DE1228255B

DE1228255B - Process for the production of 16alpha-hydroxy-9beta, 10alpha- or 9alpha, 10alpha-stiden of the androstane or pregnane series

Info

Publication number: DE1228255B
Application number: DEN23881A
Authority: DE
Inventors: Jan De Flines; Willem Frederik Van Der Waard
Original assignee: Philips Gloeilampenfabrieken NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 1962-10-16
Filing date: 1963-10-14
Publication date: 1966-11-10

Description

Verfahren zur Herstellung von 16x-Hydroxy-9ß,10a- oder 9ca,10a-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe Es ist bekannt, daß 9ß,10a-Steroide und 9a,10a-Steroide pharmakologische Eigenschaften haben, die von denen der 10ß-Methyl-9a-Reihe (Normalsteroide) abweichen.Process for the preparation of 16x-hydroxy-9ß, 10a- or 9ca, 10a-steroids of the androstane or pregnane series It is known that 9ß, 10a-steroids and 9a, 10a-steroids have pharmacological properties similar to those of the 10ß-methyl-9a series (normal steroids) differ.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, in diese 9ß,10a- oder 9x,10a-Steroide in an sich bei der Normalsteroidreihe bekannter Weise bestimmte Substituenten in das Steroidskelett einzuführen, z. B. eine Hydroxydgruppe in 16-Stellung.It has already been suggested in these 9ß, 10a or 9x, 10a steroids in a manner known per se in the normal steroid series, certain substituents in introduce the steroid skeleton, e.g. B. a hydroxide group in the 16-position.

Es wurde nun gefunden, daß diese 9ß,10oc- und 9a,10a-Steroide, die eine stereochemische Konfiguration aufweisen, die erheblich von der der in der Natur vorkommenden Steroide abweicht, im Gegensatz zu dem, was auf Grund dieser abweichenden Konfiguration zu erwarten war, mikrobiologischer Umwandlungen fähig sein können.It has now been found that these 9ß, 10oc and 9a, 10a steroids, the have a stereochemical configuration considerably different from that in nature occurring steroids differs, in contrast to what is due to this deviating Configuration was to be expected, microbiological conversions may be capable.

Die Erfindung ermöglicht, in Verbindungen der 10x-Steroidreihe, insbesondere der 9ß,10a-Steroidreihe, auf mikrobiologischem Wege eine Hydroxylgruppe in 16x-Stellung einzuführen. Wegen der besonderen stereochemischen Konfiguration des Steroidkernes bei Vertretern aus der 10a-Steroidreihe, insbesondere der 9ß,10x-Steroidreihe, welche erheblich von der Konfiguration der natürlichen Steroide abweicht, war nicht zu erwarten, daß Mikroorganismen oder deren Enzymsysteme eine Substitution an einem Steroidkern mit einer solchen nicht natürlichen Konfiguration durchführen konnten.The invention enables, in particular, in compounds of the 10x steroid series the 9ß, 10a steroid series, microbiologically a hydroxyl group in the 16x position to introduce. Because of the particular stereochemical configuration of the steroid nucleus with representatives from the 10a steroid series, in particular the 9ß, 10x steroid series, which significantly deviating from the configuration of the natural steroids was not to expect that microorganisms or their enzyme systems will be a substitution on one Steroid core could perform with such an unnatural configuration.

Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von 16a-Hydroxy-9ß,10a- oder 9oc,10a-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein entsprechendes 3-Keto-4-dehydro-, 3-Keto-4,6-bisdehydro- oder 3-Hydroxy-5-dehydro-9ß,10a:- oder -9a,10a-steroid, das am Kohlenstoffatom 16 zwei Wasserstoffatome trägt oder deren 3-Äther oder -Ester in an sich bekannter Weise der oxydierenden Wirkung eines Mikroorganismus der Familie der Moniliaceae oder Enzymsystemen oder Sporen derselben unterwirft.The invention now relates to a process for the preparation of 16a-hydroxy-9ß, 10a- or 9oc, 10a-steroids of the androstane or pregnane series, characterized in that is that you have a corresponding 3-keto-4-dehydro-, 3-keto-4,6-bisdehydro- or 3-hydroxy-5-dehydro-9ß, 10a: - or -9a, 10a-steroid, which carries two hydrogen atoms on carbon atom 16 or their 3-ethers or -esters in a manner known per se of the oxidizing effect of a Microorganism of the family of the Moniliaceae or enzyme systems or spores thereof subject.

