DE1793119C3 - S-acetamidomethylcysteine and derivatives and processes for their preparation - Google Patents
S-acetamidomethylcysteine and derivatives and processes for their preparationInfo
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Description
Peptide, die Cystein enthalten, werden im allgemeinen synthetisiert unter Schutz der fanktionellen Mercaptogruppe durch eine geeignete Gruppe. Es sind verschiedene Schutzgruppen bekannt, die für die Synthese von Cysteinreste enthaltenden Peptiden brauchbar sind, aber viele der bekannten Schutzgruppen werden während des Endstadiums der Synthese unter Schwierigkeiten entfernt oder sie sind gegen einige der im allgemeinen bei Peptidsynthesen verwendeten Reagenzien instabil.Peptides containing cysteine are generally synthesized under protection of the functional Mercapto group through an appropriate group. Various protecting groups are known which are responsible for the Synthesis of cysteine residue-containing peptides are useful, but many of the known protecting groups are removed with difficulty or they are against during the final stage of synthesis some of the reagents commonly used in peptide synthesis are unstable.
Während der Synthese von Peptiden. ausgehend von der ungeschützten Mercaptogruppe, findet sehr leicht eine Dehydrierung unter Bildung der Cystinderivate statt, und dies hat oftmals weitere Komplikationen zur Folge. Cystein wird darum fast ausschließlich in seiner S-geschützten Form bei der Synthese von Cysteinreste enthaltenden Peptiden eingesetzt, und es ist darum wünschenswert, eine geeignete Schutzgruppe zu haben, die leicht während der Synthese entfernt werden kann, die aber auch gegenüber den bei Peptidsynthestn angewendeten Reagenzien und Umsetzungsbedingungen stabil ist.During the synthesis of peptides. starting from the unprotected mercapto group, finds very easily dehydration with the formation of cystine derivatives takes place, and this often has further complications Consequence. Cysteine is therefore almost exclusively used in its S-protected form in the synthesis of cysteine residues containing peptides are used, and it is therefore desirable to have a suitable protecting group, which can easily be removed during the synthesis, but which also compared to the peptide syntheses applied reagents and reaction conditions is stable.
Die am häufigsten angewendete Schutzgruppe für die Mercaptogruppe ist die Benzylgruppe, die im allgemeinen die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln vermindert. Diese Gruppe kann jedoch nur abgespalten werden, indem man Natrium in flüssigem Ammoniak einwirken läßt. Dieses System führt jedoch zur Zersetzung vieler Peptide. Fluorwasserstoff wurde bereits zur Abspaltung der Benzylschutzgruppe verwendet, aber er ist für die Herstellung im größeren Maßstab unpraktisch, verursacht oftmals einen Abbau der Peptide und ist auch nicht ausreichend selektiv, weil auch Benzyloxycarbonyl- und t.-Butoxycarbonyl-gruppen abgespalten werden. Andere Gruppen, wie die p-Nitrobenzyl-, p-Diphenylmethyl-, Benzylthiomethyl- und die Triphenylmethylgruppe, sind bei Synthesen von Cysteinpeptiden angewendet worden, aber auch sie befriedigten noch nicht vollständig. Beispielsweise erniedrigt die p-Nitrobenzylgruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln und kann nur durch katalytische Hydrierung in Gegenwart eines Palladium-Kohlekatalysators und von Chlorwasserstoffsäure entfernt werden, wobei jedoch bedingt durch das Vorliegen schwefelhaltiger Gruppen Vergiftung des Katalysators und mangelnde Selektivität beobachtet wurden. Beim S-Benzylthiomethylcystein kann die Schutzgruppe durch Queeksilber(II)-chlorid in warmer Chlorwasserstoffsäure oder durch Quecksilber(II)-acetat in 80%iger Ameisensäure entfernt werden. Stark saure Bedingungen sind unerwünscht, weil dadurch Tryptophan-Reste zerstört werden und sich unerwünschte Nebenprodukte bilden. Die Anwesenheit dieser Gruppe vermindert auch die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln. Die p-Diphenylmethylgruppe kann durch Natrium in flüssigem Ammoniak oder durch Trifluoressigsäure entfernt werden. Das letztere Reagens ist aber ungeeignet, weil es nicht selektiv ist undThe most commonly used protective