DE1924230C - Method for isolating orgotein from blood - Google Patents
Method for isolating orgotein from bloodInfo
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Description
2- Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß aus Rindern gewonnene Erythrocvten als Ausgangsstoff verwendet werden. 2- The method according to claim 1, characterized in that erythrocytes obtained from cattle are used as the starting material.
3. \ erfahren nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß das Erwärmen durch rasches Abkühlen der Pufferlösung unter Raumtemperatur unterbrochen wird.3. \ experience according to claim 1 or 2, characterized in that the heating by rapid Cooling of the buffer solution below room temperature is interrupted.
3030th
Orgotein ist die vom »United States Adopted N:-:r.c Council« einem reinen wasserlöslichen Protein ziemlich niedrigen Molekulargewichtes, vorwiegend Λ-helicaler Konfiguration, welches durch zwei bis vier Atome zweiwertiger Metalle, wie Mg. Zn1 Cu, chelatisiert ist. zuneordneie freie Kurzbezeichnung. Bei Orgotein handelt es sich um ein physiologisch wirksames und nicht enzymatisch wirkendes Protein-Meiall-Chelai. welches bei der Behandlung von solchen Krankheiten eingesetzt werden kann, weiche, wie beispielsweise Entzündungen, auf ein gestörtes Immunisierungss >stern des erkrankten Individuums zurückzuführen sind (vgl. Huber et al, Abstracts Seventh Annual M.-eting of the Society of Toxicology, Washington D. C. März 1968. Nr. 59, und belgische Patentschrift 687 82S). In der belgischen Patentschrift 687 828 ist die Isolierung des dort noch nicht als Orgotein bczeichneten Proteins aus Rinderleber bzw. aus \on Blutresten befreiter Placenta beschrieben, jedoch muß hieraus geschlossen werden, daß Blut ein wenig geeigneter Ausgangsstoff ist.Orgotein is that of the United States Adopted N: - : rc Council, a pure water-soluble protein of fairly low molecular weight, predominantly Λ-helical configuration, which is chelated by two to four atoms of divalent metals such as Mg. Zn 1 Cu. to be assigned a free short name. Orgotein is a physiologically active and non-enzymatic protein Meiall-Chelai. which can be used in the treatment of diseases such as, for example, inflammation, can be traced back to a disturbed immunization star of the diseased individual (cf. Huber et al, Abstracts Seventh Annual M.-eting of the Society of Toxicology, Washington DC March 1968. No. 59, and Belgian patent specification 687 82S). The Belgian patent 687 828 describes the isolation of the protein, not yet referred to as orgotein, from bovine liver or from placenta freed from blood residues, but it must be concluded from this that blood is a less suitable starting material.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein einfacher und mit geringeren Kosten durchzuführendes Verfahren zum Isolieren von im wesentlichen reinem Orgotein aus leichter zugänglicheren und billigeren Ausgangsstoffen. Dieses Verfahren ist gernäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daßThe present invention now relates to a method which is simple and can be carried out at lower cost for isolating essentially pure orgotein from more accessible and cheaper ones Raw materials. This method is according to the invention characterized in that
a) Ervthrocyten von Blutplasma abgetrennt werden.a) Ervthrocytes are separated from blood plasma.
b) die plasmafreien Erythrocyien hämolysiert werden,b) the plasma-free erythrocytes are hemolyzed,
c) vom Hämolysat das Hämoglobin abgetrennt wird,c) the hemoglobin is separated from the hemolysate,
d) das vom Hämoglobin befreite Hämolysat in einer fj Ionen zweiwertiger Meialle enthaltenden Pufferlösung bis zur Inaktivierung der CO2-Anhydrase erhitzt wird.d) the hemolysate freed from the hemoglobin is heated in a buffer solution containing fj ions of divalent metals until the CO 2 anhydrase is inactivated.
e) das Erwärmen unterbrochen und der entstandene Niederschlag abgetrennt wird unde) the heating is interrupted and the precipitate formed is separated off and
f) das Orgotein von der vom Niederschlag befreiten Lösung abgetrennt wird.f) the orgotein is separated from the precipitate-free solution.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß^die Hauptmenge des in Blut enthaltenen Orgoteins in den Erythrocvten enthalten ist und daß die vom Blutserum abgetrennten Erythrocyien einen besonders leicht aufzuarbeitenden Ausgangsstoff darstellen. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt gegenüber den an sich bekannten Verfahren zum Isolieren von im wesentlichen reinem Orgotein den Vorteil, daß Orgotein mit nur wenigen Verfahrensschritten ausreichend rein, insbesondere praktisch frei von Albumin erhalten werden kann, Jas beim Verarbeiten von geronrenem Blut bis in die letzten Fraktionierschritte bei der an sich bekannten Herstellung von Orgotein mitgeschleppt wird. Nach dem Abtrennen des beim Erhitzen des vom Hämoglobin befreiten Hämolv^ats entstandenen Niederschlags kann aus der erhaltenen I osung bereits ein vorwiegend aj> Orgotein bestehender Feststoff erhalten werden, ucr in der Regel schon 90° „ Orgotein, aber oraktiseh kein Albumin enthält. Dieser Feststoff kann bereits durch Gelfiltration oder eine sonstige Abart des Chromau>graphierens in Orgotein hoher Reinheit überfuhr' werden. d>-?s ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, da das erfindungsgemäß erhältliche, im wesentlichen reine Orgotein vor allem wegen der Abwesenheit deAlbumins für viele Zwecke direkt verwendbar ist. The method according to the invention is based on the knowledge that the main amount of the orgotein contained in blood is contained in the erythrocytes and that the erythrocytes separated from the blood serum represent a starting material that is particularly easy to work up. The method according to the invention has the advantage over the method known per se for isolating essentially pure orgotein that orgotein can be obtained sufficiently pure, in particular practically free of albumin, with just a few process steps the production of Orgotein, which is known per se, is carried along. After separation of the heating of the liberated from hemoglobin Hämolv ^ ats resulting precipitate can from the resulting I solution already predominantly aj> Orgotein existing solid obtained ucr usually already 90 ° "Orgotein but oraktiseh no albumin. This solid can be converted into orgotein of high purity by gel filtration or some other type of chroma graphing. However, d> -? s is not absolutely necessary, since the essentially pure orgotein obtainable according to the invention can be used directly for many purposes, primarily because of the absence of deAlbumin.
Orgotein ist ein seiner Struktur nach helicales Pr1-iein. und zwar scheint ein wesentlicher Teil des Moleküls Λ-helicale Konfiguration zu besitzen, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, daß im Molekül des Orgoteins ketienabbrechende Aminosäurerestc. wie Reste des Serins. Threonins. Prolins, Isoleucin,- und Cysteins nur in einer im Vergleich zu den übrigen Aminosäureresten geringen Menge enthalten sind. Die durchschnittliche chemische Analyse des Orgotein-, also des Proteinchelats. ergibt 50.02° „ C, 7.^:",n H. 25,55°,„ O, 15.26° „ N. 1.10% S, 0.00°■„ P und weniger als 1 % Asche. Die Prüfung eines aus Orgotein erhaltenen sauren Hydrolysates mittels typischer /uckerreageniien spricht für die Anwesenheit von etwa 3 bis 40 0 Kohiehvdrate. berechnet als Glucose, im Molekül, wobei das Kohlehydrat wahrscheinlich kovalent an uas Protein gebunden ist. Orgotein enthält weniger als 0,01 ° „ Lipoidphosphor. weniger als 0,1 % Cholesterin, wt.liger als 0.05°.·„ Galactolipoid und höchstens nicht nachweisbare Mengen an wasserlöslichen Glycolipoiden. Orgotein is a helical Pr 1 -iein according to its structure. a substantial part of the molecule seems to have a Λ-helical configuration, which is probably due to the fact that ketiene-terminating amino acid residues in the molecule of the orgotein. like residues of the serine. Threonine. Proline, isoleucine and cysteine are only contained in a small amount compared to the other amino acid residues. The average chemical analysis of the orgotein, i.e. the protein chelate. results in 50.02 ° "C, 7th ^:", n H. 25.55 °, "O, 15.26 °" N. 1.10% S, 0.00 ° ■ "P and less than 1% ash. The test of a obtained from orgotein acid hydrolyzate by means of typical sugar reagents speaks for the presence of about 3 to 4 0 0 carbohydrates, calculated as glucose, in the molecule, whereby the carbohydrate is probably covalently bound to the protein. Orgotein contains less than 0.01% lipoid phosphorus, less than 0.1% cholesterol, weight less than 0.05 °. · “Galactolipoid and at most undetectable amounts of water-soluble glycolipoids.
Entsprechend neuesten Berechnungen besitzt das im Orgotein enthaltene Protein ein Molekulargewicht von etwa 32 600 :: H)°,'„ und einschließlich des Kohlehydrats ein Molekulargewicht von etwa 34 000. Unter Berücksichtigung dieses Molekulargewichts des Orgoteins und dessen Aschegchali von etwa 0,3°/„ ergibt sich für das Proteinchelat Orgotein im Durchschnitt ein Gehalt an insgesamt 235 Aminosäureresten und etwa 2 bis 4 Metallatomen pro Molekül.According to the latest calculations, the protein contained in orgotein has a molecular weight of about 32,600 :: H) °, '"and, including the carbohydrate, a molecular weight of about 34,000. “For the protein chelate Orgotein, on average, there is a total of 235 amino acid residues and around 2 to 4 metal atoms per molecule.