Die Ausgangsstoffe können verschiedene Substituenten, z. B. eine oder mehrere verätherte oder veresterte oder nicht verätherte oder veresterte Hydroxygruppen, ein oder mehrere Ketosauerstoffatome, eine oder mehrere gegebenenfalls ungesättigte Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ein oder mehrere Halogenatome, z. B. Cl, Br oder F, enthalten. Es können z. B. Hydroxygruppen in den Stellungen 1, 2, 3, 6, 11, 17 oder 21 (jedoch nicht in der 17a-Stellung), Ketosauerstoffatome in den Stellungen 3, 11 und/oder 20 und Alkylgruppen, wie Methyl-, Äthyl-oder Allylgruppen, in den Stellungen 1, 2, 4, 6 oder 17 (jedoch im letzteren Fäll nicht in der ß-Stellung bei gleichzeitiger Anwesenheit einer 17cc-Hydroxygruppe) vorhanden sein. Weiter dürfen in den Ausgangsstoffen eine oder mehrere Doppelbindungen vorhanden sein, z. B. ausgehend von den Kohlenstoff atomen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 14 oder 17.The starting materials can have various substituents, e.g. B. one or several etherified or esterified or non-etherified or esterified hydroxyl groups, one or more keto oxygen atoms, one or more optionally unsaturated ones Alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, one or more halogen atoms, e.g. B. Cl, Br or F. It can e.g. B. Hydroxy groups in positions 1, 2, 3, 6, 11, 17 or 21 (but not in the 17a-position), keto oxygen atoms in positions 3, 11 and / or 20 and alkyl groups, such as methyl, ethyl or allyl groups, in positions 1, 2, 4, 6 or 17 (but not in the ß-position in the latter case with the simultaneous presence of a 17cc hydroxyl group). Further one or more double bonds may be present in the starting materials, z. B. starting from the carbon atoms 1, 2, 3, 4, 5, 6, 14 or 17.

Die erfindungsgemäß herstellbaren 16a-Hydroxy-9ß,10a- oder -9a,10a-steroide sind wichtige Ausgangsprodukte für die Synthese anderer 9ß,10a- oder 9x,10a-Steroide mit pharmakologischer Wirkung, die in der Stellung 16 eine andere funktionelle Gruppe tragen, die durch Ersatz von bzw. Reaktion mit der 16a-Hydroxygruppe eingeführt werden kann, z. B. eine Alkylgruppe, eine Aminogruppe oder ein Halogenatom.The 16α-hydroxy-9β, 10a- or -9a, 10a-steroids which can be prepared according to the invention are important starting materials for the synthesis of other 9ß, 10a or 9x, 10a steroids with pharmacological effect, which in position 16 has a different functional group wear, introduced by replacement of or reaction with the 16a-hydroxy group can be, e.g. B. an alkyl group, an amino group or a halogen atom.

Als gut geeignete Ausgangsstoffe seien folgende erwähnt: 9ß,10a-Progesteron, 6-Dehydro-9ß,10x-progesteron und 9a,10a-progesteron. Weiter sind auch Steroide, die in der Stellung 17 eine ß-gebundene Hydroxygruppe tragen, wie z. B. 9ß,10a-Testosteron oder 17ca-Alkyl-9ß,10a-testosteron geeignete Ausgangsprodukte. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen gehören der Familie der Moniliaceae an, die wiederum der Ordnung der Moniliales zugehört, welche in der Klasse der Fungi imperfecti liegt.The following are mentioned as suitable starting materials: 9β, 10a-progesterone, 6-dehydro-9ß, 10x-progesterone and 9a, 10a-progesterone. Next are steroids, carry a ß-bonded hydroxyl group in position 17, such as. B. 9β, 10α-testosterone or 17ca-alkyl-9ß, 10a-testosterone suitable starting products. the Microorganisms used according to the invention belong to the Moniliaceae family which in turn belongs to the order of the Moniliales, which belongs to the class of the Fungi imperfecti lies.

