DE1300314B - Indole indicator strips - Google Patents

Indole indicator strips

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DE1300314B
DE1300314B DEW40053A DEW0040053A DE1300314B DE 1300314 B DE1300314 B DE 1300314B DE W40053 A DEW40053 A DE W40053A DE W0040053 A DEW0040053 A DE W0040053A DE 1300314 B DE1300314 B DE 1300314B
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Watson Glenville Roy
Schwartz Benjamin Sam
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Warner Lambert Co LLC
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Warner Lambert Pharmaceutical Co
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    • G—PHYSICS
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Indol4ndikatorstreifen aus einem saugfähigen Träger, z. B. Papier, p-Dimethylaminobenzaldehyd und einem sauren Reagenz. Insbesondere dient der Indikatorstreifen zur Feststellung von Indol, wie es beim Wachstum gewisser Mikroorganismen auftritt. The invention relates to an indole indicator strip made of a absorbent carrier, e.g. B. paper, p-dimethylaminobenzaldehyde and an acidic reagent. In particular, the indicator strip is used to determine indole, as is the case with Growth of certain microorganisms occurs.

Die Feststellung, ob in einem tryptophanhaltigen Nährmedium wachsende Mikroorganismen Indol erzeugen, stellt eine bekannte Diagnosehilfe bei ihrer Klassifizierung dar. Der Indolbildungstest eignet sich vor allem zur Differenzierung der zahlreichen Spezies, die man unter den Enterobacteriaceen zusammenfaßt. Determining whether growing in a culture medium containing tryptophan Microorganisms producing indole are a well-known diagnostic aid in their classification The indole formation test is particularly suitable for differentiating the numerous Species which are grouped under the Enterobacteriaceae.

So produziert beispielsweise Escherichia coli Indol und wird dadurch von den dies nicht tuenden Aerobacter aerogenes oder Salmonella typhi unterscheidbar.For example, Escherichia coli produces and becomes indole distinguishable from Aerobacter aerogenes or Salmonella typhi, which do not do so.

Diese Differenzierung ist aus epidemiologischen Gründen, weil sie eine FrüherkennungeinerSalmonellaepidemie ermöglicht, und auch wegen der großen Unterschiede in der antibiotischen Empfindlichkeit der verschiedenen Spezies dieser Gruppe wichtig. Daher würde eine rasche und empfindliche Methode für diese Differenzierung von hohem Wert sein. Die meisten bisherigen Indolbildungsteste basieren jedoch auf der Verwendung von Unterkulturen, die stundenlang in einem Spezialmedium, wie z. B. einer 1°/Oigen Tryptonlösung, gewachsen sind, und erfordern die nachträgliche Zugabe eines Indolindikators.This differentiation is epidemiological because they enables early detection of a Salmonella epidemic, and also because of the large Differences in the antibiotic susceptibility of different species to these Group important. Hence, it would be a quick and sensitive method for this differentiation be of great value. However, most of the previous indole formation tests are based on the use of subcultures that have been immersed for hours in a special medium, such as B. a 1% tryptone solution, and require the subsequent Addition of an indole indicator.

Bekannt ist die kolorimetrische Bestimmung von Indol und seinen Homologen in Petroleumdestillaten, wobei nach chromatographischer Abtrennung der Indolkörper die Farbreaktion mit Dimethylbenzaldehyd in Benzollösung in Gegenwart von Phosphorsäure und Essigsäure durchgeführt wird. Diese in einem organischen Lösungsmittel ablaufende, sehr speziell gestaltete Reaktion kann jedoch kein Vorbild für eine Mikroreaktion in wäßrigem Medium, durchgeführt an mikrobiologischem Material, und schon gar nicht für die Anfertigung eines trockenen Indikatorstreifens sein, da die hygroskopische Phosphorsäure bzw. die flüchtige Essigsäure prinzipiell nicht für die Herstellung eines trockenen, lagerfähigen Indikatorstreifens geeignet sind. The colorimetric determination of indole and its homologues is known in petroleum distillates, the indole bodies being separated off by chromatography the color reaction with dimethylbenzaldehyde in benzene solution in the presence of phosphoric acid and acetic acid is carried out. This running in an organic solvent, however, a very specially designed reaction cannot be a model for a microreaction in an aqueous medium, carried out on microbiological material, and certainly not at all for the production of a dry indicator strip, as the hygroscopic Phosphoric acid or the volatile acetic acid in principle not for the production a dry, storable indicator strip are suitable.