group for the mercapto group is the benzyl group, which in general the solubility of the peptide in solvents containing hydroxyl groups is reduced. This group can can only be split off by allowing sodium to act in liquid ammonia. This system however, it leads to the decomposition of many peptides. Hydrogen fluoride has already been used to split off the benzyl protecting group is used, but it is inconvenient for large-scale manufacture, often causing a degradation of the peptides and is also not sufficiently selective because benzyloxycarbonyl and t-butoxycarbonyl groups be split off. Other groups, such as the p-nitrobenzyl, p-diphenylmethyl, benzylthiomethyl and the triphenylmethyl group, have been used in the synthesis of cysteine peptides, but even they were not yet completely satisfactory. For example, the p-nitrobenzyl group lowers the Solubility of the peptide in solvents containing hydroxyl groups and can only be achieved by catalytic Hydrogenation can be removed in the presence of a palladium-carbon catalyst and hydrochloric acid, but due to the presence of sulfur-containing groups poisoning of the catalyst and lack of selectivity was observed. In the case of S-benzylthiomethylcysteine, the protective group can with queek silver (II) chloride in warm hydrochloric acid or with mercury (II) acetate in 80% strength Formic acid can be removed. Strongly acidic conditions are undesirable because they cause tryptophan residues are destroyed and undesirable by-products are formed. The presence of this group diminished also the solubility of the peptide in solvents containing hydroxyl groups. The p-diphenylmethyl group can be removed by sodium in liquid ammonia or by trifluoroacetic acid. The latter reagent but is unsuitable because it is not selective and
ίο weil es auch die tert.-Butylester- und tert.-Butoxycarbonylgruppen abspaltet. Die Anwesenheit einer starken Säure ist ein weiteres unerwünschtes Merkmal. Die Triphenylmethylgruppe kann mit einer schwachen Säure oder mit Quecksilbersalzen entfernt werden, aberίο because there are also the tert-butyl ester and tert-butoxycarbonyl groups splits off. The presence of a strong acid is another undesirable feature. the Triphenylmethyl group can be removed with a weak acid or with mercury salts, however
diese Schutzgruppe wird zu leicht durch schwache Säuren unter üblichen Bedingungen entfernt und ist darum eine ungenügende Schutzgruppe für Peptidsynthesen. Darüber hinaus wird durch die Gegenwart dieser Gruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxyl-this protecting group is too easily removed by weak acids under normal conditions and is therefore an insufficient protecting group for peptide syntheses. It also is through the present of this group the solubility of the peptide in hydroxyl
gruppenhaltigen Lösungsmitteln vermindert.group-containing solvents reduced.
Die Erfindung stellt neue mit Schutzgruppen versehene Cysteine zur Verfügung, die gegenüber den meisten der verwendeten Reagenzien und unter den allgemeinen Reaktionsbedingungen, wie sie bei Peptidsynthesen angewendet werden, stabil sind, und deren Schutzgruppen sich dennoch leicht mit speziellen Reagenzien entfernen lassen.The invention provides new protected cysteines that are opposed to most the reagents used and under the general reaction conditions as they are in peptide syntheses are used, are stable, and their protective groups can be easily modified with special reagents have it removed.
Gegenstand der Erfindung sind S-Acetamidomethylcystein, N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcy-The invention relates to S-acetamidomethylcysteine, N-tert-butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcy-
stein und N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystHn-hydroxysuccinimidester. stone and N-tert-butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystHn-hydroxysuccinimide ester.
Erfindungsgemäß kann S-Acetamidomethylcystein hergestellt werden, indem man Cystein in einem Lösungsmittel in Gegenwart einer Säure mit N-Hydroxymethylacetamid umsetzt.According to the invention, S-acetamidomethylcysteine can be prepared by making cysteine in a solvent in the presence of an acid with N-hydroxymethylacetamide implements.