Der Proteinanteil des Orgoteins enthält alle wesentlichen Aminosäuren, ist im wesentlichen frei von Cystin und enthält andere schwefelhaltige Reste nur in geringen Mengen, und zwar enthält es pro Molekül nur einen Cysteinrest und vier Methioninreste und keine sonstigen schwefelhaltigen Reste.The protein part of orgotein contains all essential amino acids and is essentially free from It contains cystine and other sulphurous residues only in small quantities, namely it contains per molecule only one cysteine residue and four methionine residues and no other sulfur-containing residues.
Der isoelektrische Punkt des Protein-Metall-ChelatsThe isoelectric point of the protein-metal chelate
j,,r j ,, r
Ijeäi bei einem pH-Wert \on etwa 5.5 ·■ υ "* isoionische Punkt lieg! bei einem pH-Wen ·.,.,- Cl ,Λ 5.36 = 0.G2. Der isoelektrisch^ Punkt wurde durch Elektrophorese auf Celluloseacetat unter Verwendung von Citrat-Phosphat-PufTern verschiedenen pH-We.'t ermittelt. Der isoionische Punkt wurde nach der son R i ü d i f ο r d et al. in J. Biocher.. 2 '■). S. io~y Wf>4 angegebenen Methode bestimmt. Hierbei wurde d i-Protc:n gründlich dialysien und damit von diet· Elektrolyten befreit und anschließend aeinergeiro^i. ncIjeäi at a pH \ on about 5.5 · ■ υ "* isoionic point lie in a pH-Wen ·, -... Cl, Λ = 5:36 0.G2 The isoelectric point was ^ by electrophoresis on cellulose acetate using different pH values of citrate-phosphate buffers were determined. The isoionic point was determined according to the son R i ü dif ο rd et al. in J. Biocher .. 2 '). S. io ~ y Wf> 4 Here, d i-Protc: n was thoroughly dialysed and thus freed from the electrolytes and then aeinergeiro ^ i. nc
Orgotein ergibt bei einem pH-Wert ...π Proteine typisches Infrarotspektrum. In der ·■ Tabelle 1 sind Ultraviolettabsorptionsspektre"":-: de Orgotein; angegeben, weiche be; einem ηΗ-'·Λ crt so; 0.05 n-HCl und in 0.05 n-HC! piu-' <>.'n m-kX!Orgotein gives a typical infrared spectrum at a pH value of ... π proteins. In Table 1, ultraviolet absorption spectra "" are: -: de orgotein; indicated soft be; a ηΗ- '· Λ crt so; 0.05 n-HCl and in 0.05 n-HC! piu- '<>.'n m-kX!
r.Hr.H
em fur eendcf.em for eendcf.
1.5 in in1.5 in
bei e neni pH-Wert vonat a pH of
3535
4545
Bei pH 13,0 scheinen alle Tyro5\lreste des Proteins unter spontaner Ionisierung dem Lösungsmittel frei zugänglich zu sein, wogegen bei einem pH-Wert von 1.5. selbst bei einer Ionenkonzentration von 0.05, die Tyrosylreste teilweise gegen einen Angriff von der Seite des Lösungsmittels her abgeschirmt sind. Das Proteinmolekül scheint damit im alkalischen Bereich stärker aufgefaltet y.u sein.At pH 13.0 all tyro residues of the protein appear to be freely accessible to the solvent with spontaneous ionization, whereas at a pH of 1.5. even at an ion concentration of 0.05, the Tyrosyl residues are partially shielded against attack from the side of the solvent. The The protein molecule thus appears to be more unfolded y.u in the alkaline range.
Bei einem pH-Wert von weniger als 5,5 erweist sich das Protein zunächst als im wesentlichen unlöslich, jedoch beginnt es sich bei einem pH-Wert von 2 wieder zu lövcii und ist bei einem pH-Wert von 1,5 vollständig gelöst. Im Säureciifierenzspektrum sind die hei 292 bis 294 nm auftretenden Scheitel auf Tryptophan und die bei 285 bis 287 nrr auftretenden Scheitel der HauptSache nach auf Tyrosin und zu einem sehr geringen Teil auf Tryptophan zurückzuführen, wobei Phenylalanin im Bereich von 250 bis 265 mn Änderungen in der f-emstruktur des Spektrums bewirkt. Das Säureditterenzspektrum bei einer lonenkonzentration von 0.Or- nm ist wesentlich verschieden vom Säuredifferenz^pekirum bei einer lonenkonzentration von 0.15 m. Bei einer |. nenkonzentration von 0.05 m sind bei 2NO bis 296 nm keine definierte Scheitel festzustellen. jedoch zeigt sich bei 294 bis 296 nm ein Plateau und bei 2*:- bis 29o nm. hinter einer niedriger liegenden Stufe t>es 2S0 bis 2S2 nm eine breite Schulter. Bei einer lonenkonzentration son 0.15 m zeigt sich bei 294 bis 2s6 nm kein Scheitel und auch kein Plateau, jedoch erstreckt sich über den Bereich son 27S bis 2S3 nm ein breites welliges Plateau, svobei bei 286 bis 2^(i nm eine Schulter feststellbar ist.At a pH of less than 5.5, the protein initially proves to be essentially insoluble, however, it starts again at pH 2 zu lövcii and is complete at pH 1.5 solved. In the acidification spectrum the hot 292 to 294 nm occurring vertices on tryptophan and the vertices occurring at 285 to 287 nrr the main thing after attributed to tyrosine and to a very small extent to tryptophan, with phenylalanine causes changes in the f-em structure of the spectrum in the range from 250 to 265 mn. The acid ditterent spectrum at an ion concentration of 0. Or- nm is essentially different from the acid difference ^ pekirum at an ion concentration of 0.15 m. With a |. concentration of 0.05 m are at 2NO to 296 nm no defined vertex to be found. however, there is a plateau at 294 to 296 nm and at 2 *: - up to 29o nm. Behind a lower level t> es 2S0 to 2S2 nm a broad shoulder. At a ion concentration at 0.15 m is found at 294 bis 2s6 nm no vertex and also no plateau, however A broad, wavy plateau extends over the range from 27S to 2S3 nm, with 286 to 2 ^ (i nm one shoulder is detectable.
l:s scheint, dab das bei einem pH-Wert von 1.5 bei 292 bis 2V6 nm auftretende Plateau auf eine Umgruppierung der Tryptophanreste im Proteinmolekül zurückzuführen ist. Die bei 2S~ bis 290 nm auftretende Schulter ergibt sich wahrscheinlich zum Teil durch die Tyrosinreste des Moleküls. Bei einer lonenkonzentration son 0.15 ist das Tr' ptophan, im Gegensatz fur den F:>11 einer Ionenkor/entration son 0.05. anscheinend nahezu abgeschirmt. Bei beiden lonenkonzentrationen sind die Spektren hinsichtlich der durch Tyrosin besM-rkten Scheitel nahe/u als abnorm.:', zu bezeichnen Der bei anderen Proteinen bei etwa 2S5 nm aufscheinende Scheitel fehlt bei einer lonenkonzentration son 0.15m und entartet bei einer lonenkonzentration von 0.05 m zu einer nur schwach ausgeprägten Schulter. Das bei 284 bis 2SS nm feststellbare Spektrum spricht dafür, daß die Tyrosinrcsie im Inneren des Protemmoleküls eingeschlossen und damit dem Lösungsmittel nicht zugänglich sind.l: it seems that this occurs at a pH of 1.5 292 to 2V6 nm occurring plateau on a regrouping the tryptophan residues in the protein molecule is due. The one occurring at 2S ~ up to 290 nm Shoulder probably surrenders in part through the tyrosine residues of the molecule. At an ion concentration son 0.15 is the Tr 'ptophan, in contrast for the F:> 11 of an ion correlation but 0.05. apparently almost shielded. At both ion concentrations the spectra are close to / u as abnormal with regard to the peaks enhanced by tyrosine: ', to be designated The apex that appears at about 25 nm in other proteins is absent when there is an ion concentration son 0.15m and degenerates at an ion concentration from 0.05 m to a weakly pronounced shoulder. That which can be determined at 284 to 2SS nm Spectrum suggests that tyrosine in Trapped inside the protein molecule and therefore not accessible to the solvent.
