DE1908854A1

DE1908854A1 - Prepn of 6-aminopenicillanic acid by splitting penicillins

Info

Publication number: DE1908854A1
Application number: DE19691908854
Authority: DE
Inventors: Ching Chiang; Anderson Carl F; Heuser Leon J
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1969-02-21
Filing date: 1969-02-21
Publication date: 1970-09-10

Abstract

Prepn. of 6-aminopenicillanic acid (I) by splitting penicillins with amidase enzymes and (1) using the enzyme separately from the broth in which it is produced; (2) adsorbing the enzyme on a bentonite for content with the penicillin; and (3) effecting the reaction in a medium maintained at pH 7-9 with NH3 or a cyclic amine. Increased yields of (I) and increased amounts of penicillin can be split for a given amount of enzyme; (I) used to prepare penicillins.

Description

" Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure Es sind verschiedene halbsynthetische Penicilline bekannt, die durch Acylierung von. 6-Arninopenicillansäure erhalten wurden. Die 6-Aminopenicillansäure wurde ihrerseits durch Spaltung von leicht zugänglichen Penicillinen, wie Penicillin G, hergestellt. Durch enzymatische Spaltung des Penicillins wird dieses in 6-Aminopenicillansäure und den entsprechenden Säurerest aufgespalten."Process for making 6-aminopenicillanic acid There are several semisynthetic penicillins known by acylation of. 6-aminopenicillanic acid were obtained. The 6-aminopenicillanic acid was in turn by cleavage of readily available penicillins such as penicillin G are made. By enzymatic The penicillin is split into 6-aminopenicillanic acid and the corresponding ones Split acid residue.

Zu dieser enzymatischen Spaltung wird daß Penicillin-Ausgangsmaserial in Salzform einem Kulturmedium-einverleibt, in welchem daß Enzym hergestellt wurde, oder es wird der überstehenden Flüssigkeit einverleibt, die den grössten Teil des Enzyms enthält, und die durch Zentrifugieren der Gärmaische erhalten wurde, um den grössten Teil der Fest stoffe abzutrennen.The penicillin starting material becomes this enzymatic cleavage incorporated in salt form into a culture medium in which the enzyme was produced, or it is incorporated into the supernatant fluid which contains most of the Enzyme, and obtained by centrifuging the fermentation mash to obtain the to separate most of the solids.

Bei der Durchführung dieser enzymatischon Spaltung in grösserem Maßstab, d;h. in einem Maßstab von mehr als 500 ml oder i Liter Mengen, und insbesondere im. grosstechnischen Maßstab, liegt die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure beträchtlich unter der theoretischen Ausbeute. Ferner ist die Abtrennung des Hydrolyseproduktes vom Enzym und anderen Rtlcketänden schwierig0 Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Spaltung von Penicillinen zu schaffen, das.in hoher Ausbeute verläutt und die Isolierung der 6-Aminopenicillansäure erheblich vereinfacht.When carrying out this enzymatic cleavage on a larger scale, i.e. on a scale greater than 500 ml or i liter quantities, and in particular in the. on an industrial scale, the yield of 6-aminopenicillanic acid is considerable under the theoretical Yield. Furthermore, the separation of the The hydrolysis product of the enzyme and other residue is difficult because of the problem of the invention is to use an improved process for the preparation of 6-aminopenicillanic acid To create enzymatic cleavage of penicillins, das.in high yield and the isolation of 6-aminopenicillanic acid is considerably simplified.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.This object is achieved by the invention.

Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dass drei Bedingungen beachtet werden müssen, die sich auf die Ausbeute und die Menge ag gespaltenem Penicillin bei gegebener Enzymaktivität auswirken.According to the invention, it was found that three conditions are observed must be based on the yield and amount ag of penicillin cleaved with a given enzyme activity.

