DE1593152A1

DE1593152A1 - N-Desulfo-N-acyl-heparins and process for their preparation

Info

Publication number: DE1593152A1
Application number: DE19661593152
Authority: DE
Inventors: Baganz Dr Horst; Goedicke Dipl-Chem Dr Volkmar
Original assignee: Nordmark Werke GmbH
Current assignee: Nordmark Werke GmbH
Priority date: 1966-05-07
Filing date: 1966-05-07
Publication date: 1970-07-16

Description

N-Desulfo-N-acvl-heSarine und Verfahren zu ihrer Herstellung.N-Desulfo-N-acvl-heSarine and process for their preparation.

Die vorliegende Erfindung betrifft N-Desulfo-N-acyl-heparine als pharmakologisch sehr wertvolle Heparinderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung.The present invention relates to N-Desulfo-N-acyl-heparins as pharmacological very valuable heparin derivatives and processes for their preparation.

Durch die hochinteressanten physiologisch-pharmakologischen Wirkungen des heparins auf die Blutgerinnung und den Fettstoffwechsel sind zahlreiche bedeutungsvolle Indikationen für eine Heparintherapie in der Humanmedizin gegeben. Eine Differenzierung dieser beiden Wirkungen durch Modifizierung des Heparinmoleküls ist'ein Hauptanliegen der aktuellen Heparinforschung.Due to the highly interesting physiological-pharmacological effects of heparin on blood clotting and lipid metabolism are numerous important ones There are indications for heparin therapy in human medicine. A differentiation These two effects by modifying the heparin molecule is a major concern of current heparin research.

Hierbei gehen- die Bemühungen in Richtung einer Löschung der Wirkung auf die Blutgerinnung und einer Erhaltung bzw. Steigerung der Wirkung auf den Fettstoffwechsel, der sogenannten -Lipämieklärwirkung.In this case, efforts are made towards a cancellation of the effect on blood coagulation and a maintenance or increase of the effect on lipid metabolism, the so-called lipemia clearing effect.

Für eine Modifizierung des Heparinmoleküls kommen primär die vorhandenen funktionellen Gruppen -OH,-O-SO3H, -NH-SO3H, -COOH,#CH-O-CH#infrage. In der Literatur sind als primäre Modifizierungen beschrieben: die Verseifung der 0- und N-Schwefelsäurehalbester bzw. -amide, die partielle Verseifung der N-Schwefelsäurehalbamide, die Veresterung der Carboxylgruppe mit Methylalkohol, die Fragmentierung des Makromoleküls durch Spaltung der glykosidischen Bindungen. Eine oft angewendete sekundäre Modifizierung wird durch Acylierung der nach partiellffl N-Desulfatisierung erhaltenen primären NH2-Gruppe erreicht.For a modification of the heparin molecule, the existing ones are primarily used functional groups -OH, -O-SO3H, -NH-SO3H, -COOH, # CH-O-CH # are possible. In the literature are described as primary modifications: the saponification of the 0- and N-sulfuric acid half esters or amides, the partial saponification of the N-sulfuric acid half-amides, the esterification the carboxyl group with methyl alcohol, the fragmentation of the macromolecule by Cleavage of the glycosidic bonds. A secondary modification that is often used is obtained by acylation of the primary obtained after partial N-desulfation NH2 group reached.

In den deutschen Auslegeschriften 1 192 176 und 1201 322 sind -solche Modifizierungen beschrieben. Dabei werden als acylierende Agenzien die Säurechloride oder Säureanhydride verwendet.In the German Auslegeschriften 1 192 176 and 1201 322 -such Modifications described. The acid chlorides are used as acylating agents or acid anhydrides are used.

Das erfindungagemäße Verfahren zur Herstellung von neuen N-Acyl-Derivaten des N-Desulfoheparins ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ammoniumsålz des N-Desulfoheparins (-Heparamin) mit einem Acyl-Derivat in der Imidazolschmelze umsetzt. Vorzugsweise werden als Acyl-Derivate Acylalkylester, Acylthioester bzw. Thiolactone und Acylamide eingesetzt.The process according to the invention for the preparation of new N-acyl derivatives of N-Desulfoheparins is characterized in that one Ammoniumsålz des N-Desulfoheparins (-Heparamin) with an acyl derivative in the imidazole melt. Acyl alkyl esters, acyl thioesters or thiolactones are preferably used as acyl derivatives and acylamides are used.