Bei der Gelscheibenelekt'onhorese auf Polyacrylamid und bei der Dünnschichtelektrophorese auf Agarose ergibt Orgotein drei schmale und nahe bjieinanderliegende Banden, die, bezogen auf den Ausgangspunkt, näher der Anode liegen. Diese Banden sind einfach und stets reproduzierbar und besonders geeignet zur identifizierung des Orgoteins. Die Dünnschichtelektrophorese auf Agarise stellt eine Abänderung der von R. L. P h ι I I i ρ s und 1 . R. P. 1 f ν itch in Progress in Clinical Pathology. 1960. S. 62 bis 153. beschriebenen Methode dar. Die Gelscheibenelektrophorese auf Polyacrylamid beruht auf den Arbeiten von O r η s t e ι η und D a ν i s in Ann. N.Y. Acad. Sei. 121. 321 und 404. 1964, und von W ihams und R e i s f i e 1 d in Nature, 195. 2Sl. 1962.In the case of gel disc elect'onhoresis on polyacrylamide and on thin layer electrophoresis on agarose, Orgotein gives three narrow and closely spaced ones Gangs that, based on the starting point, closer to the anode. These bands are simple and always reproducible and special suitable for the identification of orgotein. Thin-film electrophoresis on Agarise represents a modification of that of R. L. P h ι I I i ρ s and 1. R. P. 1 f ν itch in Progress in Clinical Pathology. 1960. P. 62 to 153. method described. The gel disk electrophoresis on polyacrylamide is based on the work of O r η s t e ι η and D a ν i s in Ann. N.Y. Acad. May be. 121, 321 and 404, 1964, and by W ihams and R e i s f i e 1 d in Nature, 195. 2Sl. 1962.
Aus Rmderblut isoliertes Orgotein scheint praktisch, wenn nicht vollständig identisch zu sein mit aus Rmdeilebcr isoliertem Orgotein, da die Molekulargewichte und der Metallgehalt gleich sind und schließlich auch beim Rheumatoidfaktor-Agglutiniertest und beim Bioversuch nach Ungar die gleiche antiinflammatorische Wirkung feststellbar ist.Orgotein isolated from lower blood seems practical if not to be completely identical with from Rmdeilebcr isolated orgotein, since the molecular weights and the metal content are the same and finally also in the rheumatoid factor agglutination test and in the bio-experiment according to Ungar the same anti-inflammatory one Effect can be determined.
I:s war überraschend, daß Orgotein aus Blut im wesentlichen frei von Hnzymen isoliert werden kann, da gerade Blut eine große Anzahl von lin/ymcn enthält und allein in den roten Blutkörperchen menschlichen Blutes zumindest 82 verschiedene Lnzyme aufgefunden wurden. Die Anwesenheit dieser Enzyme, des Chromproteins Hämoglobin, von Phosphorhpoiden und Cholesterin und schließlich auch von anorganischen Salzen im Blut erschwert jedoch dasI: s was surprising that orgotein from blood in the can be isolated essentially free of enzymes, since blood contains a great number of lin / ymcn and found at least 82 different enzymes in the red cells of human blood alone became. The presence of this enzyme, the chromium protein hemoglobin, of phosphorus phosphoids and cholesterol and finally also inorganic salts in the blood make this difficult
ι „ .»...,...- ... .γ.-·-, wird \on den rotenι "." ..., ...- ... .γ.- · -, becomes \ on the red
l-ohercn reine:! > Kn-- ■' e:r:- ..-.;- Bu.: rcHie-lails. .serin mangen .-.t.i..i..---^ -- ,„./· ■/.,,-.l-ohercn pure :! > Kn-- ■ 'e: r : - ..-.; - Bu .: rcHie-lails. .serin mangen .-. ti.i ..--- ^ -, "./ · ■ /.,,-.
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h:iit werden \-..r allen! de-hai^ hew. r/.ij-l. a:iI Rinder- i.:iU:re -.i"e!- \-:,:---üi;:;sulfal oder . o-:. biiü. AcL-he-- ι-. S, !dachte; cien ■" /roik-i Mengen 4, .::u!e<c -· .:.:;-;--:..■ ^ :'/-' \orgcnonrnen - .h : iit be \ - .. r all! de-hai ^ hew. r / .ij-l. a: iI cattle i.:iU:re -.i "e ! - \ -:,: --- üi;:; sulfal or. o- :. biiü. AcL-he-- ι-. S,! thought; cien ■ "/ roik-i sets 4,. :: u! e <c - ·.:.:; -; -: .. ■ ^: '/ -' \ orgcnonrnen -.
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»ils Rtnderblut wwi'iiiicni.-;;-; ' )re<>!e;ti an-Aeiehcndc K- ap'exbildunj v-ür.-aiii /ii fördern, muß er - - »Ils peripheral blood wwi'iiiicni .- ;; -; ') re <>! e; ti an-Aeiehcndc K- ap'exbildunj v-ür.-aiii / ii promote, he must - -
Opjoicinc können auch au-den retell Hlutkörperehen el;e> ,Tg-üii-che- !.-^unti-niiüel mit dem II.■.:■■ -Opjoicinc can also au-den retell hats el; e>, Tg-üii-che-! .- ^ unti-niiüel with the II. ■.: ■■ -
iindercr Säiiiietiere. l->c;\picKwcise I'iertien. /icgcn. elobin in innige iv-riihrunu jefracht 'Aerde;i. .·..·-in cattle animals. l-> c; \ picKwcise I'iertien. / icgcn. elobin in intimate iv-riihrunu jefracht 'Aerde; i. . · .. · -
Sei;.ifen usw.. gewinnen uerden. tüiil e. zeigte --ich. wegen der ! nlo-ii. i:-.eit solcher organische! Lo n:u>-Be; .if etc .. uerden win. tüiil e. showed - me. because of the ! nlo-ii. i: -. since such organic! Lo n: u> -
il;ii> .n ! in/elfallen bc-'i'iin1I.e -oLher drtioteini: ph.ar- :i5 P'i'.tel in '»^'a-ier .'Acekniaßig dadurch bcwcrks.c!;.j-til; ii> .n! in / elfallen bc-'i'iin 1I .e -oLher drtioteini: ph.ar-: i5 P'i'.tel in '»^' a-ier .'Acekniaziger thereby bcwcrks.c!;. jt
iiiakiil.misch wirksamer waren als andere. Va- Rinder- wird, d.iil zusammen mn dem mit Wasser mch' ii-;-..;·,-iiiakiil.mixedly more effective than others. Va- cattle- is, i.e. together with the water mch 'ii -; - ..; ·, -
hUil gewonnenes (Vjo'e::) erweist -ich jedoch als tu·- baren !,osungsmincl eine gewisse Menge eine- :r.itHUil won (Vjo'e: :) proves, however, to be doable!, solution mincl a certain amount of a-: r.it
(Uindcrs ui.-ks.in'. w-js!ia!!^ \,\n Kü-dorn staniniende WaSSL"1 mischbaren organischen I ösuncsmmek. ivi-(Uindcrs ui.-ks.in '. W-js! Ia !! ^ \, \ n Kü-dorn staniniende WaSSL " 1 miscible organic I ösuncsmmek. Ivi-
rote Ululkiirpcrchen '.or/u'j--«ei-e .-.N Auseangsstoff spielswei-e ein niederes Alkan.il. wie Melh.: ,, ■;,red ulcers' .or / u'j - "ei-e .-. N Ausangstoff, for example, a lower alkane. like Melh .: ,, ■ ;,
verwendet werden 6-, Äthanol. n-F'ropano]. Isopri'panol oder tert.-Butan, i.can be used 6-, ethanol. n-F'ropano]. Isopropanol or tert-butane, i.
oder ein andere- mit \\a->-er mischbares I.ö-une:-or another- with \\ a -> - er mixable I.ö-une: -
a) (.ewmr-ung roter Blutkörperchen m[[cl ^ ;,„„.,„ Tetralndrofuran. \ceton, Metini-a) (.ewmr-ung red blood cells m [[cl ^ ;, ""., "tetralndrofuran. \ ceton, metini
Kote Hlutkörper. len. welche etwi >5 bis 45 \ olum- ath\!kcton usv. . verwendet wird, we' dies eine germj-eKote parapet. len. which about 5 to 45 \ olum- ath \! kcton etc. . is used if this is a germj-e
prozent bzw. en-.i Xi~> bis 50 ( iewichlspro/ent de- cc- Menge des mit W'assci nicht misclinarcn ! ösiing-percent or en-.i Xi ~> up to 50 (iewichlspro / ent de- cc- amount of the w'assci not misclinarcn! ösiing-
siimien Blutes ausmachen, weiden '-oni Hlulplasma Pj iniHels in die AÜ-scngc l'luisc überführtmake out siimien blood, weiden '-oni Hlulplasma Pj iniHels transferred to the AÜ-scngc l'luisc
/wcckmäüig abzentnfugiert oder auc'n lediglich sedi- Is i-t wcsenthJ'. das Hämoglobin vollständig ab-/ wcckmäüig abzentnfugiert or also just sedi- Is i-t wcsenthJ '. the hemoglobin completely
menl'eren gelassen. Beim eineuieii Aufsclilämnien iler zutrennen. we-'nalr niüteN des als l'ällung'.niiltcl .c-menl'eren calm. At the one uieii separation iler to separate. we-'nalr niüteN des als l'ällung'.niiltcl .c-
sc abcetrennten roten Uluikornerchen inui Kei;n ivch- wendeten ; osunü-niuicN I älluneen so oft vori;e:.-'m-sc severed red uluikornchen inui K ei; n ivch- turned ; osunü-niuicN I älluneen vori so often; e: .- 'm-
men werden sollen, bis die überstehende Flüssigkeit nicht melir von Hämoglobin gefärbt ist.men should be until the supernatant liquid is not colored by hemoglobin.
