DE1224255B

DE1224255B - Process for the production of purified salt-free enzyme preparations

Info

Publication number: DE1224255B
Application number: DEF43473A
Authority: DE
Inventors: Dr Werner Frommer; Dr Fritz Ziegler
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1964-07-17
Filing date: 1964-07-17
Publication date: 1966-09-08

Description

Verfahren zur Gewinnung von gereinigten salzfreien Enzympräparaten Es ist bekannt, daß man Eiweißstoffe aus ihren Lösungen in Form von wasserunlöslichen Verbin-d ungen mit Tannin ausfällen kann. Darauf beruht die Verwendung des Tannins als Gruppenreagenz für Eiweißstoffe. Bei dieser Fällung werden jedoch außer den Eiweißstoffen auch noch andere Verbindungen mitausgefällt, deren Tannate ebenfalls unlöslich sind. Die völlige Abtrennung des Tannins aus den so erhaltenen gemischten Niederschlägen ist im allgemeinen sehr schwierig, da sich diese Niederschläge oft nur unvollständig in ihre Komponenten zerlegen lassen. Es glingt zwar, durch oftmaliges Auswaschen mit ' Aceton oder mit Alkoholen den größten Teil des Tantims aus reinen Eiweißfällungen herauszuwaschen, ohne daß dabei jedoch eine einfache, auch technisch durchführbare Trennung der Eiweißstoffe ermöglicht wird. Auch das Verfahren von R. W i 11 s t ä t t e r und A. P o 11 i n g e r in Liebigs A nnalen der Chemie, Bd. 430 (1923), S. 284, sieht eine solche Möglichkeit nicht vor.A process for obtaining salt-free purified enzyme preparations It is known that proteins from their solutions in the form of water-insoluble connects d can result in changes precipitated with tannin. The use of tannin as a group reagent for proteins is based on this. In this precipitation, however, in addition to the proteins, other compounds are also precipitated, the tannates of which are also insoluble. The complete separation of the tannin from the mixed precipitates thus obtained is generally very difficult, since these precipitates can often only be broken down incompletely into their components. While it glingt, wash out by off frequently washing with 'acetone or alcohols with most of the Tantims of pure protein precipitation, without, however, a simple, technically feasible separation of proteins is possible. Also, the method of R. W i 11 st ä tter and A. P o 11 g in it in Liebigs A Chemistry, Vol nnalen. 430 (1923), p 284, does not provide such a possibility.

Auch das Verfahren der Deutschen Patentschrift 629 416 zur Herstellung von reinen Amylasepräparaten nalt Hilfe der Tanninfällung, das darin besteht, daß man den Tanninniederschlag in Aceton einrührt, von der Acetonlösung abtrennt und dann mit Wasser aufnimmt, bringt keine eigentliche Fraktionierung der mit Tannin ausgefällten Eiweißstoffe, sondern lediglich eine Trennung der wasserlöslichen von den wasserunlöslichen Stoffen des ausgewaschenen Niederschlags.The process of German patent specification 629 416 for the production of pure amylase preparations with the help of tannin precipitation, which consists in stirring the tannin precipitate into acetone, separating it from the acetone solution and then taking it up with water, does not actually result in fractionation of the protein substances precipitated with tannin, but only a separation of the water-soluble from the water-insoluble substances of the washed-out precipitate.

Aus diesem Grunde wurde die Methode der Tanninfällung nur selten zur Reinigung und Anreicherung von Eiweißstoffen herausgezogen. Auch für die Herstellung von Enzympräparaten wurde sie wegen ihrer Unspezifität kaum angewendet.For this reason, the method of tannin precipitation was seldom used Purification and enrichment of proteins pulled out. Also for manufacturing it was rarely used by enzyme preparations because of its unspecificity.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur GewinnungvongereinigtensalzfreienEnzympräparaten, wobei die Enzymlösungen mit Tannin gefällt und der Niederschlag anschließend mit Wasser ausgewaschen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem gewaschenen Niederschlag die Enzyme mit dem 3- bis 6fachen Volumen des Niederschlages an wäßrigen Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln extrahiert und aus den Extrakten die Enzyme in an sich bekannter Weise durch Zusatz von Aceton oder nüt Wasser mischbaren Alkoholen ausfällt.The invention relates to a process for obtaining reconstituted salt-free enzyme preparations, wherein the enzyme solutions are precipitated with tannin and the precipitate is then washed out with water, characterized in that the enzymes are extracted from the washed precipitate with 3 to 6 times the volume of the precipitate in aqueous solutions of water extracted from miscible organic solvents and the enzymes are precipitated from the extracts in a manner known per se by adding acetone or water-miscible alcohols.

