DE1206625B

DE1206625B - Indicator for the detection of albumin

Info

Publication number: DE1206625B
Application number: DEM37191A
Authority: DE
Inventors: Galen Franklin Collins
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1957-04-02
Filing date: 1958-03-29
Publication date: 1965-12-09
Also published as: GB881001A; BE566273A; FR1193940A; CH370579A; IT586498A; US3063812A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

DEUTSCHESGERMAN

PATENTAMTPATENT OFFICE

AUSLEGESCHRIFTEDITORIAL

Int. Cl.:Int. Cl .:

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Deutsche KL: 421-3/54German KL: 421-3 / 54

1 206 625
M37191IXb/421
29. März 1958
9. Dezember 19651 206 625
M37191IXb / 421
March 29, 1958
December 9, 1965

Die Erfindung betrifft einen Indikator zum Nachweis von Albumin und verwandten Stoffen, der eine sauer reagierende Substanz und einen Farbstoff umfaßt. Insbesondere betrifft die Erfindung den qualitativen und quantitativen Nachweis von Albumin in wäßrigen Lösungen, beispielsweise in Urin.The invention relates to an indicator for the detection of albumin and related substances, the one acidic reacting substance and a dye. In particular, the invention relates to the qualitative and quantitative detection of albumin in aqueous solutions, for example in urine.

Bei bisher bekannten Verfahren der Eiweißbestimmung wurde das Protein aus der zu untersuchenden Lösung nach Zusatz eines Farbstoffes durch Sulfosalicylsäure od. dgl. ausgefallt und kolorimetrisch ίο bestimmt.In previously known methods of determining protein, the protein was derived from the protein to be examined Solution after the addition of a dye by sulfosalicylic acid or the like. Precipitated and colorimetrically ίο certainly.

Bekannt ist weiterhin das ungeklärte Phänomen des sogenannten »Proteinfehlers«, das an einigen Indikatoren beobachtet wird, wobei die Indikatorlösung nach Proteinzusatz durch ihre Farbe einen nicht dem pH-Wert der Lösung entsprechenden pH-Wert anzeigt. Beispielsweise kann ein solcher Indikator in einer sauren Proteinlösung seine »basische« Farbe zeigen, sofern der pH-Wert der Lösung nicht um mehr als 1,25 pH-Einheiten vom pH-Umschlagspunkt des Indikators abweicht.Also known is the unexplained phenomenon of the so-called "protein error", which some Indicators is observed, the indicator solution after protein addition by its color indicates a pH value that does not correspond to the pH value of the solution. For example, such Indicator in an acidic protein solution show its "basic" color, provided the pH value of the solution does not deviate by more than 1.25 pH units from the pH transition point of the indicator.

Der erfindungsgemäße Indikator zum Nachweis von Albumin zeichnet sich dadurch aus, daß er einen größeren Anteil einer festen organischen Säure oder eines sauren Salzes, die bzw. das nicht als Fällmittel für die Eiweißkomponente wirkt und eine Ionisationskonstante nicht größer als etwa 10~² besitzt, einen kleineren Anteil eines einen »Proteinfehler« aufweisenden Indikatorfarbstoffes und einen von feinteiliger Cellulose gebildeten Trägerstoff an sich bekannter Art für die sauer reagierende Substanz und den Farbstoff enthält und sämtliche Bestandteile in an sich bekannter Weise innig miteinander gemischt und zu Tabletten gepreßt werden.The indicator according to the invention for the detection of albumin is characterized in that it has a larger proportion of a solid organic acid or an acidic salt or vehicle that does not act as a precipitating agent for the protein component and an ionization has no greater than about 10 ~ ² a contains a smaller proportion of an indicator dye with a "protein defect" and a carrier material of a type known per se for the acidic substance and the dye and made up of finely divided cellulose and all components are intimately mixed with one another in a manner known per se and pressed into tablets.