Es erscheint zweckmäßig, das ausgefällte Hämoglobin einmal oder mehrere Male auszuwaschen, um dre Ausbeute an Orgotein zu erhöhen. Beispielsweise wurden 452 ml eines Kuchens von roten Blutkörperchen aus der nach Fällung von Hämoglobin verbleibenden überstehenden Flüssigkeit 640 mg einer Orgotein enthüllenden Proteinfraktion erhalten und durcU einmaliges Auswaschen des abgetrennten Hämo- to globins mittels entsalzten Wassers weitere 325 mg einer solchen Protoinfraktion gewonnen.It seems appropriate to wash out the precipitated hemoglobin one or more times in order to to increase the yield of orgotein. For example was 452 ml of a red blood cell cake from that remaining after hemoglobin precipitation supernatant liquid obtained 640 mg of a protein fraction revealing orgotein and thru single washing out of the separated hemotlobin with desalinated water a further 325 mg obtained from such a protoin fraction.
Um einen Abbau des Orgoteins zu vermeiden, soll das Ausfällen des Hämoglobins bei niedrigen Temperaturen, vorzugsweise bei Temperaturen unter 5"C, insbesondere bei Temperaturen unter 00C, beispielsweise bei einer Temperatur von -10cC vorgenommen werden.In order to avoid degradation of the orgotein, the hemoglobin should be precipitated at low temperatures, preferably at temperatures below 5 ° C., in particular at temperatures below 0 ° C., for example at a temperature of -10 ° C.
In dieser Stufe ist es gelegentlich erwünscht, die nach Fällung des Hämoglobins erhaltene über- ao stehende Flüssigkeit zu dialysieren und gefrierzutrocknen, um entweder die Menge an zu erwartendem Orgotein bestimmen zu können oder mehrere Chargen für die weitere Reinigung miteinander zu vereinigen. In diesem Falle können an sich bekannte as Methoden eingesetzt werden. Das durch Gefriertrocknen erhaltene Produkt ist ziemlich stabil, jedoch ist es zu empfehlen, dieses Produkt kühl, vorzugsweise bei einer Temperatur unter 5"C, zu lagern.At this stage it is occasionally desirable to obtain the over ao obtained after the hemoglobin has been precipitated Dialyze and freeze-dry standing liquid to either the amount of expected To be able to determine orgotein or to combine several batches for further purification. In this case, methods known per se can be used. That by freeze drying obtained product is quite stable, however it is recommended to cool this product, preferably to store at a temperature below 5 "C.
b) Zerstörung der Enzyme worauf die ausgefällten Proteine abliltricrl oder ab-/entrifugiert werden. Die hierbei erhaltene klare Ι-'lüssigkeit enthält vorwiegend Orgotein \on den insgesamt vorhandenen Proteinen. Aus der so erhaltenen Lösung kann unreines Orgotein in Pulverform durch Dialyse, womit Puffersal/.e und nicht chclatiertc Mctallioncn entfernt werden, und anschließendes (iefriertrocknen der protemhaltigcn Lösung isoliert werden.b) Destruction of the enzymes whereupon the precipitated proteins abliltricrl or ab- / entrifugiert will. The clear liquid obtained in this way mainly contains orgotein total proteins present. From the thus obtained Solution can impure orgotein in powder form by dialysis, with which Buffersal / .e and not chclatiertc Metal ions are removed, and subsequent freeze-drying of the protem-containing solution is isolated will.
Reinigung des OrgoteinsPurification of the orgotein
Nach dem Abtrennen des beim Erhitzen entstandenen Niederschlages kann das in der hiermit erhaltenen Lösung enthaltene bzw. das aus dieser Lösung durch Dialyse und Gefriertrocknen erhaltene Orgotein ohne Schwierigkeiten durch Filtrieren über ein Gemisch von Kunstharzen, durch Elektrophorese und/oder Filtrieren über ein als Molekularsieb wirkendes Polymer, beispielsweise in der in der belgischen Patentschrift 687 828 angegebenen Weise, weiter gereinigt werden. Der größte Teil der das Orgotein begleitenden organischen Verunreinigungen besitzt ein wesentlich niedrigeres Molekulargewicht als Orgotein, so daß diese Vcrunieinigungen in einfacher Weise und rasch durch Gelfiltration entfernt werden können.After the precipitate formed during heating has been separated off, this can be obtained in this way Orgotein contained in the solution or obtained from this solution by dialysis and freeze-drying without difficulty by filtering through a mixture of synthetic resins, by electrophoresis and / or filtering through a polymer acting as a molecular sieve, for example in that in the Belgian Patent 687,828 specified manner, can be further cleaned. Most of those accompanying the orgotein organic contaminants have a much lower molecular weight than orgotein, so that these associations can be made in a simple manner and can be removed quickly by gel filtration.
DL· Erfindung wird im folgenden durch Ausfühningsbeispielc näher erläutert. The invention is explained in more detail in the following by means of exemplary embodiments.
Beispiel 1 isolierung von Orgotein, aus Rinderhlutexample 1 isolation of orgotein, from cattle hides
Obzwar das als Ausgangsstoff verwendete Blut zahlreiche Enzyme enthält, ist im in der oben angegebenen Weise erhaltenen Produkt im wesentlichen nur mehr CO,-Anhydrase enthalten, die zusammen mit den in wesentlich geringeren Mengen vorliegenden Enzymen durch Wärmebehandlung zerstört wird. (Die Empfindlichkeit der COt-Anhydrase gegenüber Wärme ist beispielsweise von R. P. D a ν i s in »The Enzymes· Bd. 5, S. 545, 1961, Academic Press, beschrieben.)Although the blood used as the starting material contains numerous enzymes, the product obtained in the manner indicated above essentially only contains CO 2 anhydrase which, together with the enzymes present in significantly smaller quantities, is destroyed by heat treatment. (The sensitivity of CO t anhydrase to heat is described, for example, by RP D a ν is in “The Enzymes · Vol. 5, p. 545, 1961, Academic Press.)
Beim Erhitzen der von Hämoglobin befreiten übersiehenden Flüssigkeit wird die CO»-Anhydrase vollständig inaktiviert, wobei gleichzeitig alle übrigen wärmelabilen Enzyme inaktiviert werden. Bei 60° C muß in der Regel länger als 10 Minuten erhitzt werden, um die CO,-Anhydrase und die übrigen Enzyme zur Gänze zu zerstören. Bei 65" C genügt es in der Regel, 10 bis 15 Minuten zu erhitzen, wobei selbst während einer Erhitzungsdauer von 20 Minuten oder mehr die erzielbare Ausbeute an reinem Orgotein kaum beeinträchtigt wird. Beim Erhitzen auf 70° C während einer Stunde wird zumindest die Hälfte des Orgoteins zerstört. Wenn das Erhitzen bei 65° C während 10 bis 20 Minuten vorgenommen wird, bleibt das Orgotein in Anwesenheit einer ein zweiwertiges Metallion mit einem Atomradius von 0,69 bis 0,80 A enthaltenden Pufferlösung im wesentlichen unangegriffen, was sich beispielsweise daran zeigt, daß eine Lösung des Orgoteins in solch einer Pufferlösung beim Erhitzen auf 65° C während 20 Minuten nicht durch Zersetzungsprodukte wolkig getrübt wird. Bei 8O0C zeigt sich eine solche wolkige Trübung innerhalb 10 Minuten und bei 1000C innerhalb 2 Minuten. Bei 37c C zeigt ich eine Trübung erst nach mehreren Stunden.When the hemoglobin-free overspraying liquid is heated, the CO 2 anhydrase is completely inactivated, with all other heat-labile enzymes being inactivated at the same time. At 60 ° C, heating usually takes longer than 10 minutes in order to completely destroy the CO, anhydrase and the other enzymes. At 65 "C it is usually sufficient to heat for 10 to 15 minutes, the achievable yield of pure orgotein hardly being impaired even during heating for 20 minutes or more. When heated at 70 ° C for one hour, at least half is If the heating is carried out at 65 ° C. for 10 to 20 minutes, the orgotein is essentially unaffected in the presence of a buffer solution containing a divalent metal ion with an atomic radius of 0.69 to 0.80 Å, for example indicates that a solution of the Orgoteins is not spoiled in such a buffer solution when heated to 65 ° C for 20 minutes of the decomposition products cloudiness. at 8O 0 C, such a cloudy haze is within 10 minutes and at 100 0 C within 2 minutes. in 37 c C I only show turbidity after several hours.