Eine ähnliche Reaktionsweise unter Verwendung von Thiolaotonen ist aus der Eiweißchemie bekannt (vgl. Irving M. Klotz and Stanley G. Elfbaum: Activated acyl compounds as intermediates in the thiolation of proteins". Biochim. biophys. Acta (Amst.) 86, 100 - 105 (1964)). Hierbei werden die Reaktanten in wässriger Lösung unter Imidazol-Katalyse umgesetst. Aus der Peptid-Chemie ist seit langem die Aminolyse von Thioestern sowohl in organischen Lösungsmitteln wie in wässeriger Lösung als auch von Acylestern in der Imidazolschmelze bekannt. (Vgl. Th. Wieland und W. Schäfer, Ange. Chem. 63, 146 (1951); Th. Wieland, H. Determann und W. Kaule, Angew. Chem. 75, 209 (1963); Th.A similar mode of reaction using thiolaotones is known from protein chemistry (cf. Irving M. Klotz and Stanley G. Elfbaum: Activated acyl compounds as intermediates in the thiolation of proteins ". Biochim. biophys. Acta (Amst.) 86, 100-105 (1964)). Here the reactants are in aqueous solution converted under imidazole catalysis. Aminolysis has long been part of peptide chemistry of thioesters both in organic solvents and in aqueous solution as also known from acyl esters in the imidazole melt. (See Th. Wieland and W. Schäfer, Ange. Chem. 63, 146 (1951); Th. Wieland, H. Determann and W. Kaule, Angew. Chem. 75: 209 (1963); Th.

Wieland und K. Vogeler, Liebigs Ann. Chem. 680, 125 (1964).Wieland and K. Vogeler, Liebigs Ann. Chem. 680, 125 (1964).

Typisch sind bei diesen Reaktionen in der Peptidchemie die Jeweiligen Reaktanten. Sie sind von einem kleinen Molgewicht und enthalten wenige funktionelle Gruppen, die in der Regel bis auf die zwei notwendigen Reaktionsgruppen auch noch geschützt werden. Es ist daher äußerst überraschend, daß ein Makromolekül vom Typ des Heparins mit einem mittleren Molgewicht von 15 000 mit unzähligen ungeschützten, reaktiven funktionellen Gruppen pro Tetrasaccharideinheit eine stöchiometrisch Substitution in Imidazolschmelse mit Acyl-Derivaten erlaubt.Typical for these reactions in peptide chemistry are the respective ones Reactants. They are of a small molecular weight and contain few functional ones Groups, as a rule, apart from the two necessary reaction groups as well to be protected. It is therefore extremely surprising that a macromolecule of the type of heparin with an average molecular weight of 15,000 with countless unprotected, reactive functional groups per tetrasaccharide unit a stoichiometric substitution Allowed in imidazole melts with acyl derivatives.

Typisch bei der Verwendung von entsprechend geeigneten Thiolactonen ist die mit der Acylierung gleichzeitig verlaufende Bildung der SH-funktionellen Gruppe am Acylrest.Typical when using appropriately suitable thiolactones is the formation of the SH-functional that takes place at the same time as the acylation Group on the acyl residue.

Die Darstellung solcher durch SH-Gruppen ausgezeichneter N-Acylderivate des -N-Desulfoheparins ist ein Hauptanliegen des erfindungsgemäßen Verfahrens.The representation of such N-acyl derivatives distinguished by SH groups des -N-desulfoheparin is a major concern of the process according to the invention.

Bei Verwendung von linearen Acylthioestern kanD der Acylrest geschützte SH-Gruppen enthalten, die nach der erfindungegemäßen Acylierung in Freiheit gesetzt werden können.When using linear acyl thioesters, the acyl radical can be protected Contain SH groups that are set free after the acylation according to the invention can be.