Die Cellulose adsorbiert an ihrer Oberfläche weitgehend selektiv aus einer zu untersuchenden Lösung die Proteine, insbesondere Albumin. Wenn also ein Tropfen Untersuchungslösung auf eine solche Tablette aufgebracht wird, wird das Albumin bevorzugt im Oberflächenbereich der Tablette adsorbiert, während die anderen Bestandteile der Lösung in das Innere der Tablette einsickern. Dieser selektive Trenneffekt wird noch verstärkt durch Auftropfen von beispielsweise 2 Tropfen Wasser zum Eluieren weniger stark adsorbierter Stoffe. Auf diese Weise werden Albumin und verwandte Stoffe im Oberflächenbereich der Tablette gesammelt und stehen in konzentrierter Form für die Farbreaktion zur Verfügung, wodurch die Empfindlichkeit der Reaktion erhöht wird. 5cThe cellulose adsorbs largely selectively on its surface from a solution to be examined the proteins, especially albumin. So if a drop of test solution on such a tablet is applied, the albumin is preferentially adsorbed in the surface area of the tablet, while the other components of the solution seep into the interior of the tablet. This selective separation effect is increased by dripping on, for example, 2 drops of water less to elute strongly adsorbed substances. In this way, albumin and related substances become in the surface area the tablet and are available in concentrated form for the color reaction, thereby increasing the sensitivity of the reaction. 5c

Die Menge an Farbstoff in der erfindungsgemäßen Indikatormasse braucht nur sehr klein zu sein; gute Indikator zum Nachweis von AlbuminThe amount of dye in the indicator composition according to the invention only needs to be very small; quality Indicator for the detection of albumin

Anmelder:Applicant:

Miles Laboratories, Inc.,Miles Laboratories, Inc.,

Elkhart, Ind. (V. St. A.)Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Vertreter:Representative:

Dr.-Ing. K. BoehmertDr.-Ing. K. Boehmert

und Dipl.-Ing. A. Boehmert, Patentanwälte,and Dipl.-Ing. A. Boehmert, patent attorneys,

Bremen, Feldstr. 24Bremen, Feldstr. 24

Als Erfinder benannt:Named as inventor:

Galen Franklin Collins, Elkhart, Ind. (V. St. A.)Galen Franklin Collins, Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:Claimed priority:

V. St. v. Amerika vom 2. April 1957 (650 068)V. St. v. America April 2, 1957 (650 068)

Ergebnisse erhält man mit Mengen von etwa 0,02 bis etwa 0,3 Gewichtsprozent Farbstoff, bezogen auf das Gewicht der Tablette. Dieser Bereich ist jedoch nicht kritisch, und man kann auch mit größeren oder kleineren Mengen an Farbstoff zufriedenstellend arbeiten; allerdings wird bei geringeren Farbstoffmengen die Farbe schwächer und der Test daher weniger empfindlich, während bei größeren Farbstoffmengen der überschüssige Farbstoff meist eine Verschwendung darstellt.Results are obtained with amounts of about 0.02 to about 0.3 percent by weight of dye, based on the weight of the tablet. However, this area is not critical, and larger ones can be used or smaller amounts of dye work satisfactorily; however, with smaller amounts of dye the color is weaker and the test is therefore less sensitive, while with larger amounts of dye the excess dye is usually wasted.

Die Cellulose, die die Aufgabe hat, das Albumin an der Oberfläche der Tablette zu adsorbieren, wo es durch den Test leicht nachgewiesen werden kann, wird vorzugsweise in so großen Mengen angewandt, daß sie mindestens 35 Gewichtsprozent des gesamten Stoffgemisches ausmacht. Im allgemeinen werden Stoffgemische bevorzugt, bei denen, etwa 45 bis 55 Gewichtsprozent der Tablette aus Cellulose bestehen. Gegebenenfalls kann man aber auch größere oder geringere Prozentgehalte an Cellulosepulver verwenden, und man erzielt mit etwa 25 bis 75 Gewichtsprozent Cellulose, bezogen auf die Gesamtgewichtsmenge des Stoffgemisches, zufriedenstellende Ergebnisse. Die folgenden vier Indikatoren haben sich im Rahmen der erfindungsgemäßen Stoffgemische als besonders vorteilhaft erwiesen und werden daher bevorzugt: Bromphenolblau, Bromkresolgrün, Tetrabromphenolblau und Tetrabromphenolphtha-. leinäthylester. Ein anderer, in der gewünschtenThe cellulose, which has the task of adsorbing the albumin on the surface of the tablet where it can be easily detected by the test, is preferably used in such large quantities that that it makes up at least 35 percent by weight of the total mixture of substances. Generally will Mixtures of substances are preferred in which approximately 45 to 55 percent by weight of the tablet consists of cellulose. If necessary, however, larger or smaller percentages of cellulose powder can also be used use, and cellulose is obtained with about 25 to 75 percent by weight, based on the total amount by weight of the substance mixture, satisfactory results. Have the following four indicators have proven to be particularly advantageous in the context of the substance mixtures according to the invention and are therefore preferred: bromophenol blue, bromocresol green, tetrabromophenol blue and tetrabromophenolphtha-. linseed ethyl ester. Another, in the desired one