Besonders günstige Resultate wurden bei den Moniliaceae mit Mikroorganismen des Geschlechtes Sepedonium erzielt. Diese Klassifizierung entspricht der des »Dictionary of the Fungi« von G. C. A i n sw o r t h und G. R. B i s b y, veröffentlicht von dem Commonwealth Micrological Institute, Kew Surrey, England, 1961.Particularly favorable results were obtained with the Moniliaceae with microorganisms of the sex Sepedonium achieved. This classification corresponds to that of the »Dictionary of the Fungi ”by G. C. A i n sw o r t h and G. R. B i s b y, published by the Commonwealth Micrological Institute, Kew Surrey, England, 1961.

Von den Arten, welche insbesondere beim Zustandekommen der Erfindung gute Resultate lieferten, können folgende erwähnt werden: Sepedonium ampullosporum Damon und Sepedonium chrysosperum (Bull Fr Boudyn). Besonders mit dem Mikroorganismus Sepedonium ampullosporum sind sehr hohe Ausbeuten (80 °/o) bei der 16a-Hydroxylierung von 20-Keto-9ß;10ä-pregnanen, unter anderem von 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron erzielt worden. Im Hinblick darauf sei noch erwähnt, daß der gleiche Mikroorganismus das normale (10ß-Methyl-9a)-5ß-pregnan-3,11,20-trion nur zu etwa 20 °/o in das entsprechende 16-Hydroxy-steroid umwandelt.Of the types which were particularly important when the invention gave good results, the following can be mentioned: Sepedonium ampullosporum Damon and Sepedonium chrysosperum (Bull Fr Boudyn). Especially with the microorganism Sepedonium ampullosporum are very high yields (80%) in the 16a-hydroxylation by 20-keto-9ß; 10ä-pregnanes, including 6-dehydro-9ß, 10a-progesterone been. With regard to this, it should be mentioned that the same microorganism is the normal (10β-methyl-9a) -5β-pregnane-3,11,20-trione only about 20% in the corresponding Converts to 16-hydroxy steroid.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der bei bekannten mikrobiologischen Umwandlungen bekannten Weise durchgeführt, z. B. indem das Substrat unter geeigneten Bedingungen mit der Kultur einer der vorerwähnten Fungi und/oder mit einem Enzymsystem derselben in Berührung gebracht wird. Zu diesem Zweck wird z. B. zunächst eine Kultur des Fungus unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung entwickelt, worauf ein Gärmedium, das das zu oxydierende Steroid enthält und das in Lösung oder Suspension zugesetzt werden kann, der oxydierenden Dissimilationswirkung des entstandenen Myceliums unterworfen wird. Die Nährlösung besteht im wesentlichen aus einer Kohlenstoff= und einer Stickstoffquelle, z. B. einem Kohlehydrat, wie Glucose, Maltose oder Stärke, und einer organischen Stickstoffquelle, z. B. Maisquellwasser oder Hefeextrakt, Eiweißhydrolysaten, Aminosäuren oder einer anorganischen Stickstoffquelle, wie Ammoniumsalzen oder Alkalimetallnitraten.The method according to the invention is used in the known microbiological Conversions performed in a known manner, e.g. B. by placing the substrate under suitable Conditions with the culture of one of the aforementioned fungi and / or with an enzyme system the same is brought into contact. For this purpose z. B. first a culture of the fungus developed under aerobic conditions in a nutrient solution, whereupon a Fermentation medium that contains the steroid to be oxidized and that is in solution or suspension can be added, the oxidizing dissimilation effect of the resulting mycelium is subjected. The nutrient solution consists essentially of a carbon = and a source of nitrogen, e.g. B. a carbohydrate such as glucose, maltose or starch, and an organic nitrogen source, e.g. B. corn steep liquor or yeast extract, Protein hydrolysates, amino acids or an inorganic nitrogen source such as ammonium salts or alkali metal nitrates.

