DE1617545A1

DE1617545A1 - Antigen-free vaccines

Info

Publication number: DE1617545A1
Application number: DE19671617545
Authority: DE
Inventors: Diether Prof Dr Jachertz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1967-06-19
Filing date: 1967-06-19
Publication date: 1971-04-01
Also published as: IL30168A; NO124840B; NL6808486A; BE716806A; DK119724B; DE1617545C2; FR7781M; FR1588820A; IE32140L; GB1229888A; ES355121A1; BR6899970D0; IL30168A0; AT282821B; IE32140B1; CH513241A

Description

5407 A 6. Juni 19675407 A June 6, 1967

Dr.Tg/Li \ Dr.Tg/Li \

Antigen-free vaccines

Zur Zeit werden zur aktiven Immunisierung entweder,sogenannte Totvaccinen, abgetötete virulente Erreger, oder Lebendvaccinen,. nicht abgetötete avirulente Erreger verwendet. Daneben sind ToaeLde (entgiftete Bakterien) , »Toxine sowie Untereinheiten von Viren als Impfstoffe in Gebrauch. Diese herkömmlichen Vaccinen stellen hohe Anforderungen an die Sorgfalt des Herstellers. Bei den Totvaccinen mußdie Inaktivierung sorgfältig überwacht werden, da ungenügende Inaktivierung des natürlichen Antigens zu unerwünschten . Nebenwirkungen beim Impfling führen, andererseits aber durch die Inaktivierung das natürliche Antigen bis zu einem ge·" wiesen Grade verändert -oder geschädigt werden kann* Auch eine ungenügende Attenuierung der Viren in Impfstoffen .aus vermehrungsfähigen Viren könnte unübersehbare Auswirkungen haben. Bei der Herstellung von Impfstoffen sind daher auf-, wendigej zeitraubende und kostspielige Kontrollen notwendig. Trotzdem sind ifnverträglichkeifa&ktionen beschrieben worden.At present, for active immunization either, so-called Dead vaccines, killed virulent pathogens, or live vaccines. non-killed avirulent pathogens are used. Next to it are ToaeLde (detoxified bacteria), »Toxins and subunits of viruses in use as vaccines. These conventional vaccines are very demanding to the care of the manufacturer. With the dead vaccines it must Inactivation must be carefully monitored as it is insufficient Inactivation of the natural antigen to undesirable. Side effects lead to the vaccinee, but on the other hand by inactivating the natural antigen up to a ge · " showed degrees -or can be damaged * Also insufficient attenuation of viruses in vaccines Viruses capable of replication could have unmistakable effects. In the manufacture of vaccines, therefore, Manoeuvrable, time-consuming and costly controls are necessary. Nonetheless, incompatible functions have been described.

Die Nachteile der beschriebenen Art könnten überwunden werden, wenn man zur aktiven Immunieierung nieht das Antigen selbst, sondern eine informatorische Ribonucleinsäüre (BNS) verwendenThe disadvantages of the type described could be overcome if one does not use the antigen itself for active immunization, but use an informational ribonucleic acid (BNS)

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würde, die den gesamten Bauplan der gewünschten Antikörper enthält. Die Verwendung einer solchen informatorischen RNS als Impfstoff hätte gegenüber den bisher üblichen Impfstoffen beträchtliche Vorteile:that would have the entire blueprint of the desired antibodies contains. The use of such an informational RNA as a vaccine would have been compared to the previously usual Vaccines Significant Benefits:

1. Die informatorische RNS ist frei von Verunreinigungen· Nebenreaktionen beim Impfling sind^nicht xu befürchten.1. The informational RNA is free from impurities · Side reactions in the person being vaccinated are not to be feared.

2. Die Immunität nach der Impfung wird schnell exwicht, weil dem Makroorganismus direkt der Bauplan für die Anti* körpersynthese vermittelt und eine Antlgenverarbeitung dadurch im Makroorganismus unnötig wird.2. Post-vaccination immunity is rapidly increasing, because the blueprint for the synthesis of antibodies and an application processing are conveyed directly to the macroorganism thereby becomes unnecessary in the macroorganism.

