DE1793423A1 - Method of cleaning an antibiotic - Google Patents
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Description
Das Antibioticum 833A ist ein neues und wertvolles Antibioticum, das sich beim Wachstum eines früher unbekannten Stammes von Mikroorganismen unter gesteuerten Bedingungen bildet und durch aerobe Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien hergestellt wird. Um das Antibiotioun in gereinigter Form su erhalten, müssen die Peraentationsflüssigkeit und die rohen Lösungen des Antibioticum behandelt werden. Das Antibioticum 833A ist ein hochgradig polarer Stoff, was sich d&raua ergibt, dass es von Aktivkohle aus wässrigen lösungen bei einem pH-Wert von 5 nahezu überhaupt nicht adsorbiert wird, Es wircl auch nicht an sauren Tonen adsorbiert und lässt sich selbst in Segeowart organischer Amine nicht leicht mit polaren Lösungsmitteln, v/ie Phenol, extrahieren. Un dasThe antibiotic 833A is a new and valuable antibiotic, that occurs during the growth of a previously unknown strain of microorganisms under controlled conditions and is produced by aerobic fermentation of suitable aqueous nutrient media. To get the antibiotics in purified Form su must have the peraentation fluid and the raw solutions of the antibiotic are treated. That Antibiotic 833A is a highly polar substance, which results from the fact that it is made of activated carbon from aqueous solutions is hardly adsorbed at all at a pH value of 5, nor is it adsorbed on acid clays and does not go easily even in Segeowart organic amines Extract with polar solvents, v / ie phenol. Un that
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Antibioticum verwerten au können, buss die rohe ftraentationsflüssigkeit so behandelt werden, dass aan das Antibioticum daraus in gereinigter Fora gewinnt. 9er Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Gewinnung des neuen Antibioticum in reiner form zur Verfügung au stellen. Dies geschieht durch Adsorption an Aluminiumoxid und anschliessende 8 Eluieren nit wässrigen oder wässrig-alkoholischen Aramoniumhydroxidlösungen. You can use the antibiotic, but the raw fracture fluid be treated in such a way that the antibiotic can be obtained from it in a purified fora. 9er invention lies The underlying task is to provide a process for obtaining the new antibiotic in its pure form. this happens by adsorption on aluminum oxide and then 8 Elute with aqueous or aqueous-alcoholic aramonium hydroxide solutions.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Beinigen des Antibioticums 833A, dessen chemische Bezeichnung l-eis-1,2-Epoxy-1-propylphosphoneäure ist, welches darin besteht, dass man die Permentationsflüssigkeit, in der'dae Antibioticum erzeugt worden ist, oder Lösungen des Antibiotiouas, die Verunreinigungen enthalten, mit Aluminiumoxid behandelt und das Antibioticum dann in gereinigter Form aus des Aluminiumoxid mit alkalischen wässrigen oder wässrig-alkoholischen Lösungen eluiert. Sas Antibioticum 833A hemmt in äuseerst wirksamer Weise das Wachstum verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen.The invention relates to a method for legging the Antibiotic 833A, the chemical name of which is l-cis-1,2-epoxy-1-propylphosphonic acid is, which consists in producing the permeation fluid in which the antibiotic is produced or solutions of antibiotics containing impurities treated with aluminum oxide and that Antibiotic then in purified form from the aluminum oxide eluted with alkaline aqueous or aqueous-alcoholic solutions. Sas antibiotic 833A is an extremely effective inhibitor Way the growth of different gram-negative and gram-positive Microorganisms.
Das Antibioticum 833A ist ein wasserlöslicher, saurer Stoff, der mit anorganischen und organischen Basen Salze bildet. Es wurde gefunden, dass das Antibioticum 833A in gereinigter Form gewonnen werden kann, indem »an aunäohet eine Lösung desThe antibiotic 833A is a water-soluble, acidic substance that forms salts with inorganic and organic bases. It it was found that the antibiotic 833A in purified Form can be obtained by "anaunäohet a solution of the
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An ti bio ti cue», und swear in Fore der Feraentationsflüeeigkelt oder 1» For* einte 8alM», nie eines Matrius-, Baliue-, CaI-clu»-, Magnesium- oder Aaaoniunealses oder eines Salses einer organischen Base, alt Aluainiunoxld behandelt und das gereinigte Material alt eines alkalischen Eluierungsaittel, wie wäeeriger AMoniuBhydroxidlöeung oder wässrig-alkoholiecher Anoniunhydroxidlusung, eluiert. PUr dieses Reinigungsverfahren eignet sich sowohl basisches als auch alt Säure gewaschenes Aluminiunoxid» und die Eluate werden in Fraktionen aufgefangen.An ti bio ti cue », and swear in fore der Feraentationsflüeeigkelt or 1 »For * einte 8alM», never a Matrius-, Baliue-, CaI-clu »-, Magnesium or aaaoniunals or a salses an organic base, treated with aluminum oxide and the purified material with an alkaline eluent, such as aqueous ammonium hydroxide solution or aqueous alcohol Anonium hydroxide solution, eluted. For this cleaning method Both basic and old acid-washed aluminum oxide are suitable and the eluates are divided into fractions caught.
lach eines bevorzugten Verfahren sua Reinigen von Lösungen des Antibioticum werden die Lösungen alt Aluminiumoxid unter sauren Bedingungen behandelt. Der bevorzugte pH-Wert bei diesen Reinigungsverfahren beträgt etwa 5,7} das Verfahren kann jedoch im pH-Bereich von 3 bis 7,5 durchgeführt werden. Sie als Ausgangsaaterial verwendeten Lösungen des Antibiotioune können gewonnen werden, indem nan die Feraentatlonaflüselgkeit durch ein Anionenaustauschhars leitet, bei des quartäre Anmoniungruppen an ein Gerüst aus Polystyrol-divinylbenEol gebunden sind ("Dowex 1 χ 2"), und das sich in der Chloridform befindet. Durch Eluieren mit wässrigen oder wässrig-alkoholischen Lösungen von Salzen, wie AamoniUBchlorid, latrluachlorid, latriunacetat, Kaliumchlorid und dergleichen, erhält nan das Hatrium-, Kalius- bew. AsnBoniunsalE des Antibioticuas 833A.According to a preferred method, see also cleaning solutions of the antibiotic, the solutions are old alumina taking Treated Acid Conditions. The preferred pH for these cleaning processes is about 5.7} the process can however, can be carried out in the pH range from 3 to 7.5. she Antibiotic solutions used as starting material can be obtained by using the Feraentatlonaflüselgkeit through an anion exchange resin, in the case of the quaternary Monon groups on a framework made of polystyrene-divinylbeneol are bound ("Dowex 1 χ 2"), and that is in the chloride form is located. By eluting with aqueous or aqueous-alcoholic solutions of salts, such as AamoniUBchlorid, latrluachlorid, latriun acetate, potassium chloride and the like nan the Hatrium-, Kalius- Bew. AsnBoniunsalE of the antibiotic 833A.
