DE1673047B1 - LABORATORY REAGENT IN DRY FORM FOR THE DETERMINATION OF ALKALINE OR ACID PHOSPHATASE - Google Patents
LABORATORY REAGENT IN DRY FORM FOR THE DETERMINATION OF ALKALINE OR ACID PHOSPHATASEInfo
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Description
2525th
Die Erfindung betrifft ein Laboratoriumsreagenz in trockener Form zur Bestimmung von alkalischer oder saurer Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten, entheltend ein Salz der p-Nitrophenylphosphorsäure, einen Puffer, der den pH-Wert des Reagenz nach Auflösen in Wasser zwischen 4 und 11 hält, ein Magnesiumsalz und gegebenenfalls übliche Zusatzstoffe.The invention relates to a laboratory reagent in dry form for the determination of alkaline or acid phosphatase in biological fluids, containing a salt of p-nitrophenylphosphoric acid, a buffer that keeps the pH of the reagent between 4 and 11 after dissolving in water, a magnesium salt and, if necessary, customary additives.
In dem Buch »Methoden der enzymatischen Analyse« von H. U. B e r g m e y e r, Verlag Chemie, 1. Auflage, 1962, S. 783, sind die Reagenzien und die Herstellung der Lösungen zur Phosphatasebestimmung unter Verwendung des Natriumsalzes der p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat beschrieben. Die Phosphatasebestimmung kann auch mit Tetracolamin-Phenolphthalein-Phosphat als Substrat erfolgen (vgl. »Die Naturwissenschaften«, Jg. 40, 1953, Heft 17, S. 460 und 461). In der USA.-Patentschrift 3 002 893 ist die Bestimmung der sauren Phosphatase mit einem Salz des a-Naphthylphosphats beschrieben, wobei die Laboratoriumsreagenzien in Form der Trockenpräparate Polyäthylenglykol enthalten können. Aus den in der USA.-Patentschrift 3 069 330 beschriebenen Laboratoriumsreagenzien in trockener Form zur Bestimmung der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase ist ein Lactosezusatz bekannt.In the book "Methods of enzymatic analysis" by H. U. Ber g m e y e r, Verlag Chemie, 1st edition, 1962, p. 783, are the reagents and the preparation of the solutions for phosphatase determination using the sodium salt of p-nitrophenylphosphoric acid as a substrate. The phosphatase determination can also be carried out with tetracolamine-phenolphthalein-phosphate as substrate (See "Die Naturwissenschaften", vol. 40, 1953, issue 17, pp. 460 and 461). In the U.S. Patent 3 002 893 describes the determination of acid phosphatase with a salt of a-naphthyl phosphate, the laboratory reagents in the form of dry preparations may contain polyethylene glycol. From the laboratory reagents described in US Pat. No. 3,069,330 in drier Form for the determination of the glutamate oxaloacetate transaminase a lactose addition is known.
Im allgemeinen wird das Dinatriumsalz der p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat zur Phosphatasebestimmung verwendet. Die Stabilität dieser Verbindung in trockener Form ist jedoch begrenzt.In general, the disodium salt of p-nitrophenyl phosphoric acid is used used as a substrate for phosphatase determination. The stability of this connection however, in dry form is limited.
Ferner wird die Bestimmung der alkalischen Phosphatase besonders durch Schwierigkeiten bei der Ablesung der Geschwindigkeitsänderungen beeinträchtigt. Bisher verfügbare Reagenzien zur Phosphatasebestimmung ergaben nur einen extrem engen Bereich zwischen normalen und abnormen Werten der Enzymeinheiten. Daher war diese Bestimmung häufig mit Fehlern behaftet.Furthermore, the determination of the alkaline phosphatase is made particularly difficult by reading it changes in speed. Previously available reagents for the determination of phosphatase gave only an extremely narrow range between normal and abnormal levels of enzyme units. As a result, this provision was often flawed.
Aufgabe der Erfindung war es daher, das Laboratoriumsreagenz der eingangs genannten Art derart zu verbessern, daß es eine erhöhte Stabilität aufweist und somit eine genauere Bestimmung der alkalischen Phosphatase als bisher ermöglicht. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Laboratoriumsreagenz ein Aminsalz der p-Nitrophenylphosphorsäure und ein Polyol mit 3 bis 6 C-Atomen und 3 bis 6 Hydroxylgruppen oder Saccharose enthält.The object of the invention was therefore to provide the laboratory reagent of the type mentioned at the outset in this way improve that it has an increased stability and thus a more accurate determination of the alkaline Phosphatase than before. This object is achieved according to the invention in that the laboratory reagent contains an amine salt of p-nitrophenyl phosphoric acid and a polyol with 3 to 6 carbon atoms and 3 to 6 hydroxyl groups or sucrose.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Laboratoriumsreagenz in trockener Form zur Bestimmung von alkalischer oder saurer .Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten, enthaltend ein Salz der p-Nitrophenylphosphorsäure, einen Puffer, der den pH-Wert des Reagenz nach Auflösen in Wasser zwischen 4 und 11 hält, ein Magnesiumsalz und gegebenenfalls übliche Zusatzstoffe, das durch ein Aminsalz der p-Nitrophenylphosphorsäure und einen Gehalt eines Polyols mit 3 bis 6 C-Atomen und 3 bis 6 Hydroxylgruppen oder von Saccharose gekennzeichnet ist.The invention thus relates to a laboratory reagent in dry form for determination of alkaline or acidic phosphatase in biological fluids, containing a salt of p-nitrophenylphosphoric acid, a buffer that adjusts the pH of the reagent after dissolving in water between 4 and 11 holds, a magnesium salt and, if necessary, customary additives that are replaced by an amine salt of p-nitrophenyl phosphoric acid and a content of a polyol with 3 to 6 carbon atoms and 3 to 6 hydroxyl groups or is characterized by sucrose.