Bei Durchführung der Reaktion im wässrig-alkalischen Medium, wie für die Protein-Thiolierung beschrieben, ist auch die Heparin-Thiolierug ähnlich niedrig; 1 1 Mol-SH pro 104 bis 105g Heparin. Das erfindungsgemäße Verfahren erreicht dagegen eine überraschend hohe Rate von 1 Mol-SH pro 103 g Heparin.When carrying out the reaction in an aqueous-alkaline medium, as for described the protein thiolation, the heparin thiolation is similarly low; 1 1 mol-SH per 10 4 to 10 5 g of heparin. In contrast, the method according to the invention achieves a surprisingly high rate of 1 mole SH per 103 g of heparin.

Die überraschend hohe Thiolierungsrate des erfindungsgemäßen Verfahrernist bedingt durch den Umsatz der Reaktionspartner in Imidazolschmelze. Die Reaktion wird unter Normaldruck, aber bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise bei +500 bis +1500C, durchgeführt. Es ist weiterhin überraschend, daß die noch vorhandenen zahlreichen funktionellen Gruppen des N-Desulfoheparins die Acylierung in keiner Weise stören.The surprisingly high rate of thiolation of the process of the invention is due to the conversion of the reactants in imidazole melt. The reaction is under normal pressure, but at elevated temperature, preferably at +500 to + 1500C. It is also surprising that the numerous functional groups of N-desulfoheparins do not interfere with the acylation in any way.

Um die Heparinkomponente in der Imidazolachmelse zur Lösung zu bringen, ist es Jedoch notwendig, das Natriumsalz des N-Desulfoheparins in ein Ammoniumsalz zu überführen und dieses zu verwenden.To dissolve the heparin component in the imidazole salmon, However, it is necessary to convert the sodium salt of N-desulfoheparin into an ammonium salt to convict and use this.

Die dargestellten neuen N-Desulfo-§-acyl-Heparine sind auagezeichnet durch die Löschung der Wirkung auf die Blutgerinnung, (Antikoagulative Wirkung iE/mg) und beträchtlicher Lipämieklärwirkung. Die pharmakologisch-physiologisch hochinteressante Substitution des Acylrestes in o(- und ß- bzw. t-Stellung durch Amino- und Mercaptogruppen unterstreicht die weitere Bedeutung der neuen Substanzgruppe.The new N-Desulfo-§-acyl-heparins shown are excellent by canceling the effect on blood clotting, (anticoagulant effect iU / mg) and considerable lipemia clearing effect. The pharmacological and physiological one of great interest Substitution of the acyl radical in the o (- and ß- or t-positions by amino and mercapto groups underlines the further importance of the new group of substances.

Die gegebenen Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren, Jedoch stellen die genannten Bedingungen in keiner Richtung eine Limitierung dar.The examples given explain the process according to the invention, However, the conditions mentioned do not represent a limitation in any direction.