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Baa τοη des Anionenauetausohhars erhaltene Eluat wird Tor dem Behandeln Bit Aluminiuaoxid ie allgemeinen eingeengt, und zur Analyse bedient nan eich eines abgeänderten Analyeenverfahrene unter Terwendung τοη Proteus Tulgarie ale Analysenorganiesue. Bann wird eine wässrige Lösung dea Saleea 20 bis 40 Minuten bei eine« pH-Wert τοη 5 bis 6 nit sit Säure gewaschenen Aluminiuaoxid rerrtihrt. Bas Gemisch wird dann in allgemeinen gefiltert. Durch Zusate τοη Waeeer oder Gemischen aus Wasser und Alkohol su dea Aluminiussoxid-Aäsorbat wird eine wässrige oder wässrig-alkoholische Aufschlämmung des Adaorbats hergestellt, und das Antibioticum wird eluiert, indem ■an eine Base, wie konsentriertes Amaoniumhydroxid, susetzt, bis der pH-Wert der Aufschlämmung etwa 9 bis 12 betragt. Ia allgemeinen Terwendet »an wässrige Lösungen der Base; aan kann jedoch auch wässrig-alkoholische Lösungen verwenden. Obwohl das Antibioticum bei eines alkalischen pH-Wert eluiert wird, wird praktisch das gesamte Antibiotic!» bei pH-Werten τοη etwa 11 bis 12 gewonnen. Die alkalische Aufachlaasung wird dann 30 bis 60 Minuten gerührt und das Aluainiueoxid abfiltriert. Bas Eluat oder FiItrat wird eingeengt, und das Kon-Bentrat wird nach einer abgeänderten Analjrseneethode unter Terwendung τοη Proteus vul^aris als Teetorganiseua analysiert.Baa τοη of the Anionenauetausohhars eluate obtained is the gate Treat bit alumina ie general constricted, and used for Analysis uses a modified analysis procedure using τοη Proteus Tulgarie ale Analysorganiesue. Bann is an aqueous solution dea Saleea 20 to 40 Minutes at a pH value τοη 5 to 6 nit sit acid washed Alumina corrodes. The mixture is then in general filtered. By additions τοη Waeeer or mixtures from water and alcohol su dea aluminum oxide aesorbate becomes an aqueous or aqueous-alcoholic slurry of the adaorbate and the antibiotic is eluted by ■ is attached to a base, such as concentrated ammonium hydroxide, until the pH of the slurry is about 9-12. Generally used in aqueous solutions of the base; aan however, you can also use aqueous-alcoholic solutions. Although the antibiotic elutes at an alkaline pH becomes, practically the entire antibiotic! " obtained at pH values τοη about 11 to 12. The alkaline Aufachlaasung is then stirred for 30 to 60 minutes and the Aluainiueoxid filtered off. The eluate or filtrate is concentrated, and the concentrate is under a modified analysis method Use τοη Proteus vul ^ aris as Teetorganiseua analyzed.
lur weiteren Reinigung wird Aas Konzentrat alt Methanol sstst, und etwaige unlösliche Stoffe werden abfiltriert. Oe-Aas concentrate is used for further purification sst, and any insoluble matter is filtered off. Oe-
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wöhnlioh betragt das Volumen dee zugesetzten Methanole dae etwa 3- bis 10-fache des Volumene des Konsentrate. Das Konsentrat enthält praktisch das gesamte Antibioticum 833A und wird durch eine Kolonne geleitet, die mit mit Säure gewaschenem Aluminiumoxid beschickt ist. Die Grosse der Kolonne richtet sich nach der Menge des Ausgangsmaterials und dee Aluminiumoxiden Zum Bluieren des an das Aluminiumoxid adsorbierten Antibioticum bedient man sich eines Methanol-Konsentrationsgefalles» indem man mit 2n Ammoniaklösungen in 75 tigern, 50 tigern und 25 tigern Methanol und schliesslich mit wässriger 2a Ammoniaklösung eluiert. Die verschiedenen !Fraktionen werden aufgefangen und auf ihren Gehalt an dem Antibioticum 833A analysiert.Usually the volume of the added methanol is dae about 3 to 10 times the volume of the consume rate. The Consentrate contains practically all of the antibiotic 833A and is passed through a column that is washed with acid Alumina is loaded. The size of the column depends on the amount of starting material and the aluminum oxides A methanol concentration drop is used to blur the antibiotic adsorbed on the aluminum oxide » by using 2N ammonia solutions in 75 tigers, 50 tigers and 25 tigers methanol and finally with aqueous 2a ammonia solution eluted. The different! Factions will collected and analyzed for their content of the antibiotic 833A.
Das teilweise gereinigts Antibioticum Θ33Α kann weiter gereinigt werden, indes) man die beim Bluieren mit Methanol und wässrigem Ammoniak erhaltenen Fraktionen lyophilisiert und die Feststoffe aus den mit den verschiedenen Methanol-Ammoniaklösungen dluierten Fraktionen, d.h. aus den mit der 75 % Methanol, der 50 i» Methanol und der 25 £ Methanol enthaltenden 2n wässrigen Ammoniaklösung eluiertsn Fraktionen, derart miteinander vereinigt, dass die Feststoffe, die aus mit unterschiedlichen Methanolkonzentrationen eluierten Fraktionen stammen, nicht miteinander vermischt werden. Die Feststoffe werden dann mehrmals mit Methanol verrührt, und schliesslichThe partially purified antibiotic Θ33Α can be further purified by lyophilizing the fractions obtained during bluing with methanol and aqueous ammonia and the solids from the fractions diluted with the various methanol-ammonia solutions, ie from those with the 75 % methanol, the 50 i » Methanol and the 2N aqueous ammonia solution containing 25 pounds of methanol eluted fractions, combined with one another in such a way that the solids originating from fractions eluted with different methanol concentrations are not mixed with one another. The solids are then stirred several times with methanol, and finally
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wir* das Unlösliohe abfiltriert. Ue grOsete Menge an aktives Material findet sioh ia allgemeinen la den alt 50 £ Methanol und Aaaonlak eluierten fraktioneni eine gewies· Aktivität findet Bioh jedoch auoh In den anderen Fraktionen. Die gesonderten Methanolextrakte werden vereinigt und konsentriert, und das Konsentrat wird an alt 8ture gewaschenem Aluminiumoxid onroaatographiert, wobei aan sich eines kontinuierlichen Konzentrationsgefalles, beginnend alt 75 tigern Methanol in 2n wässriger Ammoniaklösung, und einer ffesohwindigkeit von etwa 1 ml/Min, bedient und das ursprtlngliohe Volumen der BluierungelOeung duroh lueats von 2n wässriger Ammoniaklösung konstant hält. Bas hierbei erhaltene Blust wird In Traktionen zu 20 ml aufgefangen, und die aktivsten Fraktionen, bestimmt nach dea abgeänderten AnalyBettverfahren, werden miteinander vereinigt und eingeengt·we * filtered off the insoluble matter. Ue the greatest amount of active Material is generally found in the old 50 lb. methanol and Aaaonlak eluted fractionsi exhibited activity Bioh finds however also in the other factions. the separate methanol extracts are combined and concentrated, and the concentrate is onroaatographed on old washed aluminum oxide, a continuous process Concentration drops, starting at the age of 75 tigers Methanol in 2N aqueous ammonia solution, and a ffeso speed of about 1 ml / min, served and the original volume the bluing solution by means of the solution of 2N aqueous ammonia solution keeps constant. The resulting blood is collected in tractions of 20 ml, and the most active fractions, determined according to the modified analysis bed method, are combined with each other and concentrated
Konsentrate des Antibioticum·, die teilweise gereinigt worden sind, können weiter gereinigt werden, indem aan das Konsentrat in Methanol löst und die Lösung alt Butanol versetst. Man verwendet etwa 10 bis 12 Haamteile Methanol je Baasteil Xonsentrat· Ia allgemeinen wird ein gleiches Volumen Butanol angesetztι aan kann das Btttanol aber sogar auch in Mengen bis sua dreifachen Volumen des Methanols srasetsen. Bas Methanol wird, ia allgemeinen unter vermindertem £ruok, abgedampft und das in Butanol unlösliohe Material abfiltriert. Me AnalyseConsentrates of antibiotic · that have been partially purified can be further purified by aan the consentrate Dissolves in methanol and the solution is mixed with old butanol. About 10 to 12 parts by weight of methanol are used per component Xonsentrat · Ia generally is an equal volume of butanol However, the Btttanol can even be applied in amounts of up to See three times the volume of the methanol. Bas methanol is, generally under reduced pressure, evaporated and the material insoluble in butanol is filtered off. Me analysis
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des auf diese Weise erhaltenen, in Butanol löeliohen Antibioticuas 833A nach der abgeänderten Analyasnaethode ergibt in allgemeinen bei einer Konsentration τοη etwa 0,005 ag/al eine Hemaungasone τοη 25 am. unter Umständen kann es Torteilhaftor sein, suerst alle Fraktionen, die aktlTss Material enthalten, su Terelnigen und dann das oben beschriebene Terfahren ansuwenden, um das halbgereinigte Antibiotioua welter su reinigen. Das feete Antibiotioua kann dann erhalten werden, indem aan das Butanol entfernt, oder eine wässrige Lttsung kann gewonnen werden, indes aan das Antibiotioua alt geringen Mengen Wasser extrahiert.of the antibiotic thus obtained and dissolved in butanol 833A according to the modified analysis method generally results in about 0.005 ag / al with a concentration τοη a Hemaungasone τοη 25 am. under certain circumstances it can torteilhaftor be, first of all, all factions, the current material included, see Terelnigen and then the Terfahren described above apply to the semi-purified antibiotics welter su clean. The wet antibiotic can then be obtained by removing the butanol or an aqueous solution can be obtained by extracting small amounts of water from the antibiotics.
