eingesetzten Proteins aktiv an Gel gebunden.Method 8 only removes a very small percentage of the protein used actively bound to gel.

Nach Methode 9 werden nur 18 bis 20 % des eingesetzten Proteine gebunden, wovon nur wenige Prozent Aktivität gegenüber Substraten entwickeln können. Höhermolekulare Substrate (Hämoglobin) werden nur zu 1 bis 2 % umgesetzt Derzeit ergibt Methode 10 die befriedigendsten Ergebnisse. Sie findet für Antigene, Inhibitoren und Enzyme Anwendung. Die Bin dungsreaktion erfolgt schonend in wässrigem Milieu; etwa 50 bi 60 % des Proteins lassen sich unter optimalen Bedingungen fixieren. According to method 9, only 18 to 20% of the proteins used are bound, of which only a few percent can develop activity towards substrates. Higher molecular Substrates (hemoglobin) are only converted to 1 to 2%. The method currently results 10 the most satisfactory results. It finds for antigens, inhibitors and enzymes Use. The binding reaction takes place gently in an aqueous medium; about 50 bi 60 % of the protein can be fixed under optimal conditions.

Jedoch ist das verwendet Ausgangsmaterial sehr uneinheitlich, es hat niedermolekulare (z.T. lösliche) und höhermolekulare (unlösliche) Fraktionen, die sich weder sieben noch auf andere Weise trennen lassen. Daher werden nur bis zu 60 % Protein an den urlöslichen Träger gebunden, der. Rest geht als lösliches Material verloren. Aber auch das gebundene Protein befriedigt noch nicht.However, the raw material used is very inconsistent, it has low molecular weight (partially soluble) and higher molecular weight (insoluble) fractions that can neither be sifted nor separated in any other way. Hence only up to 60% protein bound to the soluble carrier, the. Rest goes as soluble material lost. But the bound protein is not yet satisfactory either.

In der Bindung des Proteins an den Träger (EMA) hat das Protein Comonomer-Funktion; es kann nicht nur an einer Stelle, sondern an mehreren (d.h. vernetzt) gebunden werden. In Abhängigkeit von der Proteinkonzentration werden mehr oder weniger gut quellbare Protein-auf-Träger-Substanzen erhalten. Das Protein liegt dabei in einem Netzwerk covalent gebunden vor, so daß die Diffusion bei diesem Material eine wesentliche Rolle spielt, und es nur teilweise für Substrate zugänglich ist. Auch durch Zugabe von Vernetzern (Hexamethylendiamin u.a.) wird dieser Nachteil nicht aufgehoben. Von dem gebundenen Protein sind daher nur noch etwa 50 % für niedermolekulare Substrate erreichbar, so daß die Gesamtaktivität nicht mehr als 30 % beträgt. Gegenüber hochmolekularen Subs-traten sind nur 1o % und weniger gefunden worden.In the binding of the protein to the carrier (EMA), the protein has a comonomer function; it cannot be tied to just one place but to several (i.e. networked) will. Depending on the protein concentration they will be more or less good obtained swellable protein-on-carrier substances. The protein is in one Network covalently bound before, so that the diffusion in this material is an essential Plays a role, and it is only partially accessible to substrates. Also by encore Crosslinkers (hexamethylenediamine, etc.) do not eliminate this disadvantage. Therefore only about 50% of the bound protein is for low molecular weight substrates achievable so that the total activity is not more than 30%. Compared to high molecular weight Subs-steps have only been found 10% or less.

Ein zusätzlicher Nachteil dieses Materials liegt darin, daß es von Protein zu Protein verschieden, auch in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration, z.B. flockig, schwer filtrierbar anfällt und nicht ohne weiteres in Säulen gepackt werden kann.An additional disadvantage of this material is that it is of Protein to protein different, also depending on the protein concentration, e.g. fluffy, difficult to filter and not easily packed in columns can be.

Styrol-Maleinsäureanhydrid-Polymere gemäß Methode 11 lassen sich zur httfernung von Proteinen, z.B. Reinigung des Trinkwassers u.a. zur Anwendung bringen. Diese Träger haben ähnlich dem Polyaminopolystyrol ausgesprochen lypophilen Charakter. Proteine können nicht ohne Verlust ihrer Struktur gebunden werden, auch könnten sie mit Proteinen beladen nicht lyophilisiert werden.Styrene-maleic anhydride polymers according to Method 11 can be used for removal of proteins, e.g. cleaning of drinking water, among other things. Similar to polyaminopolystyrene, these carriers have an extremely hypophilic character. Proteins cannot be bound without losing their structure, too, could when loaded with proteins, they cannot be lyophilized.

Die nicht durch Protein verknüpften funktionellen Gruppen der bekannten Trägersubstanzen tragen als NH2- (Methode 1, 2, 3, 4) bzw.The functional groups not linked by protein of the known Carrier substances carry as NH2- (method 1, 2, 3, 4) or

als CO2-Gruppen (Methode 6, 8, 10) in entsprechenden pH-Bereichen positive bzw. negative Ladungen. Bei Methode 10 entstehen C°2-Gruppen zusätzlich bei der Proteinbindung des cyclischen An-.as CO2 groups (method 6, 8, 10) in the corresponding pH ranges positive or negative charges. Method 10 also creates C ° 2 groups in the protein binding of the cyclic an.

hydrids. Dieser polyvalente Charakter der Proteinträger verursacht Adsorption der Matrix, ähnlich den Ionenaustauschern, erhöhte Inaktivierung bzw. Denaturierung der Proteinstruktur und Verschiebung der pE-Optima bei gebundenen Enzymen.hydrids. This polyvalent character caused the protein carrier Adsorption of the matrix, similar to ion exchangers, increased inactivation or Denaturation of the protein structure and shift of the pE optima when bound Enzymes.

Es besteht daher großes Interesse an der Schaffung eines geeigneten Trägers für wasserunlösliche Proteine, sowie an den Träger gebundene wasserlöslichen Proteine und einem Verfahren zu ihrer Herstellung.There is therefore great interest in creating a suitable one Carrier for water-insoluble proteins, as well as water-soluble proteins bound to the carrier Proteins and a process for their production.