Es wurde festgestellt, daß Salze der p-Nitrophenylphosphorsäure mit organischen Aminen dem Dinatriumsalz bei weitem vorzuziehen sind, da sie eine höhere Stabilität aufweisen. Am geeignetsten und daher besonders bevorzugt ist wegen seiner besseren Löslichkeit das Tris-(hydroxymethyl)-aminomethansalz der p-Nitrophenylphosphorsäure; an zweiter Λ Stelle folgt das Dicyclohexylaminsalz. ™It has been found that salts of p-nitrophenylphosphoric acid with organic amines are by far preferable to the disodium salt because they are more stable. The most suitable and therefore particularly preferred, because of its better solubility, is the tris (hydroxymethyl) aminomethane salt of p-nitrophenylphosphoric acid; in the second Λ position follows the dicyclohexylamine salt. ™
Die in dem erfindungsgemäßen Laboratoriumsreagenz verwendeten Aminsalze sind sehr stabil.The amine salts used in the laboratory reagent according to the invention are very stable.
Erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, daß eine bemerkenswerte Steigerung der Empfindlichkeit der üblichen Phosphatasebestimmung eintritt, wenn das Reagenz neben den genannten Salzen der p-Nitrophenylphosphorsäure ein Polyol mit 3 bis 6 C-Atomen und 3 bis 6 Hydroxylgruppen oder Saccharose enthält. Diese Steigerung der Umsetzungsgeschwindigkeit macht wenigstens einen Faktor 2 oder mehr aus, ohne daß eine Änderung in der Kinetik der nullten Ordnung beobachtet wird.According to the invention it was also found that a remarkable increase in the sensitivity of The usual determination of phosphatase occurs when the reagent is used in addition to the salts of p-nitrophenylphosphoric acid mentioned contains a polyol with 3 to 6 carbon atoms and 3 to 6 hydroxyl groups or sucrose. This increase in implementation speed is at least a factor of 2 or more without that a change in the zero order kinetics is observed.
Spezielle Beispiele solcher Polyole sind Glycerin, reduzierte Aldosen, wie Erythrit und Ribit, und reduzierte Ketosen, wie Sorbit und Inosit. Mannit ist ein besonders bevorzugtes Polyol.Specific examples of such polyols are glycerin, reduced aldoses such as erythritol and ribitol, and reduced Ketoses, such as sorbitol and inositol. Mannitol is a particularly preferred polyol.
Die genannten Polyole und Saccharose scheinen in der Enzymreaktion aktiv zu sein und darüber hinaus die Stabilität der Substrate zu erhöhen. Es hat sich gezeigt, daß die Menge dieser Zusätze über einen ^ weiten Bereich variieren kann, da die Steigerung der \ Empfindlichkeit annähernd proportional der bei der Bestimmung vorhandenen Menge der Polyole oder Saccharose ist. Die obere Grenze scheint von der Löslichkeit der jeweiligen Verbindung in Wasser bei der Temperatur der Bestimmung abzuhängen. Im allgemeinen werden die Bestimmungen bei etwa 37° C durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß durch Zusätze von nur wenigen Milligramm der genannten Verbindungen zu jedem Millimeter wasserverdünntem, mit der Probe zu vermischendem Reagenz bis hinauf zur bekannten Löslichkeitsgrenze dieser Verbindungen brauchbare Resultate erzielt werden. Mannit kann in dem wasserverdünnten Reagenz in Mengen von 25 bis 180 mg pro Milliliter enthalten sein.The polyols and sucrose mentioned appear to be active in the enzyme reaction and, moreover, to increase the stability of the substrates. It has been found that the amount of these additives may vary over a wide range ^, because the increase of the \ sensitivity is approximately proportional to the existing amount of the polyols in the determination or sucrose. The upper limit seems to depend on the solubility of the respective compound in water at the temperature of the determination. In general, the determinations are carried out at about 37.degree. It has been found that by adding only a few milligrams of said compounds to every millimeter of water-diluted reagent to be mixed with the sample up to the known solubility limit of these compounds, useful results are achieved. Mannitol can be contained in the water-diluted reagent in amounts of 25 to 180 mg per milliliter.
Zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase werden als Puffer Alkalicarbonate und -bicarbonate verwendet. Als Magnesiumsalz wird vorzugsweise Magnesiumasparaginat oder -glutamat verwendet. Das Laboratoriumsreagenz kann in Einheitsmengen in Folien oder in Kapseln in den Handel gebracht werden. Jede dieser Einheiten enthält eine zur Durchführung einer Bestimmung ausreichende standardisierte Menge des erfindungsgemäßen Reagenz mit festgelegter Aktivität.Alkaline carbonates and bicarbonates are used as buffers to determine the alkaline phosphatase. Magnesium asparaginate or glutamate is preferably used as the magnesium salt. The laboratory reagent can be marketed in unit quantities in foils or in capsules. Every of these units contains a standardized amount of the sufficient to carry out a determination Reagent according to the invention with a fixed activity.
