DE1767498A1

DE1767498A1 - Method for obtaining L-asparaginase

Info

Publication number: DE1767498A1
Application number: DE19681767498
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr Arens; Klaus Dr Bauer; Eckart Dr Irion; Wilfried Dr Kaufmann; Erich Dr Rauenbusch; Otto Dr Wagner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1968-05-16
Filing date: 1968-05-16
Publication date: 1971-09-09

Description

Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase L-Asparaginase ist bekannt. Sie kommt in Escherichia coli intrazellulär vor /-H. A. Campbell, L. T. Mashburn, E.A. Boyse L.J. Old, Biochemistry 6 (1967), Seiten 721 bis 730, hier Weitere Literaturjund wurde auf folgende Weise aus der Zellmasse von IIE.-coli Bll = E. coli ATCC 11303 gewonnen: Freisetzen des Enzyms durch Zertrümmerung der Bakterienzellen mit Ultraschall oder Zermahlen mit Aluminiumoxyd, Beseitigung von Zelltrümmern und Nueleinsäuren durch Pällung mit Manganchlorid und anschließendes Zentrifugieren, Aussalzen des Rohenzyme aus der überstehenden Lösung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und weitere Reinigung durch Chromatographie an DEAE-Zelluloseaäulen.Method for obtaining L-asparaginase L-asparaginase is known. It occurs intracellularly in Escherichia coli / -H. A. Campbell, LT Mashburn, EA Boyse LJ Old, Biochemistry 6 (1967), pages 721 to 730, here further literature and was obtained from the cell mass of IIE.-coli BIl = E. coli ATCC 11303 in the following way: release of the enzyme by breaking up the bacterial cells with ultrasound or grinding with aluminum oxide, removing cell debris and nucleic acids by peeling with manganese chloride and then centrifuging, salting out the crude enzyme from the supernatant solution with ammonium sulfate, dialysis and further purification by chromatography on DEAE cellulose columns.

Diese Arbeitsmethoden sind jedoch für eine technische Gewinnung des Enzyms nicht geeignet.However, these working methods are for a technical extraction of the Enzyme not suitable.

Es wurde nun gefunden, daß L-Asparaginase in technischem Maßstab unter Anwendung des folgenden Verfahrens gewonnen werden kann: Nach beendetem Bakterienzüchtung wird eine organische Base mit einem Molekulargewicht über 1000 oder deren Salz zur Kulturbrühe gegeben, wodurch die Zellen ausgeflockt und leicht zentrifugierbar werden. Nach Resuspension der Zellen in Wasser werden diese durch Zugabe von Aceton erneut ausgefällt. Dabei werden die Zellen aufgeschlossen und so verändert, daß sich die gebildete L-Asparaginase im nächsten Schritt mit Wasser herauslösen läßt. Die Zellmasse wird abzentrifugiert und in Wasser suspendiert, wobei das Enzym in Lösung geht. Aus dieser Suspension werden durch Zugabe einer der oben genannten Basen die extrahierten Zellen, Nucleinsäuren und Ballastproteine ausgefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Aus der überstehenden wässrigen Lösung kann L-Asparaginase durch Zugabe von viel Aceton gefällt werden. Statt Aceton lassen sich zum Aufschluß der Zellen und zur Ausfällung der L-Asparaginase auch andere mit Wasser mischbare oder beschränkt mischbare organische Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, Methyläthylketon, Dimethylaulfoxyd, verwenden.It has now been found that L-asparaginase can be obtained on an industrial scale using the following process: After bacterial cultivation has ended, an organic base with a molecular weight of over 1000 or its salt is added to the culture broth, whereby the cells are flocculated and easily centrifuged. After resuspending the cells in water, they are precipitated again by adding acetone. The cells are disrupted and modified in such a way that the L-asparaginase formed can be dissolved out with water in the next step. The cell mass is centrifuged off and suspended in water, the enzyme going into solution. The extracted cells, nucleic acids and ballast proteins are precipitated from this suspension by adding one of the abovementioned bases and removed by centrifugation. L-asparaginase can be precipitated from the supernatant aqueous solution by adding a large amount of acetone. Instead of acetone, other water-miscible or restricted-miscible organic solvents, such as methanol, ethanol, isopropanol, methyl ethyl ketone, dimethyl sulfoxide, can also be used to disrupt the cells and precipitate the L-asparaginase.