Die Tannate vieler Enzyme sind nämlich im Gegensatz zu den Tanninverbindungen der meisten übrigen Eiweißkörper und der oft mitanfallenden Ballaststoffe in wäßrigen Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln leicht löslich, so daß sie in verhältnismäßig einfacher Weise von den übrigen Tanninverbindungen abgetrennt werden können. Die Gewinnung der tanninfreien Enzyme aus den dabei erhaltenen Extrakten kann in einfacher Weise dadurch geschehen, daß man Aceton oder mit Wasser mischbare Alkohole zusetzt. Dabei fallen die Enzyme aus, während das Tannin gelöst bleibt.The tannates of many enzymes are in contrast to the tannin compounds most of the remaining protein bodies and the dietary fiber that is often also accrued in water Solutions of water-miscible organic solvents easily soluble, see above that they are separated from the other tannin compounds in a relatively simple manner can be. Obtaining the tannin-free enzymes from the extracts obtained can be done in a simple manner by using acetone or water-miscible Adds alcohols. The enzymes fall out while the tannin remains dissolved.

Durch Auswaschen der Tanninniederschläge durch Wasser werden die löslichen Salze entfernt.By washing out the tannin precipitates with water, the soluble ones become Salts removed.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann deshalb auch dazu verwendet werden, bereits vorgereinigte, aber noch wasserlösliche Verbindungen, vor allem Salze enthaltende Enzympräparate, ohne Vorschaltung umständlicher Maßnahmen an diesen Ballaststoffen zu befreien. Zu diesem Zweck kann der Tanninniederschlag nach dem Auswaschen mit Wasser z. B. mit etwa 30- bis 50"/,igem wäßrigem Aceton extrahiert werden und die Enzyme aus dem Extrakt durch Zugabe von mehr Aceton ausgefällt werden.The method according to the invention can therefore also be used to free compounds which have already been pre-cleaned but are still water-soluble, especially enzyme preparations containing salts, without the need for laborious measures to be taken beforehand. For this purpose, the tannin precipitate can be washed out with water, for. B. extracted with about 30 to 50 "/, strength aqueous acetone and the enzymes are precipitated from the extract by adding more acetone.

An Stelle von Aceton sind zur Extraktion auch andere mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wie Alkohole, Glykole, Glykoläther, Dioxan, Tetrahydrofuran, Milchsäureäthylester, geeignet, während zur Ausfällung der Enzyme aus den Extrakten vorzugsweise Aceton oder mit Wasser mischbare Alkohole verwendet werden.Instead of acetone, others are also miscible with water for extraction organic solvents such as alcohols, glycols, glycol ethers, dioxane, tetrahydrofuran, Lactic acid ethyl ester, suitable while for precipitating the enzymes from the extracts preferably acetone or water-miscible alcohols are used.

Für die Extraktion stellt man den Wassergehalt des Extraktionsmittels je nach der Art des verwendeten organischen Lösungsmittels auf 20 bis 800/, ein. Bei Verwendung von Glykolen genügt dabei schon ein Wassergehalt von 20 bis 30"/" während bei der Verwendung von Alkoholen oder Aceton der Wassergehalt höher sein muß.For the extraction, the water content of the extractant is adjusted to between 20 and 800 %, depending on the type of organic solvent used. When using glycols, a water content of 20 to 30 "/" is sufficient, while when using alcohols or acetone the water content must be higher.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Enzympräparate in verhältnismäßig reiner Form in Ausbeuten erhalten, die wesentlich über denjenigen liegen, die nach den früheren Verfahren, z. B. bei der Sprühtrocknung oder bei der Ausfällung mit Ammonsulfat, erhalten werden. Das erfindungsgemäße Verfahren hat außerdem den großen Vorteil, daß es ein sehr schonendes Verfahren., ist und daher nicht die Gefahr einer ganzen oder teilweisen Zerstörung der Enzyme in sich birgt.According to the method according to the invention, enzyme preparations are in proportion pure form obtained in yields that are significantly higher than those obtained after the earlier procedures, e.g. B. in the spray drying or in the precipitation with Ammonium sulfate. The inventive method Has also the great advantage that it is a very gentle process., and therefore does not entail the risk of total or partial destruction of the enzymes.