Einer der beliebtesten Indolfeststellungsteste ist der von K o v a c. Er besteht darin, daß man eine Reinkultur des unbekannten Organismus in einem Pepton und Tryptophan enthaltenden Spezialmedium 48 Stunden lang wachsen läßt und die Kultur nach Beendigung der Inkubationszeit in Gegenwart von Salzsäure mit Amylalkohol extrahiert. Die Anwesenheit von Indol äußert sich dann im Entstehen einer Rotfärbung, wenn man dem Extrakt eine 50l,ige p-Dimethylaminobenzaldehydlösung zusetzt. One of the most popular indole detection tests is that of K o v a c. It consists in having a pure culture of the unknown organism in one Special medium containing peptone and tryptophan is allowed to grow for 48 hours and the culture after the end of the incubation period in the presence of hydrochloric acid with amyl alcohol extracted. The presence of indole is then expressed in the development of a red color, if a 50l p-dimethylaminobenzaldehyde solution is added to the extract.

Einen weiteren Indolfeststellungstest hat V r a c k o im American Journal of Clinical Pathology, Bd. 39 (1963), Nr. 4, S. 429, bekanntgegeben. Hierbei wird eine etwa 48 Stunden alte, auf Nährmedium gewachsene Kultur mit einem Streifen saugfähigen Materials in Berührung gebracht, der p-Dimethylaminobenzaldehyd und Salzsäure enthält. Dieser Vracko-Test stellt zwar dem Kovac-Test gegenüber eine Verbesserung dar, ist aber immer noch nicht zuriedenstellend, da der Indikatorstreifen erfahrungsgemäß wegen der Flüchtigkeit der Salzsäure bereits nach kurzzeitiger Lagerung seine Empfindlichkeit verliert. V r a c k o has another indole detection test in American Journal of Clinical Pathology, Vol. 39 (1963), No. 4, p. 429. Here becomes an approximately 48 hour old culture grown on nutrient medium with a strip brought into contact with absorbent material, the p-dimethylaminobenzaldehyde and Contains hydrochloric acid. This Vracko test contrasts with the Kovac test Is an improvement, but is still not satisfactory because the indicator strip Experience has shown that due to the volatility of hydrochloric acid, even after a short period of storage loses its sensitivity.

Aus den vorangehenden Darlegungen ersieht man, daß die bekanntenTeste nochvieleNachteile aufweisen. From the foregoing it can be seen that the known tests still have many disadvantages.

So verlangt der Kovac-Test eine mindestens 48stündige Inkubation in einem spezialisierten Medium. Beim Vracko-Test andererseits besitzt der Indikatorstreifen keine ausreichend lange Lagerfähigkeit, um eine genaue und zuverlässige Indolfeststellung zu ermöglichen. Diese Nachteile zu beseitigen ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung.The Kovac test requires incubation for at least 48 hours in a specialized medium. At the Vracko-Test, on the other hand, has the indicator strip does not have a long enough shelf life for an accurate and reliable indole determination to enable. The object of the present invention is to eliminate these disadvantages.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das saure Reagenz aus Oxalsäure besteht. According to the invention, this object is achieved in that the acidic The reagent consists of oxalic acid.