laoh einem anderen Verfahren kann aan die JeraentationaflH·- sigkeit unmittelbar etwa 90 bis (0 Minuten alt alt Säure gewaschenem Aluminiumoxid: Ttrrtihren. Der pH-Wert der Fermeatatlonsflttssigkeit wird alt TerdUanter 8äure, wie 8als*aure, auf 5 bis 6 eingestellt, das Oeaieoh dann filtriert und das abfiltrierte Aluminluaoxld<»Adsorbat gewasohen «ad alt wässriges Ammoniak,bei pH-Werten τοη etwa 11 bis 12 elulert. Sas Eluat wird dann eingedampft, ua das Ammoniak su entfernen, und die Hemmungesone wird nach der abgeändertem Analyeenmethode bestimmt. Bas teilweise gereinigte Antibiotic» 833A w^ durch 8äulenohromatographle an mit Säure gewaaohanes Aluminiumoxid, wie oben beschrieben, welter gereinigt werden.With another method, the fermentation liquid can be directly adjusted to about 90 to (0 minutes old acid-washed aluminum oxide: Ttrrt then filtered and the filtered aluminum oxide "adsorbate" ad old aqueous ammonia, eluted at pH values τοη about 11 to 12. The eluate is then evaporated, including removing the ammonia, and the inhibition is determined according to the modified analytical method be purified Welter partially purified Antibiotic "833A w ^ gewaaohanes by 8äulenohromatographle to acid alumina, as described above.
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Di· «le AuegasgeMterial für dl· hier be β ohr !ebenen Reinigungsverfahren verwendeten Fermentationsflüeeigkelten dee An tibioticuBs 833A haben Aktivitäten von etwa 1 bis 10 Einheiten je ml, wenn sie nach der genormten Analysenmethode unter Verwendung von Proteus vulgarie al ο Analysenorganlsmus untersucht werden.The AuegasgeMterial for the cleaning process that is flat here used fermentation liquor dee an Tibiotic 833A have activities of about 1 to 10 units per ml if they are under the standardized analytical method Use of Proteus vulgarie al ο analytical organism investigated will.
Bas Antibioticum 833A wird zweckmässig nach einer Scheiben-Plattenmethode unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21100 und KRRL B-3361) als Teetorganismus analysiert. Sie Testkultur wird als Schrägröhrchenkultur auf einem Nähr-■ediuo gehalten, das aus Agar (Difco) und 0,2 £ Hefeextrakt (DIfco) besteht. Die beinpften Schrägröhrchen werden 18 bis 24 Stunden bei 37° C bebrütet und eine Woche bei Kühlschranktraperaturen gelagert. Jede Woche werden frische Schrägröhrchen hergestellt.Bas Antibiotic 833A is expediently made according to a disk and plate method using Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21100 and KRRL B-3361) analyzed as a tea organism. The test culture is presented as an inclined tube culture on a nutrient ■ ediuo which consists of agar (Difco) and 0.2 pounds of yeast extract (DIfco). The pinned oblique tubes turn 18 to Incubated for 24 hours at 37 ° C and one week in the refrigerator stored. Fresh slant tubes are made every week.
Das Impfgut für die Analysenplatten wird täglich frisch hergestellt, indes oan einen 250 ml-Erlenme/erkolban, der 50 ml lähraedium (Difco) + 0,2 i> Hefeextrakt (Difoo) enthält, mit einer von dem Schrägröhrchen abgeschabten Probe beimpft. Der Kolben wird dann 18 bis 24 Stunden in einer Schtttteloaschine bei 37° C bebrütet. Dann wird die Kultur durch Zusatz von 0,2 i» Hefeextraktlösung auf 40 £ige Lichtdurchlässlgkelt für «ine Wellenlänge von 660 πμ unter Verwendung des wSpectro-The inoculum for the analysis of plates is prepared fresh daily, while oan a 250 ml Erlenme / erkolban containing 50 ml lähraedium (Difco) + 0.2 contains i> yeast extract (Difoo), inoculated with a scraped off from the slants sample. The flask is then incubated in a shaker at 37 ° C for 18 to 24 hours. Then, the culture by the addition of 0.2 i "yeast extract solution to 40 £ strength Lichtdurchlässlgkelt for" ine wavelength of 660 πμ using the Spectro w
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nie 20"-Gerätes von Bausch 4 loinb eingestellt. Ale leerprobe wird für diese Bestimmung nicht-beimpfte Feraentationefltiesigkeit verwendet. 30 ml der eo eingestellten Fermentationsflüseigkeit werden verwendet, üb 1 1 Mediua zu beimpfen.never set 20 "device from Bausch 4 loinb. Ale empty sample becomes non-inoculated fermentation liquid for this determination used. 30 ml of the eo adjusted fermentation liquid are used to inoculate over 1 1 mediua.
Als Analysenmedium dient Nähragar (Difco) + 0,2 £ Hefeextrakt (Difco). Dieses Medium wird hergestellt, durch Autoklavbehandlung sterilisiert und auf 50° C erkalten gelassen« Nach dem Beimpfen des Mediums gibt man 10 ml in sterile Petrischalen ein und lasst das Medium darin erstarren.Nutrient agar (Difco) + 0.2 pounds of yeast extract is used as the analysis medium (Difco). This medium is produced, sterilized by autoclaving and allowed to cool to 50 ° C after inoculating the medium, 10 ml are placed in sterile Petri dishes and let the medium freeze in it.
