DE1617755A1 - Process for the production of a preparation obtained by selective breeding of lactobacteria - Google Patents

Process for the production of a preparation obtained by selective breeding of lactobacteria

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DE1617755A1 DE19661617755 DE1617755A DE1617755A1 DE 1617755 A1 DE1617755 A1 DE 1617755A1 DE 19661617755 DE19661617755 DE 19661617755 DE 1617755 A DE1617755 A DE 1617755A DE 1617755 A1 DE1617755 A1 DE 1617755A1
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Description

PATENTANWALTPATENT ADVOCATE

890 Kempten^^BcSrowHStatto^Ruf 2 32 91890 Kempten ^^ BcSrowHStatto ^ Ruf 2 32 91

Uridotuer Str. 32Uridotuer Str. 32

Az. s 16 17 755.2-41 10.April 1970Az. S 16 17 755.2-41 April 10, 1970

Dr.Eberhard R e h m ----^. H/m E 3/1Dr Eberhard R e h m ---- ^. H / m E 3/1

Verfahren zur HerStellung eines durch selektive Züchtung von Laktobakterien erhaltenden Präparates*Method of making a by selective Cultivation of preparations containing lactobacteria *

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines durch selektive Züchtung von Laktobakterien erhaltenen Präparates, die Verwmdung des Präparates zur Herstellung von Nahrungsmitteln und das Präparat selbst."The invention relates to a method for producing a obtained by selective cultivation of lactobacteria Preparation, the use of the preparation for the production of food and the preparation itself. "

Laktobakterien sind die in stoff weohselphysiologischer Hinsicht spezialisiertesten Bakterien. Aus diesem Grunde werden sie in zunehmendem Maße zum Nachweis von selbst in Mikromangen vorliegenden Aminosäuren, Vitaminen und anderen Biovitalstoffen eingesetzt. Wegen ihrer besonderen Nährbodenansprüche und schwierigen Züchtung werden z.Zt.Lactobacteria are the most physiological in terms of substance Respect most specialized bacteria. For this reason, they are increasingly being used to detect themselves in Micro-amounts of amino acids, vitamins and others present Biovital substances used. Because of their special nutrient requirements and difficult breeding,

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Neue Unteriag-rn (»it. 7 crAb3.2 rir.ι satz3 deeXmtorungigM,«.'4,9.isrNew Unteriag-rn ("it. 7 crAb 3 .2 rir.ι satz3 deeXmtorungigM,". '4,9.isr MOmhen 15191t, Dtutidw 8»nk tCerapton KV401M ·MOmhen 15191t, Dtutidw 8 »nk tCerapton KV401M ·

wenige, verhältnismäßig robuste Arten routinemäSig verwendet. Einer der Anfälligsten und Anspruchsvollsten unter den Laktobakterien ist Lactobacillus bifidus, der im Stuhl des brustgenährten Säuglings in Reinkultur wächst, jedoch verschwindet, sobald von Muttermilch auf Flaschen-Kuhmilch umgestellt wird· Schon bei geringfügiger Änderung der Zusammensetzung des für ihn optimalen Nährbodens stellt er sein Wachstum ein.few, relatively hardy species routinely used. One of the most susceptible and demanding of the lactobacteria is Lactobacillus bifidus, which occurs in the The stool of breast-fed infants grows in its purest form, but disappears as soon as it moves from breast milk to bottled cow's milk is changed · Even with a slight change in the composition of the optimal nutrient medium for him he stops growing.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient der Vernichtung spezieller pathogener Bakterienkeime, insbesondere Thyphus-, Parathyphus, Enteritis-, Dysentery- oder Dyspepsie-Colibakterien. .The method according to the invention is used to destroy more specifically pathogenic bacterial germs, in particular typhoid, parathyphoid, enteritis, dysentery or dyspepsia coli bacteria. .

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß einem Stamm Laktobakterien pathogene Bakterienkeime der zu vernichtenden species zugesetzt werden, anschliessend eine AusImpfung auf einem Nährboden erfolgt,diesem Laktobakterienkeime entnommen und erneut auf einen, pathogene Bakterienkeime dieser species enthaltenden Nährboden überimpft werden» dieses Überimpfen mehrfach wiederholt wird und die so selektiv gezüchteten Laktobakterienkeime in einem pathogenkeimfrelen Nährboden vermehrt werden.The inventive method is that a Lactobacteria strain pathogenic bacterial germs of the species to be destroyed are added, then an inoculation takes place on a nutrient medium, this lactobacteria germ taken and again on a nutrient medium containing pathogenic bacteria from these species are inoculated »this over-vaccination is repeated several times and the lactobacteria germs that are so selectively grown be propagated in a culture medium free of pathogens.

Eine Weiterbildung des Verfahrens besteht darin, daßdLe letzte Züchtung vor der Vermehrung in dem pathogenkeim-A further development of the method is that dLe last cultivation before propagation in the pathogen germ

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freien Fahrboden in oder auf abgetätetepathogene Keime enthaltendem Nährboden vorgenommen wird* Sieger Verfahrensachritt dient ausschliesslich der zusätzlichen gesundheitlichen Sicherheit, wenn das Verfahren industriell angewendet wird* Wenn aufgrund der Gesetzgebung andere .MaSnahmen ausreichen, um sicherzustellen, daß dem letzteren Nährboden ausschliesslich Laktobakterienkeime in ; Reinkultur entnonmen werden - was bei Üblicher Sorgfalt in Labors unter Verwendung von Spezialsdkroskopen mit Änderung des Lichtstrahienganges undbiochemischer Kontrolle leicht möglich ist, so ist dieser weitere Verfehrensschritt erlässlich und die adaptierten Laktobakterienkeime werden, dann in der letzten Züchtung einem Nährboden entnommen« der lebende pathogene Keime enthält*free floor in or on destroyed pathogens Culture medium containing germs is made * Sieger procedural step serves exclusively the additional health safety if the process is industrial is used * If, due to the legislation, other measures are sufficient to ensure that only lactobacteria germs in the latter culture medium; Pure culture can be removed - what with the usual care in laboratories using special microscopes with changing the light beam path and biochemical control is easily possible, then this further procedural step is essential and the adapted lactobacteria germs are then taken from a culture medium in the last cultivation " which contains living pathogens *

Als Laktobakterien einerseits werden insbesondere Lactobacillus bifidus und/oder Lactobacillus acidophilus und als pathogene Keime andererseits insbesondere Typhusbakterien, Paratypitaxsbekierien sowie Teile und/oder Mischungen dieser Bakterien bzw· deren Stoffwechselprodukte ■ verwendet·- .-,.->-■ '■: :" / ■■';'- . ■ . -: - . Lactobacillus bifidus and / or Lactobacillus acidophilus in particular are used as lactobacteria on the one hand and typhoid bacteria, paratypitaxic bacteria as well as parts and / or mixtures of these bacteria or their metabolic products ■ - .-, .-> - ■ '■ : " / ■■ ';' - . ■. - : -.

Weitere vorteilhafte Merkmale bestehen darin, daß als letzter pathogenkeimfreier Nährboden eiii dickflüssiger Nährboden auf Milch- und/oder Leberbasis verwendet ifird, und daß der die letzte Laktöbakterienzüchtung entheltendeFurther advantageous features consist in the fact that the last nutrient medium free of pathogens is eiii thicker Milk- and / or liver-based nutrient medium used ifird, and that the one containing the last cultivation of lactobacilli

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pathogenkeimfreie Mhrboden durch Trocknen, Gefrieren oder Gefriertrocknen haltbar gemacht wird, um eine Verzögerung des Wachstums der Bakterien zu erreichen« soil free from pathogens by drying, freezing or freeze-drying is preserved in order to delay the growth of the bacteria «

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, adaptierten Lactobacillus bifidus selbst in großen Mengen züchten zu können· Implantiert in Kolonien, Brei oder Aufschwemmung von oben genannten Krankheitskeimen, wird Lactobacillus bifidus in erheblichem Maße wachstumsgefördert. Hierbei vollzieht sieh, wie man in Mikro-Transpläntationsversuehen mit mikromanipulatorgeführten Glasfäden zeigen kann, eine fast vollständige Vernichtung der Krankheitskeim*Kolonie zugunsten der sie schliesslich fast ausfüllenden Lactobacillus Mf idus-Kolonie ·The inventive method enables adapted To be able to grow Lactobacillus bifidus in large quantities by yourself · Implanted in colonies, pulp or suspension of the above-mentioned pathogens, Lactobacillus bifidus is promoted to a considerable extent in terms of growth. Here see how to attempt micro-transplantation show with micromanipulator-guided glass threads can, an almost complete destruction of the germ * colony in favor of the Lactobacillus Mf idus colony that eventually almost fills them

in laufenden gleichsinnigen Passagen in Ansammlungen oben angeführter Krankheitskeime gezüchteter Lactobacillus bifidus ist, auf den Menschen oder das Tier Übertragen, in der Lage« die betreffenden Krankheitskeime auch in vivo auszuzehren und soweit zu deziminieren, daß sie durch die hervorgerufene Krankheit erlischt.Lactobacillus cultivated in continuous passages in the same direction in clusters of the above-mentioned germs bifidus is transmitted to humans or animals in able to “remove the germs in question also in vivo to exhaust them and to decimate them to such an extent that they are replaced by the caused illness disappears.

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Werden die so gezüchteten Lactobacillus Mfidus-Bakterien gesunden Menschen oder fieren verabfolgt, z.B. in Form eines nach dem erfindungsgeaiä8en Verfahren hergestellten Präparates, so schützen sie in gleicher ?eise als physiologische Darmbakterien ihren Wirtsorganismus gegen evtl* in denKörper gelangende, oben g^annte Krankheits·- keime. ""_■■:.. ..-■"·.. "■ /:- -v ■. - .. If the Lactobacillus Mfidus bacteria cultivated in this way are administered to healthy people or animals, for example in the form of a preparation produced according to the process according to the invention, they protect their host organism against any disease mentioned above in the same way as physiological intestinal bacteria. - germs. "" _ ■■: .. ..- ■ "· .." ■ /: - -v ■. - ..

Bei spiel TFor example T

0,1 ml Reinkultur eines aus frischem Stuhl eines brusternährten Säuglings entnommenen» in vitro in Milch gezüchteten Stammes von Lactobacillus bifidus wurde in 10 ml abgerahmte Volliöilch geiaipft. Nöten 10-stündiger Bebrütung wird 0>1 oX eines pathogenen I^rspepsieoplißtammes zügegeben und 10 Stunden weiterbebrütet. Dann erf oilgt Ausiiapfung auf Platten-Nährboden und 24-stündige Änaerob-Bebrütung mit den Mitteln der handelsüblichen bakteriologischen Arbeitsbestecke. 0.1 ml pure culture of a fresh stool from a breast-fed stool Lactobacillus bifidus strain of Lactobacillus bifidus, raised in vitro in milk, was taken from infants in 10 ml Skimmed whole milk peeled off. Need 10 hours of incubation 0> 1 oX of a pathogenic strain of spepsia is added and incubated for 10 hours. Then elimination takes place on nutrient plates and incubation for 24 hours with the means of the commercially available bacteriological work utensils.

Nach Durchmusterung der geöffneten» bebrüteten Platten unter eineia handelsüblichen SpezialmikroskopV das zwei ver schiedene Bfileuchtungsarten, nSmlich einmal schräg gegen das Objekt und zum anderen in Richtung der optischen Achse hat, wobei mit der einen Beleuchtungiart im FaJiLeuohtbildAfter screening the opened »incubated plates under a commercially available special microscope the two ver different types of lighting, namely one at an angle the object and the other in the direction of the optical axis has, with the one lighting type in the FaJiLeuohtbild

20*8087177720 * 80871777

die pathogenen Dyspepsiecoli-Kolonie blau-rot, die Bifi-the pathogenic colony of dyspepsia coli blue-red, the bifi-

en
duskolonie hingegeg/siber-grau erscheinen, können beide Keime aufgrund dieses artcharakteristischen, unterschiedlichen Farb-Erscheinungsbildes exakt getrennt und zu Subkulturzwecken, in gleicher Welse wie oben geschildert, weit-erverwendet werden.en
duskolonie on the other hand / silver-gray, both germs can be separated exactly due to this species-characteristic, different color appearance and can be used for subculture purposes in the same way as described above.

en ■:en ■:

Nach im Abstand von zwei Tagen sich wiederholend^ monatelang durchgeführten Symbiose-Züchtungen dieser beiden Keime in Milch mit ständigen Zwischen-Selektionen der jeweils am besten an das Pathogenkeim-Eiweis adaptierten Bifiduskeirrie, schliesst sich folgende vorletzte Subkultur an: Die Dyspepsiecolikeime werden in den oben angegebenen Mengenverhältnissen in Milch geimpft, drei Stunden bebrütet und dann durch Erhitzen von 30 Minuten bei 60° G abgetötet. Dann werden in oben angegebener Menge die Bifiduskeime eingeimpft, Der wesentliche Unterschied dieser vorletzten Subkultur gegenüber den vorherigen Züchtungen besteht also darin, dad die Bifiduskeime in ausschliesslich abgetötete Dyspepsiecolikeime enthaltender Milch gezüchtet werden und somit bedenkenlos zu prophlaktisehen oder therapeutischen Zwecken per os appliziert werden können. Die letzte Bifidus-Subkultur wird dann zur massiven Keimvermehrung auf einem absolut dyspepsiecolifreien Nährboden durchgeführt. Aus diesem Nährboden, z.B. dickflüssige Milch, wird dann z.B. durch Trocknen ein haltbares Präparat gewonnen.Repeatedly every two days for months carried out symbiosis breeding of these two germs in milk with constant intermediate selections of each best adapted to the pathogen germ protein, The following penultimate subculture follows: The dyspepsia colic germs are in the proportions given above inoculated in milk, incubated for three hours and then killed by heating for 30 minutes at 60 ° G. Then the bifidus germs are inoculated in the amount specified above, The main difference between this penultimate subculture and the previous cultivars is dad the bifidus germs are grown in milk containing exclusively killed dyspepsia colic germs and thus without hesitation to see prophlactic or therapeutic Purposes can be applied per os. The final bifid subculture is then carried out on an absolutely dyspepsia coli-free nutrient medium for the massive multiplication of germs. For this A nutrient medium, e.g. thick milk, is then e.g. Drying obtained a durable preparation.

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TS17755TS17755

© 1 s| £ ß 1 2© 1 s | £ ß 1 2

Bruchteile 'lines HiliillterJB -einer aus stuhl Isoli©i*t@a R^iBkultas0 ■ ^on;-lactobacillus sowie gleiches- öantism ..©laes?Fractions' lines HiliillterJB -einer aus stuhl Isoli © i * t @ a R ^ iBkultas 0 ■ ^ on; -lactobacillus as well as equal- öantism .. © laes?

Typhus oder anderenpattogenen &«!&©&. tfei^a in 5-1® sal sterile fiüch ©cl©r Köadenssail.ch ©ing@isspf% imd M:» stsr leicMeii Sätienmg (et*m pH S9) von 3?~41Ö0. bebrütet, .itean •rorden 0^1 ml MiIeM densmilch eiiigegeböö-. wnd vrieaerusi Temperatur von 3?°G » 41 ®G bis ^ur tegiim^K^sn Mili@u< Säuerung bebrätet« Maeh:stänäig sioh maefe .dies®® vre.<shen^> odes? monateleag w&®a®vh.©l®n In Symbiosezllchttmg■ b©M®r Xei» ia üolgt das ÄTyphoid or other pattogenic & «! & © &. tfei ^ a in 5-1® sal sterile fiüch © cl © r Köadenssail.ch © ing @ isspf% imd M : »stsr leicMeii sätienmg (et * m pH S 9 ) of 3? ~ 41 Ö 0. incubated, .itean • Rorden 0 ^ 1 ml MiIeM the milk eiiigeböö-. wnd vrieaerusi temperature of 3? ° G »41 ®G to ^ ur tegiim ^ K ^ sn Mili @ u <acidification roasted« Maeh : constantly sioh maefe .dies®® vre. <shen ^> odes? monthly leag w & ®a®vh. © l®n In Symbiosezllchttmg ■ b © M®r Xei »ia o follows the Ä

nMhr-boden rai'tnMhr-soil rai't

bacillus -.-bifidus ms ©iasr · ieoliertbacillus -.- bifidus ms © iasrioliert

kultur auf ©inenculture on © inen

übertragen und b®forSt@tos BiW R@iÄ@£t der' KudLtcnr. MM saittels eines handelsübliclies Sp©Eiels&IkrosfeopB lauf®nd überprüft«' Dieser letzt® Rährbode% d®r aaeeel^leesiicb Lact©bacillue- -bifidus-Keime iß tteSjBBt&i&'fe&tä^ transferred and b®forSt @ to s BiW R @ iÄ @ £ t der 'KudLtcnr. MM saittels einer Handelsübliclies Sp © Eiels & IkrosfeopB continuously checked «'This last® Rährbode% d®r aaeeel ^ leesiicb Lact © bacillue- -bifidus-Germ eats tteSjBBt & i &' fe & ta ^

FrisdtmilcSi) * giber SM^k KotodeiiEm4äc^s "Milel3pi!lverf in kleinen Mengen i ^ FrisdtmilcSi) * giber SM ^ k KotodeiiEm4äc ^ s "Milel3pi! Lver f in small quantities i ^

Beispielexample

Eine Öse Bifidus~Reinkultur aus Säuglings-Bruststuhl wird' in eine auf Festnährboden auswachsende Kolonie von Dyspepsiecoli, Typhus o,dergl« transplantiert und, 1-2 Tage bebrütet« Danach werden beide Keime der Symblontenkolonie in Mischung auf einem bekannten geeigneten Bifidus-Festnährboden überimpft und "bebrütet". Nunmehr werden Subkulturen ständig über einen Zeitraum von mehreren Wochen wiederholte Schliesslich werden durch weit ausgezogenes Ausstreichen auf Bifidus-Festnährboden beide Keime in Einzelkolonien getrennt* Dann wird, eine, isoliert liegende Bifiduskolonie entnommen und zur massiven Keimvermehrung auf ©inen Fest- oder Flüssignährboden, insbesondere einem dickflüssigen Nährboden auf Milch« und/öder Leberbasis übertragen und bebrütet. Dieser Nährboden wird anschliessend 2.B. durch Trocknen, Gefrieren oder Gefriertrocknen haltbar gemacht und zu einem verkaufsfähigen Präparat verarbeitet.An eyelet Bifidus ~ pure culture from an infant breast chair becomes' into a colony of dyspepsia coli growing on solid culture medium, Typhus o, dergl "transplanted and incubated for 1-2 days" After that, both germs of the symbol colony are mixed together inoculated on a known suitable bifidus medium and "incubated". Subcultures are now being repeated over and over again over a period of several weeks are spread by spreading them on a solid Bifidus medium both germs separated into individual colonies * Then, an isolated bifid colony is removed and used massive germ multiplication on solid or liquid culture media, in particular transferred to a thick nutrient medium based on milk and / or liver and incubated. This breeding ground becomes then 2.B. by drying, freezing or freeze drying made durable and a salable preparation processed.

Das erfindungsgemäß hergestellte» adaptierte Laktobalcterien enthaltende Präparat wird herkömmlichen Nahrungsmitteln, insbesondere auf Milchbasis» also Kondensmilch, Milchpulver, Rahm» Joghurt, Käse und Batter zugesetzt und schützt . somit den Menschen vorbeugend gegen Erkrankung. Selbstverständlich kann das Präparat auch unmittelbar als Heilmittel verwendet werden. The "adapted lactobalceria-containing preparation produced according to the invention is added to conventional foods, in particular milk-based" ie condensed milk, milk powder, cream, yoghurt, cheese and batter and protects. thus the people preventive against illness. Of course, the preparation can also be used directly as a remedy.

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Claims (7)

f. Verfahren zur Herstellung eines durch selektiveZüchtung von Laktobakterien erhaltenen Präparates zm Vernichtung spezieller pathogener Bakterienkeime,» insbesondere Typhus-, Parat-yphiis» Enteritis-, %s©ntery- oder I^spepBie^oli* bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß einem Stamm Laktö«- bakterien pathogen© Bäkterienlcöime der zu irernichtenden species zugesetzt werdürs, ansehllessend eineAuisimpfung auf eineta !iährboden erfolgt* diesem Lairtobakterienkeiffie entnomaien und erneut auf einen, path^gene Baktörienkeime dieser species enthaltenden iföhrboden überiü^ft werden^ dieses Überiflipfen mehrfach Wiederholt wird und die so selektiv gezüchteten Laktobakterienkeime in einem pathogenkeimf reien HHhrboden vermehrt werden*f, parathyroid-yphiis "enteritis,% s © ntery- or I ^ ^ oli * spepBie bacteria. A process for the production of a preparation obtained by selective breeding of lactobacilli zm destruction of specific pathogenic bacteria germs," especially typhoid, characterized in that a strain of Lacto bacteria pathogen © bacteria are added to the species to be eradicated, then an inoculation on a soil is carried out selectively cultivated lactobacteria germs can be propagated in a pathogen germ-free soil * 2« Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekeiänzeißhnet» daß die letzte Züchtung vor der Vermehrung in dem pathogenkeiia-freten Nährboden in oder auf abgetötete pathogene Keime enthaltendeiß Kfährboden vorgenommen wird,2 «Method according to claim 1, characterized in that the last cultivation before propagation in the pathogenkeiia-freten Containing nutrient medium in or on killed pathogenic germs The medium is made, 3. Verfahren nach Anspruch t, dadurch gekennzeichnet» daß als letzter pathogenkeiffifreier Nährboden ein dickflüssiger Nährboden auf Mich- unf/oder keberbasis verwendet wird*3. The method according to claim t, characterized in »that as the last culture medium free of pathogens, a thick one Nutrient medium based on milk and / or germ is used * Weue Jünteftaöeri W^ §i a^ rmisati jWeue Jünteftaöeri W ^ §ia ^ rmisati j 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,4. The method according to claim 1, characterized in that diethe daß der/letzte Laktobakterienzüchtung enthaltende pathogenkeimfreie Nährboden durch Trocknen, Gefrieren oder Gefriertrocknen haltbar gemacht wird»that the / last lactobacteria culture containing pathogens are free of germs Culture medium is preserved by drying, freezing or freeze-drying » 5» Verfahren zur Verwendung des nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4 hergestellten Präparates, dadurch gekennzeichnet, daß das adaptierte Laktobakterien enthaltende Präparat in herkömmlichen Naehrungsmitteln enthalten ist.5 »Method of using the according to one or more of claims 1-4 manufactured preparation, characterized in that that the adapted lactobacteria containing Preparation contained in conventional nutrients is. 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat in Nahrungsmitteln auf Milchbacsis, wie Kondensmilch». Milchpulver, Rahm, Joghurt, Käse und Butter ». enthalten ist. -6. The method according to claim 5 » characterized in that the preparation in foods on milk bacsis, such as condensed milk». Milk powder, cream, yogurt, cheese and butter ». is included. - Nach demAfter this 7./Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-4 hergestelltes Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es Laktobakterien enthält, die an pathogene Bakterien bzw. deren Eiweiss spezifisch adaptiert sind.7./Verfahren according to one or more of claims 1-4 manufactured preparation, characterized in that it Contains lactobacteria that bind to pathogenic bacteria or whose protein is specifically adapted. 209808/1777209808/1777
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