DE1617814B1

DE1617814B1 - Process for the microbiological production of ergocryptine

Info

Publication number: DE1617814B1
Application number: DE1967S0110849
Authority: DE
Inventors: Alba Maria Amici; Anacleto Minghetti; Tullio Dipl-Landw Scotti; Celestino Dipl-Landw Spalla; Luigi Tognoli
Original assignee: FARM ITALIA SOC
Current assignee: FARM ITALIA SOC
Priority date: 1966-07-22
Filing date: 1967-07-17
Publication date: 1972-01-05
Also published as: SE332403B; GR36614B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Ergocryptin. Ergocryptin gehört zu einer Gruppe von Ergot-Alkaloiden; durch Hydrolyse wird Lysergsäure; Dimethylbrenz-Traubensäure, D-Prolin und Z-Leucin erhalten, die Moleküle dieser Substanzen sind durch Amidbindungen verbunden. Ergoeryptin wird zweckmäßig als hypertensives Mittel und bei der Behandlung von peripheren vasculären Störungen verwendet.The invention relates to a method for microbiological Manufacture of ergocryptine. Ergocryptine belongs to a group of ergot alkaloids; hydrolysis produces lysergic acid; Dimethylpyruvic acid, D-proline and Z-leucine obtained, the molecules of these substances are linked by amide bonds. Ergoeryptine is useful as a hypertensive agent and in the treatment of peripheral vascular Used interference.

In der Literatur sind verschiedene mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden der Ergotgruppe bekannt (niederländische Patentschriften 6 415127 und 6 405 662; USA.-Patentschriften 3117 917 und 3 110 651; japanische Patentschrift 10 250/64), nach welchen Verfahren es jedoch nur möglich ist, Mischungen derartiger Alkaloide zu erhalten.In the literature there are various microbiological methods for Production of alkaloids of the ergot group known (Dutch patents 6,415,127 and 6,405,662; U.S. Patents 3,117,917 and 3,110,651; japanese Patent specification 10 250/64), according to which process it is only possible to use mixtures to obtain such alkaloids.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man bei einem Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Ergocryptin durch submerses aerobes Züchten von Claviceps purpurea in assimilerbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden flüssigen Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten nur das Ergocryptin-Alkaloid in guten Ausbeuten erhält und daß danach außer den beträchtlichen Vorteilen während der Extraktions- und Isolationsverfahren das Alkaloid in hoher Reinheit und guten Ausbeuten erhalten wird, wenn man als Claviceps purpurea Claviceps purpurea. ATCC 20019 einsetzt.It has now surprisingly been found that one method for the microbiological production of ergocryptine by submerged aerobic cultivation from Claviceps purpurea into assimilable carbon and nitrogen sources and mineral salts containing liquid nutrient media at the usual temperature and pH values only the ergocryptine alkaloid receives in good yields and that afterwards besides the the alkaloid has considerable advantages during the extraction and isolation processes is obtained in high purity and good yields if one is called Claviceps purpurea Claviceps purpurea. ATCC 20019 uses.

Der neue Stamm Claviceps purpurea ATCC 20019 wurde aus Ergot Sclerotien isoliert, die von einer Roggenähre gesammelt worden waren; er zeigt folgende morphologischen Eigenschaften: Mikroskopisches Aussehen Auf den üblichen festen Kulturmedien zeigt das Mycel Hyphen, die in jungem Zustand lang und dünn sind und wenig auffällige und gut getrennte Septa zeigen. Beim Älterwerden werden die Hyphen größer; die Septa werden sehr auffällig; und die verschiedenen Zellen, die die Hyphen bilden, quellen. Bei jungen Hyphen beträgt die Zellenlänge etwa 24 bis 30 [., und der Durchmesser ist 3 bis 4 p,. Alte Zellen sind 10 bis 14 p: lang und haben einen Durchmesser von 4 bis 5[:. Manchmal trennen sich die Zellen, die die alten Hyphen bilden, ab und umgeben ihre Endteile, wodurch Arthrosporen entstehen, deren Dimensionen von den der oben beschriebenen Zellen nicht sehr verschieden sind.The new strain Claviceps purpurea ATCC 20019 was derived from ergot sclerotia isolated collected from an ear of rye; it shows the following morphological Properties: Microscopic appearance Shows on the usual solid culture media the mycelium hyphae, which when young are long and thin and not very conspicuous and show well separated septa. As you get older, the hyphae become larger; the septa become very noticeable; and the various cells that make up the hyphae swell. In young hyphae, the cell length is about 24 to 30 [., And the diameter is 3 to 4 p ,. Old cells are 10 to 14 p: long and a diameter of 4 to 5 [:. Sometimes the cells that make up the old hyphae separate from and surround their end parts, creating arthrospores whose dimensions differ from the of the cells described above are not very different.