So soll das Penicillin mit dem Enzym gesondert von der Gärmaische, in der das Enzym hergestellt wurde, zusammengebracht werden. Ferner soll das Enzym vorzugsweise an einem Bentonit adsorbiert werden, und dieses Adeorbat wird mit dem gespaltenen Penioillin zusammengebracht. Drittens soll die enzymatische Spaltun in alkalischem Medium durchgeführt werden, wobei zur 13instellung des Wertes Ammoniak oder ein primäres, sekundäres oder tertiäres acyclisches Amin, anstelle einer anorganischen Base, wie Natriumhydroxyd, verwendet wird.So the penicillin with the enzyme should be separated from the fermentation mash, in which the enzyme was produced. Furthermore, the enzyme should are preferably adsorbed on a bentonite, and this adeorbate is with the split penioillin brought together. Third, the enzymatic cleavage should do can be carried out in an alkaline medium, with ammonia for setting the value or a primary, secondary or tertiary acyclic amine instead of an inorganic one Base such as sodium hydroxide is used.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zu Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Spaltung von Penicillinen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Penicillin in einem wässrigen Medium, das frei von Fermentations-Feststoffen ist, mit einer Amidase, die aus ihrer Gärmaische abgetrennt und an Bentonit adsorbiert worden i8t bei einem Wert von etwa 7,0 bis 9,0 behandelt und diesen pH-Wert mit Ammoniak oder einem acyclischen organischen Amin beibehält.The invention thus provides a method for producing 6-aminopenicillanic acid by enzymatic cleavage of penicillins, which thereby is characterized by the fact that one can free the penicillin in an aqueous medium of fermentation solids is, with an amidase, separated from their fermentation mash and adsorbed on bentonite was treated at a value of about 7.0 to 9.0 and maintain that pH with ammonia or an acyclic organic amine.

Xm Verfahren der Erfindung kann jedes Penicillin verwendet werden, z.B. Penicillin G, Penicillin V, Penicillin O, Penicillin F, Phenäthicillin und 2-(Phenylthio)-äthylpenicillin. Das erhaltene Hydrolyseprodukt, nämlich 6-Aminopenicillansäure kann hierauf nach üblichen Acylierungsverfahren in ein neues, halbsynthetisches Penicillin umgewandelt werden, Die zur Spaltung verwendete Amidase kann aus verschiedenen Quellen stammen0 Vorzugsweise wird extra-cellulerep Enzym verwendet, das die Penicilline in 6-Aminopenicillansäure oder deren einfache Derivate, wie die Metallsalze oder das Desacetylanaloge, spaltet. Any penicillin can be used in the method of the invention e.g. Penicillin G, Penicillin V, Penicillin O, Penicillin F, Phenäthicillin and 2- (phenylthio) ethyl penicillin. The hydrolysis product obtained, namely 6-aminopenicillanic acid can then be converted into a new, semisynthetic one using the usual acylation processes Penicillin can be converted, the amidase used for cleavage can be from various Sources derive0 Preferably extra-cellulerep enzyme is used, which contains the penicillins in 6-aminopenicillanic acid or its simple derivatives, such as the metal salts or the deacetyl analog, cleaves.

Beispiele für Enzyme sind die Penicillinacylase (Penicillinamidase). Diese Enzyme können aus Mikroorganismen z.B. der Gattungen Brevibacterium, Achromobacterium, Flavobacterium, Penicillium, Bacillium, Escherichia, Alcaligenes, Streptomyces, Bacterium, Aerobacter, Micrococcus und Mycobacterium, z.B.Examples of enzymes are penicillin acylase (penicillin amidase). These enzymes can be extracted from microorganisms e.g. of the genera Brevibacterium, Achromobacterium, Flavobacterium, Penicillium, Bacillium, Escherichia, Alcaligenes, Streptomyces, Bacterium, Aerobacter, Micrococcus and Mycobacterium, e.g.