Das Reagenz kann daher unmittelbar in einer Standardmenge Wasser gelöst werden. Dieses flüssige Reagenz wird dann mit einer Probe der biologischen Flüssigkeit gemischt. Das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Enzymreaktion ist eine Funktion der Menge und der Aktivität der zu bestimmenden Phosphatase.The reagent can therefore be dissolved immediately in a standard amount of water. This liquid The reagent is then mixed with a sample of the biological fluid. The extent and the speed the enzyme reaction is a function of the amount and activity of the to be determined Phosphatase.
Das erfindungsgemäße Reagenz wird vorzugwweise in Form einer wäßrigen Lösung verwendet.The reagent according to the invention is preferably used in the form of an aqueous solution.
Bei der Enzymreaktion reagiert das Substrat mit der unbekannten Enzymmenge. Die Menge des Substrats, die in dem Reagenz enthalten ist, reicht zur Umsetzung des Substrats mit konstanter Geschwindigkeit aus. Der einzige Faktor, von dem die Reaktionsgeschwindigkeit der Bestimmung abhängig ist, ist daher die Menge oder die Aktivität des zu bestimmenden Enzyms.In the enzyme reaction, the substrate reacts with the unknown amount of enzyme. The amount of substrate contained in the reagent is sufficient to react the substrate at a constant rate the end. The only factor on which the reaction speed of the determination depends, is therefore the amount or the activity of the enzyme to be determined.
Bei der Enzymreaktion wird die Esterbindung des als Substrat dienenden Salzes der p-Nitrophenylphosphorsäure gespalten, wobei p-Nitrophenol und Phosphorsäure bzw. ein Salz der Phosphorsäure entsteht. In the enzyme reaction, the ester bond of the salt of p-nitrophenylphosphoric acid, which is used as the substrate, becomes split, with p-nitrophenol and phosphoric acid or a salt of phosphoric acid.
• Die Absorptionen von p-Nitrophenylphosphorsäure und p-Nitrophenol liegen bei verschiedenen Wellenlängen. Durch Messung der optischen Dichte bei einer bestimmten Wellenlänge kann so die umgewandelte Menge des Substrats bestimmt werden. Durch Messung der Änderung oder der Geschwindigkeit der Änderung der optischen Dichte bei der bestimmten Wellenlänge kann das Ausmaß oder die Geschwindigkeit der Enzymreaktion bestimmt werden. • The absorptions of p-nitrophenyl phosphoric acid and p-nitrophenol are at different wavelengths. By measuring the optical density at a certain wavelength, the converted amount of the substrate can thus be determined. By measuring the change or the rate of change in optical density at the particular Wavelength can be used to determine the extent or the speed of the enzyme reaction.
Es ist bekannt, daß Salze von p-Nitrophenylphosphorsäure im Bereich von 300 bis 415 πΐμ lichtdurchlässig sind, während p-Nitrophenol im Bereich von 390 bis 420 ηΐμ absorbiert. In alkalischer Lösung liegt das Absorptionsmaximum bei 405 πΐμ. Die Änderung der optischen Dichte der Testlösung wird deshalb stets in dem vorstehend genannten Bereich gemessen. It is known that salts of p-nitrophenyl phosphoric acid translucent in the range from 300 to 415 πΐμ are, while p-nitrophenol is absorbed in the range from 390 to 420 ηΐμ. In an alkaline solution the absorption maximum is 405 πΐμ. The change the optical density of the test solution is therefore always measured in the above-mentioned range.
p-Nitrophenylphosphorsäure kann nach jedem üblichen Verfahren, z. B. durch Behandeln eines Alkalimetallsalzes dieser Verbindung mit einem Kationenaustauscher in der H+-Form, hergestellt werden. p-nitrophenyl phosphoric acid can be prepared by any conventional method, e.g. B. by treating an alkali metal salt of this compound with a cation exchanger in the H + form.
Im allgemeinen können die Aminsalze der p-Nitrophenylphosphorsäure durch Umsetzung des entsprechenden Amins mit einem Alkalimetallsalz der p-Nitrophenylphosphorsäure hergestellt werden, wobei das Aminsalz durch Konzentrieren oder durch Zusatz von organischem Lösungsmittel zum Reaktionsgemisch ausgefällt werden kann.In general, the amine salts of p-nitrophenyl phosphoric acid by reacting the corresponding amine with an alkali metal salt of p-nitrophenylphosphoric acid, wherein the amine salt by concentrating or by adding organic solvent to the reaction mixture can be precipitated.
Ferner kann freie p-Nitrophenylphosphorsäure mit einer Lösung des entsprechenden Amins neutralisiert werden.Furthermore, free p-nitrophenyl phosphoric acid can be neutralized with a solution of the corresponding amine will.
Das Aminsalz kann durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels ausgefällt bzw. die Lösung kann bis zur einsetzenden Kristallisation eingedampft werden. Das erhaltene Aminsalz der p-Nitrophenylphosphorsäure wird gewaschen und getrocknet.The amine salt can be precipitated by adding an organic solvent or the solution can be evaporated until the onset of crystallization. The amine salt of p-nitrophenyl phosphoric acid obtained is washed and dried.
Die Art des im erfindungsgemäßen Laboratoriumsreagenz verwendeten Aminsalzes hängt ab von seiner Zugänglichkeit und seinem Vermögen, p-Nitrophenylphosphorsäure unter den Testbedingungen zu stabilisieren. The type of the laboratory reagent according to the invention Amine salt used depends on its accessibility and its ability to p-nitrophenylphosphoric acid to stabilize under the test conditions.