Als Organismus wurde Escherichia coli ATCC 9637 verwendet. Es sind jedoch praktisch auch alle anderen Escherichia coli-Stämme geeignet, z. B. Escherichia coli ATCC 4157, 8677, 8739, 97239 105369 105869 111059 111269 121429 12408, 12911, 136769 137069 13762, 14948. Gegenüber den bisher bekannten Verfahren hat das erfindungegemäße Verfahren überraschenderweise den großen Vorteill L-Asparaginase in praktisch pyrogenfreiem Zustand zu liefern.Escherichia coli ATCC 9637 was used as the organism. However, practically all other Escherichia coli strains are also suitable, e.g. B. Escherichia coli ATCC 4157, 8677, 8739, 97239 105369 105869 111059 111269 121429 12408, 12911, 136769 137069 13762, 14948. Compared to the previously known method, the inventive method surprisingly has the great advantage of delivering L-asparaginase in a practically pyrogen-free state.

Die L-Asparaginase-Bestimmung der Roh-L-Asparaginase erfolgt nach der Methode aus Cancer Research 26 (1966), Seiten 2013 bis 2017. The L-asparaginase determination of the crude L-asparaginase is carried out according to the method from Cancer Research 26 (1966), pages 2013 to 2017.

Die erfindungsgemäße gewonnene L-Asparaginase soll als Arzneimittel gegen solche Tumoren verwendet werden, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin als Wuchestoff benötigen. Vor einer solchen Verwendung ist zweckmäßig, die erfindungsgemäß gewonnene L-Asparaginase weiter anzureichern bzw. zu reinigen. Beispiel Bei der im nachstehenden als "Basel' bezeichneten Verbindung handelt es sich um ein hochmolekulares Produkt der allgemeinen Formel mit einem Molekulargewicht über 1000, die durch Umsetzung von Di-(3-amino-n-propyl)-methylamin mit Epichlorhydrin entsteht.The L-asparaginase obtained according to the invention is intended to be used as a medicament against those tumors which require L-asparagine as a growth substance for their growth. Before such use, it is advisable to further enrich or purify the L-asparaginase obtained according to the invention. Example The compound referred to below as "Basel" is a high molecular weight product of the general formula with a molecular weight of over 1000, which is produced by the reaction of di- (3-amino-n-propyl) -methylamine with epichlorohydrin.

Arbeitsgang 1 10 %ige Maisquellwasserlösung (bezogen auf Trockenaubatanz) wird mit 2 n Kalilauge auf pH 7,0 eingestellt, 20 Minuten auf 120 0 C erhitzt und,nach Abkühlung in der Uberlaufzentrifuge oder durch Seitz-Filtration geklärt. 30 Liter dieser klaren Maisquellwasserlösung werden mit 170 Litern Leitungswasser verdünnt. Es folgt dann ein Zusatz von 0,6 kg Natriumlactat, 0,3 kg L-Glutaminsäure-Na, 0,3 kg Glykokoll und 0,4 kg Ammoniumsulfat. Operation 1 10 % corn steep water solution (based on dry matter) is adjusted to pH 7.0 with 2N potassium hydroxide solution, heated to 120 ° C. for 20 minutes and, after cooling in the overflow centrifuge or clarified by Seitz filtration. 30 liters of this clear corn steep water solution are diluted with 170 liters of tap water. This is then followed by the addition of 0.6 kg of sodium lactate, 0.3 kg of L-glutamic acid Na, 0.3 kg of glycocolla and 0.4 kg of ammonium sulfate.