Penicillium chrysogenum, Bacterium cyclooxydans, Aerobacter cloaceae, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Micrococcus lysodeikticus, Mycobacterium phlei, Alcaligenes faecalis, Streptomyoes noursei oder Streptomyces griseus, oder es kann sich von rohen Pflanzenproteinasen, wie Papain, ableiten.Penicillium chrysogenum, Bacterium cyclooxydans, Aerobacter cloaceae, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Micrococcus lysodeikticus, Mycobacterium phlei, Alcaligenes faecalis, Streptomyoes noursei or Streptomyces griseus, or it can be derived from raw vegetable proteinases, such as papain.

Das hydrolysierende Enzym kann durch Züchtung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium gemäss der USA.-Patentschrift 3 144 395 hergestellt werden, das unter anderem Stickstoffverbindungen und assimilierbare Kohlenstoffverbindungen enthält. Die Gärmaische wird zentrifugiert, z.B. bei etwa 4000 bis 8CCO U/Iiin.* um die Hauptmasse der reststoffe abzutrennen.The hydrolyzing enzyme can be obtained by cultivating the microorganism under aerobic conditions in a nutrient medium according to US Pat. No. 3,144 395 are produced, which among other things nitrogen compounds and assimilable Contains carbon compounds. The fermentation mash is centrifuged, e.g. at approx 4000 to 8CCO U / Iiin. * To separate the bulk of the residues.

Der Überstand wird mit feinverteiltem Bentonit versetzt. Das Snæyu wird Qm Bentonit adsorbiert0 Vorzugsweise wird ein Bentonit mit einer Teilchengrösse von Qp5 bis 93 mm oder kleiner verwendet Es kennen natürlich vorkommende Bentonite sowie verarbeitete Bentonite sowie synthetische Bentonite verwendet werden.Finely divided bentonite is added to the supernatant. That Snæyu Qm bentonite is adsorbed0 Preferably, a bentonite with a particle size Used from Qp5 to 93 mm or smaller Naturally occurring bentonites are known as well as processed bentonites and synthetic bentonites can be used.

Gegebenenfalls kann man den Bentonit zusammen mit einer Filterhilfe, wie rasch filtrierende Diatomeenerde,verwenden. Je 1000 Liter Enzymlösung werden etwa 5 bis 20 kg Bentonit verwendet. Etwa die gleiche Menge an Filterhilfe Mann zusammen mit dem bento nit verwendet werden, um die Filtrationsgeschwindigkeit zu erhöhen. »te Adsorption es Enzyms an dem Bentonit wird vorzugsweise im wässrigen Medium unter Verwendung einer geringer Menge (0,1 bis 0,5 %)eines organischen Lösungsmittels, wie Toluool, als Bacterizid durchgeführt. Der pH-Wert des flüssingen Gemisches soll bei etwa 6,5 bis 9, vorzugsweise bei 7,0 bis 8,0 gehalten werden.If necessary, you can use the bentonite together with a filter aid, use like fast filtering diatomaceous earth. Per 1000 liters of enzyme solution about 5 to 20 kg of bentonite are used. About the same amount of filter aid man can be used together with the bento nit to increase the filtration speed raise. The adsorption of the enzyme on the bentonite is preferred in the aqueous Medium using a small amount (0.1-0.5%) of an organic solvent, like toluene, carried out as a bactericide. The pH of the liquid mixture should maintained at about 6.5 to 9, preferably 7.0 to 8.0.

Nach etwa einstundigem oder längerem Rühren wird das' Gemisch filtriert. Der Filterkuchen enthält das am Bentonit adsorbierte Enzym.After stirring for about an hour or more, the mixture is filtered. The filter cake contains the enzyme adsorbed on the bentonite.

Der Filterkuchen wird in Wasser aufgeschlämmt, da,s vorzugsweise eine geringe Menge eines inerten organischen Lösungsmittels als Bacterizid enthält, und die Hydrolyse wird durch Zusatz des Penicilins zur Aufschlämmung bewirkt. Vorzugsweise wird das Penicillin in Form eines Salzes, z.B. eines Alkli- order Erdalkalimetallsalzes, gewöhnlich als Natrium- oder Kaliumsalz verwendet.The filter cake is slurried in water, there, s preferably one contains a small amount of an inert organic solvent as a bactericide, and hydrolysis is effected by adding the penicilin to the slurry. Preferably the penicillin is in the form of a salt, e.g. an alkali or alkaline earth metal salt, usually used as the sodium or potassium salt.