Durch die Erfindung werden die anstehenden Probleme gelöst. Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Mischpolrmerisat, bestehena aus a) Acrylamid, b) Äthylenmaleinsäure bzw. deren Anhydrid oder/und c) Maleinsäure sowie d) ,'-Methylen-bis-acrylamid oder Äthylendiacrylat im Gewichtsverhältnis a:b:c:d von 3:0,5-1,5:0,05-4: 0,075-0,9, wobei die Summe von b) und c) höchstens 4 Verhältnisanteile beträgt.The present problems are solved by the invention. A thing The invention is a mixed polymer consisting of a) acrylamide, b) ethylene maleic acid or their anhydride and / or c) maleic acid and d), '- methylene-bis-acrylamide or Ethylene diacrylate in a weight ratio a: b: c: d of 3: 0.5-1.5: 0.05-4: 0.075-0.9, where the sum of b) and c) is a maximum of 4 proportions.

Vorzugsweise liegt die einpolymerisierte Dicarbonsäure als hnhydrid vor. Der Bestandteil d), d.h. N,N'-Methylen-bis-acrylamid oder/und Äthylendiacrylat, machen vorzugsweise nicht mehr als 0,45 Teile im oben angegebenen Gewichtsverhältnis aus.The polymerized dicarboxylic acid is preferably present as the anhydride before. The component d), i.e. N, N'-methylene-bis-acrylamide and / or ethylene diacrylate, preferably make no more than 0.45 parts in the weight ratio given above the end.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen Mischpolymerisate zur Fixierung von Protein.Another object of the invention is the use of the above copolymers described for fixing protein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein wasserunlösliches Protein, wobei das in ungebundenem Zustand wasserlösliche Protein an das oben beschriebene Mischpolymerisat gebunden vorliegt.Another object of the invention is a water-insoluble protein, wherein the in the unbound state water-soluble protein to that described above Bound copolymer is present.

Im Folgenden wird das erfindungsgemäße Mischpolymerisat, seine Herstellung und Verwendung näher beschrieben.The following is a description of the copolymer according to the invention and its production and use described in more detail.

Acrylamid, N, N -Methyl-bis-acrylamid oder/und Äthylendiacryl&t sowie Maleinsäure bzw. Äthylenmaleinsäure oder die entsprechenden Anhydride werden in Gegenwart von Radikalbildnern und Radikalbeschleunigern in den oben angegebenen Verhältnissen nach an sich bekannten Methoden polymerisiert. An sich ist es möglich, Maleinsäure- bzw. IIaleinsaurea-nhydridgruppen in breiten Konzentrationsbereichen einpolymerisieren. Im Hinblick auf die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabenstellung erwies sich jedoch die oben näher gekennzeichnete Zusammensetzung als Bedingung für die Erzielung eines Mischpolymerisats, welches als Trägersubstanz die gewünschten günstigen Eigenschaften aufweist.Acrylamide, N, N -methyl-bis-acrylamide and / or ethylene diacryl & t as well as maleic acid or ethylene maleic acid or the corresponding anhydrides in the presence of radical formers and radical accelerators in those specified above Polymerized ratios by methods known per se. In itself it is possible Maleic acid or IIaleic anhydride groups in broad concentration ranges polymerize. With regard to the task on which the invention is based However, the composition described in more detail above turned out to be a condition to achieve a copolymer which is the desired carrier substance has favorable properties.

Bei der Herstellung läßt sich das llengenverhältnis von Acrylamid zu Maleinsäure bzw. Äthylenmaleinsäure oder den entsprechenden Anhydriden in verhältnismäßig weiten Bereichen variieren, ohne daß hierdurch die erforderliche Vernetzermenge wesentlich beeinflußt wird. So läßt sich Acrylamid mit Maleinsaure bzw. ihrem Anhydrid im Gewichtsverhältnis von ):0,1 bis 4 verwenden, ohne daß hierdurch das Verhältnis von Acrylamid zu Vernetzer wesentlicn beeinflußt ist. Bei der Verwendung von Äthylenmaleinsäure bsw. ihrem Anhydrid als Comonomer sind die Grenzen hingegen enger r gezogen. Hier regelt der Vernetzergehalt Porengröße und Festigkeit, aber auch die Bindung der Äthylenmaleinsäure im Gel.During production, the length ratio of acrylamide relative to maleic acid or ethylene maleic acid or the corresponding anhydrides vary within a wide range without thereby reducing the amount of crosslinker required is significantly influenced. Acrylamide can be mixed with maleic acid or its anhydride in the weight ratio of): 0.1 to 4, without thereby changing the ratio is significantly influenced by acrylamide to crosslinker. When using ethylene maleic acid bsw. In contrast, the limits for its anhydride as a comonomer are narrower. here the crosslinker content regulates pore size and strength, but also the binding of the Ethylene maleic acid in the gel.

Für die Verwendung zur Fixierung von Proteinen ergaben sich besonders gute Ergebnisse bei Verwendung von Acrylamid und Male insäure bzw. Äthylenmaleinsäure oder den entsprechenden 4rhydriden im Gewichtsverhältnis 3:0,5 bis 1,0. Bei Erhöhung der Konzentration der Dicarbonsäure bis 1 wird das i-iischpolymerisat zwar spröder und weniger quellbar, zeigt jedoch iruriler noch gute Eigenschaften als Träger. Bei einem Verhältnis von tcrylamid zu Vernetzer, d.h. N,N'-Methylen-bis-acrylamid bzw. Äthyllendiacrylat, von 3:0,075 bis 0,450 werden gelartige Polymerisate - mit besonders bevorzugten Eigenschaften erhalten. Ein Verhältnis von 3:0,075 stellt die untere' Grenzkonzentration dar, bei der die Maleinsäure bzw. Äthylenmaleinsäure noch befriedigend eingeschlossen wird.For the use for fixation of proteins resulted in particular good results when using acrylamide and maleic acid or ethylene maleic acid or the corresponding hydrides in a weight ratio of 3: 0.5 to 1.0. When increasing the concentration of the dicarboxylic acid up to 1, the i-iischpolymerisat becomes more brittle and less swellable, but still shows good properties as a carrier when it is more irurate. With a ratio of acrylamide to crosslinker, i.e. N, N'-methylene-bis-acrylamide or ethylene diacrylate, from 3: 0.075 to 0.450, are gel-like polymers - obtained with particularly preferred properties. A ratio of 3: 0.075 represents the lower limit concentration at which the maleic acid or ethylene maleic acid is still satisfactorily included.