Dem Medium, das das zu oxydierende Steroid und eine oder mehrere der vorerwähnten Nährquellen enthält, kann gewünschtenfalls noch ein Antischaummittel, z. B. Glycerylmonostearat, zugesetzt werden. Der pH-Wert des Mediums kann auf normale Weise eingestellt werden; er beträgt vorzugsweise 6 bis 7.The medium containing the steroid to be oxidized and one or more of the contains the aforementioned nutrient sources, an anti-foam agent, z. B. glyceryl monostearate may be added. The pH of the medium can be normal Way to be set; it is preferably 6 to 7.

Die geeignetste Gärungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 28'C, obgleich höhere oder niedrigere Temperaturen zwischen 15 und 35'C im allgemeinen auch brauchbar sind.The most suitable fermentation temperature is usually between 20 and 28'C, although higher or lower temperatures between 15 and 35'C in general are also useful.

Die für die Oxydation des Steroids erforderliche zeit kann zwischen weiten Grenzen schwanken, aber gewöhnlich ist eine Oxydationsperiode von 10 bis 48 Stunden die beste für eine vollständige Umwandlung. Die nach Beendigung des Oxydationsvorganges erhaltenen 16a-Hydroxysteroide können auf eine der üblichen Weisen aus dem Medium und/oder dem Mycehum ausgeschieden werden, z. B. durch Extraktion mit nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther, Äthylacetat, Amylacetat, Methylisobutylketon oder mit anderen Estern und Ketonen. Insbesondere eignet sich Methylisobutylketon für die Extraktion. Das oxydierte Steroid kann auch durch chromatographische Verfahren, gegebenenfalls in Kombination mit Ex; traktion, aus dem Gärmedium abgetrennt und gereinigt werden.The time required for the steroid to oxidize can be between vary widely, but usually an oxidation period of 10 to 48 hours is the best for a complete conversion. After the end of the oxidation process 16a-hydroxysteroids obtained can be removed from the medium in one of the usual ways and / or excreted from the Mycehum, e.g. B. by extraction with not with Water-miscible organic solvents such as diethyl ether, ethyl acetate, amyl acetate, Methyl isobutyl ketone or with other esters and ketones. In particular, is suitable Methyl isobutyl ketone for extraction. The oxidized steroid can also be obtained by chromatographic Procedure, possibly in combination with Ex; traction, separated from the fermentation medium and cleaned.

Gemäß der Erfindung können die 16ca-Hydroxysteroide auch dadurch erzeugt werden, daß Sporen der erwähnten Mikroorganismen auf Lösungen oder Dispersionen der erwähnten Ausgangssteroide einwirken.According to the invention, the 16ca-hydroxysteroids can also be generated thereby that spores of the mentioned microorganisms on solutions or dispersions of the parent steroids mentioned.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.The following examples explain the process according to the invention.