Die Hydrolyse wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,0 bis 9,0, insbesondere von 8,0 bis 8,5 und am besten bei 8,0 bis 8,2 durchgeführt. Der pH-Wert wird durch Zusatz von Ammoniak oder einem Amin in diesem Bereich gehalten. Die Arbeitstemperatur liegt zwischen erwa 15 bis 45°C. Im allgemeinen ist die enzymatische Spaltung innerhalb etwa 2 bis 15 Stunden beendet.The hydrolysis is preferably carried out at a pH of 7.0 to 9.0, in particular from 8.0 to 8.5 and best performed at 8.0 to 8.2. The pH is kept in this range by adding ammonia or an amine. The working temperature lies between about 15 to 45 ° C. Generally it is enzymatic cleavage completed within about 2 to 15 hours.

Zur Einstellung des pH-Werts wird eine wässrige. Ammoniaklösung oder eine wässrige Aminolösung in einer Konzentration von etwa 5 bis 29 %, vorzugsweise etwa 10 %, verwendet. Als Amine werden vorzugsweise acyclische organische Amines wie aliphatische Amine, z.B. Methylamin, Äthylamin, Diäthylamin oder Triäthylamin oder Alkanolamine verwendet.To adjust the pH value, an aqueous. Ammonia solution or an aqueous amino solution at a concentration of about 5 to 29%, preferably about 10%, used. Acyclic organic amines are preferably used as amines such as aliphatic amines, e.g. methylamine, ethylamine, diethylamine or triethylamine or alkanolamines are used.

Zur Unterstützung der Coagulierung von Feststoffen in der Reaktionsflüssigkeit können Erdalkalimetallionen anwesend sein.To support the coagulation of solids in the reaction liquid alkaline earth metal ions may be present.

Bevorzugt werden Calciumionen, jedoch können auch Barium-, Magnesium- und andere Erdalkalimetallionen verwendet werden. Die Erdalkalimetallionen werden in Form ihrer Salze , vorzugsweise als anorganische Salze, wie Calciumchlorid, Bariumnitrat oder Magnesiumchlorid, verwendet. Es können etwa 0,1 bis 2,0 %, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 Gew.-% des Salzes, bezogen auf das Volumen der Reaktionsflüssigkeit, vorliegen.Calcium ions are preferred, but barium, magnesium and other alkaline earth metal ions can be used. The alkaline earth metal ions will in the form of their salts, preferably as inorganic salts such as calcium chloride, barium nitrate or magnesium chloride is used. It can be about 0.1 to 2.0%, preferably 0.1 up to 0.5% by weight of the salt, based on the volume of the reaction liquid, are present.

Des Hydrolysat wird abfiltriert und das Hydrolyseprodukt aus dem Filtrat isolierte Man erhalt ein verhältnismässig sauberes Hydrolysat, und das Produkt' lässt sich nach verschiedenen Methoden glatt isolieren, z.B. durch Bildung einer unlöslichen Schiff' sehen Bese, sOBO durch Umsetzung mit Salicylaldehyd und einem Aminsalz, oder durch Extraktion bei saurem pH-Wert mit einem organischen Lösungsmittel zur Abtrennung von Verunreinigungen und gegebenenfalls Eindampfen der Lösung auf ein zur 4uskristallisation der 6-Aminopenicillansäure geeignetes Volumen.The hydrolyzate is filtered off and the hydrolysis product from the filtrate isolated A relatively clean hydrolyzate is obtained, and the product ' can be isolated smoothly by various methods, e.g. by forming a insoluble ship 'see Bese, sOBO by reacting with salicylaldehyde and a Amine salt, or by extraction at acidic pH with an organic solvent to remove impurities and, if necessary, to evaporate the solution a volume suitable for the crystallization of 6-aminopenicillanic acid.