Zuvor wird N-Hydroxymethylacetamid durch Umsetzung etwa äquimolekularer Mengen Acetamid und Formaldehyd in Gegenwart einer katalytischen Menge Kaliumcarbonat hergestellt. Am einfachsten kann man eine 36- bis 38%ige wäßrige Formaldehydlösung verwenden. Die Mischung wird mehrere Minuten auf einem Dampfbad erhitzt, anschließend läßt man sie im allgemeinen mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man fügt dann Trockeneis zu zur Einführung von Kohlendioxid in die Lösung, worauf anschließend die Lösung im Vakuum auf einem Dampfbad bei etwa 40 bis 5O0C eingedampft wird. Der Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, beispielsweise in Aceton oder Methylenchlorid, die Lösung wird über einem geeigneten Trocknungsmittel getrocknet und das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird durch Kristallisation oder durch andere bekannte Methoden gereinigt.Before this, N-hydroxymethylacetamide is produced by reacting approximately equimolecular amounts of acetamide and formaldehyde in the presence of a catalytic amount of potassium carbonate. The easiest way to use a 36 to 38% aqueous formaldehyde solution. The mixture is heated on a steam bath for several minutes and then generally allowed to stand for several hours at room temperature. Is then added to dry ice to the introduction of carbon dioxide into the solution, whereupon the solution is subsequently evaporated in vacuo on a steam bath at about 40 to 5O 0 C. The residue is dissolved in a suitable solvent, for example acetone or methylene chloride, the solution is dried over a suitable drying agent and the solvent is evaporated off in vacuo. The residue is purified by crystallization or by other known methods.
Zur Umsetzung mit Cysteinhydrochlorid-monohydrat werden dieses und ein geringer Überschuß N-Hydroxymethylacetamid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol oder Äthanol, gelöst. Wie das folgende Reaktionsschema veranschaulicht, verläuft dieTo react with cysteine hydrochloride monohydrate, this and a small excess of N-hydroxymethylacetamide are used dissolved in a suitable solvent such as water, methanol or ethanol. As the The following reaction scheme illustrates how the
Reaktion wahrscheinlich über ein Zwischenprodukt;Reaction probably via an intermediate;
O H O HOH OH
Ii I Il +H· Il I·Ii I Il + H Il I
H3C-C-N-CH2OH * R-C-N=CH1 R-C-N=CH2 H 3 CCN-CH 2 OH * RCN = CH 1 RCN = CH 2
N-H® N -H®
CysteinCysteine
0 H COOH0 H COOH
Il I IIl I I
H3C-C- N-CH2- S -CH2-CHH 3 CC- N-CH 2 - S -CH 2 -CH
Die Lösung der Reaktionsteilnehmer wird in einem Eisbad gekühlt und unter Rühren gibt man eine Säure, wie konzentrierte Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, zu. Das Reaktionsgemisch wird dann vorzugsweise unter einer inerten Atmosphäre, wie Stickstoff, verschlossen und bei Raumtemperatur mehrere Stunden bis 1 oder 2 Tage stehengelassen. Das Arbeiten unter Stickstoff ist nicht unbedingt erforderlich, aber es führt im allgemeinen zu besseren Ausbeuten. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum bei etwa 40 bis 500C eingedampft Ein Lösungsmittel, wie Benzol oder Äthanol, wird zugegeben und anschließend abgedampft, um Spuren von Wasser zu entfernen. Der feste Rückstand wird aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol oder Äthanol, oder Mischungen aus Alkohol und wasserfreiem Äther, umkristallisiert. Das Produkt wird als Säureaddiiionssalz erhalten, das nach dem Ergebnis der Dünnschichtchromatographie kein Cystein enthält.The reactant solution is cooled in an ice bath and an acid such as concentrated hydrochloric acid, hydrobromic acid or sulfuric acid is added with stirring. The reaction mixture is then preferably sealed under an inert atmosphere such as nitrogen and allowed to stand at room temperature for several hours to 1 or 2 days. Working under nitrogen is not absolutely necessary, but it generally leads to better yields. The reaction mixture is evaporated in vacuo at about 40 to 50 ° C. A solvent, such as benzene or ethanol, is added and then evaporated in order to remove traces of water. The solid residue is recrystallized from a suitable solvent such as methanol or ethanol, or mixtures of alcohol and anhydrous ether. The product is obtained as an acid addition salt which, according to the result of thin layer chromatography, does not contain cysteine.
Das freie S-Acetamidomethylcystein kann erhalten werden, indem man das Säureadditionssalz mit wäßrigem Alkali behandelt bis die Lösung genau am isoelektrischen Punkt ist, oder indem man Silberoxid zufügt, um gegebenenfalls Silberchlorid auszufällen.The free S-acetamidomethylcysteine can be obtained by adding the acid addition salt with aqueous Treated alkali until the solution is exactly at the isoelectric point, or by adding silver oxide added to optionally precipitate silver chloride.