Für die Fixierung von Proteinen in wässrigem Milieu erwiesen sich auch Vernetzerlconzentrationen entsprechend einem Verhältnis von Acrylamid zu Vernetzer von mehr als 3:0,45, z.B. 3:0,6-0,9 noch als gut geeignet. Bei Arbeiten mit höheren Salzkonzentrationen, d.h. mehr als 0,05 M, erwiesen sich jedoch die hierbei erhaltenen relativ eng vernetzten Gele für die Proteinstruktur als nachteilig.It has been shown to fix proteins in an aqueous medium also crosslinker concentrations corresponding to a ratio of acrylamide to crosslinker of more than 3: 0.45, e.g. 3: 0.6-0.9, is still well suited. When working with higher However, salt concentrations, i.e. greater than 0.05 M, proved to be those obtained here relatively tightly networked gels are disadvantageous for the protein structure.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate läßt sich beispielsweise in wässriger Lösung, vorzugsweise in inerter Atmosphäre, durchführen. Beispiele für geeignete Radikalbildner bzw. Radikalbeschleuniger sind Propionsäurenitril und Ammoniumperoxydisulfat. Die Polymerisation kann bei Zimmertemperatur, aber auch bei höheren Temperaturen bis zu 100° oder bei niedrigerer Temperatur durchgeführt werden. Die Polymerisationsdauer ist von der gewählten Polymerisationstemperatur, den gewählten Beschleunigern bzw. Katalysatoren und der mengenmäßigen Zusammensetzung des Ansatzes abhängig. Sie liegt gewöhnlich zwischen etwa 5 Minuten und mehreren Stunden.The copolymers according to the invention can be produced for example in an aqueous solution, preferably in an inert atmosphere. Examples of suitable radical formers or radical accelerators are propiononitrile and ammonium peroxydisulfate. The polymerization can take place at room temperature, as well carried out at higher temperatures up to 100 ° or at a lower temperature will. The polymerization time depends on the selected polymerization temperature, the selected accelerators or catalysts and the quantitative composition depends on the approach. It usually ranges from about 5 minutes to several Hours.

Nach dem Erstarren wird der polymerisierte Ansatz zur Erzielung einer für die lIandhabung besonders günstigen Körnung durch ein Sieb der gewünschten Maschenweite gedrückt, mit Wasser gewaschen und lyophilisiert.After solidification, the polymerized approach is used to achieve a Grain size, which is particularly favorable for handling, through a sieve of the desired mesh size pressed, washed with water and lyophilized.

Für die Fixierung des Proteins ist es notwendig, daß die Dicarbonsäure in Form des Anhydrids vorliegt. Es müssen daher-vor der Proteinverknüpfung sämtliche Säuregruppen wieder in das cyclische Anhydrid überführt werden. Dies erfolgt beispielsweise durch trhitzen des lyophilisierten Mischpolymerisats im Vakuum auf eine Tetnpeitur von etwa 80 bis 12000 oder Unter Atmosphärendruck bei einer Temperatur von etwa 160 bis 220, vorzugsweise 180 bis 20iC,OC..For the fixation of the protein it is necessary that the dicarboxylic acid is in the form of the anhydride. It must therefore - before the protein linkage all Acid groups are converted back into the cyclic anhydride. This is done for example by heating the lyophilized copolymer in a vacuum on a Tetnpeitur from about 80 to 12,000 or below atmospheric pressure at a temperature of about 160 to 220, preferably 180 to 20iC, OC ..

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate sind in Abhängigkeit von der Vernetzerkonzentration wasserklare bis milchig-trübe Substanzen mit gummiartiger bis spröder Konsistenz.The copolymers according to the invention are dependent on the Crosslinker concentration water-clear to milky-cloudy substances with rubber-like to brittle consistency.

Die Mischpolymerisate lassen sich leicht körnen, beispielsweise indem man sie durch ein Metallsieb drückt. Als günstig für die Zwecke der Proteinverknüpfung erwiesen sich llierbei Korngrößen von etwa 0,35 bis 0,8 mm. Dieses Granulat quillt bei Zusatz von Wasser nach. Die Stärke der Quellung ist vom Vernetzergehalt abhängig. Je enger die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate vernetzt sind, desto weniger quellbar sind sie.The copolymers can easily be granulated, for example by you push them through a metal sieve. As beneficial for the purposes of protein linkage were found to have grain sizes of about 0.35 to 0.8 mm. These granules swell after adding water. The strength of the swelling depends on the crosslinker content. The more closely the copolymers according to the invention are crosslinked, the less swellable are they.

Die Entquellung ist z.B. mit Alkohol oder noch einfacher durch Gefriertrocknung möglich.De-swelling can be done with alcohol, for example, or even easier with freeze-drying possible.

In mancher Hinsicht gleichen die Teilchen der erfindungsgemäßen Nischpolymerisate denen des bekannten Polyacrylamidmolekularsiebes. Bei Behandlung mit Pufferlösungen erfolgt eine Schrumpfung in Abhängigkeit von der Zahl. der vorhandenen Carboxylgruppen, ähnlich wie bei den Ionenaustauschern auf Dextran- oder Polyacrylamidbasi 5.In some respects, the particles resemble the copolymers according to the invention those of the known polyacrylamide molecular sieve. When treated with buffer solutions there is a shrinkage depending on the number. the carboxyl groups present, similar to the ion exchangers based on dextran or polyacrylamide 5.