3. Es können Immunisierungen ersielt werden, die bisher mangels geeigneter Impfstoffe nicht möglich waren, da die informatorische RNS in vitro synthetisiert werden kann.3. Immunizations can be obtained that are up to now were not possible due to the lack of suitable vaccines, since the informational RNA can be synthesized in vitro.

Ea ist bereits bekannt, daß man aus immunologisch kompetenten Zellen, beispielsweise Peritoneal-Exsudatzellen, informatorisch aktive Ribonucleinsäure (RNS) isolieren kann, wenn diese Zellen in vitro vorher mit einem Antigen stimuliert wurden. Auch zellfreie Systeme aus Peritoneal·· Exsudatzellen sind in der Lage, nach einem Antigenreiz eine informatorische RNS zu synthetisieren. Die informatorisch· RNS wurde auch^S^a*5f ihren Informationsinhalt geprüft. Dabei wurde gefunden, daß sie in der Lage ist, Kulturen lymphatischer Zellen sowie zellfreie Systeme aus MiIx und Peritoneal-Exsudatzellen zur Antikörpersynthese zu veranlassen. (Z. med. Mikroblol. Immunol. 152. 1-19f 20-32; 33-kki 112-1331 262-272 (1966), ZbI. Bakter. I Orig. 199. 315-328 (1966)).It is already known that informational active ribonucleic acid (RNA) can be isolated from immunologically competent cells, for example peritoneal exudate cells, if these cells have previously been stimulated in vitro with an antigen. Cell-free systems made from peritoneal exudate cells are also able to synthesize an informational RNA after an antigen stimulus. The informational · RNS was also checked ^ S ^ a * 5f for its informational content. It was found that it is able to induce cultures of lymphatic cells and cell-free systems of MiIx and peritoneal exudate cells to synthesize antibodies. (. Z. med Mikroblol Immunol 152 1-19f 20-32;... 33-kki 112-1331 262-272 (1966), Zbi Bakter I Orig 199315-328 (1966)....).

Bs wurde nun gefunden, daß man informatorisch aktive RNS in Makroorganismen (Menschen und Tier·) injizieren kann und ^! daß diese Makroorganismen im Anschluß an dl· Injektion Antikörper bilden und «ine belastbar· Immunität entwickeln.It has now been found that informational active RNA can be injected into macroorganisms (humans and animals) and ^! that these macroorganisms form antibodies following the injection and develop a resilient immunity.

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Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend die Herstellung einer Vaccine, die dadurch gekennzeichnet ist, däi man informatorische Ribonukleinsäure in an sich bekannter Weise isoliert, sterilisiert und gegebenenfalls mit einem Adjuvans versetzt. , -The invention accordingly relates to the production of a vaccine which is characterized in that one informational ribonucleic acid isolated, sterilized and optionally with an adjuvant in a manner known per se offset. , -

Die als Grundlage für die Vaccine dienende informatorische RNS erhält man, indem man immunologisch kompefce Zellen oder vorzugsweise zellfreie Systeme aus immunologisch kompetenten Zellen mit dem entsprechenden Antigen stimuliert. Unter "immunologisch kompetenten Zellen" sind solche Zellen zu verstehen, die in der Lage sind, auf¹ einen primären Antigenstimulus mit der Bildung von informatorischer RNS zu reagieren. Die kompetenten Zellen befinden sich in der Lymphe, in Lymphknoten, in der Milz, in Exsudaten - zum Λ The informational RNA serving as the basis for the vaccine is obtained by stimulating immunologically competent cells or, preferably, cell-free systems of immunologically competent cells with the corresponding antigen. By "immunologically competent cells" such cells are to be understood which are able to respond to a primary antigen stimulus ¹ with the formation of informational RNA. The competent cells are in the lymph, in lymph nodes, in the spleen, in exudates - to the Λ