Beispiel 1
S-Acetamidomethylcystein-hydrochloridexample 1
S-acetamidomethylcysteine hydrochloride
127 g (1,43 Mol) N-Hydroxymethylacetamid und 228 g (1,3 Mol) Cysteinhydrochlorid-monohydrat werden in einem Rundkolben in 350 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird in einem Eisbad gekühlt, und es werden langsam unter Rühren 50 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zugegeben. Man leitet Stickstoff in den Kolben und läßt diesen, nachdem er verschlossen wurde, 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum bei 4O0C eingedampft. Man gibt absolutes Äthanol hinzu und dampft im Vakuum ein. Diese Operation wird mehrere Male wiederholt, um selbst Spuren Wasser zu entfernen. Der erhaltene weiße Niederschlag wird in Methanol bei Raumtemperatur gelöst. Zur Lösung wird wasserfreier Äther gegeben, bis diese trüb wird. Man läßt die Lösung 3 Tage bei 0 bis 5°C stehen. Nach dem Filtrieren und Waschen der erhaltenen Kristalle mit Äther wird das Produkt bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet, wobei man 150 g S-Acetamidomethylcystein-hydrochlorid, das bei 159 — 163°C unter Zersetzung schmilzt, erhält.127 g (1.43 mol) of N-hydroxymethylacetamide and 228 g (1.3 mol) of cysteine hydrochloride monohydrate are dissolved in 350 ml of water in a round bottom flask. The solution is cooled in an ice bath and 50 ml of concentrated hydrochloric acid are slowly added with stirring. Nitrogen is passed into the flask and, after it has been closed, left to stand for 2 days at room temperature. The reaction mixture is evaporated in vacuo at 4O 0 C. Absolute ethanol is added and the mixture is evaporated in vacuo. This operation is repeated several times to remove even traces of water. The white precipitate obtained is dissolved in methanol at room temperature. Anhydrous ether is added to the solution until it becomes cloudy. The solution is left to stand at 0 to 5 ° C. for 3 days. After filtering and washing the crystals obtained with ether, the product is dried at room temperature in vacuo, 150 g of S-acetamidomethylcysteine hydrochloride, which melts at 159-163 ° C. with decomposition, are obtained.
Die freie Base erhält man, indem man das Hydrochlorid in einer geringen Menge Wasser löst und dazu verdünntes Natriumhydroxid gibt, bis der isoelektrische Punkt erreicht ist. Das Lösungsmittel wird im NH2 The free base is obtained by dissolving the hydrochloride in a small amount of water and adding dilute sodium hydroxide until the isoelectric point is reached. The solvent is in the NH 2
Vakuum entfernt und der Rückstand aus Äthanol kristallisiert. Man kann auch ein Äquivalent Silberoxid zu der wäßrigen Lösung des Hydrochlorids zugeben. Das ausgefallene Silberchlorid wird abfiltriert, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Äthanol umkristallisiert. Die freie Base schmilzt bei 187°C.Removed vacuum and the residue crystallized from ethanol. One can also use an equivalent of silver oxide add to the aqueous solution of the hydrochloride. The precipitated silver chloride is filtered off, the The solvent was removed in vacuo and the residue was recrystallized from ethanol. The free base melts at 187 ° C.