Durch die Verwendung der Oxalsäure an Stelle der beim Vracko-Test herangezogenen Salzsäure wird ein Indikatorstreifen geschaffen, der wegen der geringeren Säurestärke der Oxalsäure die Gewähr dafür gibt, daß das Indikatorpapier bei längerer Säureeinwirkung nicht hydrolysiert wird und wegen der Nichtflüssigkeit der Oxalsäure eine auf praktisch unbegrenzte Zeit hin konstante Indikatorwirkung zeigt. Zwar könnte man auf Grund anderer Literaturstellen annehmen, daß durch den Ersatz von Salzsäure durch Oxalsäure reaktionsmäßig nichts gewonnen wird, doch zeigte sich ferner, daß durch die erfindungsgemäß verwendete Oxalsäure - vermutlich wegen ihrer reduzierenden Eigenschaft - außerdem ein stabilisierender Einfluß auf Dimethylaminobenzaldehyd ausgeübt wird, so daß der erfindungsgemäße Indikatorstreifen ein im Trokkenzustand praktisch unbegrenzt lagerfähiges Handelsprodukt darstellt, das im Anwendungsfall innerhalb von 5 bis 10 Sekunden ohne die bisher erforderliche 48stündige Inkubationszeit den Nachweis von indolerzeugenden Organismen erlaubt. Der erfindungsgemäße Indikatorstreifen gestattet somit einen wesentlich rascheren und außerdem auch zuverlässigeren Nachweis des im Einzelfall vorliegenden Mikroorganismus und schaltet die Möglichkeit der Testverfälschung durch Verunreinigungen und Fehlereinschleppung auf Grund einer Vielzahl von Testschritten, wie sie bei bekannten Testmethoden erforderlich sind, aus. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß ein dringender Bedarf an schnell und sicher arbeitenden klinischen Testmethoden besteht, da es beispielsweise bei der gezielten Behandlung von schweren Infektionserkrankungen darauf ankommt, zunächst so rasch wie möglich eine sichere Feststellung des infizierenden Mikroorganismus zu treffen. By using oxalic acid in place of the Vracko test hydrochloric acid is used, an indicator strip is created, which because of the lower Acid strength of the oxalic acid guarantees that the indicator paper will last longer Acid exposure is not hydrolyzed and because of the non-liquid nature of oxalic acid shows an indicator effect that is constant for a practically unlimited period of time. Certainly could on the basis of other literature it is assumed that by replacing hydrochloric acid nothing is obtained in terms of reaction by oxalic acid, but it was also found that by the oxalic acid used according to the invention - presumably because of its reducing Property - also a stabilizing influence on dimethylaminobenzaldehyde is exercised, so that the indicator strip according to the invention is in a dry state represents a practically unlimited storable commercial product, which in the application within 5 to 10 seconds without the previously required 48 hour incubation time the detection of indole-producing organisms allowed. The indicator strip according to the invention thus allows a much faster and also more reliable detection of the microorganism present in the individual case and switches the possibility of Test falsification through contamination and the introduction of errors due to a Large number of test steps, as they are required with known test methods, the end. In this context it should be noted that there is an urgent need fast and safe clinical test methods exist, for example in the targeted treatment of severe infectious diseases it is important First of all, a reliable identification of the infecting microorganism as soon as possible hold true.

Das zunächst auf einer Seite eines Trägermaterials aufzubringende Reagenziensystem stellt man in der Weise her, daß man zunächst eine 10- bis 40gewichtsprozentige Oxalsäurelösung in einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, herstellt und ihr dann so viel p-Dimethylaminobenzaldehyd zusetzt, daß dessen Konzentration 1 bis 10 Gewichtsprozent ausmacht. Die sich ergebende alkoholische Lösung der beiden Reagenzien läßt man von geeignetem Trägermaterial auf ganzer Fläche oder auf einem Teilbezirk aufsaugen. Nach Abdunsten des Alkohols kann es manchmal zweckmäßig sein, eine Sperrzone zu schaffen, um ein Hinausdiffundieren der Reagenzien über einen bestimmten Punkt oder Bereich hinaus zu verhindern, indem man beispielsweise auf den saugfähigen Träger ein hydrophobes Material, wie etwa Lack, aufbringt. Das Trockengewicht des Trägermaterials soll sich - vor etwaiger Aufbringung eines Sperrstoffs - durch die Reagenzieneinführung um etwa 10 bis 300/, erhöhen. The first to be applied to one side of a carrier material Reagent system is prepared in such a way that you first have a 10 to 40 percent by weight Oxalic acid solution in a lower aliphatic alcohol such as methanol or ethanol, and then add so much p-dimethylaminobenzaldehyde that its concentration 1 to 10 percent by weight. The resulting alcoholic solution of the two Reagents are left on a suitable carrier material over the entire surface or on one Soak up subdistrict. After the alcohol has evaporated, it can sometimes be useful to create a restricted zone to prevent the reagents from diffusing out through a Prevent certain point or area beyond by, for example, on applying a hydrophobic material such as varnish to the absorbent carrier. The dry weight the carrier material should - before any application of a bulk material - through Increase the reagent introduction by about 10 to 300%.