Als Salze der p-Nitrophenylphosphorsäure werden erfindungsgemäß Salze mit aliphatischen oder acyclischen Aminen oder mit Hydroxyalkyl-, Aryl- oder Aralkylaminen verwendet.According to the invention, salts with aliphatic or aliphatic acids are used as salts of p-nitrophenylphosphoric acid acyclic amines or used with hydroxyalkyl, aryl or aralkyl amines.
Beispiele für verwendbare aliphatische Amine sind die Monoalkyl-, Dialkyl- und Trialkylamine mit 1 bis 18 C-Atomen, vorzugsweise mit 1 bis 6 C-Atomen, im Alkylrest. Spezielle Beispiele sind Methylamin, Äthylamin, Tributylamin und Dipropylamin.Examples of aliphatic amines that can be used are the monoalkyl, dialkyl and trialkyl amines with 1 up to 18 carbon atoms, preferably with 1 to 6 carbon atoms, in the alkyl radical. Specific examples are methylamine, Ethylamine, tributylamine and dipropylamine.
Beispiele für verwendbare alicyclische Amine sind Monocyclohexylamin, Dicyclohexylamin und Tricyclohexylamin. Examples of usable alicyclic amines are monocyclohexylamine, dicyclohexylamine and tricyclohexylamine.
Die verwendbaren Hydroxyalkylamine enthalten 2 bis 12, vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome im Alkylrest, z. B. Monoäthanolamin und Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. The hydroxyalkylamines which can be used contain 2 to 12, preferably 2 to 6, carbon atoms Alkyl radical, e.g. B. monoethanolamine and tris (hydroxymethyl) aminomethane.
Die verwendbaren Aralkylamine enthalten 7 bis 15 C-Atome, vorzugsweise 7 bis 9 C-Atome. Ein Beispiel ist Monobenzylamin.The aralkylamines that can be used contain 7 to 15 carbon atoms, preferably 7 to 9 carbon atoms. An example is monobenzylamine.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.
p-Nitrophenylphosphorsäure-dicyclohexylaminsalzp-Nitrophenylphosphoric acid dicyclohexylamine salt
Eine Lösung von 12,5 g reinstem Dinatrium-p-nitrophenylphosphat in 50 ml Wasser wird über eine Säule filtriert, die 125 ml Kationenaustauscher, mit SO3H-Gruppen als funktioneilen Gruppen, in der H+-Form enthält. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen. Das Säuleneluat wird mit 10 g Cyclohexylamin versetzt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck auf etwa 25 ml eingeengt und mit 400 ml Aceton versetzt. Die Mischung wird auf 00C abgekühlt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Der Niederschlag wird auf einem Filter abgesaugt, mit Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute: 8 g p-Nitrophenylphosphorsäure-dicyclohexylaminsalz. A solution of 12.5 g of the purest disodium p-nitrophenyl phosphate in 50 ml of water is filtered through a column which contains 125 ml of cation exchanger, with SO 3 H groups as functional groups, in the H + form. The column is washed with 200 ml of water. 10 g of cyclohexylamine are added to the column eluate. The solution is concentrated to about 25 ml under reduced pressure, and 400 ml of acetone are added. The mixture is cooled to 0 ° C. and kept at this temperature for 2 hours. The precipitate is filtered off with suction, washed with acetone and dried under reduced pressure to constant weight. Yield: 8 g of p-nitrophenylphosphoric acid dicyclohexylamine salt.
p-Nitrophenylphosphorsäure-tris-(hydroxymethyl)-aminomethansalz p-Nitrophenyl phosphoric acid tris (hydroxymethyl) aminomethane salt
Eine Lösung von 12,5 g reinstem Dinatrium-p-nitrophenylphosphat in 50 ml Wasser wird über eine Säule filtriert, die 125 ml Kationenaustauscher, mit SO3H-Gruppen als funktionellen Gruppen, in der H+-Form enthält. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen. Das Säuleneluat wird mit 3 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Lösung bis zum pH 8,5 versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf 50 ml konzentriert und unter Rühren und Kühlen mit einer Mischung von 200 ml Methanol und 200 ml Aceton versetzt. Nach 24stündigem Stehen bei 4° C wird das kristalline Rohprodukt abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Zum Umkristallisieren werden 10 g Rohprodukt in 30 ml Wasser gelöst und mit 100 ml Methanol und 100 ml Aceton versetzt. Nach 4stündigem Kühlen wird der Niederschlag abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 8,5 gp-Nitrophenylphosphorsäure - tris - (hydroxymethyl) - aminomethansalz. A solution of 12.5 g of the purest disodium p-nitrophenyl phosphate in 50 ml of water is filtered through a column which contains 125 ml of cation exchanger, with SO 3 H groups as functional groups, in the H + form. The column is washed with 200 ml of water. The column eluate is mixed with 3 m tris (hydroxymethyl) aminomethane solution up to pH 8.5. The resulting solution is concentrated to 50 ml, and a mixture of 200 ml of methanol and 200 ml of acetone is added with stirring and cooling. After standing for 24 hours at 4 ° C., the crystalline crude product is filtered off and dried at room temperature under reduced pressure. For recrystallization, 10 g of crude product are dissolved in 30 ml of water, and 100 ml of methanol and 100 ml of acetone are added. After cooling for 4 hours, the precipitate is filtered off and dried at room temperature under reduced pressure. Yield: 8.5 g of p-nitrophenylphosphoric acid - tris - (hydroxymethyl) - aminomethane salt.
