DE1517819B - Process for the biotechnological production of L proline - Google Patents
Process for the biotechnological production of L prolineInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch Züchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium.The invention relates to a process for the biotechnological production of L-proline by growing Microorganisms under the usual conditions for this in an aqueous nutrient medium.
L-Prolin ist eine wirtschaftlich bedeutsame Aminosäure, die in Arznei- und Stärkungsmitteln und für andere Zwecke Verwendung findet. Bisher ist r-Prolin hauptsächlich durch Isolierung aus Hydrolysaten von Proteinen, wie Gelatine, oder durch organische Synthese hergestellt worden. Die nach diesen Verfahren erzielten Produktausbeuten sind jedoch sehr gering. Außerdem sind die Verfahren kompliziert. L-Prolin ist daher einer der teuersten Aminosäuren. Die Entwicklung eines Verfahrens zur Massenproduktion von L-Prolin durch Fermentation unter Verwendung billiger Kohlenhydratausgangsmaterialien wird daher seit langem angestrebt, doch ist in der Literatur über ein industrielles Verfahren.zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentation bisher nichts berichtet worden. In »Amino Acid«, Bd. 8, S. 51 (1963), wurde berichtet, daß nur eine geringe Menge —73 y/Liter L-Prolin in der Kulturflüssigkeit angesammelt wird, wenn Micrococcus glutamicus Nr. 541 gezüchtet wird.L-proline is an economically important amino acid that is used in medicines and tonics and for is used for other purposes. So far is r-proline mainly by isolation from hydrolyzates of proteins such as gelatin, or by organic ones Synthesis has been made. However, the product yields achieved by these processes are very high small amount. In addition, the procedures are complicated. L-proline is therefore one of the most expensive amino acids. the Development of a method for mass production of L-proline by fermentation using Cheaper carbohydrate feedstocks have therefore long been sought, but the literature is about an industrial process for the production of L-proline nothing has been reported so far by fermentation. In "Amino Acid", Vol. 8, p. 51 (1963), it was reported that that only a small amount -73 y / liter of L-proline is accumulated in the culture fluid when Micrococcus glutamicus No. 541 is bred.
Der vorliegenden Erfindung liegt als Aufgabe die Entwicklung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von L-Prolin zugrunde, mit dessen Hilfe sich die Nachteile und Unzulänglichkeiten der bekannten Verfahren überwinden lassen, und das gewünschte Produkt in hoher Reinheit und guter Ausbeute liefert.It is an object of the present invention to develop an improved method of manufacture based on L-proline, with the help of which the disadvantages and shortcomings of the known Allow process to be overcome and provide the desired product in high purity and good yield.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durchZüchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in dem Nährmedium als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 19 223, -ATCC 19 224 oder -ATCC 19 225 züchtet.The invention relates to a process for the biotechnological production of L-proline by breeding of microorganisms under the usual conditions for this in an aqueous nutrient medium, which is characterized by is that in the nutrient medium as microorganisms Micrococcus glutamicus ATCC 19 223, -ATCC 19 224 or -ATCC 19 225.
Es wurde nun gefunden, daß die angestrebten Ziele erreicht werden können, wenn man die genannten Mikroorganismenmutanten, die für ihr Wachstum Isoleucin, Arginin, Citrullin, Ornithin, Methionin oder Vitamin B12 benötigen, in einem wäßrigen Nährmedium züchtet, das eine Quelle für Kohlenstoff, eine Quelle für Stickstoff, anorganische Substanzen und geringe Mengen von sonstigen Nährstoffen enthält. Auf diese Weise wird eine bemerkenswerte Ansammlung von L-Prolin in einer Menge von mehr als etwa 8 — 10 mg/ccm erhalten.It has now been found that the desired goals can be achieved if the mentioned microorganism mutants, which require isoleucine, arginine, citrulline, ornithine, methionine or vitamin B 12 for their growth, are cultivated in an aqueous nutrient medium which is a source of carbon, contains a source of nitrogen, inorganic substances and small amounts of other nutrients. In this way, a remarkable accumulation of L-proline in an amount greater than about 8-10 mg / cc is obtained.