Als Träger eignen sich all jene saugfähigen Materialien, die durch Kapillarwirkung eine Flüssigkeit hochzusaugen vermögen. Hierzu gehören beispielsweise Filterpapier, Filz, poröse Keramikstreifen, Glasfasergewebe oder -matten u. dgl. Man kann das Absorptionsvermögen des Trägers dadurch erhöhen, daß man ihn mit einer Lösung einer Polymersubstanz, z. B. All absorbent materials that are suitable for use as a carrier Capillary action able to suck up a liquid. These include, for example Filter paper, felt, porous ceramic strips, glass fiber fabrics or mats and the like. You can increase the absorbency of the carrier by him with a solution of a polymer substance, e.g. B.

Hydroxymethylcellulose, überzieht.Hydroxymethyl cellulose.

Im Benutzungsfall läßt man die mit dem Reagenziensystem imprägnierte Zone des saugfähigen Trägers mit einer z. B. in einem Teströhrchen befindlichen Reinkultur eines unbekannten Mikroorganismus in Berührung kommen, wobei das saugfähige Material einen Teil der Suspension absorbiert. Ein positiver Test äußert sich darin, daß nach etwa 5 bis 10 Sekunden eine Rosa- bis Rotfärbung auftritt. In the case of use, the impregnated with the reagent system is left Zone of the absorbent carrier with a z. B. located in a test tube Pure culture of an unknown microorganism come into contact, whereby the absorbent Material absorbed part of the suspension. A positive test shows that that after about 5 to 10 seconds a pink to red color appears.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur weiteren Erfindungserläuterung. The following examples serve to further explain the invention.

Beispiel 1 Herstellung des Reagenzien systems 66 g Oxalsäure werden in so viel 95 °/Oigem Äthanol aufgelöst, daß das Endvolumen 260 ml beträgt. Die Lösung erwärmt man auf etwa 45"C, setzt ihr 2,7 g p-Dimethylaminobenzaldehyd hinzu und läßt sie dann abkühlen. Example 1 Preparation of the Reagent System 66 g of oxalic acid are used Dissolved in so much 95% ethanol that the final volume is 260 ml. the The solution is heated to about 45 ° C. and 2.7 g of p-dimethylaminobenzaldehyde are added to it and then let them cool down.

Beispiel 2 Zubereitung des Teststreifens Geeignetes saugfähiges Material, z. B. Filterpapier, wird mit dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Reagenziensystem durch und durch getränkt und dann bei Raumtemperatur an der Luft trocknen gelassen. Es nimmt auf diese Weise um etwa 2001o an Gewicht zu. Example 2 Preparation of the test strip Suitable absorbent material z. B. filter paper is prepared according to Example 1 with the reagent system Soaked through and through and then left to air dry at room temperature. It increases in weight by about 20000 in this way.

Zwecks leichterer Verpackung in Lagerflaschen schneidet man das Papier in schmale, etwa 10 cm lange und etwa 0,6 cm breite Streifen.The paper is cut for easier packaging in storage bottles into narrow strips about 10 cm long and about 0.6 cm wide.

Beispiel 3 Benutzung der Reagenzstreifen Ein oder zwei Schlingenfüllungen des unbekannten Bakteriums, das zuvor auf schrägem Agarnährmedium oder in einem Nährmittel mit Tryptophangehalt gewachsen war, wird auf den zuvor mit dem Reagenziensystem imprägnierten Streifenbezirk aufgebracht. Falls sich innerhalb von 5 bis 10 Sekunden Rosa- oder Rotfärbung entwickelt, ist Indol vorhanden. Example 3 Using the reagent strips One or two loop fillings of the unknown bacterium previously on an agar slant or in a Nutrients with tryptophan content grown on the previously grown with the reagent system impregnated strip area applied. If within 5 to 10 seconds Develops pink or red color, indole is present.

Claims (2)

Patentansprüche : 1. Indol-Indikatorstreifen aus einem saugfähigen Träger, z. B. Papier, p-Dimethylaminobenzaldehyd und einem sauren Reagenz, d a du r c h g ekennzeichnet, daß das Reagenz aus Oxalsäure besteht. Claims: 1. Indole indicator strips made from an absorbent Carrier, e.g. B. paper, p-dimethylaminobenzaldehyde and an acidic reagent, d a du r c h g indicates that the reagent consists of oxalic acid. 2. Indikatorstreifen nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß er im Anschluß an die Reagenzzone auch noch in bekannter Weise eine Sperrzone aufweist, um kapillares Auswandern der Reagenzien zu verhindern. 2. Indicator strip according to claim, characterized in that it following the reagent zone also has a blocking zone in a known manner, to prevent capillary migration of the reagents.
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