Das vorstehend beschriebene Verfahren hat-den Vorteil, dass sich das Enzym aus seiner Gärmaische rasch isolieren lässt, dass man er ein Adsorbant / hält, in welchem das sonst leicht inaktivierbare Enzym stabilisiert ist, so dass es lagerfähig ist, Das Mengenverhältnis von Enzym zu Ausgangspenicillin kann so eingestellt werden, dass sich grosstechnisch Umsetzungsgrade von mehr als 90 % bei verhältnismässig bohlen Konzentrationen in Wasser erhalten lasser. Das Hydrolysat ist verhältnismässig rein, so dass das Produkt sich leicht isolieren lässt. Die 6-Aminopenicillansäure wird in guter Ausbeute erhalten. Das Enzymadsorbat kann mehrmals wiederverwendet werden.The method described above has the advantage that the Enzyme can be quickly isolated from its fermentation mash, so that it is an adsorbent / in which the otherwise easily inactivatable enzyme is stabilized so that it can be stored is, the ratio of enzyme to starting penicillin can be adjusted so that large-scale implementation rates of more than 90% are relatively to obtain concentrations in water. The hydrolyzate is proportionate pure so that the product is easy to isolate. The 6-aminopenicillanic acid is obtained in good yield. The enzyme adsorbate can be reused several times will.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

Beispiel 1 a) Es werden 110 Liter eines wässrigen Mediums folgender Zusammensetzung hergestellt: 3,0 % bernsteinfarbenes enzymatisc hydrplysiertes Casein, 0,05 % Ucon Schmiermittel LB 625 und 0,5 % Glucose (gesondert sterilisiert). Der pH-Wert der Lösung wird vor und nach 30 minütiger Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellte Danach wird die Lösung mit 3,4 Liter einer Kultur von Bacillus megaterium ATCC 14945 beimpf, die 24 Stunden bei 30°C in folgendem Nährmedium gezüchtet wurde: 4,0 % bernsteinfarbenes enzymatisch hydrolysiertes Casein, 0,5 % Uncon Schmiermittel LB 625 und 0,5 % Glucose. Der pH-Wert dieses Nährmediums wird vor und nach 30 minütiger Sterilisation bei 12100 auf 7,0 einige, stellt. Das erhaltene Gemisch wird 48 bis 72 Stunden gelehrt und belüftet. Nach etwa 8 Stunden werden 0,15 % Phenylessigsäure zugesetzt.Example 1 a) There are 110 liters of an aqueous medium as follows Composition made: 3.0% amber enzymatic hydrated casein, 0.05% Ucon lubricant LB 625 and 0.5% glucose (separately sterilized). Of the Before and after sterilization for 30 minutes at 121 ° C., the pH of the solution is increased to 7.0 Thereafter, the solution is adjusted with 3.4 liters of a culture of Bacillus megaterium ATCC 14945 inoculum, which was grown for 24 hours at 30 ° C in the following nutrient medium: 4.0% amber enzymatically hydrolyzed casein, 0.5% Uncon lubricant LB 625 and 0.5% glucose. The pH of this nutrient medium becomes 30 minutes before and after Sterilization at 12100 to 7.0 some, represents. The resulting mixture becomes 48 bis 72 hours taught and ventilated. After about 8 hours, 0.15% phenylacetic acid becomes added.

b) Die gesamte Gärbrühe wird mit 0,5 Vol. -% Primarfloc C-3 (einem Flockungsmittel) als 30 %-ige Lösung sowie 0,2 Vol. -% Toluol versetzt, und das Gemisch wird bei einem p11,von 7,0 bis 7,5 bei Raumtemperatur zentrifugiert.b) The entire fermentation broth is mixed with 0.5% by volume Primarfloc C-3 (a Flocculant) as a 30% solution and 0.2% by volume of toluene added, and that Mixture is centrifuged at a p11, from 7.0 to 7.5 at room temperature.