Beispiel im Peritoneal-Exsudat - und insbesondere in den peripheren Leukozyten (Blut). Die Zellen können menschlicher oder tierischer Herkunft sein, je nachdem die erfindungsgemäß erhaltene Vaccine bei Menschen oder Tieren Anwendung finden soll. Zur Herstellung einer Vpccine für eine bestimmte Spezies wird daher zweckmäßig von immunologisch kompetenten Zellen dieser betreffenden Spezies ausgegangen. Menschliche informatorische RNS kann zum Beispiel aus peripheren Leukozyten gewonnen werden, die als Nebenprodukt bei der Plasmagewinnung anfälen.Example in the peritoneal exudate - and especially in the peripheral ones Leukocytes (blood). The cells can be of human or animal origin, depending on the vaccines obtained according to the invention are to be used in humans or animals. To make a Vpccine for a particular species is therefore useful from immunologically competent cells of this species were assumed. Human informational RNA can for example be obtained from peripheral leukocytes which arise as a by-product of plasma recovery.

Zur Stimulierung des immunologisch kompetenten Zellmaterials verwendet man Antigene und Toxirie aus Bakterien, Viren IAntigens and toxicity from bacteria, viruses I are used to stimulate the immunologically competent cell material

bzw. deren Untereinheiten sowie Schlangengift usw.or their sub-units as well as snake venom, etc.

Als bakterielle Ausgangsstoffe seien z.B. Tetanus- und Diphterietoxin genannt, ferner die Stoffwechsel- oder Zerfallsprodukte von Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis sowie von Salmonellen, Shigellen, Bruce11en und .Streptokokken. Viren und deren Untereinheiten sind z.B. Influenzaviren, Influenzahämaglutinin, Polioviren oder deren Proteinhülle, Masern-, Tollwut-, MKS-, Pocken-, Schweinepest-, Staupe-, Hepatitis-contagiosa-canis- ,sowie Encephalitisviren. As bacterial starting materials, e.g. tetanus and Diphtheria toxin called, also the metabolism or decay products from Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis and from Salmonella, Shigella, Bruce11en and Streptococci. Viruses and their subunits are e.g. influenza viruses, Influenza hemaglutinin, polioviruses or their protein envelope, measles, rabies, FMD, smallpox, swine fever, Distemper, hepatitis contagiosa canis and encephalitis viruses.

Verwendet man zur Gewinnung der informatorischen RNS und zur Herstellung der Vaccine ein zelluläres System, so kann man allgemein wie folgt verfahrentIf a cellular system is used to obtain the informational RNA and to produce the vaccine, one can generally proceed as follows

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Eine Zellkultur immunologisch kompetenter ZeIlen(zum Beispiel menschlicher Leukozyten) wird mit einer vorher zu bestimmenden optimalen Dosis des Antigens (in der Regel ein Antigenpartikel pro 100 Zellen) stimuliert und 5 -₄ 60 Minuteiu't vorzugsweise etwa 20 Minuten lang be,i ca. 37 C bebrütet. Dann wird die Zellkultur schnell auf mindestens 0 C gekühlt und gewaschen. Aus den gewaschenen Zellen wird die informatorische RNS nach bekannten Verfahren, vorzugsweise nach Kirby, isoliert und durch Sterilfiltration oder 5 minütiges Erhitzen auf ca. 100⁰C sterilisiert. Das erhaltene Produkt stellt die Vaccine dar} sie kann mit einem Adjuvans, zum Beispiel Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, vermischt werden. -..<·*A cell culture of immunologically competent cells (for example human leukocytes) is stimulated with an optimal dose of the antigen to be determined beforehand (usually one antigen _{particle per 100 cells) and lasted for 5 - 4} 60 minutes, preferably about 20 minutes. 37 C incubated. The cell culture is then rapidly cooled to at least 0 ° C. and washed. The informational RNA is isolated from the washed cells according to known methods, preferably according to Kirby, and ^{sterilized by sterile filtration or heating at approx. 100 °} C. for 5 minutes. The product obtained is the vaccine; it can be mixed with an adjuvant, for example aluminum hydroxide or aluminum phosphate. - .. <· *