Die Aktivität wird in Einheiten ausgedrückt, wobei eine Einheit als diejenige Konzentration des Antibiotioums Θ33Α je ml definiert ist, die auf einer 12,7 mm-Papiereoheibe eine Zone von 28 mm Durchmesser erzeugt. Zur Gewinnung der Standardkurve verwendet man vier Konzentrationen des Antibioticums 833A, nämlich 0,3, 0,4, 0,6 und 0,8 Einheiten je ml. Jede dieser Konzentrationen wird durch Verdünnen mit auf einen pH-Wert von 8,0 eingestelltem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer erhalten« Zur Herstellung der Standardkurve werden auf fünf Platten je vier Scheiben gelegt, so dass sich auf jeder Platte für jede der vier Konzentrationen dee Antibioticums eine Scheibe befindet. Die Platten werden 18 Stunden bei 37° C bebrütet, worauf die Durchmesser der Heromungszonen in mm gemessen werden. ?ür jede Konzentration wird ein mittlerer Zonendurchmesser berechnet, und aus die-Activity is expressed in units, with one unit than the concentration of the antibiotic Θ33Α each ml is defined, which creates a zone 28 mm in diameter on a 12.7 mm paper disc. To obtain the Standard curve uses four concentrations of the antibiotic 833A, namely 0.3, 0.4, 0.6 and 0.8 units per ml. Each of these concentrations is obtained by diluting with tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer adjusted to pH 8.0 Receive «To produce the standard curve, four slices each are placed on five plates so that there is a disc on each plate for each of the four concentrations of the antibiotic. The panels are Incubated for 18 hours at 37 ° C, after which the diameter of the heromation zones are measured in mm. for every concentration a mean zone diameter is calculated, and from the
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sen Ver-ten wird auf halblogartthaisohes Siagraaapapier eine Standardkurve aufgetragen. Sie Steigung der ao erhaltenen Linie liegt zwischen 4 und 5·sen ver-ten will be on semi-blog thai siagraaapapier a Standard curve plotted. The slope of the ao obtained line is between 4 and 5
Die su analysierenden Proben des Antibioticum 833A werden mit 0,05-aolarea Puffer tos pH-Wert 8,0 auf die entsprechende Konzentration verdünnt. Scheiben werden in die Testlösung eingetaucht und dann auf die Analysenplatte gelegt· Tür jede Probe legt aan normalerweise swei Scheiben auf eine Platte derart, dass die beiden Scheiben einander gegenüberliegen· Abwechselnd Bit der Probe werden swei weitere Scheiben auf die Platte gelegt, die in eine Lösung dea Antibioticum 833A mit einer Aktivität von 0,4 Einheiten je el getaucht worden sind. Die Platten werden 18 Stunden bei 37° O bebrütet und die Zonendurohaesser in aa bestimmt. Sie Stärke der Probe wird durch ein Homogras» oder τοη der Standardkurve bestirnt.The samples of the antibiotic 833A to be analyzed are with 0.05-aolarea buffer tos pH 8.0 to the appropriate Concentration diluted. Slices are in the test solution immersed and then placed on the analysis plate · door each The sample normally places two discs on a plate in such a way that the two discs are opposite each other. Alternating bits of the sample are placed on two more slices the plate is placed in a solution of the antibiotic 833A with an activity of 0.4 units per tablespoon are. The plates are incubated for 18 hours at 37 ° O and the Zonendurohaesser determined in aa. You strength of the sample is determined by a homograss »or τοη of the standard curve.
Wenn die abgeänderte Analysenaethode unter Terwendung τοη Proteus vulgar!s als Analysenorganieaua angewandt wird, verwendet man 5 al beiapftes Medina in der Petrischale, und das su analysierende Antibioticum wird auf eine Papiersoheibe mit 12,7 na Surohaesser aufgebracht. Sie Schale KLt den Probesoheiben wird dann 18 Stunden bei 57° 0 bebrütet, worauf die Hemmungezonen gemessen werden. Sie Starke wird als diejenige Menge Peststoff je al ausgedrückt, die unter diesenIf the modified analytical method using τοη Proteus vulgar! S is used as an analysis organieaua 5 al medina tapped into the Petri dish, and the antibiotic to be analyzed is placed on a sheet of paper applied with 12.7 na Surohaesser. You peel KLt the trial slices is then incubated for 18 hours at 57 ° 0, after which the inhibition zones are measured. You will be strong as the one Amount of pesticide per al expressed under these
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Dae AntibioticuB 833A wird durch aerobe Fomentation von geeigneten wässrigen lährmedien unter geeteuerten Bedingungen durch Staune von Streptoayoea fradlae hergestellt, die Antibioticum 833A erzeugen. Zur Herstellung des Antibiotiouiis 833A sind die gleichen wässrigen Medien geeignet, die auch aur Herstellung anderer Antiblotica verwendet werden. Solche Medien enthalten durch den Mikroorganissue assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salie. Aueβerde« enthalten die Fermentationamedien Spurennetalle, die für das Waohstun des Organismus notwendig sind und gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen enthalten sind, die den Medium sugesetst werden. Die genaue Menge der Kohlehydratquelle bew. -quellen hängt sum Teil von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, beträgt aber la allgemeinen etwa 1 bis 6 Gewiohtsprosent des Mediuas. Diese Kohlenstoffquellon können einsein oder In Kombination miteinander verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen sind proteinhaltige Stoffe» wie verschiedene formen von Caseinhydrolyeaten, Sojabohnennehl, Naisquellwasser, lösliche Schleapebestandteile, Hefehydrolysate, loaatenbrei und dergleichen. Die verschiedenen Quellen für Stickstoff werden, entweder für sich allein oder in Kombination miteinander, in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichteproaent des wässrigen Mediums angewandt.The AntibioticuB 833A is made by aerobic formation of appropriate aqueous culture media under controlled conditions produced by amazement of Streptoayoea fradlae, the antibiotic Generate 833A. For the production of the antibiotic 833A, the same aqueous media are suitable as are used for the production of other antiblotics. Such Media contain that can be assimilated by the microorganism Sources of carbon and nitrogen as well as inorganic salie. Aueβerde «contain the fermentation media trace metals, which are necessary for the wholesomeness of the organism and are usually contained as impurities in other ingredients that will sugesetst the medium. The exact Amount of carbohydrate source moved the other constituents of the medium, but is generally about 1 to 6 percent by weight of the medium. These Carbon swellons can be one or in combination with one another be used. Suitable nitrogen sources are proteinaceous substances »such as various forms of casein hydrolytes, Soybean meal, nais spring water, soluble Sludge ingredients, yeast hydrolysates, loaf pulp and the like. The various sources of nitrogen, either alone or in combination with one another, are in amounts of about 0.2 to 6 percent by weight of the aqueous Medium applied.
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Die Fermentation unter Verwendung von Antibioticum 833A erzeugenden Mikroorganismen kann bei Temperaturen von etwa 25 bie 31° C durchgeführt werden. Die besten Ergebnisse erzielt man bei Ferment^tionstemperaturen von 26 bis 30° C. Der für die Züchtung von Streptomyces fradiae und die Erzeugung des Antibioticuns Θ33Α geeignete pH-Wert des Hährnediusje kann im Bereich von etwa 5,5 bin 7)5 cchwankcn.Produce fermentation using antibiotic 833A Microorganisms can be carried out at temperatures of about 25 to 31 ° C. Achieved the best results one at fermentation temperatures of 26 to 30 ° C. The for the breeding of Streptomyces fradiae and the production of the Antibioticuns Θ33Α suitable pH of the Hährnediusje can in the range of about 5.5 am 7) 5 fluctuates.