Beispiel Umwandlung von 9ß,10a-Progesteron in 16a-Hydroxy-9ß,10a-progesteron Eine Nährlösung aus 10 g eingedicktem Maisquellwasser und 10 g Glucose in 500 ml destilliertemWasser wurde mit Hilfe einer wässerigen 2n-Natriumhydroxydlösung auf pH = 6,8 eingestellt und nach Sterilisierung bei einer Temperatur von 120°C 20 Minuten mit einer auf Hafermalzagar gewachsenen Kultur von Sepedonium ampullosporum geimpft. Diese Impfkultur wurde in einem Schüttelkolben von 21 Inhalt 24 Stunden bei 26'C durch eine rotierende Schüttelmaschine (250 U./ Min.) geschüttelt, worauf das entstandene Myceliumgemisch in einen rostfreien stählernen Gärbottich von 1001 mit Rührwerk und Belüftungsvorrichtung gebracht wurde, der das nachfolgende, unter. den vorerwähnten Bedingungen sterilisierte Gärmedium enthielt: Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff)........................... 300 g Glucose .............................. 250 g Glycerylmonostearat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30g Leitungswasser ........................ 401 pH = 6;8 (Natriumhydroxydlösung).Example Conversion of 9β, 10a-progesterone into 16a-hydroxy-9β, 10a-progesterone Sterilization at a temperature of 120 ° C for 20 minutes with a culture of Sepedonium ampullosporum grown on oat malt agar. This inoculation culture was shaken in a shaking flask with a capacity of 21 for 24 hours at 26 ° C. by a rotating shaker (250 rpm), whereupon the resulting mycelium mixture was placed in a stainless steel fermentation vat from 1001 with a stirrer and aeration device, which is the following , under. Fermentation medium sterilized under the aforementioned conditions contained: Corn steeple (calculated on the dry matter) ........................... 300 g glucose ..... ......................... 250 g glyceryl monostearate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30g tap water ........................ 401 pH = 6; 8 (sodium hydroxide solution).

Beispiel II Umwandlung von 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 6-Dehydro-16,x-hydroxy-9ß,10a-progesteron Ein Medium aus 20 g Caseinhydrolysat, 10 g Hefeextrakt, 20 g Glucose, 5 g Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff) und 2 g primärem Ammoniumphosphat wurde mit Wasser bis auf 1000 ml aufgefüllt und dann mit 2 n-Natriumhydroxydlauge auf pH = 6,1 gebracht. 10 l dieses Mediums wurden sterilisiert und dann mit einer Kultur von Sepedonium chrysospermum geimpft und darauf 36 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 28'C inkubiert, während durch das Fermentationsgemisch 121 sterile Luft pro Minute geleitet wurden. Der erwachsenen Kultur wurde dann eine Lösung von 6,0 g 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 250 ml Aceton zugesetzt, worauf dieses Gemisch noch 48 Stunden bei einer Temperatur von 28'C unter Rühren und Hindurchleiten von Luft inkubiert wurde.Example II Conversion of 6-dehydro-9β, 10a-progesterone into 6-dehydro-16, x-hydroxy-9β, 10a-progesterone A medium consisting of 20 g casein hydrolyzate, 10 g yeast extract, 20 g glucose, 5 g corn steep liquor (calculated on the dry substance) and 2 g of primary ammonium phosphate were made up to 1000 ml with water and then brought to pH = 6.1 with 2N sodium hydroxide solution. 10 l of this medium were sterilized and then inoculated with a culture of Sepedonium chrysospermum and then incubated for 36 hours with stirring at a temperature of 28 ° C. while 121 sterile air was passed through the fermentation mixture per minute. A solution of 6.0 g of 6-dehydro-9β, 10α-progesterone in 250 ml of acetone was then added to the adult culture, whereupon this mixture was incubated for a further 48 hours at a temperature of 28 ° C. while stirring and passing air through.

Das Mycelium wurde darauf von der Gärflüssigkeit getrennt, worauf das Filtrat viermal mit 2000 m1 Methylisobutylketon extrahiert wurde. Die gesammelten Extrakte wurden im Vakuum auf 800 ml eingedampft, dann mit einer Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und schließlich mit aktivierter Kohle behandelt. Der filtrierte Extrakt wurde darauf im Vakuum auf 35 ml konzentriert, worauf 4,59 g kristallines Produkt abfiltriert wurden. Die Mutterlauge wurde bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde zweimal aus einem Aceton-Heptan-Gemisch (1: 1) umkristallisiert. Es wurde noch weiter 0,477 g Kristallisat erhalten.The mycelium was then separated from the fermentation liquid, whereupon the filtrate was extracted four times with 2000 ml of methyl isobutyl ketone. The collected Extracts were evaporated to 800 ml in vacuo, then with a sodium bicarbonate solution and water and finally treated with activated charcoal. The filtered The extract was then concentrated in vacuo to 35 ml, whereupon 4.59 g of crystalline product were filtered off. The mother liquor was left to dryness evaporated and the residue was extracted twice from an acetone-heptane mixture (1: 1) recrystallized. A further 0.477 g of crystals was obtained.