Beispiel 1: a) 9,81 g N-Deaulfoheparin (Heparamin) [Analyse berechnet für eine Tetrasaccharideinheit: (C24H34O29N2S3Na4)n (1002.6) Ber.: N 2,80 S 9,60 Na 9,20 % Ger.: N 2,78 S 9,80 Na 9,68 %] werden als 10%ige Lösung in 1%iger NaCl-Lösung mit einer 10%igen Lösung von Benzalkoniumchlorid (mittleres' Nolgewicht für C22H40N Cl: 354.0) in aqua dest. bei Raumtemperatur unter Rühren gemischt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, zweimal mit 100 ml aqua dest. gewaschen und über P4010 im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 19,8 g Analyse berechnet für eine Tetrasaccharideinheit: (2502,5) Ber.: N 3,92 S 3,84 % Gef.: N 3,81 S 3,42 % b) 20 g Imidazol, 20 g N-Acetylhomocysteinthiolacton und 10 g Heparamin-benzalkonium werden über P4O10 im Vakuum getrocknet, anschließend gut gemischt und im Flüssigkeitsbad unter Stickstoff und Feuchtigkeitsausschluß auf +100 bis +120°C erhitzt. Die Schmelze wird homogen gerührt, nach 5 Stunden Reaktionszeit abgekühlt, mit 100 ml 2 N NaCl-Lösung verdünnt und in 500 ml eiskaltem Methanol unter Rühren und Sauerstoffausschluß eingetropft. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit 100 ml 85 %igem Äthanol, 100 ml abs.Example 1: a) 9.81 g of N-deaulfoheparin (heparamin) [analysis calculated for one tetrasaccharide unit: (C24H34O29N2S3Na4) n (1002.6) Calc .: N 2.80 S 9.60 Na 9.20% Ger .: N 2 , 78 S 9.80 Na 9.68%] are used as a 10% solution in 1% NaCl solution with a 10% solution of benzalkonium chloride (mean 'Nol weight for C22H40N Cl: 354.0) in distilled water. mixed at room temperature with stirring. The precipitate is centrifuged off, twice with 100 ml distilled water. washed and dried over P4010 in vacuo. Yield: 19.8 g Analysis calculated for one tetrasaccharide unit: (2502.5) Calc .: N 3.92 S 3.84% Found: N 3.81 S 3.42% b) 20 g of imidazole, 20 g of N-acetylhomocysteine thiolactone and 10 g of heparamine benzalkonium are im Vacuum dried, then mixed well and heated to +100 to + 120 ° C in a liquid bath under nitrogen and with exclusion of moisture. The melt is stirred homogeneously, cooled after a reaction time of 5 hours, diluted with 100 ml of 2N NaCl solution and added dropwise to 500 ml of ice-cold methanol with stirring and with the exclusion of oxygen. The precipitate is centrifuged off, with 100 ml of 85% ethanol, 100 ml of abs.

Äthanol gewaschen und über P4010 im Vakuum getrocknet. Washed ethanol and dried over P4010 in vacuo.

Ausbeute: 4,6 g. Yield: 4.6 g.

Analyse berechnet für eine Tetrasaccharideinheit und einem Substitutionsgrad von 1 pro Analyseneinheit: [C30H43O31N3S4N4]n (1161,9) Ber.: N 3,62 S 11,03 Acetyl 3,70 % Gef.: N 3,45 S 10,77 Acetyl 4,10 % Quantitative Bestimmung der SH-Gruppe mit N-Äthylmaleinimid analog: M. Maruyama und Y. Morotomi, Ann. Rep. Takamine Lab. 11, 118 (1959). Analysis calculated for a tetrasaccharide unit and a degree of substitution of 1 per analysis unit: [C30H43O31N3S4N4] n (1161.9) Calc .: N 3.62 S 11.03 acetyl 3.70% Found: N 3.45 S 10.77 acetyl 4.10% Quantitative determination of the SH group with N-ethylmaleimide analogously: M. Maruyama and Y. Morotomi, Ann. Rep. Takamine Lab. 11, 118 (1959).

Ergebnis : pro Tetrasaccharideinheit wird 0,75 SH-Gruppe gefunden; das ist eine Thiolierungsrate von 1 Mol-SH pro 1,4. 103g Heparin.Result: 0.75 SH group is found per tetrasaccharide unit; that is a rate of thiolation of 1 mole SH per 1.4. 103g heparin.

Beispiel 2: a) 1,89 g N-Formyl-2,2-dimethyl-thiazolidin-4-carbonsäure, hergest. n. John C. Sheehan u. Dung-DJung H. Yang, J. Am.Example 2: a) 1.89 g of N-formyl-2,2-dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid, made n. John C. Sheehan and Dung-DJung H. Yang, J. Am.