Wenn die Carboxylgruppen durch Erhitzen auf etwa 2000C in das cyclische Anhydrid überführt werden, tritt häufig eine leicilte Gelbfärbung auf. Wird längere Zeit erhitzte so vertieft sich die Farbe von gelb bis braun und gleichzeitig nimmt die Bindungskapazität deutlich ab. Eine länger dauernde Erhitzung auf die erforderliche Temperatur unter Normaldruck wird daher tunlichst vermieden.When the carboxyl groups are converted into the cyclic by heating to around 2000C Anhydride are transferred, a slight yellow coloration often occurs. Will be longer Time is heated so the color deepens from yellow to brown and decreases at the same time the binding capacity decreases significantly. Prolonged heating to the required level Temperature under normal pressure is therefore avoided as far as possible.

Die Porosität und die Härte des erfindungsgemäßen Michpolymerisats im Zustand eines gea,uollenen Gels wird in erster Linie durch den Vernetzergehalt bestimmt. Das Material weist Molekularsiebeigenschaften auf, ähnlich wie bei den Polyacrylamidgelen, wobei die Ausschlußgrenzen beliebig durch den Verne-tzergehalt festgelegt werden können. In gequolleneni.Zustand läßt sich das erfindungsgemäße Mischpolimerisat leicht fil-trieren oder zentrifugieren' und zeigt als Säulenfüllung ideale Eigenschaften. In Wasser- oder Pufferlösungen gequollen und entquollen als Lyophilisat ist das gelartige Mischpolymerisat uneingeschränht haltbar.The porosity and hardness of the micropolymer according to the invention in the state of a gea, uollene gel is primarily due to the crosslinker content certainly. The material exhibits molecular sieve properties similar to those of the Polyacrylamide gels, the exclusion limits being arbitrary by the content of Nerne-tzer can be set. In the swollen state, the Lightly filter or centrifuge the mixed polymer and show it as filling in the column ideal properties. Swollen in water or buffer solutions and de-swelled as Lyophilisate, the gel-like copolymer can be stored without restriction.

Das erfindungsgemäße Michpolymerisat ermöglicht eine schonende Bindung des Proteins, weil es hydrophil und stark quellbar ist, und die Proteinverknüpfung nur durch Solvolyse der acyclischen Anhydridgruppen erfolgt. Die Proteinstruktur bleibt nach erfolg ter Bindung des Proteins erhalten, wobei Aktivitätsaubeuten bis zu 100 % (und sogar darüber durch Steigerung der Aktivität) gewonnen werden. Das nicht gebundene Protein läßt sich ohne Aktivitätsverlust zurückgewinnen. Bei der Bindung überniramt das Protein nicht eine Vernetzerfunktion in der Matrix sondern die erhaltenen, als "Enzymgele" zu bezeichnenden träger/gebundenen Enzyme sind vollkommen einheitlich und weisen nicht in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration unterschiedliche Festigkeit auf.The milk polymer according to the invention enables a gentle bond of the protein because it is hydrophilic and highly swellable, and the protein linkage occurs only by solvolysis of the acyclic anhydride groups. The protein structure remains after the protein has been bound, with activity levels of up to 100% (and even more by increasing the activity). That unbound protein can be recovered without loss of activity. In the The protein does not act as a cross-linking agent in the matrix, but rather as binding the resulting supported / bound enzymes, referred to as "enzyme gels", are perfect uniform and do not have different depending on the protein concentration Firmness on.

Durch die gezielte Vernetzung können die Molekularisiebeigenschaften des Mischpolymerisats so eingestellt werden, daß Proteine nur in gewünschte Bereiche gelangen können. So ist es möglich, das Mischpolymerisat für bestimmte Proteine so zu vernetzen, daß die Proteinbindung nur an der Oberfläche des Gelpartikels erfolgen kann, wahlweise aber auch im gesamten Gel.The molecular sieve properties can be increased through the targeted crosslinking of the copolymer can be adjusted so that proteins are only in the desired areas can get. So it is possible to use the copolymer for certain proteins to be crosslinked in such a way that the protein binding takes place only on the surface of the gel particle can, but optionally also in the entire gel.

Die Polymerisationsparameter lassen sich je nach dem wirksamen Molekülaradius, sterischen Effekten und Ladungsverteilung variieren.The polymerization parameters can be adjusted depending on the effective molecular radius, steric effects and charge distribution vary.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate besitzen Adsorptionseigenschaften, so daß in Wasser oder schwachen Pufferlösungen (bis etwa 0,01 M) das Eiweiß 100%ig am Träger fixiert wird. Bis zu 85 % des Eiweißes werden hierbei kovalent, der Rest heteropolar gebunden. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate ohne vorherige Cyclisierung der Säuregruppen erfolgt die Eiweißbindung nur adsorptiv. Es wurde gefunden, daß sich unter diesen Bedingungen das Protein mit Salzlösungen ohne Aktivitätsverlust vom Träger wieder eluieren läßt.The copolymers according to the invention have adsorption properties, so that in water or weak buffer solutions (up to about 0.01 M) the protein is 100% is fixed on the carrier. Up to 85% of the protein becomes covalent, the rest heteropolar bound. When using the copolymers according to the invention without prior to cyclization of the acid groups, protein binding occurs only adsorptively. It was found that under these conditions the protein with salt solutions allowed to re-elute from the support without loss of activity.

Die Proteinbindungskapazität des erfindungsgemäßen Mischpolymerisats ist abhängig von der Zahl der vorhandenen Anhydridgruppen und der Porengröße. Bei einem enger vernetzten Produkt ist die Bindungskapazität geringer als bei einem weniger eng vernetzten Produkt bei gleicher Anzahl an vorhandenen ArJ3ydridgruppen, da das Proteinmolekül bei engerer Vernetzung nicht alle zur Verfügung stehenden bindungsfähigen Gruppen erreichen kann.The protein binding capacity of the copolymer according to the invention depends on the number of anhydride groups present and the pore size. at a more closely networked product has a lower binding capacity than a less closely networked product with the same number of arJ3hydride groups present, because the protein molecule is not all available if it is more closely networked reachable groups.