Diesem Gärmedium wurden unter aseptischen Bedingungen 12,5 g 9ß,10a-Progesteron, in 200 ml sterilem Wasser suspendiert, zugesetzt, worauf 36 Stunden bei 26'C fermentiert wurde (Umdrehungszahl: 140 pro Minute; Luftzufuhr: 0,9 m3 pro Quadratmeter Bodenfläche pro Minute).12.5 g of 9β, 10α-progesterone, Suspended in 200 ml of sterile water, added, followed by fermentation for 36 hours at 26'C was (speed: 140 per minute; air supply: 0.9 m3 per square meter of floor area per minute).

Das Filtrat der Kultur (39,41) wurde darauf dreimal mit 81 Methylisobutylketon extrahiert. Der Gesamtextrakt wurde im Vakuum auf 11 eingedampft, darauf mit Natriumhydroxyd und Wasser gewaschen und dann mit aktivierter Kohle behandelt. Der so behandelte, eingedampfte Extrakt wurde nach Filtrieren im Vakuum auf 100 ml konzentriert. Dabei entstanden 9,7 g kristalliner Niederschlag, der als 16a-Hydroxy-9ß,10ca-progesteron identifiziert wurde. Das Kristallisat wurde aus 50 ml Methanol-Wasser (2: 1) umkristallisiert, wobei 9,54 g weißes, kristallines Endprodukt mit einem Schmelzpunkt von 172,5 bis 174,5°C erhalten wurden. -92,3'(c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: Amax = 244 m#t (e = 16.900).The culture filtrate (39.41) was then extracted three times with 81% methyl isobutyl ketone. The total extract was evaporated to 11 in vacuo, then washed with sodium hydroxide and water and then treated with activated charcoal. The thus treated, evaporated extract was, after filtration, concentrated to 100 ml in vacuo. This resulted in 9.7 g of crystalline precipitate which was identified as 16α-hydroxy-9β, 10ca-progesterone. The crystals were recrystallized from 50 ml of methanol-water (2: 1), 9.54 g of white, crystalline end product having a melting point of 172.5 to 174.5 ° C. being obtained. -92.3 '(c = 1, chloroform); UV absorption spectrum in methanol: Amax = 244 m # t (e = 16,900).

Elementaranalyse für C21113003: Gefunden ... C 76,170/0, H 9,210/0; berechnet ... C 76,320/0, H 9,150/0.Elemental Analysis for C21113003: Found ... C 76.170 / 0, H 9.210 / 0; calculated ... C 76.320 / 0, H 9.150 / 0.

Aus den Mutterlaugen wurde durch Eindampfen bis zur Trockne und durch Umkristallisieren noch 0,7 g reines Produkt erhalten.The mother liquors became through evaporation to dryness and through Recrystallization still obtained 0.7 g of pure product.

Die vereinigten Kristallisate wurden zweimal aus jeweils 45 ml Methanol-Wasser (2: 1) umkristallisiert, wobei 4,71 g des Produktes erhalten wurden, das als reines 6-Dehydro-16a-hydroxy-9ß,10a-progesteron identifiziert werden konnte. Schmelzpunkt: 204 bis 205'C; = -528' (c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: Am"" = 286 m#t (e = 26.800).The combined crystals were recrystallized twice from 45 ml of methanol-water (2: 1) each time, giving 4.71 g of the product which could be identified as pure 6-dehydro-16a-hydroxy-9β, 10a-progesterone. Melting point: 204 to 205 ° C; = -528 '(c = 1, chloroform); UV absorption spectrum in methanol: Am "" = 286 m # t (e = 26,800).