c) 100 er des tiberstandes werden mit 200 ml Toluol überschichtet und bei Raumtemperatur unter Rühren mit 300 g Calciumchlorid versetzt. Sobald alles in Lösung gegangen ist, wird ein Gemisch aus 1 kg Bentonit und 1 kg rasch filtrierende Diatomeenerde Zuge geben. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Salpetersäure auf 6,2 bis .6,3 eingestellt, und das Gemisch wird eine Stunde bei kaum temperatur bei einem pH-Wert von 6f2 bis 6,3 gerührt. Danach wird das Gemisch auf einem mit schnell filtrierender Diatomeenerde beschichteten Eimco-Filter filtriert. während der Filtration wird der Filterkuchen mit 7,5 Liter einer 0,5 %-igen wässrigen Calciumchloridlösung gewaschen.c) 100 ml of the supernatant are covered with a layer of 200 ml of toluene and 300 g of calcium chloride are added at room temperature with stirring. Once everything Has gone into solution, a mixture of 1 kg of bentonite and 1 kg is rapidly filtering Give diatomaceous earth. The pH is raised with concentrated nitric acid 6.2 to 6.3, and the mixture is one hour at barely temperature at stirred to a pH of 6f2 to 6.3. After that, the mixture is on one with quickly filtering diatomaceous earth coated Eimco filter filtered. during the filtration the filter cake with 7.5 liters of a 0.5% aqueous calcium chloride solution washed.

d) Der feuchte Filterkuchen enthält die Penicillinacylase an Bent@nit adsorbiert. Dieser Filterkuchen wird in einem Gemisch aus 40 Liter Wasser und 100 ml Toluol aufgeschlämmt, und der pH-Wert wird mit 10 %-iger wässriger Ammoniaklösung auf 8,0 bis 8,2 eingestellt. Danach wird das Gemisch auf 27 bis 29°C erwärmt und fl£it einer Lösung von 300 kg des Kaliumsalzes von Penicillin G in 1136 Liter Wasser versetzt0 Die Hydrolyse wird bei dieser Temperatur und dem angegebenen pH-Wert fortgesetzt. Erforderlichenfalls wird das Reaktionsgemisch erwärmt. 10 %-ige wässrige Ammoniaklösung wird zur automatischen Einstellung des pH-Wertes verwendet. Nach etwa 15 Stunden zeigt sich das Ende der Umsetzung durch den 100 %-igen t@@retischen Verbrauch an Alkali. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt, der pH-Wert mit konzentrierter Salpetersäure auf 6,3 eingestellt. Nach 1-stündigem Rühren bei pH 6,3 wird das Hydrolysat filtriert und der Filterrückstand mit 10 Liter Wasser ausgewaschen.d) The moist filter cake contains the penicillin acylase on Bent @ nit adsorbed. This filter cake is in a mixture of 40 liters of water and 100 ml of toluene slurried, and the pH is adjusted with 10% aqueous ammonia solution set to 8.0 to 8.2. The mixture is then heated to 27 to 29 ° C and fl £ it a solution of 300 kg of the potassium salt of penicillin G in 1136 liters of water 0 The hydrolysis is continued at this temperature and the specified pH value. If necessary, the reaction mixture is heated. 10% aqueous ammonia solution is used for the automatic adjustment of the pH value. After about 15 hours the end of the implementation is indicated by the 100% t @@ retic consumption Alkali. The reaction mixture is cooled to room temperature, the pH is adjusted to 6.3 with concentrated nitric acid. After 1 hour Stirring at pH 6.3, the hydrolyzate is filtered and the filter residue is 10 liters Washed out water.