Geht man von einem zellfreien System aus, so verfährt man vorteilhaft wie folgt:If one assumes a cell-free system, then one proceeds advantageous as follows:

Gewaschene, immunologisch kompetente Zellen (zum Beispiel menschliche oder tierische Leukozyten aus dem peripheren Blut) werden in einer Pufferlösung der Molarität 0,01 0,15, vorzugsweise etwa 0,1 vom pH-Wert 7,6 - 8,6, vorzugsweise etwa 7i8» aufgenommen. Am besten eignet sich ein Tris/Maleinsäure- oder Tris/HCl-Puffer. Die Zellen werden durch mehrmaliges Einfrieren unfl Auftauen zerstört und das Zellhomogenat etwa 30 Minuten bei 30*000 g und 0°C oder unterhalb von 0°C zentrifugiert. Der nach Zentrifugation erhaltene Überstand ist das zellfreie System, das alle lösliehen Inhaltsstoffe der Zellen enthält. Es wird mit Desoxyribonuclease behandelt. Anschließend wird es mit einer optimalen Dosis eines entsprechenden Antigens stimuliert und 2 - 60 Minuten lang, vorzugsweise etwa 10 Minuten lang, bei etwa 37 C inkubiert. Die weitere Verarbeitung erfolgt wie oben.Washed, immunologically competent cells (for example human or animal leukocytes from the peripheral Blood) are in a buffer solution of molarity 0.01 0.15, preferably about 0.1 with a pH of 7.6-8.6, preferably about 7.18 ». One is best suited Tris / maleic acid or Tris / HCl buffer. The cells will destroyed by repeated freezing and thawing and the cell homogenate for about 30 minutes at 30 * 000 g and 0 ° C or centrifuged below 0 ° C. The supernatant obtained after centrifugation is the cell-free system, all of which are soluble Contains ingredients of the cells. It is treated with deoxyribonuclease. Then it will be with a optimal dose of an appropriate antigen and stimulated for 2 to 60 minutes, preferably for about 10 minutes incubated about 37 C. The further processing takes place as above.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet zahlreiche Vorteile für die Herstellung von Impfstoffen. Der bei der üblichen Herstellung-von Vnccinen notwendige Verfahrensechritt der Inaktivierung entfällt. Nebenreaktionen (allergische Reaktionen) und Impfschäden sind nicht zu befürchten, da die Vaccinen absolui antigenfrei sind. Die Ausgangsstoffe für das Verfahren sind leicht in größeren Mengen zu erhalten. Die Kosten des Verfahren« sind gering. _1O98U/1g₈2The method according to the invention offers numerous advantages for the production of vaccines. The process step of inactivation, which is necessary in the customary production of vaccines, is omitted. Side reactions (allergic reactions) and vaccine damage are not to be feared, as the vaccines are absolutely antigen-free. The starting materials for the process can easily be obtained in larger quantities. The costs of the procedure «are low. _{1O98U / 1} g ₈ 2

Fir 5*07 AFir 5 * 07 A

Beispiel 1example 1

Aus 100 ecm menschlichen Blut werden die Leukozyten isoliert. Sie werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in einem 0.1 molaren Tris/Maleinsäure-Puffer vom pH 7.8, der zusätzlich 0.01 molar an KCl, O.OO5 molar an Magnesiumacetat und O.OO6 molar an 2-Mercaptoäthanol.ist, aufgenommen. Die Zellsuspension wird. lOmal eingefroren und aufgetaut. Das Zellhomogenat wird bei 30 000 g und 0⁰C 30 Minuten lang zentrifugiert. DasThe leukocytes are isolated from 100 ecm human blood. They are washed with physiological saline solution and then taken up in a 0.1 molar tris / maleic acid buffer with a pH of 7.8, which is also 0.01 molar in KCl, OOO5 molar in magnesium acetate and OOO6 molar in 2-mercaptoethanol. The cell suspension will. Frozen and thawed once. The cell homogenate is centrifuged at 30,000 g and 0 ^° C. for 30 minutes. That

Sediment wird verworfen, das zellfreie System wird mitSediment is discarded, the cell-free system is with

«3 dee^Receptors«3 dee ^ Receptors

10 ^J BinheitentTür den PhagenfKkappa) aus Serratia marcescens10 ^J BinheitentTür the phage fKkappa) from Serratia marcescens versetzt und 10 Minuten im Wasserbad bei 37°C bebrütet. Danach wird die SNS nach Kirby isoliert.added and incubated for 10 minutes in a water bath at 37 ° C. The SNS is then isolated after Kirby.