Gemäß Beispiel 1 werden die nachstehend aufgeführten Amine umgesetzt, wobei die entsprechenden Salze der p-Nitrophenylphosphorsäure erhalten werden: According to Example 1, the amines listed below are reacted, with the corresponding Salts of p-nitrophenylphosphoric acid can be obtained:
J E405ZMm (Amin) zl£405/Min(Na2) JE 405 ZMm (amine) zl £ 405 / min (Na 2 )
200200
b) Die Gewichtsprozente an freiem p-Nitrophenol werden durch Lösen der Probe (100 mg) in 100 ml 0,0In-NaOH bestimmt. Falls unlösliches Material vorliegt, wird die Lösung filtriert. Durch Lösen von 10 mg p-Nitrophenol in 1000 ml 0,0In-NaOH wird eine Standardlösung hergestellt. Es wird die Extinktion jeder Lösung bei 405 πΐμ bestimmt.b) The percent by weight of free p-nitrophenol is determined by dissolving the sample (100 mg) in 100 ml 0.0In NaOH determined. If insoluble material is present, the solution is filtered. By A standard solution is prepared by dissolving 10 mg of p-nitrophenol in 1000 ml of 0.0 in NaOH. The absorbance of each solution is determined at 405 πΐμ.
Prozent freies p-Nitrophenol =Percent free p-nitrophenol =
der Probe Aktivität von p-Nitrophenylphosphorsäuresalzen in der Enzymreaktionof the sample activity of p-nitrophenylphosphoric acid salts in the enzyme reaction
Salze der p-NitrophenylphosphorsäureSalts of p-nitrophenyl phosphoric acid
Die Geschwindigkeit der p-Nitrophenolat-Freisetzung wird nach der Methode von A. A. B e s s e y, O. H. L ο u r y und M. J. B r ο c k, J. Biol. Chem., Bd. 164, (1946), S. 321, und L. A. B e s s e y und R. H. L ο ν e, J. Biol. Chem., Bd. 196 (1952), S. 175, verfolgt.The rate of p-nitrophenolate release is determined according to the method of A. A. B e s s e y, O. H. L o u r y and M. J. B r o c k, J. Biol. Chem., Vol. 164, (1946), p. 321, and L. A. B e s e y and R. H. L ο ν e, J. Biol. Chem., Vol. 196 (1952), p. 175, tracked.
Komponenten des ReagenzComponents of the reagent
a) Puffer - pH 10.2: 8 g Na2CO3 +2g NaHCO3 + JOO mg Magnesiumglutamat in 1 1 Wasser,a) Buffer - pH 10.2: 8 g Na 2 CO 3 + 2 g NaHCO 3 + JOO mg magnesium glutamate in 1 1 water,
b) Hylands abnormes Kontrollserum für klinische Chemie,b) Hyland's Abnormal Clinical Chemistry Control Serum,
c) p-Nitrophenylphosphorsäure-Aminsalzlösung, 0,03 m, oderc) p-nitrophenylphosphoric acid amine salt solution, 0.03 m, or
d) p-Nitrophenylphosphorsäure-Dinatriumsalz, 0,03 m (als Kontrolle).d) p-nitrophenylphosphoric acid disodium salt, 0.03 m (as a control).
BerechnungenCalculations
a) Prozentuale relative Umsetzungsgeschwindigkeit der Aminsalze von p-Nitrophenylphosphorsäurea) Percentage relative conversion rate of the amine salts of p-nitrophenylphosphoric acid
Dinatrium Disodium
Dinatrium Disodium
Methylamin Methylamine
Dimethylamin Dimethylamine
Trimethylamin Trimethylamine
Monoäthanolamin Monoethanolamine
Morpholin Morpholine
Monobenzylamin Monobenzylamine
Furfurylamin Furfurylamine
Anilinaniline
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Tris (hydroxymethyl) aminomethane
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, trockenTris (hydroxymethyl) aminomethane, dry
Dicyclohexylamin Dicyclohexylamine
Geschwindigkeit speed
100100
104104
107107
105105
8484
9898
8686
5050
6666
9696
9191
81 10481 104
Prozent freiesPercent free
p-Nitrophenolp-nitrophenol
vor der Zugabebefore the addition
des Serumsof the serum
0,04 0.07 0,08 0,09 0,10 0.05 0,12 0,06 0,04 0.040.04 0.07 0.08 0.09 0.10 0.05 0.12 0.06 0.04 0.04
0,030.03
0.04 0,040.04 0.04
B eis piel 4Example 4
Freisetzung von p-Nitrophenol aus p-Nitrophenylphosphorsäuresalzen unter verschiedenen Bedingungen: Release of p-nitrophenol from p-nitrophenylphosphoric acid salts under different conditions:
Verfahrenprocedure
E405 des StandardsE 405 of the standard
a) Von jedem Salz werden drei Proben zu je 100 mg ausgewogen.a) Three samples of 100 mg each are weighed out of each salt.
b) Eine Probe jedes Salzes wird in einen trockenen Exsikkator gestellt, die zweite Probe wird zur Aufrechterhaltung konstanter Feuchtigkeit in einen Exsikkator über gesättigter Ammoniumsulfatlösung aufbewahrt. Die dritte Probe wird Raumbedingungen ausgesetzt.b) A sample of each salt is placed in a dry desiccator, the second sample becomes Maintaining constant humidity in a desiccator over saturated ammonium sulfate solution kept. The third sample is exposed to room conditions.
c) Alle Proben werden 48 Stunden bei den genannten Bedingungen belassen.c) All samples are left under the stated conditions for 48 hours.
d) Jede Probe wird in 5 ml Wasser gelöst, unlösliche Rückstände werden entfernt. Freies p-Nitrophenoi löst sich in 5 ml Wasser.d) Each sample is dissolved in 5 ml of water, insoluble Residues are removed. Free p-nitrophenoi dissolves in 5 ml of water.
e) 0,05 ml jeder Probe werden in eine Küvette pipettiert und mit 2,5 ml Puffer (pH 10,2) versetzt.e) 0.05 ml of each sample are pipetted into a cuvette and 2.5 ml of buffer (pH 10.2) are added.
f) Die Extinktion wird in einem Spektrophotometer bei 405 ηΐμ gemessen.f) The extinction is measured in a spectrophotometer at 405 ηΐμ.