e) Das Filtrat wird mit 1/3 Volumen Isobutylacetat versetzt und auf 5 bis 10°C abgekühlt. Danach wird der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 2,0 bis 2,2 eingestellt, dasd Gemisch wird 15 Minuten gerührt und anschliessend durch Zentrifugieren getrennt. Geringe Mengen an Feststoffen werden durch Zentrifugieren abgetrennt. Die wässrige Lösung wird mit 50 %-iger Natronlauge auf pH 7,2 bis 7,4 eingestellt.e) 1/3 volume of isobutyl acetate is added to the filtrate and the mixture is added Chilled 5 to 10 ° C. The pH is then adjusted to 2.0 with concentrated hydrochloric acid adjusted to 2.2, the mixture is stirred for 15 minutes and then through Centrifuge separately. Small amounts of solids are removed by centrifugation severed. The aqueous solution is adjusted to pH 7.2 to 7.4 with 50% sodium hydroxide solution set.

f) Die erhaltene wässrige Lösung wird in einem Flash-Verdampfer unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unterhalb 40°C auf ein Volumen von 5 bis 6 Liter eingedampft. Die erhaltene Lösung wird mit konzentrierter Salzsäure innerhalb eines Zeitraumes von einer Stunde auf pH 3,8 bis 4,0 angesäuert. Hierbei fällt kristalline 6-Aminopenicillansäure aus. Nach weiterem 3-stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden die Kristalle abfiltriert und zunächst mit 1,5 Liter Wasser und hierauf mit 1,5 Liter Aceton gewaschen. Der Produkt wird unter vermindertem Druck bei 40°C getrocknet.f) The aqueous solution obtained is taking in a flash evaporator reduced pressure and at a temperature below 40 ° C to a volume of 5 evaporated to 6 liters. The resulting solution is treated with concentrated hydrochloric acid acidified to pH 3.8 to 4.0 over a period of one hour. Here crystalline 6-aminopenicillanic acid precipitates. After stirring for a further 3 hours at The crystals are filtered off at room temperature and first with 1.5 liters of water and then washed with 1.5 liters of acetone. The product is under reduced Print dried at 40 ° C.

Beispiel 2 a) Es werden 41@0 Liter Nährmedium gemäss Beispiel 1 a) hergestellt, und Bacillus megaterium ATCC 14945 wird in gleicher Weise gezüchtet.Example 2 a) There are 41 @ 0 liters of nutrient medium according to Example 1 a) and Bacillus megaterium ATCC 14945 is grown in the same way.

b) Nach 70 bis 72 Stunden wird die Cärmaische aufgearbeitet und auf 15°C abgehühlt. Danach werden 0.@ @@@.-% des Flockungsmittels Primafloc C-3 sowie eine 0,5 gew.-%ige Lösung von CaCl2 zugegeben. Der Ansatz wird hierauf mit 20 %-iger Schwefelsäure auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt und eine Stunde unter einer Toluolschicht und in Stickstoffatmosphäre gerührt. Danach wird die Brühe von festen Stoffen abzentrifugiert. 3790 Liter der geklärten Lösung werden mit 137,8 kg schnell filtrierender Diatomeenerde (1,5 %) sowie 137,8 kg (1,5 %) Bentonit versetzt. Die Adsorption wird eine Stunde bei pH 7,0 bis 7,2 unter Rühren durchgeführt.b) After 70 to 72 hours, the Cärmaische is worked up and on Cooled down to 15 ° C. After that, 0. @ @@@ .-% of the flocculant becomes Primafloc C-3 and a 0.5% strength by weight solution of CaCl2 were added. The approach is based on this adjusted to pH 7.0 to 7.2 with 20% sulfuric acid and one hour below a toluene layer and stirred in a nitrogen atmosphere. After that, the broth is made from centrifuged solid matter. 3790 liters of the clarified solution are 137.8 kg of rapidly filtering diatomaceous earth (1.5%) and 137.8 kg (1.5%) of bentonite are added. The adsorption is carried out for one hour at pH 7.0 to 7.2 with stirring.