Elementaranalyse für C21112,03: Gefunden ... C 76,850/0, H 8,490/0; berechnet ... C 76,79 0/0, H 8,59 0/0.Elemental Analysis for C21112.03: Found ... C 76.850 / 0, H 8.490 / 0; calculated ... C 76.79 0/0, H 8.59 0/0.

Beispiel III Umwandlung von 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 6-Dehydro-16a-hydroxy-9ß,10a-progesteron Einer 24stündigen Kultur von Sepedonium ampullosporum in 5001 Nährmedium mit 5 kg Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff') und 0,5 0/0 Glucose wurden 250 g 6-Dehydro-9ß,10a-progesteron in 51 Aceton zugesetzt.Example III Conversion of 6-dehydro-9β, 10a-progesterone into 6-dehydro-16a-hydroxy-9β, 10a-progesterone A 24-hour culture of Sepedonium ampullosporum in 5001 nutrient medium with 5 kg corn steep liquor (calculated on the dry matter ') and 0 , 50/0 glucose were added to 250 g of 6-dehydro-9β, 10α-progesterone in 51 acetone.

Die Gärflüssigkeit wurde unter den im Beispiel I beschriebenen Bedingungen 60 Stunden bei 24'C inkubiert.The fermentation liquid was prepared under the conditions described in Example I. Incubated for 60 hours at 24'C.

Nach Unterbrechung der Gärung wurde das Mycelium durch Zentrifugieren von der Kulturflüssigkeit getrennt. Sowohl das Mycelium als auch die Kulturflüssigkeit wurden dreimal mit 601 Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wurde nach Beispiel II aufgearbeitet, bis ein kristallines Produkt erhalten wurde. Insgesamt wurden 195 g kristallines 6-Dehydro-16a-hydroxy-9ß,10a-progesteron erhalten; Schmelzpunkt: 203 bis 204°C; - -520° (c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: .1..x = 286 mp. (e = 26.800).After fermentation was interrupted, the mycelium was separated from the culture liquid by centrifugation. Both the mycelium and the culture fluid were extracted three times with 60 liters of methyl isobutyl ketone. The extract was worked up according to Example II until a crystalline product was obtained. A total of 195 g of crystalline 6-dehydro-16a-hydroxy-9β, 10a-progesterone were obtained; Melting point: 203 to 204 ° C; - -520 ° (c = 1, chloroform); UV absorption spectrum in methanol: .1..x = 286 mp. (e = 26,800).