Berechnungen Prozent freies p-Nitrophenol = E405 · 0,228.Calculations percent free p-nitrophenol = E 405 x 0.228.
Prozent freies p-NitrophenolPercent free p-nitrophenol
p-Nitrophenylphosphorsäuresalzp-nitrophenyl phosphoric acid salt
Zu Beginn Laufl
RaumbedingungenAt the beginning Laufl
Room conditions
Lauf trockenrun dry
Lauf3 feuchtRun3 wet
Dinatrium Disodium
Äthylamin Ethylamine
Methylamin Methylamine
Dimethylamin
Trimethylamin
Monoäthanolamin
Morpholin Dimethylamine
Trimethylamine
Monoethanolamine
Morpholine
0,010.01
0,0090.009
0,0140.014
0,0060.006
0,0040.004
0,0070.007
0,016 0,04
0,07
0,09
0,07
0,15
0,05
0,130.016 0.04
0.07
0.09
0.07
0.15
0.05
0.13
0,28 0,07 0,10 0,11 0,14 0,04 0,110.28 0.07 0.10 0.11 0.14 0.04 0.11
0,04 0,07 0.09 0.20 0,11 0,05 0,150.04 0.07 0.09 0.20 0.11 0.05 0.15
Fortsetzungcontinuation
p-Nitrophenylphosphorsäuresalzp-nitrophenyl phosphoric acid salt
Zu Beginn Laufl
RaumbedingungenAt the beginning Laufl
Room conditions
Lauf 2
trockenRun 2
dry
Lauf 3
feuchtRun 3
wet
Monobenzylamin*) 0,035 0,06 0,05 0,05Monobenzylamine *) 0.035 0.06 0.05 0.05
Furfurylamin*) 0,01 0,04 0,04 0,04Furfurylamine *) 0.01 0.04 0.04 0.04
Anilin*) 0,016 0,05 0,04 0,04Aniline *) 0.016 0.05 0.04 0.04
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 0,005 0,02 0,02 0,02Tris (hydroxymethyl) aminomethane 0.005 0.02 0.02 0.02
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
trocken nicht geprüft 0,04 0,04 0,04Tris (hydroxymethyl) aminomethane,
dry not tested 0.04 0.04 0.04
Cyclohexylamine 0,007 0,03 0,02 0,03Cyclohexylamine 0.007 0.03 0.02 0.03
*) Nicht vollständig löslich.*) Not completely soluble.
Die nachstehenden Ergebnisse bestätigen, daß mit dem erfindungsgemäßen Reagenz eine Steigerung der Umsetzungsgeschwindigkeit erhalten wird, wobei keine Änderung der Kinetik nullter Ordnung eintritt.The following results confirm that with the reagent according to the invention an increase in Conversion rate is obtained, with no change in the kinetics of the zeroth order occurs.
Bedingungen: Gilford 2000 bei 37°C und 415 ηΐμ.Conditions: Gilford 2000 at 37 ° C and 415 ηΐμ.
Serum: Hylands abnormes Kontrollserum, Nr.368 A 16 alkalische Phosphatase-Einheiten = 11.Serum: Hyland's Abnormal Control Serum, # 368 A 16 alkaline phosphatase units = 11.
Günstiger Meßbereich = 10 bis 12 (Umrechnungsfaktor in Internationale Einheiten μΜοΙ/Min./Liter = 16,66).Favorable measuring range = 10 to 12 (conversion factor in international units μΜοΙ / min. / Liter = 16.66).
Zur Durchführung der Bestimmung der alkalischen Phosphatase werden 3,0 ml H2O, eine Reagenz-Tablette und 20 Mikroliter Serum verwendet.To carry out the determination of the alkaline phosphatase, 3.0 ml of H 2 O, a reagent tablet and 20 microliters of serum are used.
internationale
EinheitenTheoretical
international
units
(5 ml)
(2) 2,5 ml von (1), 2,5 ml H2O ...
(3) 2,5 ml von (2), 2,5 ml H2O ...
(4) 2,5 ml von (3), 2,5 ml H2O ...(1) Renatured bottle contents
(5 ml)
(2) 2.5 ml of (1), 2.5 ml H 2 O ...
(3) 2.5 ml of (2), 2.5 ml H 2 O ...
(4) 2.5 ml of (3), 2.5 ml H 2 O ...