Die Ermittlung der durch die erhaltene Vaccine bewirkten Antikörpersynthese im zellulären (A) und zellfreien (B) System wird wie folgt durchgeführt»Determination of the effects of the vaccine obtained Antibody synthesis in the cellular (A) and cell-free (B) system is carried out as follows »

A) Prüfung der informatorischen RNS in einem zellulären SystemsA) Examination of the informational RNA in a cellular system

Aus menschlichen Lymphknoten wird eine Lymphzeilkultur mit 10' Zellen/Kultur angelegt* Zu dieser Lymphzeilkultur werden 0,3 ail einer wässrigen Lösung der obigen Vaccine mit einer optischen Dichte von Q004 gegeben, gemessen bei 260 mjx. Nach zwei Tagen wird der Überstand der Zellkultur abgetrennt und im Rezepto^Neutralisationstest auf seinen Antikörpergehalt geprüft. Es wurden 10¹^ Antikörpermoleküle pro ml Gewebekulturflüasigkeit nachgewiesen.A lymph cell culture with 10 'cells / culture is established from human lymph nodes. 0.3 ail of an aqueous solution of the above vaccine with an optical density of Q004, measured at 260 mjx, is added to this lymph cell culture. After two days, the supernatant from the cell culture is separated off and tested for its antibody content in the receptor neutralization test. 10 ¹ ^ antibody molecules per ml of tissue culture liquid were detected.

B)B) Prüfung der RNS in einem zellfreien System aus menschlichen Leukozyten! | .Examination of RNA in a cell-free human system Leukocytes! | .

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- 6 - Fw 5407 A- 6 - Fw 5407 A

Ss wird wie oben beschrieben ein zeilfei ββ Systen hergestellt. Die in diesem System vorhandene Desoxyribonucleinsäure -wird mit Oesoxyribonucleaae abgebaut. Durch diese Behandlung ist das zellfreie System nicht mehr in der Lage, nach Zugabe von Antigen informatorische RNS oder Antikörper zu synthetisieren·. Eb ist daher als Testsystem für den Informationsgehalt einer RNS-Präparation, die als Vaccine verwendet werden soll, geeignet. Zu 0.1 ecm eines solchen zellfreien Sys tarn* werden 0.1 ecm einer RNS-Präparation mit der optischen°.j£hte von 0.00% (bei 26O bmi ) gegeben. Der Ansatz wird bei 37°C JO Minuten lang bebrütet | anschließend wird die Menge der nach Zugab· der RNS synthetisierten Antikörper im Rezeptor-Neutralisationateet gemessen. Der Antikörpertiter betrug 10⁷ Antikörper _{pro β}χ Gewebekulturflüssigkeit.A cell-free ββ system is established as described above. The deoxyribonucleic acid present in this system is degraded with oesoxyribonucleic acid. As a result of this treatment, the cell-free system is no longer able to synthesize informational RNA or antibodies after the addition of antigen. Eb is therefore suitable as a test system for the information content of an RNA preparation that is to be used as a vaccine. 0.1 ecm of such a cell-free system is added 0.1 ecm of an RNA preparation with an optical degree of 0.00% (at 260 bmi). The batch is incubated at 37 ° C for JO minutes | then the amount of antibodies synthesized after the addition of the RNA is measured in the receptor neutralization kit. The antibody titer was 10 ⁷ antibodies _{per β} tissue culture fluid.