Die erhaltene Nährlösung wird in einem Fermenter 40 Minuten bei 110 0 C sterilisiert, anschließend abgekühltund dann mit 500 ccm einer 18 Stunden bei 30 0 C gewachsenen Schüttelkultur von Escherichia coli ATCC 9637 in einer Nährlöaung, bestehend aus 1,5 % Hefeextrakt und 0,5 % Natriumlacetat, pH 7,0 beimpft. Der Fermentationsanaatz wird bei 30 0 C mit 80 Litern Luft/Minute bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet. Arbeitsgang 2 Nach einer Wachstumszeit von 16 bis 18 Stunden - wenn das pH der Kultur auf etwa 8,8 angestiegen ist- wird die Kulturbrühe auf etwa 20 0 C abgekühlt. Die Bakterien, welche L-Asparaginase enthalten, werden durch einen Zusatz von 1,0 Liter 2,5%ige "Basel'-Lösung ausgeflockt, in der Überlaufzentrifuge abgetrennt und zu einem Volumen von 20 Litern mit Leitungswasser reauspendiert. Arbeitsgang 3 In die in Arbeitsgang 2 erhaltene Zellauspension läßt man unter Rühren 80 Liter Aceton einlaufen, setzt 20 cem 2,5%ige "Basel'-Löeung hinzu, trennt die ausgefällten Bakterien in der Überlaufzentrifuge ab und reauspendiert die Zellmaese wiederum zu 20 Litern mit Leitungewaaser. Arbeitsgang 4 Zur Extraktion der L-Asparaginase aus den Bakterienzellen wird die in Arbeitsgang 3 hergestellte Suapension 4,5 Stunden bei 30 0 2 gerührt. Während dieser Zeit wird das pH durch Zusätze von 1 n Natronlauge bzw. 10%iger Essigsäure bei pH 7,5 bis 7,8 gehalten. Anschließend wird auf etwa 20 0 C abgekühlt. Arbeitsgang 5 In die nach Arbeitsgang 4 extrahierte Zelleuopension läßt man unter Rühren 2,5 Liter 295%ige "Base"-Lößung einlaufen und trennt den entstandenen starken Niederschlag, der aus extrahierten Bakterien und unlöslichem "Base"-Nueleinsäure-Proteinkomplex besteht, in der Überlaufzentrifuge ab. Der Niederschlag wird verworfen. Man erhält etwa 17 Liter einer klaren Lösung, in der sich neben anderen Zellinhaltentoffen die L-Aoparaginaae befindet.The nutrient solution obtained is sterilized in a fermenter for 40 minutes at 110 ° C. , then cooled and then mixed with 500 ccm of a shaking culture of Escherichia coli ATCC 9637 grown for 18 hours at 30 ° C. in a nutrient solution consisting of 1.5% yeast extract and 0.5% % Sodium acetate, pH 7.0 inoculated. The fermentation batch is aerated at 30 ° C. with 80 liters of air / minute at 150 revolutions of the stirrer per minute. Operation 2 After a growth time of 16 to 18 hours - when the pH of the culture has risen to about 8.8 - the culture broth is cooled to about 20 ° C. The bacteria containing L-asparaginase are, by an addition of 1.0 liter of 2.5% "flocculated Basel' solution separated in the centrifuge overflow and reauspendiert to a volume of 20 liters with tap water. In the step 3 in Cell suspension obtained in step 2 is allowed to run in 80 liters of acetone with stirring, 20 cem 2.5% "Basel" solution is added, the precipitated bacteria are separated off in the overflow centrifuge and the cell debris is again resuspended to 20 liters with tap water. Operation 4 To extract the L-asparaginase from the bacterial cells, the suapension produced in operation 3 is stirred at 30 ° 2 for 4.5 hours. During this time the pH is maintained by addition of 1N sodium hydroxide solution and 10% acetic acid at pH 7.5 to 7.8. It is then cooled to about 20 ° C. Operation 5 In the cell suspension extracted according to operation 4, 2.5 liters of 295% "base" solution are run in with stirring and the resulting strong precipitate, which consists of extracted bacteria and insoluble "base" -nuelic acid protein complex, is separated Overflow centrifuge. The precipitate is discarded. About 17 liters of a clear solution are obtained, in which the L-Aoparaginaae are found alongside other cell contents.

Arbeitsgang 6 Aus der in Arbeitsgang 5 gewonnenen Lösung wird Roh-L-Asparaginase durch Zusatz von 68 Litern Aceton ausgefällt. Die entstandene Fällung wird isoliert, mit Aceton nachgewaschen und im Vakuum bei 25 bis 30 0 C getrocknet. Man erhält etwa 100 g Roh-L-Aoparaginase mit einer L-Asparaginase-Aktivität von etwa 4,0 internationalen Einheiten pro mg. Operation 6 Crude L-asparaginase is precipitated from the solution obtained in operation 5 by adding 68 liters of acetone. The resulting precipitate is isolated, washed with acetone and dried at 25 to 30 ° C. in vacuo. About 100 g of crude L-aoparaginase with an L-asparaginase activity of about 4.0 international units per mg are obtained.

Claims

Claims 1. A method for obtaining L-asparaginase, characterized in that after culturing Escherichia coli cells, the grown cells are precipitated with organic bases with a molecular weight of over 1000 or their salts, the isolated cells are opened up with acetone and the cells with water extracted, extracted cells, nucleic acids and ballast proteins removed by precipitation with organic bases with a molecular weight of more than 1000 or their salts, and L-Asparaginaae is precipitated from the supernatant solution with acetane and isolated. 2. The method according to claim 1, characterized in that cells from Eacherichia coli ATCC 9637 are used. 3. The method according to claim 1, characterized in that other water-miscible or restricted-miscible organic solvents are used for disrupting the cells and for precipitating the asparaginase instead of acetone.