91,5
46
23183
91.5
46
23
Berechnungen (für 415 ηΐμ)Calculations (for 415 ηΐμ)
InternationaleInternational
Einheiten Liter SerumUnits liter of serum
Küvettenvolumen 1000Cell volume 1000
17,7 ml Serum17.7 ml of serum
Hylands abnormes Serum, 415 πΐμHyland's Abnormal Serum, 415 πΐμ
der TabletteOD *)
of the tablet
nach 10 Minuten'OD
after 10 minutes'
nach 20 MinutenOD
after 20 minutes
(10 Minuten) Δ
(10 mins)
nach 30 MinutenOD
after 30 minutes
(20 Minuten) Δ
(20 minutes)
2) 0,168
3) 0,160
4) 0,1591) 0.167
2) 0.168
3) 0.160
4) 0.159
0,380
0,225
0,2000.595
0.380
0.225
0.200
0,600
0,340
0,2500.960
0.600
0.340
0.250
0,022
0,011
0,0050.037
0.022
0.011
0.005
0,795
0,450
0,3001,350
0.795
0.450
0.300
0,021
0,011
0,0050.048
0.021
0.011
0.005
*) O. D. = Optische Dichte.*) O. D. = optical density.
Internationale EinheitenInternational units
(10 Minuten) Δ
(10 mins)
(20 Minuten) Δ
(20 minutes)
50 50 mg Magnesiumasparaginat,
315 mg p-Nitrophenylphosphorsäure-dicyclohexylaminsalz.
50 50 mg magnesium asparaginate,
315 mg of p-nitrophenylphosphoric acid dicyclohexylamine salt.
Enzymatische Bestimmung der alkalischen Phosphatase und dabei auftretender EffektEnzymatic determination of alkaline phosphatase and the resulting effect
von Mannitof mannitol
Lösung A: In 100 ml destilliertem Wasser werden gelöst:Solution A: Dissolve in 100 ml of distilled water:
850 Na2CO3,
205 mg NaHCO3,850 Na 2 CO 3 ,
205 mg NaHCO 3 ,
60 Lösung B: 1000 mg Mannit werden in 10 ml der Lösung A gelöst. 60 Solution B: 1000 mg of mannitol are dissolved in 10 ml of solution A.
Es werden die nachfolgend aufgeführten Reagenzien hergestellt:The reagents listed below are produced:
Reagenz 1: 3 ml destilliertes Wasser,Reagent 1: 3 ml distilled water,
Reagenz 2: 3 ml Lösung A (Mannitkonzentra-Reagent 2: 3 ml solution A (mannitol concentrate
tion = 0 mg/ml),
Reagenz 3: 2 ml Lösung A und 1 ml Lösung Btion = 0 mg / ml),
Reagent 3: 2 ml of solution A and 1 ml of solution B
(Mannitkonzentration. = 33 mg/ml), Reagenz 4: 0 ml Lösung A und 3 ml Lösung B(Mannitol concentration. = 33 mg / ml), reagent 4: 0 ml solution A and 3 ml solution B
(Mannitkonzentration = 100 mg/ml).(Mannitol concentration = 100 mg / ml).
Diese Reagenzien werden in Küvetten übergeführt. Die Reagenzien werden 10 Minuten bei 370C vorinkubiert; hierauf erfolgt die Ablesung und Aufzeichnung der optischen Dichten.These reagents are transferred to cuvettes. The reagents are pre-incubated for 10 minutes at 37 0 C; this is followed by the reading and recording of the optical densities.
209524/275209524/275
Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 20 Mikrolitern Hylands abnormes Kontrollserum Nr. 368 A 16 gestartet.The enzymatic reaction is activated by adding 20 microliters of Hyland's Abnormal Control Serum No. 368 A 16 started.
Die Ablesungen erfolgen 10 Minuten (E10) und 15 Minuten (E15) nach Zugabe des Enzyms.Readings are made 10 minutes (E 10 ) and 15 minutes (E 15 ) after adding the enzyme.
Daher istthats why
A Ο.Ό. =A Ο.Ό. =
- E1 - E 1
ΊΟΊΟ
5 Min.5 min.
0,560
0,6520.480
0.560
0.652
internationale
EinheitenCalculated
international
units
zunahme bezüglich
Reagenz 2%Speed
increase in
Reagent 2%
2
3
41
2
3
4th
0,051
0,0510.051
0.051
0.051
0,772
0,9320.645
0.772
0.932
0,042
0,0560.033
0.042
0.056
355
473279
355
473
7027
70
Das Serum ist zuvor nach bekannten Methoden eingestellt worden, um die Aktivität in Internationalen Einheiten auf folgende Weise bestimmen zu können:The serum has previously been adjusted according to known methods in order to reduce the activity in international To be able to determine units in the following way:
1 μΜοΙ p-Nitrophenol/ml ergibt E415 m[1 von 17,7.1 μΜοΙ p-nitrophenol / ml results in E 415 m [1 of 17.7.
Internationale Einheiten/Liter SerumInternational units / liter of serum
Küvettenvolumen W Cell volume W
10001000
ml Serumml of serum
wobeiwhereby
_ Ε415ιημ nach 10 Min. — Ε415ηΐμ nach 5 Min. 5 Min._ Ε 415ιημ after 10 min. - Ε 415ηΐμ after 5 min. 5 min.
Küvettenvolumen = 3,0 ml.Cell volume = 3.0 ml.
ml Serum = 0,020 ml (20 Mikroliter).ml serum = 0.020 ml (20 microliters).
Es wird berechnet:It is calculated:
Internationale
EinheitenInternational
units
Liter SerumLiter of serum
3,03.0
1000 0,0201000 0.020
mg/mlReagent
mg / ml
10 MinutenOdin
10 mins
Zunahme
der
Reaktions
geschwin
digkeitPercentage
increase
the
Reaction
speed
age
Mannit
Sorbit
Saccharose
Glycerin Blind test
Mannitol
Sorbitol
Sucrose
Glycerin
91
171
4691
91
171
46
0,188
0,214
0,142
0,1840.118
0.188
0.214
0.142
0.184
81
20
5659
81
20th
56
2020th
3030th
3535
4040
Es wird berechnet: Internationale Einheiten/Liter Serum = 8450.The following is calculated: International units / liter of serum = 8450.