Bezüglich der erfindungsgemäß einsetzbaren Mikroorganismen ist zu sagen, daß Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 von Isoleucin, Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 von Arginin, Citrullin oder Ornithin und Micrococcus glutamicus ATCC 19 225 von Methionin oder Vitamin B12 abhängig ist.With regard to the microorganisms that can be used according to the invention, it should be said that Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 is dependent on isoleucine, Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 on arginine, citrulline or ornithine, and Micrococcus glutamicus ATCC 19 225 on methionine or vitamin B 12.
Was die Zusammensetzung des wäßrigen Nährmediums anbelangt; so können sowohl künstlich zu- sammengestellte als auch natürliche organische Medien verwendet werden, so lange sie die für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wesentlichen Nährstoffe enthalten. Diese Nährstoffe sind bekannt. Dazu gehören Substanzen wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen und sonstige Nährstoffe, die von den Bakterien in bestimmten Mengen verwertet werden. Als Quellen für Kohlenstoff seien z. B. erwähnt, Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Lactose, Trehalose, Cellobiose, Raffmose, Arabinose, Mannit, Sorbit, Inosit, Xylose sowie Stärkehydrolysat, Abfallmelassen u. dgl. Auch Gemische aus zwei oder mehreren dieser Substanzen können verwendet werden. Als Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze oder Verbindungen, wie z. B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumeitrat usw., Nitrate, Harnstoff oder andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Brennereischlempe, Caseinhydrolysat, Fischmehl, Fleischbrühe, entfetteter Sojabohnenrückstand, Seidenraupenpuppen u. dgl., verwendet werden. Gemische dieser Substanzen kann man ebenfalls benutzen. Weiterhin ist es erforderlich, zu dem Züchtungsmedium die bestimmten für das Wachstum der Bakterien erforderliche Nährstoffe zu geben, nämlich Isoleucin, Arginin, Citrullin, Ornithin, Methionin oder Vitamin B12. Anorganische Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium gegeben werden können, sind unter anderem Kaliumhydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Mangansulfat, andere Salze des Mangans und des Magnesiums sowie Salze des Eisens, Kobalts, Zinks, Nickels u. dgl.As for the composition of the aqueous nutrient medium; Both artificially composed and natural organic media can be used as long as they contain the nutrients essential for the growth of the microorganisms used. These nutrients are well known. These include substances such as sources of carbon, sources of nitrogen, inorganic compounds and other nutrients that the bacteria use in certain quantities. Sources of carbon are e.g. B. mentioned, carbohydrates, e.g. B. glucose, fructose, mannose, galactose, sucrose, maltose, lactose, trehalose, cellobiose, Raffmose, arabinose, mannitol, sorbitol, inositol, xylose and starch hydrolyzate, waste molasses and the like. Mixtures of two or more of these substances can also be used . A wide variety of inorganic or organic salts or compounds, such as. B. ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium carbonate, ammonium acetate, ammonium citrate, etc., nitrates, urea or other nitrogen-containing compounds such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, distillery mash, casein hydrolyzate, fish meal, meat stock, defatted ., be used. Mixtures of these substances can also be used. It is also necessary to add the specific nutrients required for the growth of bacteria to the culture medium, namely isoleucine, arginine, citrulline, ornithine, methionine or vitamin B 12 . Inorganic compounds that can be added to the growth medium include potassium hydrogen phosphate, potassium monohydrogen phosphate, magnesium sulfate, calcium carbonate, manganese sulfate, other salts of manganese and magnesium, and salts of iron, cobalt, zinc, nickel and the like.
Wenn als Quelle für Stickstoff Ammoniumsulfat verwendet wird, führt seine Zugabe in einer Menge von 1,5 bis 2,5 °/0 zu einer sehr hohen Ansammlung von L-Prolin. Im Falle von Ammoniumchlorid erlaubt seine Zugabe in einer Menge von 1,0 bis 3,0 °/0 eine hohe Ansammlung von L-Prolin.When it is used as nitrogen source ammonium sulfate, its addition results in an amount of 1.5 to 2.5 ° / 0 to a very high accumulation of L-proline. In the case of ammonium chloride allowed its addition in an amount of 1.0 to 3.0 ° / 0 a high accumulation of L-proline.