Dae Antibioticum Θ33Α und seine Salse sind wertvolle Antimikrobenmittel, die das Wachs tue sowohl graia-poaitiver al 3 auch gram-negativer pathogener Bakterien hemmen. Das Antibioticum kann als antiseptieches Mittel verwendet werden, um Mikroorganismen von pharmazeutischen, zahnärztlichen und medizinischen Geräten zu entfernen. Ferner eignet es sich zum Abtrennen gewisser Mikroorganismen aus Gemischen mit anderen Mikroorganismen. Das Antibioticum kann auch verwendet werden, um zu Teatzwecken im Laboratorium dienende Mäuse zu behandeln, die Bit verschiedenen grac-negatlven OrganisEen infiziert worden sind, und auf diese Woios Infektionsquellen zu beseitigen, die die Tiere andernfalls ungeeignet fiir Laboratoriumsunterauchungen machen würden. Da das Antibioticum und seine Salze das Wachetun verschiedener Arten von Salmonella äuseerat wirksam hemmen, können dicso Verbindungen als Desinfizieralttel sum Waschen von Eiern und von Flächen vertrendet werden, die clurch Salmonella infiziert sind.Dae Antibioticum Θ33Α and its Salse are valuable antimicrobial agents, which the wax does both graia-poaitiver al 3 also inhibit gram-negative pathogenic bacteria. The antibiotic can be used as an antiseptic agent to Remove microorganisms from pharmaceutical, dental and medical equipment. It is also suitable for Separation of certain microorganisms from mixtures with other microorganisms. The antibiotic can also be used to treat mice used for tea in the laboratory, the bit infected various grac-negative organisms have been, and to these woios sources of infection too Eliminate which would otherwise make the animals unsuitable for laboratory studies would do. Because the antibiotic and its salts wake up different types of Salmonella These compounds can be used as disinfecting agents to effectively inhibit iceerat Sum washing eggs and surfaces finished off infected by Salmonella.
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Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Antibioticums 833A.The following examples illustrate methods of making and obtaining the antibiotic 833A.
500 al einer vegetativen Kultur von Streptoayoee fradiae HA-2898 (ATCO 21096) (HRRIi B-3357), hergestellt äuroh Züchten des Mikroorganismus in einem 2 Liter-Erlenaeyerkolb·», werden verwendet, um ein 757 1 fassendes feraentationsgefäss aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, das 467 1 steriles Medina der folgenden Zusammensetzung enthält: ν500 al a vegetative culture of Streptoayoee fradiae HA-2898 (ATCO 21096) (HRRIi B-3357), manufactured by breeding of the microorganism in a 2 liter Erlenaeyer's flask · » used to make a 757 1 feraentation vessel Inoculate stainless steel containing 467 1 sterile medina of the following composition: ν
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Hefeextrakt 10Yeast extract 10
Glucose 10Glucose 10
MgSO4^ H2O 0,05MgSO 4 ^ H 2 O 0.05
Phosphatpuffer* 2 alPhosphate buffer * 2 al
destilliertes Wasser Restdistilled water remainder
* 91 g KH2PO4 und 95»0 g Ka2HPO4 mit Wasser auf 1 1 verdünnt.* 91 g KH 2 PO 4 and 95 »0 g Ka 2 HPO 4 diluted to 1 liter with water.
Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei 28° C unter mechanischer Bewegung und Einleiten von 283 1 Luft je Minute bebrütet, wobei eine geringe Menge "Polyglycol 2000" zugesetzt wird, um Schaumbildung au unterdrücken. 215 1 der so erhaltenen Formentationsflüssigkeit werden verwendet, um ein 5680 1 fassendes ?ermentationsgefäss aus rostfreiem Stahl zuThe inoculated medium is 24 hours at 28 ° C under mechanical Incubate agitation and introduction of 283 l of air per minute, with a small amount of "Polyglycol 2000" added is used to suppress foaming au. 215 l of the formation fluid thus obtained are used to make a 5680 1 stainless steel fermentation vessel
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beiapfen, daa 4542 1 einea sterilen IMhnediuBS der folgendeninapfen the 4542 1 a sterile medium of the following
lÖBliche Schleapebestandteile 10Soluble sludge components 10
SojabohnenBehl 20 latriuaoitrat 2Soybean flour 20 latriuaoitrat 2
destilliertes Wasser Best.distilled water
Dieses Hediun wird Tor des Sterilisieren auf einen pH-Wert Ton 6,5 eingestellt.This hediun will gate the sterilization to a pH Tone 6.5 set.
Die belspfte feraentationsfiaeeigkeit wird bei 28° O 2 Tage unter Bewegung und Einleiten τοη 1960 1 Luft je Minute bebrütet, wobei geringe Mengen τοη "Polyglyfcol 2000* al« Sohauarerhütungsoittel sugesetzt werden.The aerated feraentation is at 28 ° O for 2 days incubated with movement and introduction τοη 1960 1 air per minute, where small amounts τοη "Polyglyfcol 2000 * al" Sohauarerhütungsoittel can be used.
Dieses FeraentationsBediusj wird Bit Hilfe τοη Diatoaeenerde filtriert. 2082 1 des filtrate ait einer AktiTitflt τοη 0,34 Einheiten je al werden durch eine Säule geleitet» die Bit de« oben beschriebenen Anionenaustauschhars gefüllt ist« dae quartäre Aanoniuagruppen an ein Polystyrol-diTinylbenaol-Oerüet gebunden enthält ("Dowex 1x2») und elon in der Chloridform befindet. Das Harpadsorbat wird Bit 3 £iger wäearigerThis FeraentationsBediusj will help τοη Diatoaeenerde bit filtered. 2082 1 of the filtrate with an activity τοη 0.34 Units per al are passed through a column »the bit de« The anion exchange resin described above is filled with «dae quaternary Aanoniuagruppen on a polystyrene-diTinylbenaol-Oerüet contains bound ("Dowex 1x2") and elon in the chloride form is located. The harpadsorbate becomes a bit more watery
- 14 109808/2000 - 14 109808/2000
11 58011 580
Kochealelöeung eluiert und das Eluat in Fraktionen von je 18,9 1 geeanielt. Die verbrauchte Feraentationsflüesigkeit erweist eich nach dta Durchgang durch die Kolonne sufolge einer Analyse Bit Froteue vulgar is als inaktiv* Die Fraktionen Hr. 5 bis 12, die die stärkste antibiotisohe Aktivität enthalten, werden vereinigt.Kochealelöeung eluted and the eluate in fractions of each 18.9 1 held. The spent fermentation liquid after dta proves passage through the column as a result an analysis Bit Froteue vulgar is as inactive * The fractions Hr. 5 to 12, which is the strongest antibiotic activity contain are united.