Weitere Daten von erfindungsgemäß verwendeten Polyolen und von Saccharose sind nachstehend zusammengestellt. Die Bestimmung dieser Daten wird mit einem Gilford 2000 bei 37° C bei einer Wellenlänge von 415 πΐμ durchgeführt. 50 Mikroliter eines menschlichen Mischserums werden mit 3,0 ml Wasser vermischt, das zuvor niit 0,5 Millimol der zu prüfenden Verbindung versetzt worden war.Further data on polyols used according to the invention and on sucrose are summarized below. The determination of these data is carried out with a Gilford 2000 at 37 ° C at one wavelength performed by 415 πΐμ. 50 microliters of a human Mixed serums are mixed with 3.0 ml of water, previously with 0.5 millimoles of the water to be tested Connection had been transferred.
5555
6060
Je nachdem, ob eine saure oder eine alkalische Phosphatase bestimmt wird, wird der pH-Wert durch eine geeignete Auswahl eines oder mehrerer Puffer über den weiten Bereich von pH 4 bis 11 konstant gehalten.Depending on whether an acidic or an alkaline phosphatase is determined, the pH value is determined by a suitable selection of one or more buffers over the wide range of pH 4 to 11 constant held.
Solange das erfindungsgemäße Reagenz trocken gehalten wird, ist es sehr stabil und hat eine lange Lebensdauer. Es kann in Einheitsmengen geteilt werden, die mit Wasser ein flüssiges Reagenz bilden, das zur Durchführung eines Serumtests ausreicht. Die Einheitsmengen können zum späteren Gebrauch zu Tabletten verarbeitet oder in Kapseln verpackt werden.As long as the reagent according to the invention is kept dry, it is very stable and has a long duration Lifespan. It can be divided into unit quantities which, with water, form a liquid reagent that sufficient to perform a serum test. The unit quantities can be used for later use Tablets can be processed or packed in capsules.
Es kann auch eine wäßrige Lösung eines erfindungsgemäßen Aminsalzes gefroren und lyophilisiert werden, wobei geringere Mengen an freiem p-Nitrophenol entstehen als im Falle des Natriumsalzes der p-Nitrophenylphosphorsäure. An aqueous solution of an amine salt according to the invention can also be frozen and lyophilized, smaller amounts of free p-nitrophenol are formed than in the case of the sodium salt of p-nitrophenylphosphoric acid.
Zur Herstellung des Reagenz werden die folgenden trockenen Bestandteile in einem Hobart-Mischer vermischt. Die trockene Mischung wird tablettiert oder verkapselt.To prepare the reagent, mix the following dry ingredients in a Hobart mixer. The dry mixture is tabletted or encapsulated.
Herstellung von Tabletten für 3 ml Tests von
alkalischer PhosphataseManufacture of tablets for 3 ml tests of
alkaline phosphatase
50 mg
600 mg
2830 mg
250 mg850 mg
50 mg
600 mg
2830 mg
250 mg
p-Nitrophenylphosphorsäure-
tris-(hydroxymethyl)-amino-
methansalz Magnesium asparaginate
p-nitrophenyl phosphoric acid
tris- (hydroxymethyl) -amino-
methane salt
Das Gesamtgewicht der Mischung beträgt 4850 mg. Diese Menge ist für ein Volumen der Testlösung von 100 ml bestimmt. Für einen Test werden 3,0 ml Testlösung benötigt. Mit 100 ml Testlösung können demnach 33,33 Tests durchgeführt werden. Eine Testtablette enthält somit 4580:33,33 = 137 mg der vorstehenden Mischung.The total weight of the mixture is 4850 mg. This amount is for a volume of test solution of 100 ml determined. 3.0 ml of test solution are required for a test. With 100 ml test solution you can 33,33 tests are performed. A test tablet thus contains 4580: 33.33 = 137 mg of the above Mixture.
Eine Tablette oder Kapsel wird in 3,0 ml Wasser in einer Küvette gelöst. Dieses Reagenz wird mit 20 Mikrolitern einer zu bestimmenden Serumprobe versetzt. Nach Vermischen der Reagenz und der Probe setzt folgende Reaktion ein:A tablet or capsule is dissolved in 3.0 ml of water in a cuvette. This reagent comes with 20 microliters of a serum sample to be determined are added. After mixing the reagent and the The sample sets in the following reaction:
Aminsalz der p-Nitrophenylphosphorsäure
Alkalische PhosphataseAmine salt of p-nitrophenyl phosphoric acid
Alkaline phosphatase
pH 8 bis 10 (Puffer) * Ρ\Νΐί^Τ + Salz pH 8 to 10 (buffer) * Ρ \ Νΐί ^ Τ + salt
der Phosphorsäureof phosphoric acid
Die Inkubation wird bei 37° C durchgeführt. Es wird die Geschwindigkeit der Änderung der optischen Dichte während 10 Minuten verfolgt. Da es sich um die Aufnahme einer Enzymkinetik handelt, müssen Temperatur und Meßintervalle sorgfältig kontrolliert werden.Incubation is carried out at 37 ° C. It will be the speed of change in optical Density followed for 10 minutes. Since it is a matter of recording enzyme kinetics, must The temperature and measuring intervals are carefully checked.
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|---|---|---|---|
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