Nachdem die gesamte CO,-Anhydrase durch Erhitzen inaktiviert worden ist, wird das Gemisch sofort ausreichend weit unter Raumtemperatur gekühlt, Frisches Rinderblut wurde bei OC während 10 Minuten bei 2600 · g (das 26O0fachc der Erdbeschleunigung) zentrifugiert, worauf das Plasma abdekantiert und die roten Blutkörperchen mit dem 2- bis 3fachen Volumen einer 0,9gewichtsprozentigen Kochsalzlösung gewaschen wurden. Die gewaschenen roten Blutkörperchen wurden durch Vermischen mit dem 1,1 fachen ihres Volumens an kaltem entsalztem Wasser, welches als Netzmittel 0,02 Gewichtsprozent Saponin enthielt, hämolysiert.After all of the CO, anhydrase has been inactivated by heating, the mixture is immediately cooled sufficiently below room temperature. Fresh bovine blood was centrifuged at OC for 10 minutes at 2600 x g (260 times the acceleration due to gravity), whereupon the plasma is decanted and the red blood Blood cells were washed with 2 to 3 times the volume of 0.9 weight percent saline solution. The washed red blood cells were hemolyzed by mixing with 1.1 times their volume of cold deionized water which contained 0.02 percent by weight saponin as a wetting agent.
Nach einer Hämolysedaucr von mindestens 30 Minuten bei 4°C wurde das Hämolysat bei 15 C langsam und unter Rühren mit dem 0,25fachen seines Volumens an Äthylalkohol und dann ebenfalls bei 15rC mit dem 0,31fachen seines Volumens an Chloroform versetzt, worauf das erhaltene Gemisch bei einer Temperatur von höchstens —5rC 15 Minul η gerührt wurde. Es wurde so eine die Form einer dicken PasteAfter a Hämolysedaucr of at least 30 minutes at 4 ° C, the hemolysate at 15 C and was slowly added with stirring to 0.25 times its volume of ethyl alcohol and then also at 15 C r with the 0,31fachen its volume of chloroform, whereafter the resulting mixture was stirred η at a temperature of at most -5 r C 15 Minul. It became so in the form of a thick paste
So aufweisendes Gemisch erhalten. Aus dieser Paste wurde das Hämoglobin dadurch ausgefällt, daß sie zunächst einige Zeit bei einer Temperatur von — 10.0C verwahrt, dann 15 Minuten bei 4° C stehengelassen und dann mit den 0,2fachen ihres Volumens an kältet 0,15 m NaC'-Lösung versetzt wurde, womit sich eine gut fließfähige Suspension ergab. Aus dieser Suspension wurde der Niederschlag und überschüssige! Chloroform durch Abzentrifugieren bei — 100C während 10 Minuten (beim 20 000fachen der Erd beschleunigung) abgetrennt. Die hierbei erhalten« klare Flüssigkeit wurde filtriert und gegen kaltes ent salztes Wasser dialysiert, worauf die erhaltene dialy sierte Lösung gefriergetrocknet wurde.So obtained having mixture. NaC secures 10. 0 C, then allowed to stand for 15 minutes at 4 ° C and then kältet with 0.2 times its volume of 0.15 m '- in this paste, the hemoglobin was precipitated characterized in that it initially some time at a temperature of Solution was added, resulting in a free-flowing suspension. This suspension became the precipitate and excess! Chloroform separated by centrifugation at -10 0 C for 10 minutes (at 20,000 times the acceleration of the earth). The clear liquid obtained in this way was filtered and dialyzed against cold deionized water, whereupon the dialyzed solution obtained was freeze-dried.
Der Alkohol und Chloroform enthaltende Nieder schlag wurde durch Vermischen mit möglichst wenij entsalztem V/asser in einem Mischer extrahiert worauf die Flüssigkeit abzentrifugiert wurde. Fü dieses Extrahieren des erwähnten Niederschlages isThe precipitate containing alcohol and chloroform was mixed with as little as possible Desalinated water was extracted in a mixer and the liquid was centrifuged off. For this extraction of the mentioned precipitate is
309630/31309630/31
9 109 10
in der Regel die gleiche Voliimcnmenge an Wasser er- vollständig abgesetzt halle, wurde die Kolonne durch forderlich', als d;>s Volumen der als Au:gaiigsstoii einen mit einem Hller ausgestatteten Verschluß verwendeten roten Blutkörperchen betrug. Auch die geschlossen. Anschließend wurde durch die Kolonne durch diese Extraktion erhaltene Lösung wurde zwei Tage Pufferlösung umgewälzt, um das in der dialssiert und uefriergetrocknet. Durch diese Ruck- 5 Kolonne befindliche Bett zu stabilisieren: hierbei ·■·-.fraktion des ausuefällten Hämoglobins werden -In wurde eine l'mwäl/geschwindigkeit von IC ml nun bi> 50" ,, der ursprünuiio! in der klaren Flüssigkeit aufrechterhalten. Das sehheßliche Bettvolumen beenthaltenen Proteine gewonnen Durch nochmaliges trug 775.7 cm3 wegen Γ rtr'-h 3.14 ■( \.b ein)2 · Rückcurahieren dieses Nicdersch'.tges worden weitere 4)6,5 cm.As a rule, if the same volume of water had been completely deposited, the column became necessary when the volume of the red blood corpuscles used as an outlet for a cap equipped with a cap was. Also closed. Subsequently, the solution obtained through the column by this extraction was circulated for two days of the buffer solution, dialed around that in the and freeze-dried. To stabilize the bed located by this jerk column: in this case the fraction of the precipitated hemoglobin was maintained at a rate of IC ml now up to> 50 ", the original in the clear liquid. The ugly bed volume of the retained proteins was recovered by adding 775.7 cm 3 because of Γ rtr'-h 3.14 ■ ( \ .b a) 2 · back-curving this Nicdersch'.tges was a further 4) 6.5 cm.
10 bis 15°o erhalten. >° Das nach dem Abtrennen der Enzyme erhaltene10 to 15 ° o. > ° That obtained after separating the enzymes
Das durch Gefriertrocknen erhaltene Material gefriergetrocknete Material wurde mit einer Konzenwurde in O,O25m Tris-Glycin-Puffer gelöst, welcher tration von 20 mg/ml in Pufferlösung gelöst, worauf an Mn" O.Olmolar war. einen pH-Wert und 7,? he- gegebenenfalls vorhandene unlösliche Feststoffe ab- «aß und etwa 20 mg gefriergetrocknetes Material pro zentrifugiert wurden. Die erhaltene klare Lösung Milliliter enthielt. Die erhaltene Lösung wurde 15 Mi- 15 wurde auf die Kolonne unter Verwendung eines nuten auf 65 C erhitzt, womit die COj-Anhydrase Dosierventils aufgegeben.The material obtained by freeze-drying was freeze-dried with a concentrate dissolved in 0.025m Tris-glycine buffer, which tration of 20 mg / ml dissolved in buffer solution, whereupon at Mn "O.Olmolar was. a pH value and 7,? he- any insoluble solids present «Ate and about 20 mg of freeze-dried material per centrifuged. The clear solution obtained Contained milliliters. The resulting solution was 15 Mi- 15 was applied to the column using a nuten heated to 65 C, with which the COj anhydrase dosing valve is abandoned.
und die sonstigen wärmclabüen En/>me ausgefällt Beim Betrieb der Kolonne wurde stets eine Tempe-and the other heat clusters precipitated During the operation of the column, a temperature was always
wurden. Anschließend wurde die erhaltene Lösung ratur von 4 C "'ngchalten. Der verwendete Puffer lofort in einem Eisbad auf 5 C gekühlt und dann bei war ein 0,05molarer Tris-HCI-Puffer, welcher einen QC 10 Minuten /entrifugiert (beim 20000fachen der io pH-Wert von 7.5 besaß, an KCl 0,15molar und an Erdbeschleunigung) um den Niederschlag abzutrennen. Glycin 0,005molar war und im übrigen an Mg4* Die erhaltene Flüssigkeit wurde gegen entsalzles 10 3molar, an Cu' * 10 'molar und an Zn'' 10 smolar Wasser dialysiert, worauf die durch Dialyse von über- war.became. The resulting solution was then switched to a temperature of 4 ° C. The buffer used was immediately cooled to 5 ° C. in an ice bath and then a 0.05 molar Tris-HCl buffer, which entrifuged a QC for 10 minutes (at 20,000 times the io pH 7.5 possessed 0,15molar and to acceleration due to gravity) to remove KCl to the precipitate. glycine was 0,005molar and the rest of Mg 4 * the obtained liquid was 10 molar against entsalzles 3, Cu '* 10' molar and dialyzed on Zn '' 10 s molar water, whereupon that of dialysis was over.