Liegen im erfindungsgemäßen Mischpolymerisat zu viele Ladungen vor, die nicht von Protein durch kovalente Bindung besetzt werden können, so erfolgt im allgemeinen eine Verschiebung der pH-Optima bei den gebundenen Enzymen. Entsprechend wurde bei den bekannten trägergebundenen Enzymen beobachtet, daß es bei negativ geladenen Trägermaterialien zu einer Verschiebung um zwei pH-Einheiten, beispielsweise bei an Äthylenmaleinsäureanhydrid gebundenem Trypsin von 7,8 auf 10,0, und bei positiv gelagerten Trägern eine Verschiebung in den sauren Bereich erfolgt. Bei dem erfindungsgemäßen MischpoLymerisat ist es möglich, die bindungsfähigen Gruppen maximal auszunutzen, so daß sich trägergebundene Proteine erhalten lassen, die keine Verschiebung des pH-Vert-Optimums zeigen. If there are too many charges in the copolymer according to the invention which cannot be occupied by protein through covalent bonding, there is generally a shift in the pH optima of the bound enzymes. Correspondingly, it has been observed with the known carrier-bound enzymes that negatively charged carrier materials shift by two pH units, for example trypsin bound to ethylene maleic anhydride from 7.8 to 10.0, and with positively stored carriers a shift into the acidic range he follows. With the mixed polymer according to the invention it is possible to make maximum use of the groups capable of binding, so that carrier-bound proteins can be obtained which show no shift in the pH-Vert optimum.

Eine besonders interessante Eigenschaft der erfindungsgemäßen auf Träger gebundenen wasserunlöslichen Proteine besteht darin, daß unter Umständen höhere Michaelis-Konstanten erhalten werden als bei nicht-gebundenem Enzym. So wurde beispielsweise gefunden, daß die Aktivität von erfindungsgemäß gebundenem Trypsin gegenüber M-Benzoyl-1-arginin-p-nitranilid erhöht wird in Vergleich zu nicht-gebundenem Enzym.A particularly interesting property of the invention Carrier-bound water-insoluble proteins consists in that under certain circumstances higher Michaelis constants can be obtained than with unbound enzyme. So became found for example, that the activity of the invention Bound trypsin compared to M-benzoyl-1-arginine-p-nitranilide is increased to unbound enzyme.

Die erfindungsgemäßen trägergebundenen Enzyme weisen eine Fülle höchsterwünschter Eigenschaften auf und lassen sich für sahlreiche Anwendungsgebiete verwenden. So ermöglichen sie es, Substratumsätze weitaus gezielter als bisher auszuführen, da das Enzym zu jedem gewünschten Zeitpunkt aus dem Inkubationsansatz wieder entfernt werden kann. Ist der Umsatz noch nicht quantitativ, so läßt sich das gleiche Enzym erneut zusetzen. Bei Proteasen kann das zu spaltende Protein bei jeder gewünschten Hydrolyserate isoliert werden. Die Spaltungsreaktion läßt sich damit direkt verfolgen. Das enzymatisch aktive Protein muß nicht mehr, wie bisher, nach dem Substratumsatz ausgefällt werden -hierdurch wurden oftmals die Substratumsätze vermindert - sondern ea läßt sich durch einfaches Filtrieren oder Abdekantieren oder dgl. entfernen.The carrier-bound enzymes of the invention have an abundance of the most highly desirable Properties and can be used for a variety of areas of application. So they make it possible to carry out substrate sales in a much more targeted manner than before, because the enzyme is removed from the incubation mixture at any desired point in time can be. If the conversion is not yet quantitative, the same enzyme can be used add again. In the case of proteases, the protein to be cleaved can be used in any desired Hydrolysis rate can be isolated. The cleavage reaction can thus be followed directly. The enzymatically active protein no longer has to, as before, after the substrate turnover precipitated - this often reduced substrate sales - but ea can be removed by simple filtration or decanting or the like.

Substratumsätze lassen sich mit derartigen trägergebundenen enzymatisch aktiven Proteinen auch über Säulen ausführen. In ein käfigartiges Gefäß gepackte erfindungsgemäße Traägerenzyme lassen sich ähnlich wie ein Tee-Ei zu einem Inkubationsansatz geben und jederzeit wieder daraus entfernen.Substrate conversions can be carried out enzymatically with such carrier-bound active proteins also run over columns. Packed in a cage-like container Carrier enzymes according to the invention can be incubated in a manner similar to a tea egg give and remove from it at any time.

Mit proteolytisch wirksamen trägergebundenen-Enz-men lassen sich auf einfache preise Inhibitoren isolieren. Die Stabilität der Proteasen wird dabei durch die Bindung an das Trägermaterial wesentlich erhöht, da die Proteasen keincr Autolysereaktion mehr unterliegen.With proteolytically effective carrier-bound enzymes can be isolate simple price inhibitors. The stability of the proteases is thereby achieved the binding to the carrier material is significantly increased, since the proteases do not undergo an autolysis reaction more subject.

Mit erfindungsgemäßen trägergebundenen Protease-Inhibitoren lassen sich Proteasen einfach, schnell und anz spezifisch isolieren. I.it ihrer Hilfe ist es auch möglich, Proteassen enthaltende Proteinlösungen von den Proteasen zu reinigen uncl damit zu stabilisieren.Leave with carrier-bound protease inhibitors according to the invention isolate proteases easily, quickly and individually. I. is with your help it is also possible to purify protein solutions containing proteases from the proteases uncl to stabilize with it.

Durch erfindungsgemäße auf Träger fixierte Antigene bzw. Antikörper läßt sich eine einfache Isolierung von Antigenen bzw.By antigens or antibodies according to the invention fixed on carriers a simple isolation of antigens or

Antikörper durchführen. Mit derartigen trägergebundenen Enzymantikörpern kann eine besonders einfache und wirksame Enzymisolierung durchgeführt werden.Carry out antibodies. With such carrier-bound enzyme antibodies a particularly simple and effective enzyme isolation can be carried out.

Die erfindungsgemäßen gebundenen Proteine lassen sich ganz allgemein wiederholt benutzen und seigen zum Teil auch bei verlängertem Gebrauch keinerlei Aktivitätsschwund.The bound proteins according to the invention can be very generally use it repeatedly and sometimes even after prolonged use do not appear Loss of activity.