Die Ausfällung der Tanninniederschläge kann durch Zugabe von Salzen, z. B. Ammoniumsulfat, Natriumchlorid usw., unterstützt werden. Diese Salze werden dabei in so geringen Mengen angewendet, daß sie allein eine Fällung n - icht verursachen würden.The precipitation of the tannin precipitates can be achieved by adding salts, e.g. B. ammonium sulfate, sodium chloride, etc., can be supported. These salts are thereby applied in such small quantities that they alone n precipitation - would cause maybe.

Ebenso kann die Ausfällung- der salzfreien Enzympräparate aus den die organischen Lösungsm- ittel enthaltenden Extrakten durch Zugabe geringer Mengen von in diesem Medium löslichen organischen Salzen, z. B. Ammoniumsalieylat, unterstützt werden. Beispiel 1 4101 der filtrf#rten Kulturbrühe eines celluloseabbauende Enzyme produzierenden Schimmelpilzes, die pro Kubikzentimeter etwa 3,2LVE (Lichenase-Vergleichs-Einheiten nach W. Grassmann) enthielt, insgesamt also etwa 1,30Mill. LVE, murden im Vakuum bei 30'C -etwa auf 100 1 eingeengt. Das Konzentrat wurde unter Rühren mit 5kg Ammonsulfat und 600 g Tanniin, in 6 1 Wasser gelöst, versetzt. Nach Einstellen eines pH-Wertes von etwa 5,8 blieb die Lösung mit dem Niederschlag etwa 2Stunden stehen. Dann wurde der in feuchtem Zustand mehrere Kilogramm ausmachende Niederschlag abgeschleudert, durch Aufschlämmen in Wasser und. nochmaliges Abschleudern ausgewaschen. Der stark gequollene Niederschlag, der ein Volumen von 3 bis 41 einnahm, wurde einmal mit etwa 61 500./,igem und einmal mit 8 1 400/nigem wäßrigem Aceton eluiert. Die durch Passieren eines Druckfilters geklärten und vereinigten Eluate, etwa 15 1, wurden mit etwa 65 1 Aceton versetzt; zur Beschleunigung der Ausflockung der Proteinstoffe wurde eine geringe Menge einer acetonischen Lösung von Salicylsäure hinzugegeben, die zugleich eine Aufhellung der Lösung bewirkte. Nach kurzem Stehen wurde der Niederschlag abgeschleudert, nochmals mit Aceton ausgewaschen und dann getrocknet. Es hinterblieben 360 g eines in Wasser löslichen Präparates, das pro Gramm etwa 1875 LVE, insgesamt also 0,675 Mill. LVE, enthielt. Da die Tanninfällung noch nicht vollständig war, wurde die Mutterlauge von der Tanninfällung n-dt weiteren 300 g Tannin versetzt. Der sich bildende Niederschlag wurde in der gleichen Weise wie der erste aufgearbeitet und lieferte noch 270 g eines Trockenpräparates mit etwa 940 LVE/g, insgesamt etwa 0,252 Mill. LVE. Die Gesamtausbeute betrug somit 0,928 Mill. LVE, das sind etwa 710/, der in der Ausgangslösung vorhandenen Enzymmenge. Beispiel 2 200 cem der filtrierten Kulturbrühe eines celluloseabbauende Enzyme produzierenden SchiTnmelpilzes, die pro Kubikzentimeter etwa 4,5 LVE (Lichenase-Vergleichs-Einheiten nach W. G r a s s m a n n) enthielt, wurden auf einen. pH-Wert von etwa 5,7 eingestellt und dann mit 6 ccm 100/,)iger, auf den gleichen pH-Wert eingestellten Tanninlösung direkt gefällt. Der ausgeschiedene Niederschlag wurde nach 3stündigem Stehen bei Zimmertemperatur (etwa 18'C) abgeschleudert und zweimal mit Wasser gewaschen. Der gallertige Niederschlag, der nach dem Abschleudern noch ein Volumen von etwa 10 bis 15 ccm einnahm, wurde zweimal mit je 30 ccm 400/,igem wäßrigem Aceton eluiert. Die vereinigten Elutionen (etwa 50 ccm) wurden mit etwa 250 ccm Aceton versetzt und der entstandene Niederschlag (der in einem in gleicher Weise durchgeführten Parallelversuch etwa 200 mg Trockenpräparat geliefert hatte) nach einmaligem Auswaschen mit Aceton in 100 ccm Wasser suspendiert, wobei die Suspension noch eine Trübung aufwies.Likewise, the precipitation of the salt-free enzyme preparations from the extracts containing the organic solvents can be achieved by adding small amounts of organic salts which are soluble in this medium, e.g. B. Ammoniumsalieylat be supported. Example 1 4101 of the filtered culture broth of a mold producing cellulose-degrading enzymes, which contained about 3.2 LVE (lichenase comparison units according to W. Grassmann) per cubic centimeter, so a total of about 1.30 mill. LVE, murden in vacuo at 30'C - concentrated to about 100 l. The concentrate was mixed with 5 kg of ammonium sulfate and 600 g of tanniine, dissolved in 6 l of water, while stirring. After adjusting the pH to about 5.8 , the solution with the precipitate remained standing for about 2 hours. Then the precipitate, which made up several kilograms when wet, was thrown off by slurrying in water and. repeated spinning washed out. The highly swollen precipitate, which occupied a volume of 3 to 41, was washed once with about 61 500./,igem and eluted once with 8 1 400 / NiGEM aqueous acetone. The eluates, about 15 l, which were clarified and combined by passing through a pressure filter, were mixed with about 65 l of acetone; To accelerate the flocculation of the protein substances, a small amount of an acetone solution of salicylic acid was added, which at the same time caused the solution to lighten. After standing for a short time, the precipitate was spun off, washed out again with acetone and then dried. 360 g of a water-soluble preparation remained, which contained about 1875 LVU per gram, i.e. a total of 0.675 million LVU. Since the tannin precipitation was not yet complete, a further 300 g of tannin was added to the mother liquor from the tannin precipitation n-dt. The precipitate that formed was worked up in the same way as the first and yielded 270 g of a dry preparation with about 940 LVU / g, a total of about 0.252 million LVU. The total yield was thus 0.928 million LVU, that is about 710 /, of the amount of enzyme present in the starting solution. Example 2 200 cc of the filtered culture broth of a cellulose-degrading enzymes-producing SchiTnmelpilzes that about 4.5 cubic centimeters per LVE (lichenase-comparison units by W. G Rassmann) were coated onto a. The pH is adjusted to about 5.7 and then directly precipitated with 6 ccm of 100% tannin solution adjusted to the same pH value. The precipitate which separated out was spun off after standing for 3 hours at room temperature (about 18 ° C.) and washed twice with water. The gelatinous precipitate, which after being spun off, still took up a volume of about 10 to 15 ccm, was eluted twice with 30 ccm of 400% aqueous acetone each time. The combined elutions (about 50 ccm) were mixed with about 250 ccm of acetone and the resulting precipitate (which had supplied about 200 mg of dry preparation in a parallel experiment carried out in the same way) was suspended in 100 ccm of water after being washed once with acetone, the suspension still remaining exhibited haze.