B e i s ρ i e I 2B e i s ρ i e I 2
N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcysteinN-tert-butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcysteine
22,8 g (0,1 Mol) S-Acetamidomethylcystein-hydrochlorid werden in einem Dreihalskolben, der mit einem mechanischen Rührer und Kühler ausgerüstet ist, in 250 ml 5O°/oigem Dioxan (sauerstoffrei) gelöst. Man gibt 12 g Magnesiumoxid (0,3 Mol) hinzu und rührt die Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten. Man gibt 15.7 g (0,11 Mol) mehrfach destilliertes t.-Butoxycarbonylazid hinzu und rührt die Mischung 20 Stunden bei 45°C. Man läßt das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen und gibt 1 1 Wasser zu. Die wäßrige Mischung wird zweimal mit je 250 ml Äthylacetat gewaschen, in einem Eisbad gekühlt und mit 50%iger Zitronensäure auf pH 3 angesäuert. Die saure Lösung wird dann mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden zweimal mit 200 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in warmem Äthylacetat gelöst, dazu gibt man 2 Volumenteile Benzol. Beim Stehen bei Raumtemperatur kristallisiert das Produkt und wird nach dem Filtrieren mit Benzol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Einen zweiten und einen dritten Anteil erhält man, indem man Benzol zu den Filtraten hinzufügt und Impfkristalle zusetzt. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 11 g N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein, F. 110° bis 112° C.22.8 g (0.1 mole) of S-acetamidomethylcysteine hydrochloride are in a three-necked flask equipped with a mechanical stirrer and condenser, in 250 ml of 50% dioxane (oxygen-free) dissolved. 12 g of magnesium oxide (0.3 mol) are added and the mixture is stirred Mix at room temperature for 30 minutes. 15.7 g (0.11 mol) of repeatedly distilled t-butoxycarbonylazide are added and the mixture is stirred at 45 ° C. for 20 hours. The reaction mixture is allowed to come to room temperature cool and add 1 liter of water. The aqueous mixture is washed twice with 250 ml of ethyl acetate each time washed, cooled in an ice bath and acidified to pH 3 with 50% citric acid. The acidic solution is then saturated with sodium chloride and extracted with ethyl acetate. The extracts are made twice washed with 200 ml of a saturated sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated in vacuo. The residue is dissolved in warm ethyl acetate, in addition give 2 parts by volume of benzene. The product crystallizes and becomes on standing at room temperature washed with benzene after filtration and dried in vacuo. A second and a third Part is obtained by adding benzene to the filtrates and adding seed crystals. After drying 11 g of N-tert-butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcysteine are obtained in vacuo, F. 110 ° to 112 ° C.
N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcysteinhydroxysuccinimidester N-tert-butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcysteine hydroxysuccinimide ester
7,3 g (0,025 Mol) N-tert.-Butoxy-S-acetamidomethylcystein werden in einem trockenen Kolben in 100 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Der Kolben wird in einem Eisbad gekühlt, dazu gibt man 2,9 g (0,025 Mol) N-Hydroxysuccinimid. Sobald alles gelöst ist, werden 5,66 g (lO°/oiger Überschuß) Dieyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde in einem Eis/Salz-Bad gerührt und dann über Nacht bei 0 bis 50C stehengelassen. Der als Nebenprodukt gebildete Dicy-7.3 g (0.025 mol) of N-tert-butoxy-S-acetamidomethylcysteine are dissolved in 100 ml of peroxide-free tetrahydrofuran in a dry flask. The flask is cooled in an ice bath and 2.9 g (0.025 mol) of N-hydroxysuccinimide are added. As soon as everything has dissolved, 5.66 g (10% excess) dieyclohexylcarbodiimide are added. The mixture is stirred for 1 hour in an ice / salt bath and then left to stand at 0 to 5 ° C. overnight. The dicy-
clohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der erhaltene weiße Niederschlag wird in Äthylacetat gelöst, einmal mit 1 n-Natriumbicarbonat und dreimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft, wobei man 9 g eines amorphen Feststoffes erhält- Das Produkt wird in Chloroform gelöst und dazu wird Äther gegeben, bis die Lösung trüb wird. Beim Stehen über Nacht bei Raumtemperatur kristallisiert N-tcrL-Butoxycarbonyl-S-acctamidomethyl-hydroxysuccinimidester aus. Die Analyse zeigt ein Produkt der Zusammensetzung C15H23N3O7S. Der Schmelzpunkt ist 106 bis 1080C: die Ausbeute beträgt 80% d. Th.The clohexylurea is filtered off and the filtrate is evaporated in vacuo. The white precipitate obtained is dissolved in ethyl acetate, washed once with 1N sodium bicarbonate and three times with saturated sodium chloride and then dried over sodium sulfate. The solvent is evaporated in vacuo to give 9 g of an amorphous solid. The product is dissolved in chloroform and ether is added until the solution becomes cloudy. On standing overnight at room temperature, N-tcrL-butoxycarbonyl-S-acctamidomethyl-hydroxysuccinimide ester crystallizes out. The analysis shows a product with the composition C15H23N3O7S. The melting point is 106 to 108 ° C.: the yield is 80% of theory. Th.
Claims (1)
N-tert-Butoxyqarbonyl-S-acetamidomethylcystein und1. S-acetarnidomethylcysteine,
N-tert-Butoxyqarbonyl-S-acetamidomethylcysteine and
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US65866567A | 1967-08-07 | 1967-08-07 | |
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Publications (3)
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