Beispiel IV Umwandlung von '9ß,10a-Testosteron in 16a-Hydroxy-9ß,10a-testosteron 20 Schüttelkulturen von Sepedonium chrysospermum von je 1000 ml in 2-1-Erlenmeyerkolben wurden ,48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine (300 U./Min.) bei 26'C geschüttelt. Das verwendete Medium wurde mit 2n-Natriumhydroxydlösung auf p11 6,2 eingestellt und enthielt die nachfolgenden Bestandteile Eingedicktes Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff) . . . . . . . . . . . . . 10/0 Rohrzuckermelasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20/0 Caseinhydrolysat ..................... 0,50/0 Primärammoniumphosphat ............ 0,20/0 Natriumacetat .... .... . ...... ... . .. .. . 0,10/0 Darauf wurde das Gärgemisch in einen rostfreien stählernen Gärbottich von 501 mit einem Rührwerk und einer Belüftungsvorrichtung gebracht, worauf 4 g 9ß,10a-Testosteron in 300 ml Aceton zugegeben wurden. Nach 56stündiger Züchtung bei 26'C (Umdrehungszahl: 140 pro Minute; Luftzufuhr: 151/Min.) wurde die Gärflüssigkeit von dem Mycelium getrennt und das Filtrat dreimal mit 41 Methylisobutylketon extrahiert. Der Gesamtextrakt wurde im Vakuum auf 750 ml eingedampft, mit Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen und schließlich mit aktivierter Kohle behandelt. Die Lösung wurde darauf im Vakuum auf 90 ml konzentriert. Aus diesem Konzentrat wurden nach Abkühlung 2,9 g kristallines Produkt abgetrennt. Die Mutterlauge wurde trockengedampft und der Rückstand wurde unter Erwärmung in einem Gemisch von 4 ml Aceton und 4 ml Heptan gelöst. Durch Abkühlung wurden daraus noch 0,120 g Kristallisat erhalten. Das Gesamtprodukt wurde aus 45 ml Methanol-Wasser (2: 1) umkristallisiert, wobei 2,85 g reines 16a-Hydroxy-9ß,10a-testosteron erhaltenwurde, welches die nachfolgenden Konstanten aufwies: Schmelzpunkt 210 bis 212'C; = -164' (c = 1, Chloroform); UV-Absorptionsspektrum in Methanol: @max = 242 m[.; (s = 16.700).Example IV Conversion of '9β, 10α-testosterone into 16α-hydroxy-9β, 10α-testosterone 20 shaking cultures of Sepedonium chrysospermum of 1000 ml each in 2-1 Erlenmeyer flasks were placed on a rotating shaker (300 rpm) for 48 hours. ) shaken at 26'C. The medium used was adjusted to p11 6.2 with 2N sodium hydroxide solution and contained the following components: Thickened corn steep liquor (calculated on the dry substance). . . . . . . . . . . . . 10/0 cane sugar molasses. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20/0 casein hydrolyzate ..................... 0.50 / 0 primary ammonium phosphate ............ 0.20 / 0 sodium acetate. ... ..... ...... .... .. ... 0.10 / 0 The fermentation mixture was then placed in a stainless steel fermentation vat from 501 with a stirrer and aeration device, whereupon 4 g of 9β, 10α-testosterone in 300 ml of acetone were added. After 56 hours of cultivation at 26 ° C. (number of revolutions: 140 per minute; air supply: 151 / min.) The fermentation liquid was separated from the mycelium and the filtrate was extracted three times with 41% methyl isobutyl ketone. The total extract was evaporated to 750 ml in vacuo, washed with sodium carbonate solution and water and finally treated with activated charcoal. The solution was then concentrated to 90 ml in vacuo. After cooling, 2.9 g of crystalline product were separated off from this concentrate. The mother liquor was evaporated dry and the residue was dissolved with heating in a mixture of 4 ml of acetone and 4 ml of heptane. 0.120 g of crystals were obtained therefrom by cooling. The total product was recrystallized from 45 ml of methanol-water (2: 1) to give 2.85 g of pure 16a-hydroxy-9β, 10a-testosterone which had the following constants: melting point 210 to 212 ° C; = -164 '(c = 1, chloroform); UV absorption spectrum in methanol: @max = 242 m [.; (s = 16,700).

Elementaranalyse für C19112,03: Gefunden ... C 74,750/0, H 9,300/0; berechnet ... C 74,960/0, H 9,270/0.Elemental Analysis for C19112.03: Found ... C 74.750 / 0, H 9.300 / 0; calculated ... C 74.960 / 0, H 9.270 / 0.

Claims

Claims: 1.

Process for the preparation of 16a-hydroxy-9ß, 10a- or 9a, 10a-steroids of the androstane or pregnane series, marked thereby, that one has a corresponding 3-keto-4-dehydro-, 3-keto-4,6-bisdehydro- or 3-hydroxy-5-dehydro-9ß, 10a- or -9a, 10a-steroid, which carries two hydrogen atoms on carbon atom 16 or their 3-ethers or -esters in a manner known per se of the oxidizing effect of a Microorganism of the family of the Moniliaceae or enzyme systems or spores thereof subject. 2 ': The method according to claim 1, characterized in that that the conversion takes place with a representative of the Sepedonium clan.

3. Procedure according to claim 2, characterized in that a fungus of the species Sepedonium ampullosporum or Sepedonium chrysospermum is used.

4. The method according to claim 3, characterized characterized in that 6-dehydro-9ß, 10cx-progesterone is used as the starting compound. Documents considered: U.S. Patent Nos. 3,007,950, 3 011951: