DE1617718C - Process for the production of anti-Rh-gamma-globulin - Google Patents
Process for the production of anti-Rh-gamma-globulinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahrenzur Herstellung von Anti-Rh-Globulin.The invention relates to a method for producing anti-Rh globulin.
Fetale Erythroblastose ist eine hämolytische Krankheit, die bei Neugeborenen Gehirnschäden, Herzschäden oder den Tod verursachen kann. Diese Krankheit wird verursacht durch Antikörper gegen fötale Erythrozyten, die durch die Plazenta der Mutter zur Frucht gelangen. Dieses Krankheitsbild tritt allgemein auf bei Kindern von Eltern, deren Blut verschiedene Rhesusfaktoren hat, z. B. bei den Kindern einer Rh-negativen Mutter und eines Rh-positiven Vaters.Fetal erythroblastosis is a hemolytic disease that causes brain damage, heart damage in newborns or cause death. This disease is caused by antibodies against fetal erythrocytes that travel through the mother's placenta to the fruit. This clinical picture occurs generally on in children of parents whose blood has different Rhesus factors, e.g. B. with the children one Rh-negative mother and a Rh-positive father.
Wenn eine Frau, deren Rhesusfaktor von dem ihres Mannes verschieden ist, zum ersten Mal schwanger wird, können rote Blutkörperchen aus der Frucht in ihren Kreislauf gelangen. Wenn die Frau Rh-negativ und ihr Mann Rh-positiv ist, sind die fötalen roten Blutkörperchen gewöhnlich Rh-positiv. Antikörper zu den Rh-positiven roten Blutkörperchen bilden sich nur selten während der ersten Schwangerschaft im Kreislauf der Mutter, und das erste Kind bleibt unbeeinflußt. Nach der Schwangerschaft können die im Kreislauf der Mutter verbleibenden Rh-positiven fötalen Erythrozyten die Mutter so immunisieren, daß sie eine etwa 9- bis 20% ige Aussicht hat, Rh-Antikörper zu bilden. Während der folgenden Schwangerschaften gelangen die Rh-positiven Antikörper im Kreislauf der Mutter durch die Plazenta in den Kreislauf der Frucht und zerstören die fötalen roten Blutkörperchen und verursachen fetale Erythroblastose. Da etwa 15% der Bevölkerung Rh-negativ sind, ist die Krankheit nicht selten.When a woman whose rhesus factor is different from that of her husband becomes pregnant for the first time red blood cells from the fruit can enter their circulation. If the woman is Rh negative and her husband is Rh positive, the fetal red blood cells are usually Rh positive. Antibodies to Rh-positive red blood cells are rarely formed during the first pregnancy The mother's cycle, and the first child remains unaffected. After pregnancy, the Rh-positive fetal erythrocytes remaining in the mother's circulation immunize the mother so that it has about a 9-20% chance of producing Rh antibodies. During subsequent pregnancies the Rh-positive antibodies pass through the placenta in the mother's circulation and into the circulation of the mother Fruit and destroy the fetal red blood cells and cause fetal erythroblastosis. Since about 15% of the population are Rh negative, the disease is not uncommon.
Freda,Gorman und P ο 11 a c k berichteten, daß bei einer Rh-negativen Mutter durch intramuskuläre Injektion von Anti-Rh-y-Globulin innerhalb von 72 Stunden nach der Geburt die Bildung von Antikörpern, die fetale Erythroblastose bei der Frucht der nächsten Schwangerschaft verursachen können, im Kreislauf verhindert wird (Science, 18. 2. 1966, Bd. 151, Nr. 3712, S. 828 bis 830).Freda, Gorman and P ο 11 a c k reported that that in a Rh-negative mother by intramuscular injection of anti-Rh-γ-globulin within 72 hours after birth, the formation of antibodies, fetal erythroblastosis in the fruit the next pregnancy, is prevented in the circulatory system (Science, February 18, 1966, Vol. 151, No. 3712, pp. 828 to 830).
C oh η beschreibt in der USA.-Patentschrift 2 390 074 ein Verfahren zur Fraktionierung von Blut, bei dem y-Globuline hergestellt werden. Die nach dem Verfahren von C ο h η hergestellten y-Globuline enthalten 19 S-Globulin, Plasminogen und Lipoide. Dieses y-Globulin eignet sich zwar ausgezeichnet für die Prophylaxe von Krankheiten, wie Masern und Tetanus, jedoch sind das 19 S-Globulin, das Plasminogen und die Lipoide unnötige Verunreinigungen, die die Wirksamkeit hinsichtlich der Verhinderung der Immunisierung gegen den Rh-Faktor an den fötalen Erythrozyten verringern.C oh η is described in the USA patent 2,390,074 discloses a method for fractionating blood in which γ-globulins are produced. The after Process of C ο h η contain y-globulins produced 19 S-globulin, plasminogen and lipoids. This y-globulin is excellent for the prophylaxis of diseases such as measles and tetanus, however, 19 S-globulin, the plasminogen and the lipoids unnecessary contaminants, which are effective in preventing them the immunization against the Rh factor on the fetal erythrocytes.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Anti-D-Immunglobulin zu erzeugen, das frei von Plasminlipoiden und 19 S-Globulinen ist. Die Abwesenheit dieser Begleitsubstanzen ist für die Wirksamkeit in der Praxis von großer Bedeutung. Es ist '-bekannt, daß Antikörper häufig ein Enzym als Aktivator enthalten, das das Plasminogen aktiviert und auf diese Weise eine fibrinolytische Wirkung hervorruft. Wenn die Antikörperfraktion frei von * Plasmin und Plasminogen ist, dann können .die y-Globuline auch nicht während der Lagerung von den Enzymen abgebaut werden. .The invention was therefore based on the object of producing an anti-D immunoglobulin that is free from Plasmin lipoids and 19 S-globulins is. The absence of these accompanying substances is of great importance for the effectiveness in practice. It is known, that antibodies often contain an enzyme as an activator that activates the plasminogen and in this way produces a fibrinolytic effect. If the antibody fraction is free from * If plasmin and plasminogen are present, the y-globulins cannot be used during storage of the Enzymes are broken down. .
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Anti-D-Immunglobulin (Anti-Rh-y-Globulin) aus dieses enthaltendem menschlichem Blutplasma, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß manThe invention thus relates to a method for obtaining anti-D immunoglobulin (anti-Rh-y globulin) from this containing human blood plasma, which is characterized in that one
a) das Blutplasma auf etwa 1°C kühlt und den in der Kälte unlöslichen Niederschlag von der flüssigen Phase trennt,a) the blood plasma cools to about 1 ° C and the insoluble in the cold precipitate from the separates liquid phase,
b) diese flüssige Phase durch Zusatz von Methanol auf einen Methanolgehalt von 10,6 bis 10,8% bringt, auf etwa -5° C kühlt, einen pH-Wert von 7 bis 7,4 und eine Ionenkonzentration von 0,136 gl/Liter einstellt und den erhaltenen Niederschlag I von der flüssigen Phase I trennt,b) this liquid phase by adding methanol to a methanol content of 10.6 to 10.8% brings, when cooled to about -5 ° C, a pH value of 7 to 7.4 and an ion concentration of 0.136 g / liter adjusts and separates the precipitate I obtained from the liquid phase I,
c) die flüssige Phase I durch Zusatz von Methanol auf einen Methanolgehalt von 33,25 bis 33,35% bringt, eine Temperatur von etwa — 5° C aufrechterhält, durch Zugabe einer Pufferlösung einen pH-Wert von 6,7 bis 7,1 und eine Ionenkonzentration von 0,081 bis 0,091 gl/Liter einstellt und den erhaltenen Niederschlag II + III von der flüssigen Phase II + III trennt,c) the liquid phase I by adding methanol to a methanol content of 33.25 to 33.35% brings, maintains a temperature of about - 5 ° C, by adding a buffer solution Adjusts a pH value of 6.7 to 7.1 and an ion concentration of 0.081 to 0.091 gl / liter and separates the obtained precipitate II + III from the liquid phase II + III,
d) den Niederschlag II + III durch Zusatz von Wasser und Methanol in eine Suspension mit einem Methanolgehalt von 26,5 bis 26,9% überführt, darin eine Temperatur von etwa —5° C, einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4 und eine Ionenkonzentration von 0,0047 bis 0,0057 gl/Liter einstellt und die Suspension in eine flüssige Phase II + III und einen Niederschlag II 4- III W trennt,d) the precipitate II + III by adding water and methanol in a suspension with a methanol content of 26.5 to 26.9% converted, therein a temperature of about -5 ° C, a pH of 7.0 to 7.4 and an ion concentration of 0.0047 to 0.0057 gl / liter adjusts and separates the suspension into a liquid phase II + III and a precipitate II 4- III W,
e) den Niederschlag II + III W durch Zusatz von Wasser und Methanol in eine Suspension mit einem Methanolgehalt von 22,5 bis 22,9% Methanol überführt, darin eine Temperatur von etwa — 60C, einen pH-Wert von 5,0 bis 5,4 und eine Ionenkonzentration von 0,008 bis 0,018 gl/Liter einstellt, die Suspension in einen Niederschlag III und eine flüssige Phase III trennt und die flüssige Phase III filtriert,e) the precipitate II + III W is converted into a suspension with a methanol content of 22.5 to 22.9% methanol by adding water and methanol, therein a temperature of about −6 ° C. and a pH of 5.0 up to 5.4 and an ion concentration of 0.008 to 0.018 g / liter is set, the suspension is separated into a precipitate III and a liquid phase III and the liquid phase III is filtered,
f) die filtrierte flüssige Phase III durch Zusatz von Methanol auf einen Methanolgehalt von 33,0 bis 33,4% bringt, darin eine Temperatur von —6,0 bis -7,00C, einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4 und eine Ionenkonzentration von 0,055 bis 0,065 gl/ Liter einstellt, daraus einen Niederschlag II abtrennt und diesen gefriertrocknet.f) the filtered liquid phase III brings by adding methanol to a methanol content of from 33.0 to 33.4%, in a temperature from -6.0 to -7.0 0 C, a pH of 7.0 to 7.4 and an ion concentration of 0.055 to 0.065 g / liter is set, a precipitate II is separated therefrom and freeze-dried.
Das so hergestellte Anti-D-Immunglobulin ist speziell ein y-G-Globulin, das frei von Plasmin, Lipoiden und 19 S-Globulinen ist. Die erfindungsgemäß hergestellten Antikörper haben eine höhere Affinitätskonstante für Rh-Antigen als die von C ο h η und Mitarbeitern isolierte y-Globulinfraktion. Die Lösung ist klarer und praktisch frei von Aggregaten. Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet auch in industriellem Maßstab eine hervorragende Gleichmäßigkeit der so hergestellten Antikörper. Wegen der Freiheit von Plasmin und Plasminogen können die y-Globuline auch nicht während der Lagerung von Enzymen abgebaut werden. Es gelingt daher, einen stabilen hochwirksamen Antikörper herzustellen, was nach den bekannten Verfahren nicht möglich war.The anti-D immunoglobulin produced in this way is specifically a y-G globulin that is free from plasmin, Lipoids and 19 S-globulins is. The antibodies produced according to the invention have a higher Affinity constant for Rh antigen as the y-globulin fraction isolated by C ο h η and co-workers. the Solution is clearer and practically free of aggregates. The method according to the invention also ensures an excellent uniformity of the antibodies thus produced on an industrial scale. Because of the The y-globulins cannot be free from plasmin and plasminogen even during storage of Enzymes are broken down. It is therefore possible to produce a stable, highly effective antibody, what according to the known method was not possible.
Die Möglichkeit, menschliches Plasma zu fraktionieren, hängt von der Löslichkeit der verschiedenen Komponenten des Plasmas ab. In jeder Phase der Fraktionierung hängen die Abtrennung der Fraktion und die schließliche Entfernung der Komponenten; die im Anti-Rh-Globulin unerwünscht sind, von der genauen Regelung von pH, Temperatur, Konzentration des Fällmittels und von der Ionenstärke des Systems ab.The ability to fractionate human plasma depends on the solubility of the various Components of the plasma. In each phase of fractionation depend on the separation of the fraction and the eventual removal of the components; which are undesirable in the anti-Rh globulin, from the precise control of pH, temperature, concentration of the precipitant and the ionic strength of the Systems.
Verschiedene organische Lösungsmittel mit niedriger Dielektrizitätskonstante, z. B. Aceton und Aiko-Various low dielectric constant organic solvents, e.g. B. Acetone and Aiko-
hole, fällen Proteine und sind bei der Fraktionierung von Plasma verwendet worden. Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird Methanol als organisches Lösungsmittel verwendet. Die Fähigkeit, die entscheidend wichtigen Ionenkonzentrationen bei den verschiedenen Phasen der Fraktionierung aufrechtzuerhalten, hängt von der Verwendung von Methanol ab.hole, precipitate proteins and have been used in plasma fractionation. In the procedure according to In the invention, methanol is used as the organic solvent. The ability that is crucial maintaining important ion concentrations at the various stages of fractionation depends on the use of methanol.
Um eine Denaturierung der Proteine während der Fraktionierung zu verhindern, wird die Fällung bei niedrigen Temperaturen vorgenommen. Da die Proteinlöslichkeit temperaturabhängig ist, muß die Temperatur, die Tür jede Stufe der Fraktionierung gewählt wird, die niedrigste mögliche Temperatur sein, die die gewünschte Trennung zuläßt, um die Denaturierung zu verhindern.In order to prevent denaturation of the proteins during fractionation, precipitation is carried out at made at low temperatures. Since the protein solubility is temperature-dependent, the temperature, the door each stage of fractionation is chosen to be the lowest possible temperature that the allows desired separation to prevent denaturation.
Die Fraktionierung von vollständigem menschlichem Plasma gemäß dem Fließschema wird wie folgt vorgenommen: Das Plasma wird auf etwa 1°C gekühlt und dann zentrifugiert, wobei ein in der Kälte unlöslicher Niederschlag von einer obenstehenden Flüssigkeit abgetrennt wird. Die obenstehende Flüssigkeit wird weiter fraktioniert, wobei ein Niederschlag I und eine obenstehende Flüssigkeit I erhalten werden. Der Niederschlag I, der hauptsächlich aus Fibrinogen besteht, wird verworfen. Die obenstehende Flüssigkeit I wird weiter fraktioniert, wobei die obenstehende Flüssigkeit II + III und der Niederschlag II + III erhalten werden. Die obenstehende Flüssigkeit II + III, die verworfen wird, enthält «- und //-Globulin und Lipoide. Der Niederschlag II + III besteht hauptsächlich aus //- und )-Globulinen und Isoagglutininen, enthält jedoch auch Prothrombin, Plasminogen, Cholesterin und andere Lipoide. Der Niederschlag II + III ergibt bei weiterer Fraktionierung die obenstehende Flüssigkeit II + III W und die Fällung II + III W. Das //-Globulin, Cholesterin und andere Lipoide werden weitgehend in der verworfenen obenstehenden Flüssigkeit II + III W entfernt. Der Niederschlag II + III W besteht hauptsächlich aus y-Globulinen, Isoagglutinin, Plasminogen und Prothrombin und etwas /i-Globulin, Cholesterin und anderen Lipoiden. Bei weiterer Fraktionierung ergibt der Niederschlag II + III W die obenstehende Flüssigkeit III + Niederschlag III. Der Niederschlag III, der verworfen wird, enthält Isoagglutinine, Plasminogen und Prothrombin. Die obenstehende Flüssigkeit III besteht hauptsächlich aus y-Globulinen und geringfügigen Mengen an Fibrinogen und Lipoiden. Die Endstufe der Fraktionierung ergibt den Niederschlag II, der im wesentlichen reines y-G-Globulin ist, das fast vollständig frei von 19 S-Globulin, "Plasminogen und Lipoiden ist.The fractionation of whole human plasma according to the flow sheet is as follows made: The plasma is cooled to about 1 ° C and then centrifuged, taking one in the cold insoluble precipitate is separated from an above liquid. The above liquid is further fractionated to give a precipitate I and a liquid I above. The precipitate I, which consists mainly of fibrinogen, is discarded. The above liquid I is fractionated further, the above liquid II + III and the precipitate II + III being obtained will. The above liquid II + III, which is discarded, contains «- and // - globulin and Lipoids. The precipitate II + III consists mainly of // - and) -globulins and isoagglutinins, however, it also contains prothrombin, plasminogen, cholesterol and other lipoids. The precipitation II + III results in further fractionation the above liquid II + III W and the precipitation II + III W. That // - Globulin, cholesterol and other lipoids are largely discarded in the above liquid II + III W removed. The precipitate II + III W consists mainly of y-globulins, isoagglutinin, Plasminogen and prothrombin and some / i-globulin, Cholesterol and other lipoids. With further fractionation, the precipitate yields II + III W the above liquid III + precipitate III. The precipitate III, which is discarded, contains Isoagglutinins, plasminogen and prothrombin. The above liquid III mainly consists from y-globulins and small amounts of Fibrinogen and lipoids. The final stage of the fractionation gives the precipitate II, which is essentially pure y-g globulin that is almost completely is free of 19 S-globulin, "plasminogen and lipoids.
Der nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellte Niederschlag II ist ein Anti-Rh-y-Globulin.The precipitate II produced by the process according to the invention is an anti-Rh-γ globulin.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.The invention is illustrated in more detail by the following example.
Menschliches Blutplasma wird auf 1 ± Γ C gekühlt. Das Plasma wird in einer Sharples-Superzentrifuge mit einem dreifachen Flügel bei 1 ± 1°C bei einer Zulaufmenge von 1000 ± 50 ml/Min, zentrifugiert.. Der in der Kälte unlösliche Niederschlag wird verworfen. Der pH-Wert der obenstehenden Flüssigkeit wird auf 7,2 ± 0,2 eingestellt. Der Methanolgehalt der Charge wird durch Zusatz von 177 ml 71%igem (V/V) Methanol pro Liter Plasma auf 10,7 ± 0,1 % (V/V) gebracht. Die Lösung wird 1 Stunde langsam bei -5 ±0,5° C gerührt und bei Nacht bei -5 ± 0,50C gehalten.Human blood plasma is cooled to 1 ± Γ C. The plasma is centrifuged in a Sharples supercentrifuge with a triple blade at 1 ± 1 ° C. with a feed rate of 1000 ± 50 ml / min. The precipitate, which is insoluble in the cold, is discarded. The pH of the above liquid is adjusted to 7.2 ± 0.2. The methanol content of the batch is brought to 10.7 ± 0.1% (V / V) by adding 177 ml of 71% (V / V) methanol per liter of plasma. The solution is slowly stirred for 1 hour at -5 ± 0.5 ° C and kept at overnight at -5 ± 0.5 0 C.
Die Lösung wird in einer Sharples-Superzentrifuge bei — 5 ± 0,5° C bei einer Zulaufmenge von 1000 ± 100 ml/M in. zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit I wird in einem Gefäß aufgefangen, das mit einer Kühlvorrichtung versehen ist.The solution is in a Sharples supercentrifuge at -5 ± 0.5 ° C with a feed rate of 1000 ± 100 ml / M in. Centrifuged. The above liquid I is collected in a vessel fitted with a cooling device.
Pro Liter der obenstehenden Flüssigkeit I werden unter Rühren 60l· ml 71%iges (V/V) Methanol, 0,88 ml 10n-Essigsäure und 0,44 ml 4n-Natriumacetat gegeben. Hierdurch wird die Methanolkonzentration aufPer liter of the above liquid I, 60 l ml of 71% (V / V) methanol, 0.88 ml 10N acetic acid and 0.44 ml 4N sodium acetate. This increases the methanol concentration
ίο 33,3%, die Ionenstärke auf 0,086 gl/Liter und der pH-Wert auf 6,9 gebracht. Die Lösung wird auf eine Temperatur von - 5 ± 0,5° C gebracht und 2 Stunden langsam gerührt. Die Lösung wird dann 16 Stunden bei -5,5 ± 0,50C stehengelassen.ίο 33.3%, the ionic strength brought to 0.086 gl / liter and the pH value to 6.9. The solution is brought to a temperature of -5 ± 0.5 ° C and slowly stirred for 2 hours. The solution is then left to stand at -5.5 ± 0.5 ° C. for 16 hours.
Die Lösung wird in der obengenannten Sharples-Superzentrifuge bei — 5 ± 0,50C in einer Menge von 1000 ml ± 100 ml/Min, zentrifugiert. Der Niederschlag II + III wird aus dem Gefäß genommen, gewogen und bei einer Temperatur von -20° C aufbewahrt.The solution is in the above-Sharples Super Centrifuge at - 5 ± 0.5 0 C in an amount of 1000 ml ± 100 ml / min, centrifuged. The precipitate II + III is removed from the vessel, weighed and stored at a temperature of -20 ° C.
Während die Temperatur bei 00C gehalten wird, wird der Niederschlag II + III in 2 Raumteilen (doppeltes ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II + III) Wasser von 00C, das sich im Gleichgewicht mit Eis befindet, durch Zerkleinern der Paste mit einem Spatel aus nichtrostendem Stahl in einem Behälter aus nichtrostendem Stahl und Rühren suspendiert, bis die Suspension gleichmäßig ist. 3 Raumteile (dreifaches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II + III) einer O,0187molaren Dinatriumphosphatlösung werden unter Rühren zur Suspension gegeben. Nach Zugabe von 20 Raumteilen (20faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II + III) Wasser von 0° C wird noch 30 bis 60 Minuten bei 0° C gerührt. Der pH-Wert beträgt 7,2 ± 0,2. Um einen Methanolanteil von 26,7 ± 0,2% zu erhalten, werden 15 Raumteile (15faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II + III) 71%iges (V/V) Methanol bei - 10°C zugesetzt. Die Ionenstärke der Lösung beträgt 0,0052 ± 0,0005 gl/Liter.While the temperature is kept at 0 0 C, the precipitate II + III in 2 parts by volume (twice the original weight of the precipitate II + III) water of 0 0 C, which is in equilibrium with ice, by crushing the paste with a spatula stainless steel suspended in a stainless steel container and stirring until the suspension is uniform. 3 parts by volume (three times the original weight of the precipitate II + III) of a 0.0187 molar disodium phosphate solution are added to the suspension with stirring. After adding 20 parts by volume (20 times the original weight of the precipitate II + III) of water at 0 ° C., the mixture is stirred at 0 ° C. for a further 30 to 60 minutes. The pH is 7.2 ± 0.2. In order to obtain a methanol content of 26.7 ± 0.2%, 15 parts by volume (15 times the original weight of the precipitate II + III) 71% (V / V) methanol at -10 ° C are added. The ionic strength of the solution is 0.0052 ± 0.0005 gl / liter.
Die Lösung wird auf eine Temperatur von —5° C gebracht und in der obengenannten Sharples-Superzentrifuge bei einer Temperatur von —5,5 ± 0,50C in einer Menge von 500 ± 50 ml/Min, zentrifugiert. Der Niederschlag II + III W wird aus dem Gefäß genommen und gewogen.The solution is brought to a temperature of -5 ° C and in the above-Sharples Super Centrifuge at a temperature of -5.5 ± 0.5 0 C in an amount of 500 ± 50 ml / min, centrifuged. The precipitate II + III W is removed from the vessel and weighed.
Der Niederschlag II + III W wird in 2 Raumteilen (doppeltes Gewicht des Niederschlages II + III W) Eiswasser suspendiert. Zur Suspension werden 2 Raumteile (2faches Gewicht des Niederschlages II + III W) 0,175molares Natriumacetat gegeben. Ein weiterer Raumteil (Gewicht des Niederschlages II + III W) Eiswasser, das 0,216 ml Acetatpuffer enthält, wird pro Gramm des Niederschlages II + III W, der in Pastenform vorliegt, zugesetzt. Der Acetatpuffer wird hergestellt durch Verdünnung von 40 ml 10n-Essigsäure und 20 ml 4n-Natriumacetat auf 100 ml mit destilliertem Wasser. Der pH-Wert der Lösung beträgt 5,2 ± 0,2. Die Lösung wird 1 Stunde langsam gerührt. Dann werden 13,5 Raumteile (13,5faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II+ III W) Eiswasser und 8,66 Raumteile (8,66faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II + III W) 71%iges (V/V) Methanol zugesetzt, während die Temperatur bei -6 ± 0,5°C gehajten wird. Die Lösung wird 1 StundeThe precipitation II + III W is divided into 2 parts of the space (twice the weight of the precipitation II + III W) Suspended ice water. Two parts of the volume are added to the suspension (twice the weight of the precipitate II + III W) 0.175 molar sodium acetate. Another part of the room (weight of the precipitation II + III W) Ice water containing 0.216 ml of acetate buffer is used per Grams of the precipitate II + III W, which is in paste form, added. The acetate buffer is prepared by diluting 40 ml of 10N acetic acid and 20 ml of 4N sodium acetate to 100 ml with distilled Water. The pH of the solution is 5.2 ± 0.2. The solution is slowly stirred for 1 hour. Then 13.5 parts by volume (13.5 times the original weight of the precipitate II + III W) become ice water and 8.66 parts of space (8.66 times the original weight of the precipitation II + III W) 71% (V / V) Methanol added while maintaining the temperature at -6 ± 0.5 ° C. The solution is 1 hour
langsam gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Lösung enthält 22,7% Methanol und hat einen pH-Wert von 5,2 und eine lonenkonzentration von 0,015 gl/Liter.stirred slowly and left to stand overnight. The solution contains 22.7% methanol and has a pH value of 5.2 and an ion concentration of 0.015 gl / liter.
Die Lösung wird in einer Sharples-Superzentrifuge des vorstehend genannten TyRS bei einer Temperatur von — 6 ± 0,5" C und einer Zuflußmenge von 500 ± 50 ml/Min, zentrifugiert. Das Volumen der obenstehenden Flüssigkeit III wird gemessen. Der Niederschlag III wird verworfen.The solution is in a Sharples supercentrifuge of the aforementioned TyRS at a temperature of -6 ± 0.5 "C and an inflow rate of 500 ± 50 ml / min, centrifuged. The volume of the Liquid III above is measured. The precipitate III is discarded.
Die obenstehende Flüssigkeit III wird mit 0,4% (Gew./Vol.) Kieselgur behandelt und 20 Minuten gerührt. Das Gemisch wird mit einer Eitel-Filterpresse mit Filterkissen D-8 filtriert.The above liquid III is 0.4% Treated (w / v) kieselguhr and stirred for 20 minutes. The mixture is filtered with a Eitel filter press filtered with filter pad D-8.
Ein Acetatpuffer von pH 5,2 wird wie folgt hergestellt: 25 ml 4n-Natriumacetat und 3 ml 10n-Essigsäure werden mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Der Acetatpuffer wird , mit 22,7%igem Methanol lOOfach verdünnt. Diese Lösung hat eine Ionenstärke von 0,01 gl/Liter. Eine Eitel-Filterpresse wird vorher mit dem Acetatpuffer plus Kieselgur (0,08 g/cm2 Kissenoberfläche) unter Verwendung von 6,2 ml Acetat-Methanol-Puffer/cm2 Kissenfläche überzogen. Die obenstehende Flüssigkeit III wird filtriert und das Filtrat mit 50 mMol (2,923 g) Natriumchlorid und 7,65 ml 1 molarem Natriumbicarbonat pro Liter der filtrierten obenstehenden Flüssigkeit III versetzt.An acetate buffer of pH 5.2 is prepared as follows: 25 ml of 4N sodium acetate and 3 ml of 10N acetic acid are made up to 100 ml with distilled water. The acetate buffer is diluted 100-fold with 22.7% strength methanol. This solution has an ionic strength of 0.01 gl / liter. An Eitel filter press is previously coated with the acetate buffer plus diatomaceous earth (0.08 g / cm 2 cushion surface) using 6.2 ml acetate-methanol buffer / cm 2 cushion surface. The liquid III above is filtered and the filtrate is admixed with 50 mmol (2.923 g) sodium chloride and 7.65 ml 1 molar sodium bicarbonate per liter of the filtered liquid III above.
Das Filtrat hat einen pH-Wert von 7,2 ± 0,2.
Zum Filtrat werden 160 Raumteile 100%ige.s Methanol bei einer Temperatur unter -5° C gegeben. Das
Gemisch wird 1 Stunde langsam bei einer Temperatur von -6,5 ±0,5° C gerührt. Das Gemisch wird über
Nacht stehengelassen.The filtrate has a pH of 7.2 ± 0.2.
160 parts by volume of 100% strength methanol are added to the filtrate at a temperature below -5 ° C. The mixture is slowly stirred for 1 hour at a temperature of -6.5 ± 0.5 ° C. The mixture is left to stand overnight.
Die Lösung wird in einer Sharples-SuperzentrifugeThe solution is in a Sharples supercentrifuge
des obengenannten Typs bei einer Temperatur vonof the above type at a temperature of
-6 ± 0,50C und bei einer Durchflußmenge von-6 ± 0.5 0 C and at a flow rate of
ίο 500 ± 50 ml/Min, zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit wird verworfen.ίο 500 ± 50 ml / min, centrifuged. The above Liquid is discarded.
Der Niederschlag II wird entfernt, in 4 Raumteilen Eiswasser suspendiert und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wird gewogen und bei einer Temperatur unterhalb von —5° C aufbewahrt.The precipitate II is removed in 4 parts of the room Suspended ice water and freeze-dried. The freeze-dried powder is weighed and at a Store at a temperature below -5 ° C.
Der gemäß diesem Beispiel hergestellte Niederschlag II besteht zu 99% aus y-G-Globulin, das frei von Plasminogen, Lipoiden und 19 S-Globulinen ist und eine elektrophoretische Beweglichkeit von nicht mehr als 1,1 χ 10"5 cm2/V/Sek. in Veronalpuffer, einen pH-Wert von 8,6 und eine Ionenstärke von 0,1 gl/Liter hat. Der Niederschlag II enthält außerdem etwa 0,99% Natriumchlorid.The precipitate II produced according to this example consists of 99% yG-globulin, which is free from plasminogen, lipoids and 19 S-globulins and has an electrophoretic mobility of no more than 1.1 χ 10 " 5 cm 2 / V / sec. in veronal buffer, has a pH of 8.6 and an ionic strength of 0.1 gl / liter. Precipitate II also contains about 0.99% sodium chloride.
Plasmaplasma
Kühlen auf 1°C
Zentrifugieren 1 l/Min.Cool to 1 ° C
Centrifugation 1 l / min.
In der Kälte' unlöslichen Niederschlag verwerfenDiscard the insoluble precipitate in the cold
Flüssige Phase eingestellt aufLiquid phase adjusted to
pH : 7,2±0,2pH: 7.2 ± 0.2
Methanol 10,7 ±0,2%Methanol 10.7 ± 0.2%
Ionenkonzentration 0,136 gl/LiterIon concentration 0.136 gl / liter
Temperatur -2±2°CTemperature -2 ± 2 ° C
Niederschlag verwerfenDiscard the precipitate
Flüssige Phase I eingestellt aufLiquid phase I adjusted to
pH 6,9±0,2pH 6.9 ± 0.2
Methanol 33,3 ±0,05%Methanol 33.3 ± 0.05%
Ionenkonzentration 0,086 ±0,005 gl/LiterIon concentration 0.086 ± 0.005 gl / liter
Temperatur — 5 ± 2° CTemperature - 5 ± 2 ° C
Niederschlag II + IIIPrecipitation II + III
pH 7,2±0,2pH 7.2 ± 0.2
Methanol -26,7 ±0,2%Methanol -26.7 ± 0.2%
Ipnenkonzentration .... 0,0052 ± 0,0005 gl/Liter Temperatur — 5 ± 2%Iin concentration .... 0.0052 ± 0.0005 gl / liter temperature - 5 ± 2%
Flüssige Phase verwerfenDiscard the liquid phase
Niederschlag II + III WPrecipitation II + III W
pH 5,2±0,2pH 5.2 ± 0.2
Methanol 22,7 ±0,2%Methanol 22.7 ± 0.2%
Ionenkonzentration 0,013 ±0,005 gl/LiterIon concentration 0.013 ± 0.005 gl / liter
Temperatur -6±2°CTemperature -6 ± 2 ° C
Flüssige Phase verwerfenDiscard the liquid phase
Niederschlag III verwerfenDiscard precipitate III
Flüssige Phase IIILiquid phase III
Filterfilter
Filtral eingestellt aufFiltral set on
pH 7,2±0,2pH 7.2 ± 0.2
Methanol 33,2 ί 0,2%Methanol 33.2 ί 0.2%
lonenkonzcnlration 0,06 ± 0,005 gl/Literion concentration 0.06 ± 0.005 g / liter
Temperatur — 6,5 ± 2" CTemperature - 6.5 ± 2 "C
Niederschlag II
suspendieren in O'C, Wasser
(4 bis 5 VoI.)
lagern bei -20" CPrecipitation II
suspend in O'C, water
(4 to 5 VoI.)
store at -20 "C
Flüssige Phase verwerfenDiscard the liquid phase
Claims (1)
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