Weitere 2082 1 der filtrierten Fernentationsflttssigkelt werdon durch eine Kolonne geleitet, die 150 1 frisches Anionenauetaueohhare der gleichen Art enthält. Das Harsadsorbat wird Bit 3 Jtiger w&aeriger KoehsalBlttsung eluiert und das Eluat in Fraktionen «u 16,9 1 aufgefangen. Die Fraktionen Ir. 2 bis 11, die den gröeeten Teil der antibiotisohen Aktivität enthalten, werden nit den Fraktionen Hr. 5 bis 12 des ersten Ghrooatographieverfahrens vereinigt und unter verainderten Druck auf 26,5 1 eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat hat einen pH-Wert von 8,5 und eine Stärke von 0,2 Einheiten je ng, bestimmt nach den oben beschriebenen genormten Analyseverfahren unter Yerwendung von Proteus vulgaris. Das Konzentrat des Haraeluats wird ferner nach eine» abgeänderten Analyseverfahren unter Yerwendung von Froteue vulgaris untersucht.A further 2082 l of the filtered remote-control liquids are produced passed through a column containing 150 l of fresh Anionenauetaueohhare contains the same type. The hard adsorbate is eluted in bit 3 more aqueous cohesion solution and the eluate in Fractions «u 16.9 1 collected. The groups Ir. 2 to 11, which contain most of the antibiotic activity, with the parliamentary groups Mr. 5 to 12 of the first ghroatography process united and under changed pressure concentrated to 26.5 liters. The concentrate obtained in this way has a pH of 8.5 and a strength of 0.2 units per ng according to the standardized analysis methods described above using Proteus vulgaris. The concentrate of the Haraeluats will also use a »modified analysis method investigated using Froteue vulgaris.
Bei diesen Verfahren verwendet »an 5 al beiapftee Medira in der Petrischale, und das su untersuchende Antibioticum wird auf eine 12,7 n-Papiereoheibe aufgebracht. Die Schale Bit denIn this procedure used »an 5 al beiapftee Medira in the Petri dish, and the antibiotic to be investigated will be applied to a 12.7 n paper disk. The peel bit the
- 15 109808/2000 bad- 15 109808/2000 bath
11 58011 580
Teetecheiben wird dann 18 Stunden bei 37° 0 bebrütet, und die Hemmungezonen werden gemessen. Die Stärke wird als diejenige Menge Festetoff je al ausgedrückt, die unter dieean Bedingungen eine Heomungszone von 25 nm> erzeugt.Tea slices are then incubated for 18 hours at 37 ° 0, and the Inhibition zones are measured. Strength is expressed as the amount of solid per al that under the conditions a Heomungszone of 25 nm> generated.
Das Harzeluat (25,85 1) enthält 10,4 kg Feststoffe und ergibt bei einer Konzentration von 2,7 mg/ml eine Hemmungssone ▼on 25 na. Diese 25,85 1 Eluatkonzentrat werden mit 15 kg mit Säure gewaschenem Aluminiumoxid vorsetzt, und das Gemisch wird 30 Minuten "uti oinem pH-Wert von 5,7 gorührt. Nach dom Filtrieren enthält das Filtrat 9»5 kg Feststoffe und ergibt bei dea oben beschriebenen abgeänderten Analyseverfahren bei einer Konsentration von 6,1 mg/ml eine Hemmungszone von 25 mm. Das Adeorbat des Antibioticum 833A an dem Aluminiumoxid wird in 25 1 Wasser aufgeschlämmt. Me Aluminiumoxidaufschlämmung wird mit konsertriertem Ajamoniuiahyclroxid auf einen pH-Wert ▼on 11,1 eingestellt. Nach 40 Hinuten langem Rühren wird das Aluminiumoxid abfiltriert und das Eluat unter vermindertem Druck auf 1 1 eingeengt. Dieoeo Konzentrat enthält 361 g Feststoffe und ergibt bei einer Konsentration von 0,17 mg/ml oine Hemoungszone von 25 mm.The rosin eluate (25.85 liters) contains 10.4 kg of solids and yields at a concentration of 2.7 mg / ml, an inhibitor sone ▼ on 25 na. These 25.85 1 eluate concentrate are 15 kg with Acid washed aluminum oxide and the mixture is stirred for 30 minutes at a pH of 5.7. According to dom Filtration contains the filtrate 9-5 kg of solids and yields with the modified analytical method described above at a concentration of 6.1 mg / ml, a zone of inhibition of 25 mm. The adeorbate of the antibiotic 833A on the aluminum oxide is suspended in 25 l of water. Me alumina slurry is brought to pH with preserved ajamoniuiah cyclroxide ▼ set to 11.1. After stirring for 40 minutes this will be Aluminum oxide is filtered off and the eluate is concentrated to 1 l under reduced pressure. Dieoeo concentrate contains 361 g of solids and gives oine at a concentration of 0.17 mg / ml Hemoungszone of 25 mm.
850 ad dieses angereicherten Konzentrats werden rait 7650 ml Methanol versetzt und die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Das Filtrat, das praktisch das gesamte Antibiotics 833A enthält,850 ad of this enriched concentrate are increased to 7650 ml Methanol is added and the insoluble substances are filtered off. The filtrate, which contains practically all of Antibiotics 833A,
- 16 109808/200 0- 16 109808/200 0
11 58011 580
wird durch eine Kolonne geleitet, die 1 kg mit Säure gewaschenes Aluminiumoxid enthält. Das Aluminiumoxid-Adsorbat wird unter Anwendung eines Methanol-Konzentrationsgefälles eluiert, wobei man 2n Ammoniaklösungen in 75 £igem, 50 #igem und 25 tigern Methanol und schliesslioh wässrige 2n AamoniaklÖBung verwendet. Jede der verschiedenen Methanollösungen und die zum Schluss angewandte wässrig· Ammoniaklösung werden in einer Menge von je 4000 ml angewandt. Das mit der 2n Ammoniaklösung in 75 tigern Methanol gewonnene Eluat wird in vier Fraktionen zu je 1 1 aufgefangen und analysiert. Die Analyeen zeigen, dass diese Fraktionen nur eine unbedeutende Aktivität enthalten, weswegen die Fraktionen verworfen werden*is passed through a column containing 1 kg of acid washed alumina. The aluminum oxide adsorbate is made using a methanol concentration gradient eluted, 2N ammonia solutions in 75%, 50% and 25 tiger methanol and finally aqueous 2N ammonia solution used. Each of the various methanol solutions and the aqueous ammonia solution applied at the end become applied in an amount of 4000 ml each. The eluate obtained with the 2N ammonia solution in 75 tiger methanol is in four fractions of 1 1 each collected and analyzed. The analyzes show that these fractions are only insignificant Contain activity, which is why the fractions are discarded *
Das mit der 2n Ammoniaklösung in 50 tigern Methanol gewonnene Eluat wird ebenfalls in vier Fraktionen zu je 1 1 aufgefangen. Der Feststoffgehalt und die Analysen dieser Fraktionen ergeben sich aus der nachstehenden Tabelle.That obtained with the 2N ammonia solution in 50 tiger methanol Eluate is also collected in four fractions of 1 liter each. The solids content and the analyzes of these fractions result from the table below.
Heanungszone
von 25 mnmg / ml for one
Climbing zone
from 25 mn
- 17 109808/2000 »AD ORKätNAL- 17 109808/2000 »AD ORKätNAL
11 580 /Ι11 580 / Ι
Sae ait der 2n ABaoniaklösung in 25 £igea Methanol gewonnene Bluat wird ebenfalls in Tier Fraktionen iu je 1 1 aufgefangen. Der feststoffgehalt und die Analysen dieser Fraktionon ergeben «ich aus der folgenden Tabelle:Sae ait the 2N ABaoniaklösung in 25 pounds of methanol obtained Bluate is also collected in animal fractions of 1 liter each. The solids content and the analyzes of this fraction result from the following table:
/ el»e/ el »e
fraktion Qeeaatfeststoffe, g το» 2§ astfraction qeeaat solids, g το »2§ ast
1 4,99 O1IQ1 4.99 O 1 IQ
2 8,1 0,(H2 8.1 0, (H.