Was die anorganischen Substanzen in dem Züchtungsmedium anbelangt, so wurde gefunden, daß die Zugabe von mehr als 0,4 °/0 MgSO4 die gebildete Menge an L-Prolin beeinflußt, wie die folgende Zusammenstellung zeigt.As for the inorganic substances in the culture medium, it has been found that the addition of more than 0.4 ° / 0 MgSO 4 affects the amount of L-proline formed, as shown below represent.
Deshalb ist eine besondere Ausführungsform des be-, anspruchten .Verfahrens dadurch gekennzeichnet, daß* der Gehalt des Nährmediums an Magnesiumsulfat wenigstens 0,4 Gewichtsprozent/Volumprozent beträgt. Therefore, a special embodiment of the loading, method characterized in that * the magnesium sulfate content of the nutrient medium is at least 0.4 percent by weight / percent by volume.
Die entsprechenden Versuche wurden in der Weise .durchgeführt, daß Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 96 Stunden unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Medium gezüchtet wurde, das (in Gewicht/ Volumen) 12°/0 Glucose, 1,5 °/0 Ammoniumsulfat, 0,5 °/0 Ammoniumchlorid, 0,75 °/0 Hefeextrakt, 3°/0 CaCO3, 0,15 °/o KH2PO4, 0,15 D/o K2HPO4, 50 y/Liter Biotin sowie die in obiger Zusammenstellung genannten Mengen MgSO4 enthielt.The corresponding tests were .durchgeführt in such a manner that Micrococcus glutamicus ATCC 19223 was grown 96 hours under aerobic conditions in an aqueous medium containing (in w / v) 12 ° / 0 glucose, 1.5 ° / 0 Ammonium sulfate 0 , 5 ° / 0 of ammonium chloride, 0.75 ° / 0 yeast extract, 3 ° / 0 CaCO 3, 0.15 ° / KH 2 PO 4, 0.15 D / o K 2 HPO 4, 50 y / liter biotin and contained the amounts of MgSO 4 given in the above list.
Die verwendete Menge an Biotin hat keinen Einfluß auf die gebildete Menge an L-Prolin.The amount of biotin used has no effect on the amount of L-proline formed.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie als aerobe Schüttelkultur oder durch Rühren einer Tauchkultur unter Einleiten von Luft, bei einer Temperatur von etwa 23 bis 37° C ,vorzugsweise 26 bis 32° C, und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 6,5 durchgeführt.The cultivation is carried out under aerobic conditions, such as an aerobic shake culture or by stirring a Immersion culture with the introduction of air at a temperature of about 23 to 37 ° C, preferably 26 to 32 ° C, and a pH of about 5.0 to 6.5.
Wenn ein pH-Wert oberhalb von 7 angewendet wird, besteht die Gefahr, daß sich die angesammelte Menge L-Prolin rasch wieder verringert, Ammoniak, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Calciumcarbonat oder Calciumhydroxyd können als Neutralisationsmittel zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums verwendet werden. Weiterhin kann Harnstoff zu dem Züchtungsmedium gegeben werden, um dem Medium Ammoniumionen zuzuführen sowie seinen pH-Wert einzustellen. If a pH above 7 is used, there is a risk of the accumulated amount L-proline rapidly decreases again, ammonia, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium carbonate or Calcium hydroxide can be used as a neutralizing agent to adjust the pH of the medium will. Furthermore, urea can be added to the culture medium to add ammonium ions to the medium add and adjust its pH.