DieSuspensionmitderTrübungenthielt6,9LVE/ccm, entsprechend einer Enzymausbeute von etwa 770/,. Nach dem Abschleudern der Trübung enthielt die blanke Lösung noch 6,0 LVE/ccm, entsprechend einer Enzymausbeute von etwa 67 Ofc, Beispiel 3 In 5401 eines aus der Züchtung eines Proteasen erzeugenden Schimmelpilzes stammenden Kulturfiltrates, das pro Kubikzentimeter etwa 110TVE (TVE=Tyrosiia-Vergleichs-Einheit, eine für die Routinebestimmung von uns verwendete kleine Proteaseeinheit, die wie die von A n s o n eingeführte T.-U. [Tyrosin-Unit] auf der Freilegung von Tyrosin .aus Kasein unter der Einwirkung von Proteasen beruht und nach der gleichen Methode bestimmt wird, aber wesentlich kleiner ist und den bei der spektrophotometrischen Bestimmung herrschenden Größenverhältnissen angepaßt ist) enthielt,. insgesamt also etwa 59,4 Mill. TVE, wurden 10 kg Amna7onsulfat gelöst und dann in die Lösung 750 g Tannin, in etwa 71 Wasser gelöst, eingerührt. Nach dem Einstellen eines pH-Wertes von etwa 5,8 in der Lösung blieb diese 2 Stunden stehen. Nach dieser Zeit wurde der entstandene Niederschlag abgeschleudert, einmal püt dem mehrfachen Volumen Wasser aufgeschlämmt und wieder abgeschleudert, Der stark gequollene, ein Volumen von 6 bis 71 einnehmende Niederschlag wurde nun nacheinander mit 71 60"/,igem, 51 50%igem und 31 400/,igem wäßrigem Aceton eluiert, die Elutionen vereinigt (etwa 17 1) und nach dem -völligen Klären durch ein Druckfilter in die 5fache Menge Aceton gegossen. Der entstehende Niederschlag wurde mit Aceton nochmals ausgewaschen und dann getrocknet. Ausbeute 538 g mit etwa 94,5 TVE pro Milligramm, entsprechend etwa 50,48 Mill, TVE oder 840/, der im Kulturfiltrat vorhandenen Enzymmenge.The suspension with the turbidity contained 6.9 LVU / ccm, corresponding to an enzyme yield of about 770 / cc. After the turbidity had been spun off, the bare solution still contained 6.0 LVU / ccm, corresponding to an enzyme yield of about 67 oc, Example 3 In 5401 of a culture filtrate from the cultivation of a protease-producing mold, which per cubic centimeter was about 110TVE (TVE = Tyrosiia- comparison unit, a small protease unit used for the routine determination of us who like based on a nson introduced T.-U. [tyrosine-unit] on the exposure of tyrosine .from casein by the action of proteases and by the same method is determined, but it is much smaller and the pressure prevailing in the spectrophotometric determination proportions adapted contained) ,. So a total of about 59.4 million TVU, 10 kg of ammonium sulfate were dissolved and then 750 g of tannin dissolved in about 71 water were stirred into the solution. After adjusting the pH to about 5.8 in the solution, it remained there for 2 hours. After this time, the resulting precipitate was centrifuged, once Puet several times its volume of water slurried and again centrifuged, the highly swollen, a volume 6-71 engaging precipitate was then washed successively with 71 60 "/, sodium, 51 50% and 31 400 /, aqueous acetone eluted, the elutions combined (about 17 l) and, after complete clarification, poured through a pressure filter into 5 times the amount of acetone. The resulting precipitate was washed out again with acetone and then dried. Yield 538 g with about 94, 5 TVU per milligram, corresponding to about 50.48 mill, TVE or 840 /, the amount of enzyme present in the culture filtrate.

Beispiel 4 Eine aus Pankreatin hergestellte, durch Filtration geklärte Lösung enthielt pro Kubikzentimeter 168 TVE. 490 ccm dieser Lösung wurden nach Zugabe von 20 ccm gesättigter Animensulfatlösung mit 50 ccM 10"/,iger Tanninlösung gefällt. Der Niederschlag wurde nach Istündigem Stehen abgeschleudert und einmal mit destilliertem Wasser ausgewaschen. Der stark gequollene Niederschlag, der nach dem Abschleudern noch ein Volumen von etwa 25 ccm einnahm, wurde zweimal mit je 40 ccm 500/,igem wäßrigem Aceton eluiert. Die von den unlöslichen Anteilen getrennte und durch Filtration geklärte Elution, etwa 80 ccm, wurde mit etwa dem 6fachen Volumen Aceton gefällt, der Niederschlag mit Aceton ausgewaschen und dann getrocknet. Es wurden 1,4 g eines Präparates erhalten, das pro Milligramm 42,8 TVE, insgesamt also etwa 73 % der in der Lösung enthaltenen proteolytischen Enzyme aufwies.Example 4 A solution prepared from pancreatin and clarified by filtration contained 168 TVU per cubic centimeter. 490 ccm of this solution were precipitated after the addition of 20 ccm of saturated anime sulfate solution with 50 ccM 10 "strength tannin solution. The precipitate was spun off after standing for one hour and washed out once with distilled water about 25 occupied cc, was eluted twice with 40 cc of 500 /, aqueous acetone. the separated from the insoluble constituents and clarified by filtration elution, about 80 ccm, was precipitated with about 6 times the volume of acetone, and the precipitate with acetone, washed and 1.4 g of a preparation were obtained which had 42.8 TVU per milligram, a total of about 73% of the proteolytic enzymes contained in the solution.

Durch Versetzen der Acetonrestlösung mit einer acetonischen Lösung von Salicylsäure wurde noch eine kleinere Menge (0,330 g) eines Präparates ausgefällt, das pro Milligramm etwa 13,0 TVE enthielt.By adding an acetone solution of salicylic acid to the residual acetone solution, a smaller amount (0.330 g) of a preparation was precipitated which contained about 13.0 TVU per milligram.

Die Prüfung der Amylaseaktivität der Hauptfällung ergab, daß sie etwa 162 Amylasgeinheiten im Gramm enthielt, gegenüber etwa 8 Amylaseeinbeiten im Gramm des Ausgangspräparates, von dem bei der Herstellung der Lösung aber ein Teil ungelöst geblieben war. Beispiel 5 50 g eines Rohpräparates von Pilzprotease, das pro Milligramm 11,8 TVE - insgesamt also etwa 590000 TVE - enthielt, wurden in 700 ccm destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 5 g Tannin, das in 50 ccm Wasser gelöst worden war, versetzt und dann auf einen pH-Wert von etwa 5,8 eingestellt. Nach 2stündigem Stehen wurde der Niederschlag abgeschleudert und einmal mit dem mehrfachen Volumen destilliertem Wasser ausgewaschen. Der voluminöse feuchte Niederschlag, der nach dem Abschleudern ein Volumen von etwa 60 bis 80 ccm einnahm, wurde nun mit etwa 200 ccm kaltem 500/,igem wäßrigem Äthanol eluiert, wobei er zum größten Teil in Lösung ging. Nach dem Klären durch Filtration wurde die Elution (200 ccm) in zwei gleiche Teile geteilt, von denen 100 ccm mit 600 ccm Aceton und 100 ccm mit 600 ccm kaltem Äthanol gefällt wurden. Die Ausflockung wurde durch Zugaben geringer Mengen von Ammoniumsalicylat unterstützt. Die Niederschläge wurden mit den Fällungsmitteln ausgewaschen und dann getrocknet. Es ergaben sich bei der Acetonfällung 3,25 g Trockenpräparat mit etwa 68,0 TVE/mg, entsprechend etwa 75 "/, Ausbeute, während bei der Äthanolfällung 2,90 g Präparat mit etwa 67,5 TVE/rng, entsprechend etwa 66 0/, Ausbeute, erhalten wurden. Beispiel 6 250 ccm der Lösung eines rohen Proteasepräparates, die pro Kubikzentimeter etwa 94,5 TVE - insgesamt etwa 236000 TVE - enthielt, wurden unter Zugabe von etwa 5 0/() Ammonsulfat mit 5 g Tannin bei pH 5,9 gefällt. Nach 2 Stunden wurde der Niederschlag abgeschleudert undmit destilliertemWasserausgewaschen. Der feuchte Niederschlag, der nach dem Abschleudern ein Volumen von etwa 20 ccm einnahm, wurde in zwei Portionen mit etwa 60 ccm 500/,igem Isopropylalkohol eluiert und die Elution durch Filtration geklärt. Das klare Filtrat wurde mit 360 ccm kaltem Isopropylalkohol gefällt, der Niederschlag durch Abschleudern getrennt und nach dem Auswaschen mit Aceton getrocknet. Es ergaben sich etwa 2,0 g eines Trockenpräparates mit etwa 83,0 TV-E/mg, entsprechend etwa 70 "/, Ausbeute. Beispiel 7 250 ccm der für Beispiel 6 verwendeten Proteaselösung wurden in gleicher Weise mit Tannin gefällt, der Niederschlag, der nach dem Abschleudern ein Volumen von etwa 20 ccm einnahm, mit Wasser gewaschen und dann mit 40 ccm etwa 60"/,igem Äthylenglykol eluiert. Nach dem Klären wurde die Elution mit dem 8fachen Volumen Aceton gefällt, der Niederschlag mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute etwa 2,2 g Trockenpräparat mit etwa 77 TVE/mg, entsprechend etwa 169 000 TVE oder etwa 72 0/, der in der Ausgangslösung enthaltenen Protease. Beispiel 8 25 g eines rohen Protease-Präparates mit 11,8 TVE pro mg wurden in 250 ccm destilliertem Wasser gelöst und nach Zugabe von etwas Ammonsulfat mit 5 g Tannin bei pH etwa 5,7 gefällt. Nach dem Auswaschen des Niederschlages, der feucht ein Volumen von etwa 30 ccm einnahm, mit Wasser wurde er mit etwa 60 ccm einer 50"/,igen Lösung von Ätbylenglykol-mono-äthyläther (= Äthylglykol)', eluiert, die Elution geklärt und mit etwa 450 cem Aceton gefällt. Der Niederschlag wurde mit Aceton ausgewaschen, und getrocknet. Ausbeute 2,85 g Trockenpräparat mit etwa 71,5 TVE/mg, entsprechend etwa 70 0/, Ausbeute.The examination of the amylase activity of the main precipitate showed that it contained about 162 amylase units per gram, compared to about 8 amylase units per gram of the starting preparation, of which, however, a part had remained undissolved during the preparation of the solution. Example 5 50 g of a crude preparation of fungal protease which contained 11.8 TVU per milligram - that is, a total of about 590,000 TVU - were dissolved in 700 cc of distilled water. The solution was treated with 5 g of tannin, which had been dissolved in 50 cc of water, and then adjusted to a pH of about 5.8. After standing for 2 hours, the precipitate was spun off and washed out once with multiple volumes of distilled water. The voluminous moist precipitate, which after being spun off took up a volume of about 60 to 80 ccm, was then eluted with about 200 ccm of cold 500% aqueous ethanol, most of which went into solution. After clearing by filtration, the elution (200 cc) was divided into two equal parts, 100 cc of which were precipitated with 600 cc of acetone and 100 cc with 600 cc of cold ethanol. The flocculation was supported by adding small amounts of ammonium salicylate. The precipitates were washed out with the precipitants and then dried. The acetone precipitation gave 3.25 g dry preparation with about 68.0 TVU / mg, corresponding to about 75 % yield, while the ethanol precipitation gave 2.90 g preparation with about 67.5 TVU / mg, corresponding to about 66% . /, yield, were obtained example 6 250 of the solution cc of a crude protease preparation containing, per cubic centimeter, about 94.5 TVE - a total of about 236000 TVE - contained, were the addition of about 5 0 / () ammonium sulfate with 5 g of tannin at pH 5.9 like. after 2 hours, the precipitate was centrifuged off andwith destilliertemWasserausgewaschen. the wet precipitate that occupied by the centrifuging a volume of about 20 cc, was eluted in two portions with about 60 cc of 500 /, isopropyl alcohol and elution by filtration The clear filtrate was precipitated with 360 cc of cold isopropyl alcohol, the precipitate was separated by spinning and, after washing with acetone, dried to give about 2.0 g of a dry preparation with about 83.0 TV-U / mg speaking about 70 "/, yield. EXAMPLE 7 250 cc of the protease solution used for example 6 were precipitated in the same way with tannin, the precipitate, which after centrifuging had a volume of about 20 cc, was washed with water and then eluted with 40 cc of about 60 "strength ethylene glycol. after careful elution with a 8-fold volume of acetone was precipitated, the precipitate was washed with acetone and dried. the yield is about 2.2 g dried preparation with about 77 TVE / mg, corresponding to approximately 169 000 TVE or about 72 0 /, which in the starting solution Example 8 25 g of a crude protease preparation with 11.8 TVU per mg were dissolved in 250 ccm of distilled water and, after adding a little ammonium sulfate, precipitated with 5 g of tannin at a pH of about 5.7. the wet took a volume of about 30 ccm, it was eluted with water with about 60 ccm of a 50 "/, strength solution of ethylene glycol mono-ethyl ether (= ethyl glycol), the elution was clarified and found with about 450 cem acetone falls. The precipitate was washed out with acetone and dried. Yield 2.85 g dry preparation with about 71.5 TVE / mg, corresponding to about 70 % yield.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur sehr einfach durchzuführen, sondern liefert auch reinere Präparate als z. B. die Methode der Sprühtrocknung oder der vollständigen Ausfällung der Enzyme mit Ammonsulfat. Die durch Sprühtrocknung hergestellten Präparate enthalten natürlich alle in den Lösungen enthaltenen Ballaststoffe, und die durch ein entsprechend einfaches Verfahren mit Ammonsulfat ausgefällten Präparate enthalten - abgesehen davon, daß ihre Abtrennung bei den zur Ausfällung von Enzymen mit Ammonsulfat erforderlichen hohen Salzkonzentrationen oft große Schwierigkeitenmachtzumindest einen erheblichen Anteil an Ammonsulfat.The inventive method is not only very easy to carry out, but also provides purer preparations than z. B. the method of spray drying or the complete precipitation of the enzymes with ammonium sulfate. The preparations produced by spray drying naturally contain all of the dietary fiber contained in the solutions, and they contain preparations precipitated with ammonium sulphate by a correspondingly simple process - apart from the fact that their separation is often very difficult due to the high salt concentrations required for the precipitation of enzymes with ammonium sulphate, at least a considerable proportion of ammonium sulfate.

Auch gegenüber dem Verfahren der deutschen Patentschrift 629 416 ist das erfindungsgemäße Verfahren technisch fortschrittlich. Aus dem nachstehenden Versuchsbericht ergibt sich nämlich, daß die Reinheitsgrade der mit A ceton ausgefälltenTrockenpräparate nicht wesentlich voneinander abweichen, daß aber die Ausbeuten beim erfindungsgemäßen Verfahren erheblich höher sind. Versuchsbericht Je 100m1 eines eingeengten, rohen Kulturfiltrates einer Pilzprotease-Fermentation wurden zuerst nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 629416 und dann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgearbeitet.The process according to the invention is also technically advanced compared to the process of German patent specification 629 416. From the following experimental report results namely, that the degree of purity of not vary with ceton A precipitated dry preparations substantially from each other, but that the yields in the present process are significantly higher. Test report Each 100 ml of a concentrated, crude culture filtrate from a fungal protease fermentation was first worked up by the method of German patent specification 629416 and then by the method according to the invention.

1. Nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 629 416 wurden 100 ml des eingeengten Kulturfiltrates mit einer Aktivität von 52000 TVE mit 20 ml einer wäßrigen 5%igen Tanninlösung gefällt. Der entstehende Niederschlag wurde abgeschleudert, nach dem Waschen mit Wasser in Aceton eingerührt und dann abgeschleudert. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen, vom Unlöslichen durch Zentrifugieren getrennt und die entstehende Lösung in die 5fache Menge an Aceton eingegossen. Zur Unterstützung der Ausflockung wurde der Lösung eine geringe Menge einer wäßrigen 101)/,igen Lösung von Ammoniumsalicylat zugegeben. Nach mehrstündigem Stehen in der Kälte wurde der Niederschlag abgescbleudert, mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Es hinterbleiben 222 mg Trockenpräparat mit 133,2 TVE/mg, insgesamt also 29 600 TVE, was einer Ausbeute von 56,8 0/, entspricht. 1. According to the method of German patent specification 629 416, 100 ml of the concentrated culture filtrate with an activity of 52,000 TVE were precipitated with 20 ml of an aqueous 5% tannin solution. The resulting precipitate was spun off, stirred into acetone after washing with water and then spun off. The residue was taken up in water, separated from the insoluble matter by centrifugation and the resulting solution was poured into 5 times the amount of acetone. To support the flocculation, a small amount of an aqueous 101% strength solution of ammonium salicylate was added to the solution. After standing in the cold for several hours, the precipitate was thrown off, washed with acetone and dried. There remain behind 222 mg dry preparation 133.2 TVE / mg, ie a total of 29,600 TVE, corresponding to a yield of 56.8 0 /, corresponds.

2. 100 ml der gleichen Ausgangslösung wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der gleichen Menge Tannin bei pH 5,8 gefällt. Die Fällung wurde abgeschleudert und mit Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde nacheinander mit 30 ml 500/"igem, 30 ml 401/,igem und 30 ml 30"/"igem Aceton eluiert. Die vereinigte Elution wurde mit einem Aachen Überschuß an Aceton versetzt und wie oben einige Tropfen Ammoniumsalicylat zur Beschleunigung der Ausflockung zugegeben. Die abgeschleuderte Fällung wurde mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Es ergaben sich 287mg Trockenpräparat mit einem Reinheitsgrad von 135TVE/mg, insgesamt also 38800TVE, entsprechend 74,5D/, Ausbeute, bezogen auf die Ausgangslösung.2. 100 ml of the same starting solution were precipitated by the method according to the invention with the same amount of tannin at pH 5.8. The precipitate was spun off and washed with water. The residue was eluted successively with 30 ml of 500%, 30 ml of 40% and 30 ml of 30% of acetone. The combined elution was treated with an excess of acetone and, as above, a few drops of ammonium salicylate to accelerate the flocculation The precipitated precipitate was washed out with acetone and dried, giving 287 mg dry preparation with a degree of purity of 135 TVU / mg, a total of 38800 TVU, corresponding to 74.5D /, yield based on the starting solution.

Die ebenso mit Pankreatinlösung durchgeführten Vergleichsversuche ergaben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine etwa viermal höhere Ausbeute als nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 629416.The comparative experiments also carried out with pancreatin solution gave an approximately four times higher yield than by the process according to the invention according to the method of German patent specification 629416.

Claims

Claim-process for recovery of purified salt-free enzyme preparations wherein the enzyme solutions with tannin precipitated and the precipitate is subsequently washed with water d, ABy in that from the washed precipitate the enzymes with the 3- to 6-fold volume of the precipitate in aqueous solutions of extracted with water-miscible organic solvents and the enzymes are precipitated from the extracts in a manner known per se by adding acetone or water-miscible alcohols. Documents considered: German Patent No. 629 416; 0. Hof f mann -0 stenh of, "Enzymologie", 1954, p.34.