Aufgrund der Molekularisiebeigenschaften der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate lassen sich die trägergebundenen Proteine auch zur Substrattrennung einsetzen.Due to the molecular properties of the copolymers according to the invention the carrier-bound proteins can also be used for substrate separation.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate sind hinsichtlich ihre Eignung zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen den bisher bekannten, für gleiche Zwecke verwendeten Trägermaterialien in hohem Ausmaße überlegen, wie die in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigen.The copolymers according to the invention are suitable with regard to their suitability for the fixation of biologically active proteins the previously known, for the same Purposes used carrier materials to a large extent superior to those in the The table below shows the results summarized.

Tabelle 1 Träger- Einheitlich- Träger: Ausbeute Aktivität4) Ausbeute material keit des Protein geb. Pro- niedermolek. Aktivität Materials tein in % Substrate v.einges. Table 1 Carrier-Uniform-Carrier: Yield Activity4) Yield materiality of the protein-bound pro-low molecular weight. Activity material protein in% substrates v. some.

in % in % PAAD¹) einheitlich 20:1 15 - 18 905) 10 - 13 OMC-HYDRA-ZID (EN- einheitlich 10:0,1-1 25 - 30 bis 406) bis 14 ZYME)²) DMA³) nicht " 5:1 40 - 45 60 - 707) bis 30 erfin- einheitlich beliebig bis 80 bis 1008) bis 80 dungsgem. 1:2 Anmerkungen: 1) Polyacrylamid 2) Oarboxymethylcellulosehydrazid 3) Äthylenmaleinsäureanhydrid 4) Trypsin-Aktivität 5) alle niedermolekularen Aminosäuren-Substrate 6) Chymotrypsin-Aktivität 7) am Stickstoff geschützte Aminosäure-Ester 8) N-Benzoyl-1-arginin-p-nitranilid Die tberlegenheit der erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine liegt nicht nur in ihrer überlegenen Ausbeute und Aktivität, sondern auch in dem weitaus vorteilhafteren zulässigen Verhältnis von Träger zu Protein. in% in% PAAD¹) uniformly 20: 1 15 - 18 905) 10 - 13 OMC-HYDRA-ZID (EN- uniformly 10: 0.1-1 25 - 30 to 406) to 14 ZYME) ²) DMA³) not "5: 1 40 - 45 60 - 707) to 30 according to the invention, as desired, to 80 to 1008) to 80 according to the invention. 1: 2 Notes: 1) polyacrylamide 2) arboxymethyl cellulose hydrazide 3) ethylene maleic anhydride 4) trypsin activity 5) all low molecular weight amino acid substrates 6) Chymotrypsin activity 7) amino acid esters protected on nitrogen 8) N-benzoyl-1-arginine-p-nitroanilide The superiority of the carrier-bound proteins according to the invention is not only in their superior yield and activity, but also in the far more advantageous one allowable ratio of carrier to protein.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate lassen sich zur Fixierung von Proteinen sehr unierschiedlicher Molekülgröße und Eigenschaften verwenden, da sich die Eigenschaften dieses Trägermaterials ohne weiteres je nach den Erfordernissen des zu bindenden Proteins einstellen lassen. Wenn æ.B. das Protein ein besonders großes Molekül aufweist, so kann durch Verringerung des Vernetzungsgrades in weitem Umfange noch ein Eindringen des Proteins in die Matrix und Bindung in derselben bewirkt werden. Bei Proteinmolelesen, die so groß sind, daß auch durch eine Vernetzung im geringstmöglichen Ausmaß ihr Eindringen in die Matrix wesentlich erschweren wird, ist es auch möglich, eine Fixierung des Proteins lediglich an der Oberfläche der Teilchen vorzunehmen, wobei in diesem Falle das Mischpolymerisat vorzugsweise so fein gekörnt wird, daß eine sehr große Oberfläche erhalten wird, wobei die dann allein an der Oberfläche stattfindende Fixierung des Proteins zu einem völlig ausreichenden Fixierungsgrad führt.The copolymers according to the invention can be used for fixing of proteins with very different molecular sizes and properties, since the properties of this carrier material can easily be changed depending on the requirements of the protein to be bound. If æ.B. the protein a special one has a large molecule, so can by reducing the degree of crosslinking to a large extent Extend penetration of the protein into the matrix and binding in the same be effected. With protein mole readings that are so large that also through a network will make it much more difficult to penetrate the matrix to the lowest possible extent, it is also possible to fix the protein only on the surface of the Make particles, in which case the copolymer is preferably so is finely grained that a very large surface is obtained, which then Fixation of the protein taking place solely on the surface is completely sufficient Degree of fixation leads.

Das Verhältnis von homöopolar zu adsorptiv bzw. heteropolar am trager gebundenen Enzym läßt sich beeinflussen durch die Art der Herstellung der Bindung zwischen Protein und Träger. Wird beispielsweise das Protein vorgelegt in relativ hoher Pufferkonzentration und langsam das nicht-gequollene Gel zugegeben, so ist die Ausbeute an homöopolar gebundenem Enzym sehr hoch und praktisch kein adsorptiv gebundenes Enzym~nachzuweisen.The ratio of homeopolar to adsorptive or heteropolar on the carrier bound enzyme can be influenced by the species the production the bond between protein and carrier. For example, the protein is presented The non-swollen gel is added slowly and in a relatively high buffer concentration, thus the yield of homeopolarly bound enzyme is very high and practically none to detect adsorptively bound enzyme.

Wird andererseits mit niedriger Pufferkonzentration gearbeitet und Träger und Enzym rasch zusammengegeben, so ist zwar die Ausbeute an gebundenem Protein höher, von diesem an den Träger gegangenen Protein läßt sich jedoch mit hohen Pufferkonsentrationen wieder ein erheblicher Anteil eluieren, der also nicht homöopolar gebunden gewesen sein kann. Wird beispielsweise wie oben angegeben mit hoher Pu'fferkonzentration und langsamer Trägegzugabe gearbeitet, so gehen etwa 80 % des vorgelegten Enzyms an den Träger und es läßt sich dann nichts mehr davon eluieren.On the other hand, if you work with a low buffer concentration and When the carrier and enzyme are quickly combined, the yield of bound protein is indeed higher, but this protein which has been transferred to the carrier can be obtained with high buffer concentrations a considerable proportion elute again, which means that it was not bound in a homeopolar manner can be. For example, as stated above, with a high buffer concentration and slower carrier addition worked, about 80% of the enzyme submitted goes to the carrier and nothing more can then be eluted from it.

Das Enzym ist also annähernd vollständig homöopolar gebunden, und seine Aktivität wird lediglich noch durch die Zuganglichkeit für das Substrat bestimmt. Im zweiten Fall hingegen bei niedriger Pufferkonzentration und rascher Zugabe werden zwar 100 % des vorgelegten Proteins am Träger absorbiert. Hiervon lassen sich aber bis 35 s wieder mit hohen Salz- oder Pufferkonzentrationen eluieren, waren also nicht homöopolar gebunden Die folgenden Beispiele erläntern der Erfindung weiter.The enzyme is almost completely bound homeopolar, and its activity is only determined by its accessibility to the substrate. In the second case, however, use a low buffer concentration and rapid addition although 100% of the protein presented is absorbed on the carrier. But this can be elute again with high salt or buffer concentrations up to 35 s, so were not homeopolarly bound The following examples further illustrate the invention.

Beispiel 1 Herstellung des Mischpolymerisatz 3 g Acrylamid (AAD), 0,3 g N,N'-Methylen-bis-acrylamid (bis-AAD) werden mit 1 g Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA) in 23 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,6 suspendiert und unter starkem Rühren in Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur mit je 1 ml 5%igem Propionsäurentril und 5%igem Ammoniumperoxydisulfat versetzt. Example 1 Preparation of the mixed polymer 3 g of acrylamide (AAD), 0.3 g of N, N'-methylene-bis-acrylamide (bis-AAD) are mixed with 1 g of ethylene maleic anhydride (EMA) suspended in 23 ml of 0.05 M phosphate buffer pH 7.6 and with vigorous stirring in a nitrogen atmosphere at room temperature with 1 ml of 5% propionic acid tril each and 5% ammonium peroxydisulfate added.

Nach 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen Block. Dieser wird 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelasen und dann durch ein Metallisieb mit einer lichten Maschenweite von 0,5 mm gedrückt. Das erhaltene Granulat wird mit etwa 5 l destilliertem Wasser gewaschen. Das Naßgewicht beträgt nun 38,2 g.After 10 to 15 minutes at room temperature, block left to stand. This is left to stand for 60 minutes at room temperature and then through a metal sieve pressed with a mesh size of 0.5 mm. The granulate obtained is washed with about 5 liters of distilled water. The wet weight is now 38.2 g.

Das so erhaltene gequollene Mischpolymerisat wird zum Entquellen gefriergetrocknet. In getrocknetem Zustand beträgt das Gewucht (Ausbeute) 5,4 g.The swollen copolymer obtained in this way is freeze-dried to de-swell. In the dried state, the weight (yield) is 5.4 g.

Zur Cyclisierung zum Säureanhydrid wird anschließend 1,5 bis 2 Stunden bei 20000 im Trockenschrank erhitzt.The cyclization to the acid anhydride then takes 1.5 to 2 hours heated at 20000 in the drying cabinet.

Bespiel 2 3 g Acrylamid, 0,075 g Äthylendiacrylat und 1 g Maleinsäure werden wie in Beispiel 1 beschrieben mischpolymerisiert. Die Polymersationdauer beträgt 15 Stunden. Example 2 3 g of acrylamide, 0.075 g of ethylene diacrylate and 1 g of maleic acid are copolymerized as described in Example 1. The polymerization time is 15 hours.

Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 bebeschrieben. Die Ausbeute an Lyophilisat beträgt 2,3 g. Nach der Oyclisierung beträgt das Gewicht des Produktes 2,05 g.Further processing is also carried out as described in Example 1. The yield of lyophilizate is 2.3 g. After the cyclization, the weight is of the product 2.05 g.

Beispiel 3 3 g Acrylamid, C,3 g N,N'-Methylen-bis-Acrylamid nd 1 g Maleinsäure werden wie in Beispiel 1 beschrieben mschpolymerisiert. Example 3 3 g of acrylamide, C, 3 g of N, N'-methylene-bis-acrylamide and 1 g maleic acid are mschpolymerized as described in Example 1.

Die Polymerisationsdauer beträgt 15 Stunden. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ausbeute an Lyophilisat beträgt 2,67 g. Nach Cyclisierung beträgt das Gewicht des Produktes 2,45 g. The polymerization time is 15 hours. The further processing is also carried out as described in Example 1. The yield of lyophilizate is 2.67 g. After cyclization, the weight of the product is 2.45 g.

Beispiel 4 ,Wie in Beispiel 1 beschrieben werden~3 g Acrylamid, 0,6 g N,N'-Nethylen-bis-acrylamid und 1 g Maleinsäure mischpolymerisiert. Die Polymerisationsdauer beträgt 5 Stunden. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Example 4 As described in Example 1 ~ 3 g of acrylamide, 0.6 g of N, N'-ethylene-bis-acrylamide and 1 g of maleic acid copolymerized. The polymerization time is 5 hours. Further processing is also carried out as described in Example 1.

Die Ausbeute an Lyophilisat beträgt 2,8 g. Nach der Cyclisierung werden 2,6 g Endprodukt erhalten. The yield of lyophilizate is 2.8 g. After the cyclization 2.6 g of end product are obtained.