3 4,4 0,033 4.4 0.03
4 2,0 0,044 2.0 0.04
Auch da· Bit der waserigen 2n Aveoniaklöeux^ gewonaene lluat wird in Tier fraktionen au je 1 1 aufgefangen. Me erste Traktion enthält inθgesaut 2,9 g feststoffe und ersengt bei einer Eonsentration τοη 0,12 ag/el ein· HeMrangasone tob 22 ■■; die sweite fraktion enthält 4,0 g feststoffe uaä erzeugt bei einer Konsentration τοη 0,16 *g/*l ein» Heaaengsson· τοη 22 sä. Sie übrigen beiden fraktionen enthalten nur •ehr geringe antibiotisch· AktiTität und werden deehalb verworfen. Also there bit of the watery 2n Aveoniaklöeux ^ won lluat is collected in animal fractions au 1 1 each. Me first Traction contains 2.9 g of solids and sinks in an eonsentration τοη 0.12 ag / el a · HeMrangasone tob 22 ■■; the sweite fraction contains 4.0 g of solids among other things with a concentration τοη 0.16 * g / * l a »Heaaengsson · τοη 22 sä. They only contain the remaining two factions • Rather little antibiotic activity and are therefore discarded.
■1t 2n ABBoniaklösung in 50 ^ige» Methanol werden Tereinigt,■ 1t 2n ABBonia solution in 50% methanol are cleaned,
- 18 -- 18 -
109808/7000109808/7000
11 580 JS11 580 JS
dreimal in 500 el Methanol aufgeschlämmt und dann filtriert. Die Methanoloxtrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 500 ml eingeongt. Das eo erhaltene Konzentrat enthält 7,5 g Feststoffe und ergibt bei einer Konsentration von 0,006 mg/ml eine Heamungezone von 25 mm.Slurried three times in 500 el methanol and then filtered. The methanoloxtrakte are combined and under reduced Pressure reduced to 500 ml. The concentrate obtained contains 7.5 g solids and yields at a concentration of 0.006 mg / ml for a haemun area of 25 mm.
134 ml dieses Konsentrate werden an 100 g mit Säure gewaschenem Aluminiumoxid chromatographiert und unter Anwendung eines kontinuierlichen (exponentiellen) Metianol-Konsentrationsgefalles, beginnend mit 2 1 einer 2n Ammoniaklösung in 75 tigern Methanol, mit einer Geechwindigkeit von 1 ml/Min, eluiert, wobei dte Volumen der Eluierungslösung ständig durch Zusatz von wässriger 2n Anaoniaklusung auf 2 1 gehalten wird. Bas Eluet wird in Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Die aktivsten Fraktionen Hr. 10 bis 25 werden vereinigt und unter verminderten Druck auf 1 al eingeengt, und das Konsentrat wird in134 ml of this consume rate is chromatographed on 100 g of acid washed alumina and, using a continuous (exponential) drop in Metianol concentration, starting with 2 1 of a 2N ammonia solution in 75 tigers Methanol, eluted at a rate of 1 ml / min, whereby dte volume of the eluting solution continuously by adding aqueous 2N Anaoniaclusion is kept at 2 1. Bas eluet is collected in fractions of 20 ml each. The most active Parliamentary groups Mr. 10 to 25 are combined and concentrated under reduced pressure to 1 al, and the concentrate is in
12 ml Methanol gelöst und mit einer gleichen Raummenge n-Butanol versetzt. Das Methanol wird unter vermindertem Druck abgedampft. Dae in Butanol unlösliche Material wird abfiltriert. Die Analyse der Butacollösung auf Antibioticum 833A nach der eben beschriebenen abgeänderten Analyaennethode ergibt eine Hernmungazone von 25 mm bei einer Eonsentration von 0,005 ag/ml.Dissolved 12 ml of methanol and mixed with an equal volume of n-butanol. The methanol is under reduced pressure evaporated. The material which is insoluble in butanol is filtered off. Analysis of the butacol solution for antibiotic 833A according to the modified analysis method just described a respiratory zone of 25 mm with an eonsentration of 0.005 ag / ml.
- 19 -- 19 -
109808/2000109808/2000
11 58011 580
Beispiel 2Example 2
Bine lyophilisierte Kultur von Streptomyces fradiae MA-2913 (ATCC 21099) (NRRI B-3360) wird verwendet, um 50 2nl eines sterilen Hediune in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen. Das sterile Medium hat die folgende Zusammensetzung:A lyophilized culture of Streptomyces fradiae MA-2913 (ATCC 21099) (NRRI B-3360) is used to produce 50 2nl of one inoculate sterile Hediune in a 250 ml conical flask. The sterile medium has the following composition:
g/lg / l
Gemahlenes Hafermehl 10Ground oatmeal 10
Hefehydrolyeat 10Yeast hydrolyte 10
HgSO+.7 H2O 0,05HgSO + .7 H 2 O 0.05
Phosphatpuffer* 2 mlPhosphate buffer * 2 ml
Waeser RestWaeser rest
* 91 g KHgPO^ und 95 g Na2HPO* mit Wasser auf 1 1 verdünnt.* 91 g KHgPO ^ and 95 g Na 2 HPO * diluted to 1 liter with water.
Yor dem Sterilisieren wird das Medium auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.Before sterilizing, the medium is brought to a pH of 6.5 set.
Der beimpfte Kolben wird 24 Stunden bei 28° C in einer rotierenden Schüttelmaschine bebrütet. 10 ml der so erhaltenen flüssigkeit werden verwendet, um einen zweiten 250 ml-Erlen-■eyerkolben zu beimpfen, der 50 ml des gleichen sterilen Mediums enthält. Nach 24-stündigem Bebrüten bei 28° C in einer rotierenden Sohüttelmasohine wird die so gewonnene Fennentationsflüssigkeit verwendet, um ein 5 1 fassendes Fermentations gefäa θ zu beimpfen, das 3 1 eines sterilen Häaraediums der folgenden Zusammensetzung enthält:The inoculated flask is rotated for 24 hours at 28 ° C Incubated shaker. 10 ml of the liquid obtained in this way are used to create a second 250 ml alder-eyed flask inoculate containing 50 ml of the same sterile medium. After incubating for 24 hours at 28 ° C in a Rotating Sohüttelmasohine is the so obtained separation liquid used to inoculate a 5 1 fermentation vessel θ, the 3 1 of a sterile Haaraediums the following composition contains:
- 20 109808/2000 - 20 109808/2000
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
11 58011 580
g/lg / l
Vor dem Sterilisieren wird daB Medium auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.Before sterilization, the medium is brought to a pH of 6.5 set.
Das beimpfte Medium wird dann 4 Tage bei 28° C unter Bewegung und Belüftung mit 3 1 Luft je Minute bebrütet, wobei 3 ml Polypropylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000 ("Polyglycol P-2000" der Dow Chemical Company) zugesetzt werden, um übermässiges Schäumen zu verhüten. Die so erhaltene Fermentationsflüssigkeit hat zufolge der genormten Analysenmethode unter Verwendung von Proteua vulgaria oine Aktivität von 5>9 Einheiten je ml.The inoculated medium is then kept under agitation for 4 days at 28 ° C and aeration with 3 l of air per minute, with 3 ml of polypropylene glycol with a molecular weight of 2000 ("Polyglycol P-2000 "from Dow Chemical Company) can be added to to prevent excessive foaming. The fermentation liquid thus obtained has an activity of 5> 9 according to the standardized analysis method using Proteua vulgaria Units per ml.