Anschliessend werden 1893 Liter Wasser zugegeben, und nach 30-minütigem Rühren wird die Aufschlämmung während 2 Stunden absetzen gelassen. Der Überstand wird dekantiert. Die restliche Aufschlämmung wird zentrifugiert und mit 10 Vol.-% Wasser gewaschen. Der das Enzym enthaltende Filterkuchen wird mit Toluol überschichtet und bei 5 bis 10°C aufbewahrt.Then 1893 liters of water are added, and after 30 minutes With stirring, the slurry is allowed to settle for 2 hours. The supernatant is decanted. The remaining slurry is centrifuged and with 10 vol .-% Water washed. The filter cake containing the enzyme is covered with toluene and stored at 5 to 10 ° C.

c) Der das Enzym enthaltende Filterkuchen wird in 6650 Liter Wasser aufgeschlämmt, die Aufschlämmung wird mit 10 %-iger wässriger Ammoniaklösung auf pH 8,0 bis 8,2 eingestellt und auf 27 bis 29°C erhitzt. Nach Zugabe von 300 kg Penicillin G (45 g/Liter) wird die Hydrolyse bei der gleichen Temperatur 16 Stunden durchgeführt.c) The filter cake containing the enzyme is in 6650 liters of water slurried, the slurry is made up with 10% aqueous ammonia solution Adjusted pH 8.0 to 8.2 and heated to 27 to 29 ° C. After adding 300 kg of penicillin G (45 g / liter) the hydrolysis is carried out at the same temperature for 16 hours.

10 %-ige wässrige Ammoniaklösung wird zur Einstellung des pH-Wertes verwendet. Das Hydrolysat wird zentrifugiert und die Fällung mit 665 Liter des ursprünglichen Anmachwassers gewaschen. Das abgeschleuderte und gewaschene Hydrolysat wird hierauf abgekühlt und gemäss Beispiel 1 e) und f) auf kristalline 6-APS aufgearbeitet.10% aqueous ammonia solution is used to adjust the pH used. The hydrolyzate is centrifuged and the precipitation with 665 liters of the original Washed mixing water. The centrifuged and washed hydrolyzate is then cooled and worked up to crystalline 6-APS according to Example 1 e) and f).

Beispiel 3 Gemäss Beispiel 2. jedoch unter Verwendung des Kaliumsalzes von Penicillin V anstelle des Kaliumsalzes von Penicillin G sowie des sich von Streptomyces griseus ableitenden Enzyms, wird 6-Aminopenicillansäure hergestellt.Example 3 According to Example 2, but using the potassium salt of penicillin V instead of the potassium salt of penicillin G and des themselves Streptomyces griseus-derived enzyme, 6-aminopenicillanic acid is produced.

Beispiel 4 Gemäss Beispiel 2, jedoch unter Verwendung in den Stufen a) und b) Penicillinacylase von Streptomyces noursei und unter Verwendung von Triäthylamin anstelle von Ammoniak, wird die 6-Aminopenicillansäure hergestellt.Example 4 As in Example 2, but using the stages a) and b) Penicillin acylase from Streptomyces noursei and using triethylamine instead of ammonia, 6-aminopenicillanic acid is produced.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Process for the production of 6-aminopenicillanic acid by enzymatic Splitting of penicillins d a d u r c h g e -k to e n n z e i c b n e t that one the penicillin in an aqueous medium that is free of fermentation solids is separated from its fermentation mash and an amidase that adsorbs on bentonite istp is treated at a from about 7.0 to 9.0 and this pH is treated with ammonia or an acyclic organic amine.

2 * Method according to claim 1, d u r c h g e n n n z e i c h n e t that one used an amidase before the andsorption on the bentonite was freed of fermentation solids and the pH with aqueous ammonia solution is set,

3 The method according to claim 1, d a d u r c h g e e. k e n n 5 e It does not mean that penicillin acylase is freed from fermentation solids Bentonite adsorbed and the penicillin with the bentonite containing the acylase in watery. Bringing together medium containing ammonia.

4 procedure according to. Claim 1, d a d u r c Ii g e k e n n n z e i c h n e tS that penicillin acylase is adsorbed on bentonite. Penicillin G with the die Acylase-containing bentonite enzymatically cleaves at a pH of 8.0 to 8.2 and adjust the pH with aqueous ammonia solution until hydrolysis is complete has expired.