Beispiel 5 Wie in Beispiel 1 beschrieben werden 3 g Acrylamid, 0,3 g N,lT'-MethyIen-bis-acrylamid und 0,1 g Maleinsäure 5 Stunden mischpolymerisiert. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Daß Naßgewicht des gequollenen Produktes beträgt 53,5 g. Nach der Lyophilisierung wird ein Trockengewicht von 4,8 g erhalten. Die Cyclisierung führt zu einem Endprodukt in einer Ausbeute von 3,1 g. Example 5 As described in Example 1, 3 g of acrylamide, 0.3 g N, IT'-methylene-bis-acrylamide and 0.1 g maleic acid copolymerized for 5 hours. Further processing is also carried out as described in Example 1. That wet weight of the swollen product is 53.5 g. After lyophilization it becomes a dry weight of 4.8 g obtained. The cyclization leads to an end product in one yield of 3.1 g.

Beispiel 6 Herstellung des trägergebundenen Proteins Es wird ein cyclisiertes Mischpolymerisat aus 3 g Acrylamid, 0,15 g N,N'-Hethylen-bis-acrylamid und 1 g Maleinsäure als Träger verwendet. 100 mg Trypsin werden mit 1 g Träger in 15 ml eiskaltem Wasser, pH = 5,2, eingerührt und bei 400C 15 Stunden im Kühlraum reagieren lassen. Anschließend wird das Produkt in eine Säule gepackt. Example 6 Preparation of Carrier Bound Protein cyclized copolymer of 3 g of acrylamide, 0.15 g of N, N'-ethylene-bis-acrylamide and 1 g of maleic acid used as a carrier. 100 mg of trypsin are added to 1 g of carrier in 15 ml of ice-cold water, pH = 5.2, stirred in and put in the refrigerator for 15 hours at 40 ° C let react. The product is then packed into a column.

Das heteropolar gebundene Protein wurde mit 65 ml Waschwasser eluiert. Mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH -- 7,8, konnte danach kein weiteres Protein mehr eluiert werden. The heteropolar bound protein was eluted with 65 ml of washing water. With 0.2 M phosphate buffer, pH - 7.8, no further protein could then be eluted will.

Heteropolar gebundenes Protein: 31 % bei pH 7,0, 8,5, 10 20 % Rest-Aktivität, bezogen auf nicht gebundenes Trypsin: 50 .Heteropolar bound protein: 31% at pH 7.0, 8.5, 10 20% residual activity, based on unbound trypsin: 50.

Beispiel 7 Als Träger wird das Produkt von Beispiel 5 verwendet. Der Träger wird wie in Beispiel 1 beschrieben mit 100 mg Trypsin reagieren gelassen. Example 7 The product from Example 5 is used as the carrier. The carrier is reacted as described in Example 1 with 100 mg of trypsin.

Nichtgebundenes Protein: 30 % Aktivität des gebundenen Proteins vor Behandlung mit 0,2 M Puffer: 100 % nach " " II " " 50 .Unbound protein: 30% activity of the bound protein Treatment with 0.2 M buffer: 100% according to "" II "" 50.

Beispiel 8 Es wird der gleiche Träger wie in Beispiel 6 verwendet. 100 mg Träger und 200 mg Trypsin werden wie in Beispiel 1 beschrieben reagieren gelassen. Example 8 The same support as in Example 6 is used. 100 mg of carrier and 200 mg of trypsin will react as described in Example 1 calmly.

Nichtgebundenes Protein: 50 % Aktivität des gebundenen Proteins vor Behandlung mit 0,2 M Puffer: 100 % nach " " " " " 48 %.Unbound protein: 50% activity of the bound protein Treatment with 0.2 M buffer: 100% after "" "" "" 48%.

Beispiel 9 Es wird das Produkt von Beispiel 3 als Träger verwendet. 100 mg Rinderserumalbumin werden mit 1 g Träger wie in Beispiel 1 beschrieben reagieren gelassen. Example 9 The product of Example 3 is used as a carrier. 100 mg of bovine serum albumin will react with 1 g of carrier as described in Example 1 calmly.

Nichtgebundenes Protein: 32 .Unbound protein: 32.

Wede-r mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7,8, noch mit Q,2 M Glycinpuffer, pH = 1,8, kann Protein vom Träger eluiert werden. Die-Ausbeute an homöopolar gebundenem Protein beträgt 68 %, bezogen auf eingesetztes Protein, und 100 %, bezogen auf' -gebundenes Pro6- Bei Verwendung von Humanserumalbumin anstelle von Rinderserumalbumin wird das gleiche Ergebnis erhalten.Wede-r with 0.2 M phosphate buffer, pH = 7.8, still with Q, 2 M glycine buffer, pH = 1.8, protein can be eluted from the support. The yield of homeopolar bound Protein is 68%, based on the protein used, and 100%, based on ' -bound Pro6- When using human serum albumin instead the same result is obtained from bovine serum albumin.

Beispiel 10 Es wird das Produkt von Beispiel 3 als Träger verwendet. 1 g Träger wird portionsweise innerhalb von 60 Minuten zu 200 mg gelöst in 18 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7,8) gegeben und 18 Stunden bei 40C reagieren gelassen. Example 10 The product of Example 3 is used as a carrier. 1 g of carrier is dissolved in portions in the course of 60 minutes to give 200 mg in 18 ml Phosphate buffer (0.1 M, pH = 7.8) was added and left to react for 18 hours at 40C.

Nichgebundenes Protein: 50 % Aktivität des gebundenen Proteins, bezogen auf eingesetzte Aktivität, 40 %.Unbound protein: 50% activity of bound protein, based on on activity used, 40%.

Mit 0,2, 0,33 bzw. 0,5 M Phosphatpuffer kann kein Protein und keine Aktivität vom Träger eluiert werden.With 0.2, 0.33 or 0.5 M phosphate buffer, neither protein nor Activity can be eluted from the support.

+) Trypsin +) Trypsin

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Water-insoluble protein, thereby characterized in that it is attached to a copolymer consisting of a) acrylamide, b) ethylene maleic acid or their anhydride and / or c) maleic acid and d) N, N'-methylene-bis-acrylamide or ethylene acrylate in a weight ratio a: b: c: d of 3: 0.5-1.5: 0.05-4: 0.075-0.9, whereby the sum of b) and c) is a maximum of 4 proportions.

2. Protein according to claim 1, characterized in that the component d) does not make up more than 0.45 proportions of the copolymer.