Mehr oder weniger schnell und mehr oder weniger häufig, je nach den verwendeten Kulturmedien, bilden sich an der Spitze von zahlreichen Hyphen Conidien, die bei manchen Kulturmedien rundlich und bei anderen deutlich oval sind; die Größe der ersteren ist etwa 5 bis 7 #t (Durchmesser) und die der anderen 6 bis zu 3 bis 5 #L.More or less quickly and more or less frequently, depending on the person culture media used, conidia form at the tip of numerous hyphae, which are rounded in some culture media and distinctly oval in others; the size the former is about 5 to 7 #t (diameter) and that of the other 6 up to 3 bis 5 #L.

Makröskopisches Aussehen Die makroskopischen Eigenschaften wurden an Streifen der in der Tabelle angegebenen Medien festgestellt, die 8, 16 bzw. 24 Tage lang bei 28'C bebrütet worden waren. TS-Medium Reichliches Wachstum; samtiges Aussehen und weiße Farbe,. die beim Altern violett wird; das Luftmycel ist reichlich. Die Rückseite der Kolonie ist farblos bis violett. Es werden keine löslichen Pigmente gebildet. Reichliche Conidien. Agarkartoffelglukose Diskretes Wachstum, reichliches Luftmycel, weiß, häufig gebündelt wie Coremia. Die Rückseite der Kultur ist fabrlos. Lösliche Pigmente sind nicht vorhanden. Zahlreiche Conidien.Macroscopic appearance The macroscopic properties were found on strips of the media listed in the table, the 8, 16 and 24 Had been incubated for days at 28'C. TS medium Abundant growth; velvety Appearance and white color. which turns purple with aging; the aerial mycelium is plentiful. The back of the colony is colorless to purple. There will be no soluble pigments educated. Abundant conidia. Agar potato glucose Discrete growth, abundant Aerial mycelium, white, often clustered like Coremia. The reverse side of culture is unbranded. Soluble pigments are not present. Numerous conidia.

T 36-Medium: Gutes Wachstum. mit großen Falten; mäßiges weißliches Luftmycel. Die Rückseite ist farblos; lösliche Pigmente sind nicht vorhanden. Zählreiche - Conidien.T 36 medium: good growth. with large wrinkles; moderately whitish Aerial mycelium. The back is colorless; There are no soluble pigments. Numerous - Conidia.

T 31-Medium: Gefaltet, hell, weißlich,-mäßiges Wachstum. Kein Luftmycel vorhanden. Keine löslichen Pigmente vorhanden. Spärliche Conidien.T 31 medium: folded, light, whitish, moderate growth. No aerial mycelium available. No soluble pigments present. Sparse conidia.

T 25 S-Medium Spärliches Wachstum, irregulär; in mehr oder weniger domartigen Kolonien. Mäßiges Luftmycel mit samtigem Aussehen und rosa Farbe. Violette Rückseite. Keine löslichen Pigmente vorhanden. Reichliche Conidien. S. P:-Medium: Gutes Wachstum, gleichmäßig verteilt, mit samtigern Aussehen und weißlicher Farbe. Rückseite farblos: Keine löslichen Pigmente vorhanden. Keine Conidien vorhanden.T 25 S medium Sparse growth, irregular; in more or less dome-like colonies. Moderate aerial mycelium with a velvety appearance and pink color. Violet Back. No soluble pigments present. Abundant conidia. S. P: -Medium: Good growth, evenly distributed, with a velvety appearance and whitish color. Colorless back: no soluble pigments available. No conidia present.

T 22-Medium: Gutes Wachstum, ungleichmäßig, weißlich, mit farbloser Rückseite. Keine löslichen Pigmente und keine Conidien vorhanden. Tabelle Verbindungen TS - T25 S T36 , _ ° T 31 Kartoffel- ( glukose : S. P. T 22 Maisquellflüssigkeit................. 25 g Saccharose......................... 100 g 300 g 200 g 300 g 100 g Glukose .......................... 300 g 20 g Asparagin . . . . . . . . . . . : . . . . . . . . . . . . . 10 g Mehlhydrolysate..:................ Tabelle (Fortsetzung) Verbindungen TS T25 S T36 T 31 Kartoffel- S. P. T 22 glukose Baumwollsamen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g 10 g Peptone .......................... 2 g 10 g Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0;1 g 0,1 g 60 mg Zitronensäure...................... 15 g 10 g Kartoffelinfusion('). . . . . . . . . . . . . . . . 500m1 Häckselinfusion (2) ................ 500m1 KCl . .... .................. 125 mg 80 mg KH,P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g 0,5 g 0,35 g 0,5 g 0,5 g M9S04 - 7H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3 g 0,5 g 0,35 g 0,5 g 0,3 g FeS04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 mg 7 mg 4 mg 7 mg ZnS04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 mg 6 mg 3 mg 6 mg Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g 20 g 20 g 20 g 20 g 20-g 20 g Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . ad 11 ad 11 ad 11 10001111 Leitungswasser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ad 11 ad 11 10001111 wässeriger Ammoniak . . . . . . . . . . . . . . ad pH ad pH 5,2 5,2 NaOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ad pH 5,2 pH .............................. 5,5 (1) 200 g Kartoffeln werden 45 Minuten lang in 500 ml Leitungswasser gekocht. Das Ganze wird durch Gaze filtriert, und das (infundierte) Filtrat wird auf das Volumen gebracht. (z) 200g Kornhäcksel (Spelzen) werden 45 Minuten lang in 51 Leitungswasser gekocht, dann filtriert und auf das Volumen gebracht. Der erfindungsgemäß zum Einsatz kommende Mikroorganismus wird insbesondere in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen in Submerskultur bei einer Temperatur von 20 bis 30°C, vorzugsweise 24°C, während eines Zeitraumes von 8 bis 16 Tagen gezüchtet. Der pH-Wert kann je nach den verwendeten Fermentationsmedien von 4 bis 6,5 schwanken: Als Ausgangsstoff für Kohlenstoff kann Glukose; Saecharose, Mannit; Sorbit, Glyzerin, Zitronensäure und Bernsteinsäure verwendet werden. Der Ausgangsstoff für Stickstoff kann Ammoniak, Asparagin, Pepton, Kaseinhydrolisate und Ammoniumsalze, wie Sulfat und Chlorid und andere Substanzen, wie sie gewöhnlich verwendet werden, sein. Als Mineralsalze werden zweckmäßig für die Herstellung des Alkaloids je nach dem verwendeten Medium verschiedene Salze verwendet, und es können Chloride, Phosphate, Sulfate und Magnesium, Eisen, Zink, Mangan und Kalium verwendet werden.T 22 medium: good growth, uneven, whitish, with a colorless reverse. No soluble pigments and no conidia present. Tabel Connections TS - T25 S T36 , _ ° T 31 potato (glucose : SP T 22 Corn steep liquor ................. 25 g Sucrose ......................... 100 g 300 g 200 g 300 g 100 g Glucose .......................... 300 g 20 g Asparagine. . . . . . . . . . . :. . . . . . . . . . . . . 10 g Flour hydrolysates ..: ................ Table (continued) Connections TS T25 S T36 T 31 Potato sp T 22 glucose Cottonseed. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g 10 g Peptones .......................... 2 g 10 g Yeast extract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0; 1 g 0.1 g 60 mg Citric acid ...................... 15 g 10 g Potato infusion ('). . . . . . . . . . . . . . . . 500m1 Chop infusion (2) ................ 500m1 KCl. .... .................. 125 mg 80 mg KH, P04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g 0.5 g 0.35 g 0.5 g 0.5 g M9S04 - 7H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.3 g 0.5 g 0.35 g 0.5 g 0.3 g FeS04 - 7H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 mg 7 mg 4 mg 7 mg ZnS04 - 7H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 mg 6 mg 3 mg 6 mg Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g 20 g 20 g 20 g 20 g 20-g 20 g Distilled water . . . . . . . . . . . . . . . . ad 11 ad 11 ad 11 10001111 Tap water. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ad 11 ad 11 10001111 aqueous ammonia. . . . . . . . . . . . . . ad pH ad pH 5.2 5.2 NaOH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ad pH 5.2 pH .............................. 5.5 (1) 200 g of potatoes are boiled in 500 ml of tap water for 45 minutes. The whole is filtered through cheesecloth, and that The (infused) filtrate is brought to volume. (z) 200g chopped grains (husks) are boiled in tap water for 45 minutes, then filtered and brought to volume. The microorganism used according to the invention is grown in particular in a liquid culture medium under aerobic conditions in submerged culture at a temperature of 20 to 30 ° C., preferably 24 ° C., for a period of 8 to 16 days. The pH value can vary from 4 to 6.5 depending on the fermentation media used: Glucose can be used as the starting material for carbon; Saecharose, mannitol; Sorbitol, glycerin, citric acid and succinic acid can be used. The raw material for nitrogen can be ammonia, asparagine, peptone, casein hydrolyzate and ammonium salts such as sulfate and chloride and other substances which are commonly used. As mineral salts, various salts are suitably used for the preparation of the alkaloid depending on the medium used, and chlorides, phosphates, sulfates and magnesium, iron, zinc, manganese and potassium can be used.

Der Stamm Claviceps purpurea ATCC 20019 kann durch Gefriertrocknung gelagert werden, wobei als Suspendiermittel eine Flüssigkeit verwendet wird, die aus drei Teilen einer 60°/;igen Saccharoselösung und zwei Teilen Milch besteht: Außerdem kann er auf T 36-Medium weiter übertragen werden. Die Ferm;entierung kann im Erlenmeyerkolben und in Laboratoriums- oder industriellen Fermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.The strain Claviceps purpurea ATCC 20019 can be freeze-dried be stored, a liquid is used as the suspending agent, the consists of three parts of a 60% sucrose solution and two parts of milk: It can also be retransmitted on T 36 medium. The ferm; entation can in Erlenmeyer flasks and in laboratory or industrial fermenters of various kinds Capacity to be carried out.

Die Menge des in der Nährbrühe vorhandenen Alkaloids kann qualitativ durch Papierchromatographie bestimmt werden in Vergleich mit einem Ergocryptinstandard und quantitativ durch spektrophotometrische Verfahren: Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: Beispiel 1 In einem 10-1-Fermeinter werden 61 TG-Medium durch 30 Minuten langes Erhitzen auf 120°C sterilisiert. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung: Glukose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1009 Zitronensäure ..................-10 g Hefeextrakt .................... 0;1 g KH2PO4 ....................... 0,5 g M9S04 ' 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3 g Fe504 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 mg ZnS04. 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . 6 mg Destilliertes Wasser ....... auf 1000 ml pH 5,2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mit Ammoniak Hierauf wird mit 50 ml einer Suspension von Conidien und Mycel, erhalten durch Suspendieren von fünf Kulturen des Stammes Claviceps purpurea ATCC 20019 in einem Probierrohr in T 36-Mediiun, in Wasser beimpft.The amount of alkaloid present in the nutrient broth can be determined qualitatively by paper chromatography in comparison with an ergocryptine standard and quantitatively by spectrophotometric methods: The following examples illustrate the invention: Example 1 In a 10-1 Fermeinter, 61 TG medium are used for 30 minutes Sterilized by heating to 120 ° C. This medium has the following composition: Glucose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1009 Citric acid .................. - 10 g Yeast extract .................... 0; 1 g KH2PO4 ....................... 0.5 g M9S04 '7H20. . . . . . . . . . . . . . . . . 0.3 g Fe504 - 7H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 mg ZnS04. 7H20. . . . . . . . . . . . . . . . 6 mg Distilled water ....... to 1000 ml pH 5.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . with ammonia This is followed by inoculation with 50 ml of a suspension of conidia and mycelium, obtained by suspending five cultures of the strain Claviceps purpurea ATCC 20019 in a test tube in T 36 medium, in water.

Die Kultur wird 4 Tage lang bei 24°C gezüchtet, wobei mit einem Mischstrom von 41 pro Minute belüftet und mit einer rotierenden Schütteleinrichtung mit sechs Blättern bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM geschüttelt wurde. Die so erhaltenen Kulturen dienen zur Animpfung mit einem Verhältnis von 10"/, von 61 T25-Medium, das in einem anderen 104-Fermenter hergestellt und fermentiert worden war. Dieser wird dann bei 24°C mit einer Belüftung entsprechend einer Luftzufuhr von 61 pro Minute und mit einem Schüttelrührwerk, das mit sechs Rührblättern versehen ist, bei einer Drehzahl von 350 UpM, gehalten. Nach 10tägiger Züchtung enthält die Kultur 1100 y/ml Ergocryptin.The culture is grown for 4 days at 24 ° C with a mixed current aerated by 41 per minute and with a rotating shaker with six Scroll was shaken at a speed of 300 rpm. The so obtained Cultures are used for inoculation with a ratio of 10 "/, of 61 T25 medium, that had been made and fermented in another 104 fermenter. This is then at 24 ° C with a ventilation corresponding to an air supply of 61 per Minute and with a shaking stirrer equipped with six stirring blades, at a speed of 350 rpm. After 10 days of cultivation, the culture contains 1100 y / ml ergocryptine.

Außerdem wurde an Stelle des T 25-Mediums das Medium 668 verwendet, welches folgende Zusammensetzung hat: Saccharose ..................... 60 g' Glyzerin . ................... 60 l Glukose ...... .:............. 80 g Hefeextrakt .................... 01 g Zitronensäure .. ............. 15 g KCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,125 g KH2P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g M9S04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g FeS04 . 711,0 . . . . . . . . . . . . . . . . 7 m11 ZnS04 # 7H20 . . . . . . . . . . . . . . 6 mg Destilliertes H20 . . . . . : auf 1000 ml pH 5,2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mit Ammoniak Sterilisierung ................... 20 Minuten lang_bei 100'C Nach 14tägiger Züchtung enthält die Kultur 1500,y/ml Ergocryptin.In addition, the medium 668 was used instead of the T 25 medium, which has the following composition: Sucrose ..................... 60 g ' Glycerine. ................... 60 l Glucose .......: ............. 80 g Yeast extract .................... 01 g Citric acid .. ............. 15 g KCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.125 g KH2P04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g M9S04 - 7H20. . . . . . . . . . . . . . . 0.5 g FeS04. 711.0 . . . . . . . . . . . . . . . . 7 m11 ZnS04 # 7H20. . . . . . . . . . . . . . 6 mg Distilled H20. . . . . : to 1000 ml pH 5.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . with ammonia Sterilization ................... 20 minutes long_at 100'C After 14 days of cultivation, the culture contains 1,500 y / ml ergocryptine.

Beispie12 Es wird. wie im Beispiel 1 gearbeitet, wobei jedoch von fünf Kulturen auf S. F:-Medium in Probierrohren ausgegangen wurde.Example12 It will. worked as in Example 1, but from five cultures on S. F: medium in sample tubes was assumed.

Es werden 1300' y/ml Ergocryptin erhalten. Beispiel 3 Es wird wie. im Beispiel l -beschrieben gearbeitet, wobei jedoch von, fünf Kulturen auf T 22-Medium in Probierrohren ausgegangen wurde.1300 μg / ml of ergocryptine are obtained. Example 3 It will be like. Worked described in Example 1, but with five cultures on T 22 medium was assumed in test tubes.

Es werden 1250 y/ml Ergocryptin erhalten. -1250 μg / ml ergocryptine are obtained. -

Claims

Claim: Process for the microbiological production of ergocryptine by submerged aerobic cultivation of Claviceps purpurea into assimilable carbon and liquid nutrient media containing nitrogen sources and mineral salts in therefor usual temperature and pH values, that is to say that one is called Claviceps purpurea Claviceps purpurea ATCC 20019 begins.