Es wird im allgemeinen 2 bis 4 Tage gezüchtet, wobei sich L-Prolin in dem wäßrigen Züchtungsmedium als Hauptprodukt ansammelt. Nach beendetem Züchten wird im allgemeinen gefunden, daß sich in dem Züchtungsmedium außerdem etwa 1 bis 2 mg/ccm Lysin, etwa 3 mg/ccm Alanin und weniger als etwa 1 mg/ccm Leucin als Nebenprodukte gebildet haben. Weiterhin werden Valin, Glutaminsäure und Asparaginsäure in geringen Mengen als Nebenprodukte gebildet. Die Bildung von Lysin kann durch Verwendung von Ammoniumsulfat als Quelle für Stickstoff gehemmt werden.It is cultured generally for 2 to 4 days with L-proline in the aqueous culture medium as the main product accumulates. After breeding is complete, it is generally found that in the The culture medium also includes about 1 to 2 mg / cc lysine, about 3 mg / cc alanine, and less than about Have formed 1 mg / cc of leucine as by-products. Furthermore, valine, glutamic acid and aspartic acid are used Formed in small quantities as by-products. The formation of lysine can be achieved through use be inhibited by ammonium sulfate as a source of nitrogen.
Q Nach beendetem Züchten wird die Kulturflüssigkeit filtriert, wonach die Aminosäuren an einem Kationenaustauschharz adsorbiert und von diesem wieder eluiert werden. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und sodann durch ununterbrochene Zugabe von Methanol entwässert. Das in der Lösung enthaltene Methanol wird wieder durch Wasser verdrängt, nachdem diejenigen Aminosäuren abfiltriert worden sind, die in Methanol nur schwach löslich sind. Die noch verbliebenen geringen Mengen an basischen und sauren Aminosäuren werden entfernt, indem die wäßrige Lösung durch Säulen mit Kationen- und Anionenaustauschharzen geleitet wird. Beim Einengen und Entwässern des Eluats unter Zugabe von Methanol, gefolgt von einem Eindampfen bis zur Trockne unter vermindertem Druck, wird rohes kristallines L-Prolin erhalten. Q After the cultivation is complete, the culture liquid is filtered, after which the amino acids are adsorbed on a cation exchange resin and eluted from it again. The eluate is concentrated under reduced pressure and then dehydrated by the continuous addition of methanol. The methanol contained in the solution is displaced again by water after those amino acids have been filtered off which are only slightly soluble in methanol. The remaining small amounts of basic and acidic amino acids are removed by passing the aqueous solution through columns with cation and anion exchange resins. When the eluate is concentrated and dehydrated with the addition of methanol, followed by evaporation to dryness under reduced pressure, crude crystalline L-proline is obtained.
In den folgenden Beispielen, die das Verfahren erläutern, beziehen sich die Prozentangaben auf Gewicht/Volumen. In the following examples, which illustrate the process, the percentages relate to weight / volume.
B e i s ρ i e 1 1B e i s ρ i e 1 1
Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 wird als Impfkultur verwendet. 200 ecm einer Impfkultur dieses Mikroorganismenstammes werden in einen Fermentationsbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5 1 gegeben. Sodann werden 2 1 eines Kulturmediums, das 12% Glucose, 2,0 % Ammoniumsulfat, 0,5 % Ammoniumchlorid, 1,5 % MgSO4,0,75 % Hefeextrakt, 0,15% KH2PO4, 0,05 % K2HPO4, 50y/Liter Biotin und 3,0 % CaCO3 enthält, in den Fermentationsbehälter gegeben.Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 is used as an inoculum. 200 ecm of an inoculation culture of this microorganism strain are placed in a fermentation vessel with a capacity of 5 liters. Then 2 l of a culture medium containing 12% glucose, 2.0% ammonium sulfate, 0.5% ammonium chloride, 1.5% MgSO 4 , 0.75% yeast extract, 0.15% KH 2 PO 4 , 0.05% K 2 HPO 4 , 50 y / liter biotin and 3.0% CaCO 3 containing, added to the fermentation vessel.
Es wird dann 96 Stunden bei 28° C mit einer Rührgeschwindigkeit von 450 Umdrehungen pro Minute und unter Einleiten von 2 1 Luft pro Minute gezüchtet. Der pH-Wert des Mediums wird während des Züchtens mit einer 15%igen wäßrigen Ammoniaklösung auf 5,8 bis 6,0 eingestellt. Die in dem Züchtungsmedium gebildete Menge an L-Prolin beträgt 9,2 mg/ccm.It is then 96 hours at 28 ° C with a stirring speed of 450 revolutions per minute and grown with the introduction of 2 liters of air per minute. The pH of the medium is increased during cultivation adjusted to 5.8 to 6.0 with a 15% aqueous ammonia solution. Those in the growth medium The amount of L-proline formed is 9.2 mg / ccm.