ichüssigen Metallionen und Puffersubstanzen befreite Der Kolonne wurde die Proteinlösung vom BodenLiquid metal ions and buffer substances were freed from the column. The protein solution was removed from the bottom of the column
Lösung' gefriergetrocknet wurde. Der so erhaltene 25 her zugeführt, wobei eine Zufuhrgeschwindigkeit von Feststoff bestand vorwiegend aus Orgotein. 10 ml/h eingestellt wurde. Der Proteingehalt _r ein-Solution 'has been freeze-dried. The thus obtained 25 was fed here, a feed rate of solids consisting predominantly of orgotein. 10 ml / h was set. The protein content _r
,. lfi, zelnen Fraktionen wurde durch deren Absorption bei,. If the individual fractions were absorbed,
a) ueiniiraiion 280 nm ^stimmt. Die für die einzelnen Proteine auf-a) ueiniiraiion 280 nm ^ is correct. The information available for the individual proteins
Fm vernet/tes Dextrangcl mit einem Molgewicht gefangenen Fraktionen wurden gewogen, und es Fraktionierungsbereich von iOuü bis 5ö ööö wurde 30 wurde auch deren Volumen bestimmt. Die das erste unter dauerndem Rühren langsam auf etwa 60 C Absorptionsmaximum zeigende Fraktion, welche der erhitztem und entsalztem Wasser zugesetzt, worauf das Kolonne entströmte, enthielt Orgotein, welches in der erhaltene Gemisch mitsamt dem Behälter 5,75 Stun- Regel in 300 bis 400 ml des Eluats enthalten ist. Diese den in ein auf 60' C erhitztes Wasserbad gestellt und Fraktionen wurden zwecks weiterer Aufarbeitung mitdann 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen 35 einander vereinigt. Auf diese Fraktionen, welche ein wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde samt den wohldefiniertes Absorptionsmaximum zeigen, folgen aufgeschlämmten Stoffen abgesaugt. Dem so erhal- Fraktionen, welche im Absorptionsmaxi.num eine tenen Dextrangel wurde das 4- bis Sfache seines Vo- Schulter zeigen, mutmaßlich ein Analog des Orgotcins lumens an Wasser zugesetzt, worauf erneut gerührt. enthalten und nicht unbedingt isoliert werden müssen, absitzen gelassen und überstehendes abgesaugt wurde. 40 Es erscheint jedoch angezeigt, diese Fraktionen dann Anschließend wurde erneut frische Pufferlösung dem zu isolieren, wenn deren Proteingehalt von einer Gel zugesetzt und die oben angegebene Arbeitsweise maximalen Konzentration rasch absinkt. Beim weiviermal wiederholt. Die schließlich erhaltene Suspen- teren Eluieren der Kolonne folgen beträchtlich später sion wurde auf 4C gekühlt und vor ihrer Verwendung Verunreinigungen darstellende Proteine niedrigeren unter vermindertem Druck entlüftet. 45 Molekulargewichts enthaltende Fraktionen. die" ausFm linked dextran cl with a molecular weight captured fractions were weighed, and it The fractionation range from iOuü to 5ö ööö was 30 and their volume was also determined. The first while stirring slowly to an absorption maximum of about 60 C, which fraction is added heated and desalinated water, whereupon the column flowed out, contained orgotein, which in the The mixture obtained, including the container, is usually contained in 300 to 400 ml of the eluate for 5.75 hours. This placed in a water bath heated to 60 ° C. and fractions were then used for further work-up Left to stand for 1 hour at room temperature 35 combined. On these factions, which one would. The supernatant liquid and its well-defined absorption maximum would follow Suspended substances sucked off. The resulting fractions, which in the absorption maxi.num one The ten dextran rod would show 4 to 5 times its Vo shoulder, presumably an analog of orgotcin lumens of water were added, whereupon the mixture was stirred again. contain and do not necessarily have to be isolated, Allowed to settle and the excess was sucked off. 40 It appears, however, these factions then Subsequently, fresh buffer solution was again used to isolate, if its protein content was of a Gel added and the above procedure, maximum concentration drops rapidly. At four times repeated. The suspensions finally obtained, eluting the column, follow considerably later Sion was chilled to 4C and contaminated proteins were lowered prior to use vented under reduced pressure. 45 molecular weight fractions. from
Es wurde eine aus Polymethacrylat gefertigte Ko- der Kolonne entfernt werden, um sie für die Auflonne nut Umwälzeinrichtung verwendet. Die Länge arbeitung weiterer Chargen vorzubereiten. ! der Kolonne betrug 1050 mm. und der DurchmesserA cord made of polymethacrylate was removed from the column in order to be ready for the opening nut circulating device is used. Prepare the length work for further batches. ! the column was 1050 mm. and the diameter
\ der Kolonne betrug 32 mm. Beim Füllen der Kolonne b» Abtrennen von Puffersubstanzen und über- \ the column was 32 mm. When filling the column b »separation of buffer substances and excess
j mit entgastem Puffer wurde besondere Sorgfalt darauf 50 schüssigen Metallionenj with degassed buffer, special care was taken to ensure that 50 metal ions were used
J verwendet, daß nahe dem an der Seite der Kolonne Die durch Gelfiltration erhaltene Lösung desJ used that close to the one on the side of the column. The solution of des obtained by gel filtration
j befindlichen Filter keine Luftblasen eingeschlossen Orgoteins wird über eine mit einem Kationen- undj filter located no air bubbles trapped Orgoteins is via a with a cation and
wurden. Die mit Puffer gefüllte Kolonne wurde sodann Anionenaustauscherharz gefüllte Kolonne filtriert in einen kalten Raum gebracht und dort mit Hilfe wobei das Austauschharz sowohl stark s&ure SO3H-einer Wasserwaage in vertikaler Lage justriert. Nach 55 Gruppen als auch stark basische Temperaturangleich im kalten Raum wurde die Gel- _became. The column filled with buffer was then filtered and brought into a cold room, filled with anion exchange resin, where the exchange resin was adjusted in a vertical position with the aid of both strongly acidic SO 3 H and a spirit level. After 55 groups as well as a strongly basic temperature adjustment in the cold room, the gel _
aufschlämmung unter dauerndem Rühren in einen "i'J"KLHa)1i.HtOH-Gruppenslurry with constant stirring in a "i ' J " KLH a ) 1 iH t OH groups
am Kopf der Kolonne befestigten Trichter gegossen. im Styrol-Divinylbenzol-Copolymer aufweist. Au! Sobald sich am Boden der Kolonne eine einige Zenti- diese Weise wird der Gehalt der Lösung an Puffer meter starke Schicht \on Dextrangel ausgebildet haue, 60 substanzen verringert und der Gehalt der Losung ai wurde der Auslaß am Boden der Kolonne so weit ge- Mg·*-, Cu-- und Zn---Ionen auf weniger als 10-' öffnet, daß sich eine gleichmäßige Ausflußgeschwindig- molar gebracht. Alternativ kann der gleiche Zwecl keit ergab. Es zeigte sich durch das Hochsteigen einer auch durch Dialyse erreicht werden horizontal üegenden Gelfläche im Rohr, ob dip Ko- Eine Kolonne von 3,7 cm Durchmesser und !14 cnpoured funnel attached to the top of the column. in the styrene-divinylbenzene copolymer. Ow! As soon as there is a few centimeters at the bottom of the column, this increases the buffer content of the solution meter thick layer of dextran gel, reduced 60 substances and the content of the solution ai the outlet at the bottom of the column has been reduced to less than 10- ' opens that brings a steady outflow velocity molar. Alternatively, the same purpose revealed. It was shown to be achieved by ascending a well through dialysis horizontally lying gel surface in the tube, whether dip Ko- A column 3.7 cm in diameter and! 14 cn
lonne gleichmäßig gefüllt wird. Nachdem sich in der S5 Länge wurde mit entsalztem und entgastem Wasse Kolonne eine etwa 95 cm hohe Gelschicht abgesetzt zur Hälfte gefüllt, worauf eine Aufschlämmung de hatte, wurde aus der Kolonne überschussiges Gel und Ionenaustauschharzes in entlüftetem und entsalzten Puffer entfernt. Nachdem sich die oberste Gelschicht Wasser langsam in die Kolonne "ep-jsscn vurde umlonne is filled evenly. After being in the S 5 length, an approximately 95 cm high gel layer was deposited half-filled with desalinated and degassed water, whereupon a slurry had de, excess gel and ion exchange resin was removed from the column in deaerated and desalinated buffer. After the top gel layer of water is slowly in the column "ep-jsscn vurde around
das Austauschbar/ absetzen gelassen wurde. Hie Kolonne wurde sodann mehrmals mittels entsalzen Wassers gewaschen, bis sich ein konstanter pH-Wert vim etwa /,0 ergab und die lonenkon/enlratiom des Ablaufs 1US der Kolonne einer l.eiifanigkeit von etwa l.i'S entsprach. Fs ergab sich hiermit eine Füllhöhe der Kolonne von 84cm und cm Bettvolumen von i*57 ml, dies entspricht einer gesamten lonenaustauschkapazität von 440 Milliäquivalenten, wenn man den vom Hersteller des Austauschharzes angegebenen Faktor von 0,46 berücksichtigt.that has been left exchangeable / discontinued. The column was then washed several times with desalinated water until a constant pH value of about 1.0 resulted and the ion ratio of the outlet 1 US of the column corresponded to an oil content of about 1%. This resulted in a filling height of the column of 84 cm and cm bed volume of i * 57 ml, this corresponds to a total ion exchange capacity of 440 milliequivalents if the factor of 0.46 given by the manufacturer of the exchange resin is taken into account.