Sine sweite Fomentation nach dem gleichen Verfahren führt zu einor i'erniei"tat.LonsflüsDigk:eit mit oiner Aktivität von 6,75 Einheitsn je ml.Sine weite fomentation following the same procedure leads to einor i'erniei "tat.LonsflüsDigk: eit with an activity of 6.75 Units per ml.
Die bei diesen beiden Fermentationen erhaltenen Flüssigkeiten werden miteinander verainigt und filtriert. Das Filtrat ant-The liquids obtained from these two fermentations are combined and filtered. The filtrate ant-
- 2\ 109808/2000 - 2 \ 109808/2000
BAD OfUGINALBAD OFUGINAL
11 58011 580
hält 20 ng feststoffe je «1 und erseugt bei der in Beispiel '> beschriebenen abgeänderten iaalyeennethode unter Verwendung von Proteus vulgaris bei einer Verdünnung von 1i32 eino Hen-' auiigsBone von 25 en.Holds 20 ng of solids per 1 and sucks in the modified iaalyeennethode described in Example '> using Proteus vulgaris at a dilution of 1'32 one Hen-' auiigsBone of 25 en.
96,5 ml der Jeroentationeflüseigkeit werden 40 Minuten Bit 2,5 g oit Säure gewaschenes Aluainiuaexid verrührt. Der pH-Wert wird mit 2,5n Salzsäuro auf 5»7 eingestellt und das Gemisch filtriert. Pas Pil trat enthält 20 Jt .Aktivität. Due abfiltrierte AluBiniuaoxia-Adsorbat wird gewaschen und Bit wässrigen Ammoniak boi einen pH-Wert von 11,2 eluiert. Das Eluat wird eingedampft, um das Aaaoniak su entfernen und erseugt dann zufolge der abgeänderten Analysensethode eine Heamungezone von 25 aa bei einer Verdünnung von 0,125 ag/al·96.5 ml of the jeroentation fluid will be 40 minute bit 2.5 g of aluainiuaexide washed with acid were stirred up. The pH is adjusted to 5 »7 with 2.5N hydrochloric acid and the mixture filtered. Pas pil entered contains 20 mill. Of activity. Due filtered AluBiniuaoxia adsorbate is washed and bit aqueous Ammonia eluted at pH 11.2. The eluate is evaporated to remove the aaaonia and sucked then, according to the modified analytical method, a haemun zone of 25 aa at a dilution of 0.125 ag / al
Ein naoh dec Verfahren des Beispiels 1 Bit einer 2n Aaaoniakr· lösimg in 25 £igea Methanol gewonnenes Eluat wird gefriergetrocknet, wobei aan 250 ag feststoffe erhalt, die nach der in Beispiel 1 beschriebenen abgeänderten Analyseneethode unter Verwendung von Proteus vulgaris eine Heunaeesona von 25 wm bei einer Verdünnung von 0,028 Bg/al ergeben. Der getrooknete Feststoff wird in 5 al Methanol gelöst und die lösung «ft 5 al n-&itanol versetzt. Ditee Lösung wird filtriert und 4m FIltrat unter verminderten Druok eingedaapf\$ vm das Xettianol aV-A similar method of example 1 bit of an eluate obtained in 2n aaaoniacrol in 25 pounds of methanol is freeze-dried, 250 ag of solids being obtained which, according to the modified analytical method described in example 1 using Proteus vulgaris, produces a haynea of 25 wm at a dilution of 0.028 Bg / al. The dried solid is dissolved in 5 μl of methanol and the solution is added 5 μl of n- & itanol. Ditee solution is filtered and 4m filtrate under reduced Druok eingedaapf \ $ vm the Xettianol AV
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BAD 109808/2000BATH 109808/2000
11 58011 580
eutreiben. Die Butanollöeung wird filtriert, ua unlöeliohe· Material zu entfernen; das FiItrat enthält das Antibiotioun 833A und ergibt bei einer Verdünnung von 0,0065 ag/al eine Hetnaungseone von 25 bb.drive. The butanol solution is filtered, including insoluble · Remove material; the filtrate contains the antibiotics 833A and at a dilution of 0.0065 ag / al gives a Hetnaungseone from 25 bb.
Die boi dor Chromatographie von unreinem Antibioticum 833A an AluDiniuinrxiü nach den Verfahren dee Beispiele 1 mit 2n Aniiiorjjiailiieun^ in 50 *igen Methanol und in 25 ^igen Methanol gewonnenen Eluate werden vereinigt und unter verhinderten Dinick auf 500 ml oirigedaapft. Dieeee Konzentrat wird alt 1500 icl HetLcnol verestzt und die Lösung filtriert. Dae FiI-trat wird unter vernindertea Druck su einer wäeerigon Lösung (Ie3 Aii-.-.icioticuua Θ33Α eingeengt, die boi der in Beiepiol 1 beschriebenen abgeänderten Analyse unter Verwendung von Protquo vulgQrir eine Heomungezone von 25 bb bei einer Verdünnung von 0,0( Γι5 ug/ml orgibt. „ The boi dor chromatography of impure antibiotic 833A on AluDiniuinrxiü according to the method of Example 1 with 2n aniiiorjjiailiieun ^ in 50% methanol and in 25% methanol eluates are combined and poured down to 500 ml of oil under prevented Dinick. The concentrate is converted to 1500 icl HetLcnol and the solution is filtered. The filter is concentrated under reduced pressure to a aqueous solution (Ie3 Aii -.-. Icioticuua Θ33Α, the modified analysis described in Beiepiol 1 using Protquo vulgQrir a Heomungezone of 25 bb at a dilution of 0.0 ( Γ ι5 ug / ml orgibt. "
2 öl dieee,«3 Konzentrate werden Bit 20 nl -Methanol verse tat, und die Iiöaung wird filtriert. Da3 FiItrat wird Bit 60 al n-Btttanol verdünnt, ur.ö die unlöslichen Stoffe werden abfil-•triert. Das Filtrat, welchee dae Antibiotioua 833A enthält, ' ergibt eine Heemungszone von 25 an bei finer Verdünnung von 0,0025 mg/al. Das 3"ilirat wird auf B nl eingeengt und das unlösliche Materiel abfiltriert. Die so erhaltene n-Butanollö-2 oil dieee, «3 concentrates are bit 20 nl -Methanol verse tat, and the solution is filtered. Bit 60 is al n-Btttanol diluted, ur.ö the insoluble substances are filtered off. The filtrate, which contains the antibiotic 833A, ' results in an embarrassment zone of 25 with a fine dilution of 0.0025 mg / al. The 3 "ilirat is concentrated to B nl and the insoluble Filtered off material. The n-butanol oil thus obtained
- 23 !•MO·/2000 BAD ORIGINAL- 23! • MO · / 2000 BAD ORIGINAL
11 580 *11 580 *
sung dee Antibioticuffls 833A ergibt bei der abgeänderten Αηβ-lyee unter Verwendung von Proteue vulgarie eine Henramngßsone von 25 BB bei einer YerdUnnung von 0,0014 ng/nX,Solution dee Antibioticuffls 833A results in the modified Αηβ-lyee using Proteue vulgarie a Henramngßsone of 25 BB with a Yerd-dilution of 0.0014 ng / nX,
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