Nach beendetem Züchten wird der pH-Wert mit Schwefelsäure auf etwa 2,0 eingestellt, und die Verunreinigungen werden abfiltriert. Das Filtrat wird durch eine mit einem Kationenaustauschharz vom Sulfonsäuertyp beschickte Säule gegeben, um die Aminosäuren zu adsorbieren, die sodann mit wäßriger Ammoniaklösung eluiert werden. Nach Einengen des Eluats unter vermindertem Druck auf etwa 0,5 1 werden diejenigen Aminosäuren, die in Methanol nurAfter the cultivation is complete, the pH is adjusted to about 2.0 with sulfuric acid, and the impurities are filtered off. The filtrate is passed through a sulfonic acid type cation exchange resin loaded column to adsorb the amino acids, which then with aqueous ammonia solution be eluted. After the eluate has been concentrated to about 0.5 l under reduced pressure those amino acids that are in methanol only
ίο schwach löslich sind, so vollständig wie möglich entfernt, indem während des Einengens ununterbrochen Methanol zugegeben wird, um die Lösung von Wasser zu befreien. Nach Abfiltrieren der ungelösten Aminosäuren wird das in der Lösung enthaltene Methanol wieder durch Wasser verdrängt und die wäßrige Lösung durch ein Kationenaustauschharz und sodann durch ein Anionenaustauschharz geleitet. In dem Eluat wird das Wasser nach teilweisem Einengen wieder durch Methanol verdrängt, und die unlöslichen Substanzen werden abfiltriert. Etwa 200 ecm der auf diese Weise erhaltenen methanolischen. Lösung werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 13,5 g rohes kristallines L-Prolin mit.einem Reinheits-ίο are slightly soluble, removed as completely as possible, by continuously adding methanol during the concentration to make the solution of water to free. After filtering off the undissolved amino acids, the methanol contained in the solution becomes displaced again by water and the aqueous solution through a cation exchange resin and then through passed an anion exchange resin. In the eluate, the water flows through again after partial concentration Displaced methanol, and the insoluble substances are filtered off. About 200 ecm of this way obtained methanolic. Solution are concentrated to dryness under reduced pressure. It will 13.5 g of crude crystalline L-proline with a purity
" grad von 85 % erhalten."received a degree of 85%.
Es wird mit dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur daß eine Impfkultur von Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 verwendet wird. Man findet, daß die Kulturflüssigkeit 9,5 mg/ccm L-Prolin enthält. Bei der Behandlung der Kulturfiüssigkeit wie im Beispiel 1 werden 14,0 rohes kristallines L-Prolin mit einem Reinheitsgrad von 86 % erhalten.It is grown with the same medium and under the same conditions as in Example 1, only that a seed culture of Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 is used. One finds that the Culture fluid contains 9.5 mg / cc L-proline. When treating the culture liquid as in Example 1 14.0 crude crystalline L-proline are obtained with a purity of 86%.
Es wird unter den gleichen Bedingungen und mit dem gleichen Medium wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur daß das Medium außerdem 50 mg/Liter Vitamin B12 enthält und daß Micrococcus glutamicus ATCC 19 225 (Mathionin oder Vitamin B12 erfordernde Mutante) als Impfkultur verwendet wird. Man findet, daß die Kulturfiüssigkeit 9,8 mg/ccm L-Prolin enthält. Bei weiterer Behandlung wie im Beispiel 1 werden 14,5 g"rohes kristallines L-Prolin mit einem Reinheitsgrad von 86 % erhalten.It is grown under the same conditions and with the same medium as in Example 1, except that the medium also contains 50 mg / liter of vitamin B 12 and that Micrococcus glutamicus ATCC 19 225 (mutant mathionin or vitamin B 12 ) is used as the inoculum . The culture liquid is found to contain 9.8 mg / cc L-proline. Further treatment as in Example 1 gives 14.5 g of crude crystalline L-proline with a degree of purity of 86%.
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