Beispiel 2Example 2

Gemäß Beispiel 1 wurde zellfreies System aus menschlichen Leukozyten mit Equine-Milford-Hämagglutinin stimuliert und daraus wie beschrieben eine Vaccine hergestellt. Mit dieser Vaccine wurden zellfreie Systeme aus menschlichen Leukozyten zur Antikörpersynthese gebracht. 3s konnten 5 χ ΙΌ Anti· körpermoleküle/ml nachgwf^sen werden.According to Example 1, the cell-free system of human leukocytes was stimulated with equine Milford hemagglutinin and made a vaccine from it as described. With this vaccine, cell-free systems from human leukocytes were made to synthesize antibodies. 3s could 5 χ ΙΌ Anti body molecules / ml are detected.

Beispiel 3Example 3

Gemäß Beispiel 1 wurde eine Kultur von peripher en Leuko* zyten von Rhesusaffen mit Bquine-Milford-Uämagglutinin stimuliert und daraus eine Vaccine (informatorische RNS) hergestellt. Diese Vaccine wurde In einer Menge von 0*5 "1 (Verdünnung intramuskulär 1/20, optisch· Dicht« 0.002) an Rhesusaffen gespritzt. Die beiden immunisierten Affen wiesen einen Antikörpertiter von 6,0 χ 10⁹ mnd 12,0 χ 10⁹ safe .ml Serum auf. Die Kontrolltiere hatten keine Antikörper gegen lquim«*Milford-t Hämagglutinin gebildet.According to Example 1, a culture of peripheral leukocytes from rhesus monkeys was stimulated with Bquine-Milford-uämagglutinin and a vaccine (informational RNA) was produced therefrom. This vaccine was injected into rhesus monkeys in an amount of 0 * 5 "1 (intramuscular dilution 1/20, optical. Dense« 0.002). The two immunized monkeys had an antibody titre of 6.0 χ 10 ^{9 and} 12.0 χ 10 ⁹ safe .ml serum. The control animals had not produced any antibodies against lquim «* Milford-t hemagglutinin.

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Beispiel example kk . .. .

Gemäß Beispiel 1 wurde eine Kultur von Per^toneälzellen vonAccording to Example 1, a culture of Per ^ toneälzellen was from

NMRI-Mäusen mit Equine-Milford-Hämagglutinin stimuliert und daraus eine Vaccine (informatorische RNS) hergestellt. Mit dieser Vaccine wurden NMRI-Mäuse intraperitoneal gespritzt. Bei einer Belastungsinfeltion mit den obigen Virustypen erwiesen sich solche Tiere als immun. Das Serum enthielt 6,7 χ ίο" Antikörper pro ml, die Kon* trollen bildeten keine Antikörper.NMRI mice stimulated with equine Milford hemagglutinin and made a vaccine (informational RNA) from it. NMRI mice were injected intraperitoneally with this vaccine. In the event of a stress infection with the Such animals were found to be immune to the above virus types. The serum contained 6.7 χ ίο "antibodies per ml, the con * trolls did not produce antibodies.

Beispiel example 55

Gemäß Beispiel 1 wurde ein zellfreies System von Milzzellen von Rhesusaffen mit Hämagglutinin der Influenzaviren der Typen A, A , A _t Swine, B Lee und PR 8 stimuliert und daraus eine Vaccine hergestellt. Mit dieser Vnccine wurden Rhesusaffen gespritzt. Die mit Vaccine (informatorischer RNS) behandelten Tiere bildeten daraufhin Antikörper wie bereits in Beispiel 3 beschrieben.According to Example 1, a cell-free system of spleen cells from rhesus monkeys was stimulated with hemagglutinin of the influenza viruses of types A, A, A _t Swine, B Lee and PR 8 and a vaccine was produced therefrom. This Vnccine was used to inject rhesus monkeys. The animals treated with vaccine (informational RNA) then formed antibodies as already described in Example 3.

BAD UR(GINAi. 1098U/1982BAD UR (GINAi. 1098U / 1982

Claims

PATENT CLAIMS

1. A method for producing a vaccine, characterized in that that informational ribonucleic acid is isolated, sterilized and optionally mixed with an adjuvant.

2) Vaccine, characterized by a content of informational Ribonucleic acid ..

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