Soc.- 80, 1158-1164 (1958), werden in 100 ml abs. Tetrahydrofuran unter Zusatz von 1,56 ml Triäthylamin bei Raum--temperatur gelöst, dann wird die Lösung auf -10 bis 1500 abgekühlt. In diese Lösung werden unter Rühren und Stick- -stoffatmosphäre 1,05 ml Chlorameisensäureäthylester in 20ml abs. Tetrahydrofuran langsam - Eintropfzeit ca. 10 Minuteneingetropft. Nach weiteren 10 Minuten werden 1,13 ml Thiophenol in 20 ml abs. Tetrahydrofuran ebenfalls langsam eingetropft, so daß bei beiden Zugaben die Temperatur nicht über -10°C steigt. Die Kühlung wird nicht erneuert. Die Reaktionslösung steht über Nacht und erwärmt sich auf Raumtemperatur. Es wird mit 500 ml Wasser verdünnt und die wässrige Lösung mit 3 x 100 ml Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte werden neutral gewaschen, über Natriumsulfat- getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Äther/Hexan umkristallisiert. Soc. 80, 1158-1164 (1958), in 100 ml of abs. Tetrahydrofuran with the addition of 1.56 ml of triethylamine at room temperature, then the Solution cooled to -10 to 1500. In this solution, stirring and sticking substance atmosphere 1.05 ml of ethyl chloroformate in 20 ml of abs. Tetrahydrofuran slowly - dripping in time approx. 10 minutes. After another 10 minutes will be 1.13 ml of thiophenol in 20 ml of abs. Tetrahydrofuran also slowly added dropwise, so that the temperature does not rise above -10 ° C with either addition. The cooling will not renewed. The reaction solution stands overnight and warms to room temperature. It is diluted with 500 ml of water and the aqueous solution with 3 x 100 ml of ether extracted. The combined ether extracts are washed neutral, over sodium sulfate dried and concentrated in vacuo. The residue is recrystallized from ether / hexane.

Ausbeute: 1,9 g . 70 - 75°C Analyse für C13H1502NS2 (281,4) Ber.: C 55,49 H 5,38 N 4,99 S 22,82 % Gef.: a 55,80 H 5,56 N 5,07 S 22,56 % -b) 10 g Imidazol, 10 g N-Formyl-2,2-dimethyl-thiazolidin-4-carbonsäurethiophenylester und 5 g Heparamin-benzal-konium werden analog Beispiel 1 vorgetrocknet und bei +80 bis 95°C umgesetzt. Nach dem Ausfällen und Waschen des Heparins wird dieses Jedoch in 100 ml 1%iger NaCl-Lösung gelöst und gegen aqua dest. dialysiert. Das Dialysat wird anschließend gefriergetrocknet. Yield: 1.9 g. 70 - 75 ° C analysis for C13H1502NS2 (281.4) calc .: C 55.49 H 5.38 N 4.99 S 22.82% Found: a 55.80 H 5.56 N 5.07 S 22.56% -b) 10 g imidazole, 10 g of N-formyl-2,2-dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid thiophenyl ester and 5 g of heparamine-benzalconium are predried analogously to Example 1 and reacted at +80 to 95 ° C. After this However, the heparin is precipitated and washed in 100 ml of 1% NaCl solution dissolved and against aqua dest. dialyzed. The dialysate is then freeze-dried.

Ausbeute: 1,1 g Analyse berechnet für eine Tetrasaccharideinheit und einen Substitutionsgrad von 1 pro Analyseneinheit: (C31H42O31N3S4Na5)n (1195,9) Ber.: C 31,13 H 3,54 N 3,51 S 10,72 % Gef.: C 30,83 H 3,76 N 3,83 S 10,86 % Quantitative Bestimmung der SH-Gruppe analog Beispiel 1 nach Hydrolyse des Thiazolidinringes mit 1 N HCl. Yield: 1.1 g Analysis calculated for one tetrasaccharide unit and a degree of substitution of 1 per analysis unit: (C31H42O31N3S4Na5) n (1195.9) Calc .: C 31.13 H 3.54 N 3.51 S 10.72% Found: C 30.83 H 3.76 N 3.83 S 10.86% Quantitative Determination of the SH group as in Example 1 after hydrolysis of the thiazolidine ring with 1 N HCl.

Ergebnis: pro Tetrasaccharideinheit werden 1,07 SH-Gruppe gefunden; das ist eine Thiolierungsrate von 1 Mol SH pro 1,2 x 103 g Heparin. Result: 1.07 SH groups are found per tetrasaccharide unit; this is a thiolation rate of 1 mole of SH per 1.2 x 103 g of heparin.