Das bei der Gelfiltration anfallende und Orgotein enthaltende Eluat wird erforderlichenfalls auf einen froteingehalt von 8 bis 10°/n eingeengt, worauf die trhaltene Lösung mit der erforderlichen Sorgfalt auf den Kopf der mit Ionenaustauschharz gefüllten Kolonne aufgebracht und die Fraktionen mittels entsalztem Wasser auseinandergezogen werden. Die Durchflußgeschwindigkeit wird auf etwa 20 ml min eingestellt, wobei die erhaltenen Fraktionen durch Bestimmung der Ultraviolettabsorption bei 280 nm uuf einen Gehalt an Orgotein überprüft werden. Es werden Fraktionen in Mengen von 25 bis 50 ml aufgefangen. Das erwünschte Protein scheint in der Regel in den Fraktionen 4 bis 12 auf. Die Konzentration dieser Fraktionen an Puffersubstanz und zweiwertigen Metallionen wird hierbei beträchtlich unter 10"'molar gesenkt, was sich durch den Abfall der Leitfähigkeit der Lösung vor der Filtration »her die Kolonne (die Leitfähigkeit zu diesem Zeitpunkt betrug etwa 4000 bis 5000 S) auf einen Wert von 1.5 bis 2,5 S anzeigte.The obtained in the gel filtration and the eluate containing Orgotein is necessary, concentrated on a froteingehalt 8-10 ° / n, is applied to the top of the filled ion exchange resin column, after which the trhaltene solution with the necessary care and fractions are pulled apart by means of deionized water. The flow rate is adjusted to about 20 ml min, the fractions obtained being checked for an orgotein content by determining the ultraviolet absorption at 280 nm. Fractions are collected in amounts of 25 to 50 ml. The desired protein usually appears in fractions 4 to 12. The concentration of these fractions of buffer substance and divalent metal ions is hereby reduced considerably below 10 "molar, which is reduced to one due to the drop in the conductivity of the solution prior to filtration (the conductivity at this point in time was about 4000 to 5000 S) Indicated value from 1.5 to 2.5 S.
Um eine für Injektionszwecke geeignete sterile Lösung des Proteins herzustellen, wird der erhaltenen Lösung Fructose, Sucrose oder ein anderes Saccharid in einer solchen Menge zugesetzt, daß zumindest 2 Gewichtsteile des Saccharids auf 1 Gewichtsteil des Proteins kommen, worauf die erhaltene Lösung durch Ultrafiltration sterilisiert und gleichzeitig unter sterilen Bedingungen in sterilisierte Ampullen oder Fläschchen eingefüllt wird. Um ein stabileres Produkt zu erhalten, kann die Füllung der Phiolen br*. Fläschchen vor dem Verschließen gefriergetrocknet werden.In order to prepare a sterile solution of the protein suitable for injection purposes, the obtained Solution fructose, sucrose or another saccharide added in such an amount that at least 2 parts by weight of the saccharide come to 1 part by weight of the protein, whereupon the resulting solution passes through Ultrafiltration and sterilized at the same time under sterile conditions in sterilized ampoules or Vial is filled. In order to obtain a more stable product, the filling of the vials can be br *. Vials must be freeze-dried before sealing.
Beim Arbeiten gemäß Beispiel 1 können folgende Abänderungen einzeln oder zu mehreren gemacht werden, ohne die Ergebnisse nennenswert zu verändern. When working according to Example 1, the following changes can be made individually or in groups without changing the results significantly.
a) Das Gefriertrocknen vor dem Zerstören der Entyme durch Erhitzen kann entfallen.a) Freeze-drying before destroying the entymes by heating can be omitted.
b) Vor dem Erhitzen kann das dialysierte Material in einer Pufferlösung, beispielsweise 0,025 m Tris-Glycin-Puffer, pH 7,8, enthaltend lO'm Mg**, 10~*m Cu+* und 10-*m Zn·*, erhitzt werden.b) Before heating, the dialyzed material can be in a buffer solution, for example 0.025 M Tris-glycine buffer, pH 7.8, containing 10'm Mg **, 10 ~ * m Cu + * and 10- * m Zn * , be heated.
c) Die Gelfiltration kann in der unter b) angegebenen Pufferlösung oder in einer anderen einen pH-Wert von 7,8 aufweisenden Pufferlösung, beispielsweise in einem Boratpuffer, vorgenommen werden.c) The gel filtration can take place in the buffer solution specified under b) or in another one Buffer solution having a pH of 7.8, for example in a borate buffer will.
d) Die Verunreinigungen niedrigen Molekulargewichts können durch Filtrieren der überstehenden klaren Flüssigkeit über ein Fi'termedium entfernt werden, welches für Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 30 000 keine Adsorptionsfähigkcit besitzt.d) The low molecular weight impurities can by filtering the supernatant clear liquid can be removed via a filter medium, which is suitable for compounds with a molecular weight of more than 30,000 has no adsorptive capacity.
e) l°/oige Ammoniumsulfatlösung kann dazu verwendet werden, das Hämoglobin vom Hämolysat abzutrennen, und e) 10% ammonium sulphate solution can be used for this separate the hemoglobin from the hemolysate, and
f) Orgotein und seine Analoga können auch ausf) Orgotein and its analogues can also be made from
den roten Blutkörperchen von Kaninchen. Hühnern. Menschen und den in der folgenden Tabelle angegebenen weiteren Tieren erhallen werden.rabbit red blood cells. Chickens. People and those given in the table below other animals.
l ionen ilc-· Aih.uii'l undl ion ilc- · Aih.uii'l and
I NicdciI Nicdci
Kühe, Stiere ..Cows, bulls ...
Kälber Calves
VollblutpferdeThoroughbred horses
Schafe Sheep
Ratten Rats
Meerschweinchen Guinea pig
0.005
0,0053
0,0067
0,0028
0.00884)0.005
0.0053
0.0067
0.0028
0.0088 4 )
0,00340.0034
2,1 2,1 2,1 3.1 2.82.1 2.1 2.1 3.1 2.8
3,53.5
0.2s)0.2 s )
zweimal keine ' einmal keine keinetwice none 'once none none
keinenone
l) Bezogen auf das gesamte Blutgewicht; der Gehalt des Blutes an roten Blutkörperchen schwankt je nach Rasse und Alter *) Nach dem Filtrieren über Dcxtrangel. ') Durchschnitt aus S Chargen. ') Vollständige Reinigung. l ) Based on total blood weight; the content of red blood cells in the blood fluctuates depending on race and age *) After filtering through Dcxtrangel. ') Average of S batches. ') Complete cleaning.
Beispiel 2 Isolierung von Orgotein aus RinderblutExample 2 Isolation of orgotein from bovine blood
1050 g Rinderblut, welches von Schlächtereien angeliefert und in Alsevers-Lösung oder mit ÄDTE stabilisiert worden war, wurden beim 4000fachen der Erdbeschleunigung bei OC 20 Minuten zentrifugiert, um die roten Blutkörperchen vom Plasma zu trennen. Das erhaltene Plasma wurde verworfen. Die Alsevers-Lösung wurde durch Auflösen von 24,6 g Glucose, 9,6 g Natriumcitrat-Dihydrat. 5,04 g Natriumchlorid in 1200 ml kaltem destilliertem Wasser, Einstellen des pH-Wertes der erhaltenen Lösung auf 6,1 mittels Zitronensäure und Sterilisieren der Lösung durch Filtrieren über ein Millipore-FilU: hergestellt. Die roten Blutkörperchen wurden durch Vermischen mit dem 1- bis 2fachen ihres Volumens mit 0,9gewichtsprozentiger Natriumchloridlösung gewaschen, worauf dieses Waschen noch zweimal in der gleichen Weise wiederholt wurde und schließlich bei OC während 20 Minuten bei 4000 · g zentrifugiert wurde.1050 g of bovine blood, which had been delivered from slaughterhouses and stabilized in Alsevers solution or with ADTE, was centrifuged at 4000 times the acceleration due to gravity at OC for 20 minutes in order to separate the red blood cells from the plasma. The resulting plasma was discarded. The Alsevers solution was made by dissolving 24.6 g glucose, 9.6 g sodium citrate dihydrate. 5.04 g of sodium chloride in 1200 ml of cold distilled water, adjusting the pH of the resulting solution to 6.1 using citric acid and sterilizing the solution by filtering through a Millipore FilU: The red blood cells were washed by mixing 1 to 2 times their volume with 0.9 weight percent sodium chloride solution, this washing was repeated two more times in the same manner and finally centrifuged at OC for 20 minutes at 4000 x g.
Die roten Blutkörperchen wurden durch Vermischen mit dem l.lfachen ihres Volumens an kaltem entsalztem Wasser und anschließendes Stehenlassen der erhaltenen Mischung bei 4"C während 1 Stunde hämolysiert. Dem erhaltenen Hämolysat wurde dasThe red blood cells were made by mixing with one and a half times their volume in cold demineralized water and then allowing the mixture obtained to stand at 4 ° C. for 1 hour hemolyzed. The hemolysate obtained was the
ö,25fache seines Volumens an Äthylalkohol bei —15 C unter Rühren langsam zugesetzt, worauf noch da; 0,31fache des Volumens des Hämolysats an Chloro form bei — 15eC zugesetzt wurde, um das Hämo globin auszufällen. Nachdem das erhaltene Gemiscl bei —15 C noch etwa 15 Minuten gerührt wordei war, hatte das Gemisch die Form einer dicken Pasti angenommen, die bei 4'C noch 15 Minuten stehen gelassen wurde und dann mit dem 0,2fachen ihre Volumens an kaltem entsalztem Wasser versetz wurde, um eine leicht fließfähige Suspension zu ei halten. Von dieser Suspension wurde der Niederschla und überschüssiges Chloroform bei O3C und 20000 innerhalb 20 Minuten abzentnfugiert. Die erhalten überstehende Flüssigkeit wurde noch durch ein Ve sapor-Epoxyfilter (0,9) filtriert, womit ein klares Fi trat erhalten wurde.0.25 times its volume of ethyl alcohol at -15 ° C. slowly added with stirring, whereupon there; 0,31fache the volume of the hemolysate of chloro form at - 15 was added to C e to the hemo globin precipitate. After the resulting Gemiscl had been stirred at -15 C for about 15 minutes, the mixture had taken the form of a thick pasti, which was left to stand at 4 ° C for 15 minutes and then 0.2 times its volume in cold deionized water was added in order to keep an easily flowable suspension to egg. The precipitate and excess chloroform were removed from this suspension at O 3 C and 20,000 within 20 minutes. The supernatant liquid obtained was filtered through a Ve sapor epoxy filter (0.9), whereby a clear filtrate was obtained.
Der erhaltene Niederschlag wurde durch Ve mischen mit kaltem entsalztem Wasser (in eineThe precipitate obtained wu r de Ve by mixing with cold desalinated water (in a
77777777
Ostcrizcr blender) rückextrahiert, wobei /uinindesl .),?> Volumteile kalten cntsal/len Wassers, bezogen auf ilas Volumen des ursprünglich vorliegenden Hämolysats. verwendet wurden, um eine leicht fließfähige Suspension zu erhalten. Diese Suspension wurde bei 20 000 · κ und bei 0 C während 20 Minuten zentrifugiert, worauf die erhaltene Flüssigkeit über ein Versapore-I ilter filtriert wurde. Das klare Filtrat wurde mit der Hauptfraktion vereinigt (Rückextrak- §on I). Der nunmehr erhaltene Niederschlag wurde frneut in der oben angegebenen Weise rückextrahiert, fentrifugiert und filtriert. Das erhaltene klare Filtrat •rufde mit dem vorher erhaltenen Gemisch aus Haupttraktion und erster Waschflüssigkeit vereinigt (Rücktxtraktion 11). Ostcrizcr blender) back-extracted, where / uinindesl.),?> Parts by volume of cold cntsal / len water, based on the volume of the originally present hemolysate. were used to obtain an easily flowable suspension. This suspension was centrifuged at 20,000 κ and at 0 ° C. for 20 minutes, after which the liquid obtained was filtered through a Versapore filter. The clear filtrate was combined with the main fraction (back extract I). The precipitate now obtained was again extracted, centrifuged and filtered in the manner indicated above. The clear filtrate obtained is combined with the previously obtained mixture of main extraction and first washing liquid (back extraction 11).
Das so erhaltene Gemisch aus den verschiedenen Zutraten wurde ohne Dialyse gefriergetrocknet, womit 2,i g eines Produktes erhalten wurden, die Ausbeute, l^zogen auf die gesamte Blutmenge also 0,2°/o betrug. t)as gefriergetrocknete Material wurde mit einer Konzentration von 20 mg/ml in 0,025 m Tris-Glycin- !"uffer gelöst, welcher einen pH-Wert von 7,5 besaß und fen M *" 10 *molar war. Die Lösung wurde in einem Wasserbad unter gelegentlichem Rühren 15 Minuten Huf 65°C erwärmt, worauf der entstandene Niederschlag durch Filtrieren über ein Versapor-Filler abjfiltncrt wurde. Das erhaltene klare Filtrat wurde gegen (entsalztes Wasser diaiysiert, dann über ein VersaporiFilter filtriert und schließlich gefriergetrocknet. In dieser Arbeitsstufe wurden 100 mc eines Produktes erhalten, also eine Ausbeute von 0,029°/„, bezogen auf die eingesetzte Blutmenge, erzielt. Dieses Produkt bestand vorwiegend aus Orgotein und wurde r.iit einer Konzentration von etwa 50 mg/ml in einem Puffer gelöst, welcher an Tris 0,03molar, an Glycin 5,10~3-molar, an Mg*+ 10-3molar, an Cu-' 10~4molar und an Zn** 10 smolar war und einen pH-Wert von 7,1 besaß. Die so erhaltene Lösung wurde auf eine mit Sephadex G 75 gefüllte Kolonne von einem Durchmesser von 3,2 cm und einer Länge von 95 cm aufgegeben, deren Inhalt mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde mit 10 ml/h gewählt, wobei Fraktionen zu je 100 Tropfen (etwa 3,2 ml) aufgefangen wurden. The mixture thus obtained of the various ingredients was freeze-dried without dialysis, with which 2 μg of a product were obtained; The freeze-dried material was dissolved at a concentration of 20 mg / ml in 0.025 M Tris-glycine buffer, which had a pH of 7.5 and was M * "10 * molar. The solution was heated in a water bath with occasional stirring for 15 minutes at 65 ° C., after which the precipitate formed was filtered off by filtering through a Versapor filler. The clear filtrate obtained was diaiysiert against (deionized water, then filtered through a VersaporiFilter and finally freeze-dried. In this work stage r wu to 100 mc of a product were obtained, ie a yield of 0.029 ° / ", based on the used amount of blood obtained. This product consisted mainly of Orgotein and was dissolved r.iit a concentration of about 50 mg / ml in a buffer containing Tris at 0,03molar, -molar glycine 5.10 ~ 3, mg + * 10- 3 molar, in Cu - '10 ~ 4 molar and Zn ** 10 sec was molar and had a pH of 7.1 The solution thus obtained was applied to a column filled with Sephadex G 75 column with a diameter of 3.2 cm and a. 95 cm in length, the contents of which had been brought into equilibrium with the same buffer solution, and the flow rate was chosen to be 10 ml / h, with fractions of 100 drops each (about 3.2 ml) being collected.
Fraktion A (Auffangrohrc 81 bis 100), B (Auffangrohre 101 bis 107),V (Auffangrohre 108 bis 122). D (Auffangrohre 123 bis 135), h (Auffangrohre 136 bis 158). F (Auffangrohre «59 bis 180) und G (/.uffangrohre 181 bis 235> geteilt. Die Fraktion C enthalt das Orgotein. Die Fraktion C wurde sehr scharf herausgeschnitten, um sicherzugehen, daß sie nur reines Orgotein enthält. Die weniger reines Orgotein enthaltenden Fraktionen B und D wurden zwecks noch-Fraction A (collecting tubes 81 to 100), B (collecting tubes 101 to 107), V (collecting tubes 108 to 122). D (collecting tubes 123 to 135), h (collecting tubes 136 to 158). F (collecting tubes 59 to 180) and G (/. Collecting tubes 181 to 235 > divided. Fraction C contains the orgotein. Fraction C has been cut out very sharply to ensure that it contains only pure orgotein. The less pure orgotein Fractions B and D were
»o maliger Aufarbeitung beiseite gestellt. Jede der erhaltenen Fraktionen wurde gegen entsalztes Wasser diaiysiert, über ein Millipore-Filter filtriert und dann gefriergetrocknet. Der Gehalt der einzelnen Fraktionen an gelösten»O one time work-up put aside. Each of the obtained fractions was against deionized water dialysed, filtered through a Millipore filter and then freeze-dried. The dissolved content of the individual fractions
Stoffen und die maximale Ultraviolettabsorption dieser Fraktionen bei 280 nm zeigt die folgende Tabelle.The following table shows substances and the maximum ultraviolet absorption of these fractions at 280 nm.
Die Gesamtausbeute an Orgotein, einschließlich der in den Fraktionen B und D enthaltenen 3 mg, betrug 58 mg, ws einer Ausbeute von 0,0058%, bezogen auf die eingesetzte Menge an Blut, entspricht.The total yield of orgotein, including the 3 mg contained in fractions B and D, was 58 mg, based on a yield of 0.0058% on the amount of blood used.
B e i s ρ i e 1 3B e i s ρ i e 1 3
Die Arbeitsweise gemäß Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch das Hämoglobin aus dem Hämolysat dadurch entfernt wurde, daß der pH-Wert desThe procedure according to Example 2 was repeated, but the hemoglobin was removed from the hemolysate by the fact that the pH of the
Hämolysats zunächst auf 6,8 his 7,0 eingestellt wurde und dann dem Hämolysat hü 25CC (NH«),SO« in einer Menge zugesetzt wurde, daß die erhaltene Lösung 47 bis 50% der Sättigungskonzentration des Ammonsulfats an Ammonsulfat enthielt; anschließendHemolysate initially to 6.8 his 7.0 was adjusted and then the hemolysate rg 25 C C (NH "), SO" has been added in an amount such that the solution obtained 47 to 50% of the saturation concentration of ammonium sulfate contained in ammonium sulphate; subsequently wurde 20 bis 30 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert.was centrifuged at 8000 rpm for 20 to 30 minutes.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72877768A | 1968-05-13 | 1968-05-13 | |
| US72877768 | 1968-05-13 | ||
| US81517569A | 1969-04-10 | 1969-04-10 | |
| US81517569 | 1969-04-10 |
Publications (2)
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|---|---|
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