Beispiel 3: a) 10,4 g N-Formyl-2,2-dimethylthiazolidin-4-carbonsäure (vgl.Example 3: a) 10.4 g of N-formyl-2,2-dimethylthiazolidine-4-carboxylic acid (see.

Beispiel 2), 3,75 g Imidazol und 10,3 g N,N'-dicyclohexylcarbodiimid werden separat in je 200 ml abs. 2tetrahydrofuran gelöst und nach Abkühlung auf +5°C werden die Lösungen vereinigt. Nach Rühren über Nacht unter Feuchtigkeitsausschluß wird vom Kristallbrei abgesaugt - Abtrennung des N,N'-Dicyclohexylharnstoffes - und das Filtrat im Vakuum eingeent. Example 2), 3.75 g of imidazole and 10.3 g of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide are sold separately in 200 ml abs. 2tetrahydrofuran dissolved and after cooling on + 5 ° C the solutions are combined. After stirring overnight with exclusion of moisture is sucked off from the crystal pulp - separation of the N, N'-dicyclohexylurea - and the filtrate concentrated in vacuo.

Hierbei werden verschiedene Fraktionen des N-Formyl-2,2-di methyl-thiazolidin-4-carbonsäureimidazolids erhalten, insgesamt 6,25 g F. 137 - 1390 C. Different fractions of the N-formyl-2,2-dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid imidazolide are used obtained, a total of 6.25 g F. 137 - 1390 C.

Analyse für C10H15O2N3S (239,3) Ber.: C 50,19 H 5,48 N 17,56 S 13,39 % Gef.: C 49,34 H 5,68 N'17,70 S 13,72 % b) 10 g Imidazol, 10 g N-Formyl-2,2-dimethyl-thiazolidin-4-carbonsäureimidazolidid und 5 g Heparaminbenzalkonium werden analog Beispiel 1 vorgetrocknet und bei +50 bis +800C umgesetzt. Analysis for C10H15O2N3S (239.3) Calculated: C 50.19 H 5.48 N 17.56 S 13.39 % Found: C 49.34 H 5.68 N'17.70 S 13.72% b) 10 g imidazole, 10 g N-formyl-2,2-dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid imidazolidide and 5 g of heparamine benzalkonium are predried analogously to Example 1 and at +50 implemented up to + 800C.

Gemäß Beispiel 2 wird aufgearbeitet. Work-up is carried out according to Example 2.

Ausbeute: 0,85 g Nach Analyse identisch mit dem nach Beispiel 2 erhaltenen Produkt. Yield: 0.85 g Identical to that obtained in Example 2 after analysis Product.

Patentangrüche: Patent Claims:

Claims

Claims: 1. N-Desulfo-N-acyl-heparin.

2. Process for the preparation of the compounds according to claim 1, characterized characterized in that an ammonium salt of N-Desulfoheparins (heparamine) with a Acyl derivative converts into imidazole melt.

3. The method according to claim 2, characterized in that as Acyl derivative an acyl ester or an acyl amide is used.

4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that an activated acyl ester, especially a thioester, is used as the aryl ester Amino acid used.

5. The method according to claim 2-4, characterized in that one as acyl ester an acrylic or a suitable acyclic thioester (lactones) used.

6. The method according to claim 2-5, characterized in that one used as acyl ester §-acetyl homocysteine thiolactone.

7. The method according to claim 2-5, characterized in that one N-formyl-2,2-dimethyl-thiazolidine-4-carboxylic acid thiophenyl ester is used.

8. The method according to claim 2 or 3, characterized in that an imidazolide of an amino acid is used as the acylamide.

9. The method according to claims 2 to 8, characterized in that the ammonium salt of heparamine is a quaternary ammonium salt of heparamine, in particular the limethylbenzylalkyl ammonium salt is used, the alkyl radical of which has 8-18 carbon atoms having.

0. The method according to claims 2-9, characterized in that one the reaction is carried out at + 50 ° C to + 150 ° C, preferably at + 80 ° C to + 120 ° C.