509 757/350509 757/350

Weise reagierender Indikator, der jedoch bei dem Test nur eine schwache Farbe entwickelt, ist das Natriumsalz von m-(p-Anilinophenylazo)-benzoIsulfonsäure. This is an indicator that reacts wisely, but only develops a weak color during the test Sodium salt of m- (p-anilinophenylazo) -benzoisulphonic acid.

Die Aufgabe des sauer reagierenden Stoffes besteht darin, daß er das pH des Urins bis unterhalb des Farbumschlagpunktes des Indikators von sauer nach basisch herabsetzt; dieser Punkt liegt beim Bromphenolblau bei einem pH von 3,0, beim Bromkresolgrün bei einem pH von 3,8, beim Tetrabromphenolblau bei einem pH von 3,0 und beim Tetrabromphenolphthaleinäthylester bei einem pH von 4,0. Handelt es sich bei der zu untersuchenden Flüssigkeit um Urin, so bildet die Säure einen Puffer mit den alkalischen Bestandteilen des Urins, κ der zur Innehaltung des pH-Wertes der Flüssigkeit unterhalb des Farbumschlagpunktes des Farbstoffes beiträgt.The task of the acidic reacting substance is to keep the pH of the urine below it the color change point of the indicator decreases from acidic to basic; this point lies with Bromophenol blue at a pH of 3.0, for bromocresol green at a pH of 3.8, for tetrabromophenol blue at a pH of 3.0 and in the case of tetrabromophenolphthalein ethyl ester at a pH of 4.0. Is it the one to be examined? If there is fluid around urine, the acid forms a buffer with the alkaline components of the urine, κ that to maintain the pH value of the liquid below the color change point of the dye contributes.

Im Rahmen der Erfindung kann man eine große Anzahl fester, sauer reagierender Stoffe einschließlich einer großen Gruppe organischer Säuren und einer Anzahl anorganischer, sauer reagierender Salze verwenden, wobei diejenigen bevorzugt werden, die eine Ionisationskonstante zwischen etwa 10~⁵ und 10"², vorzugsweise von etwa 10 ³, besitzen und in Wasser entweder schwach oder langsam löslich sind. Geeignete sauer reagierende Stoffe sind Citronensäure, Weinsäure, Glykolsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure, Phthalsäure, Malonsäure, Mandelsäure, Glutarsäure, Aconitsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Adipin- ^o säure. Salicylsäure, Gerbsäure, 2,5-Dioxybenzoesäure. Aluminiumsulfat und Aluminiumchlorid. Bevorzugt werden Salicylsäure, Fumarsäure oder Phthalsäure. In the present invention, can be a large number of solid, acid-reacting substances, including a large group of organic acids and a number of inorganic, acidic reacting salts use wherein those are preferred which an ionization constant of between about 10 ~ ⁵ and 10 ^"2, preferably about 10 ³ , and are either slightly or slowly soluble in water. Suitable acidic substances are citric acid, tartaric acid, glycolic acid, malic acid, fumaric acid, phthalic acid, malonic acid, mandelic acid, glutaric acid, aconitic acid, maleic acid, benzoic acid, adipic acid. Salicylic acid, tannic acid, 2,5-dioxybenzoic acid, aluminum sulfate and aluminum chloride, salicylic acid, fumaric acid or phthalic acid being preferred.

Die Säure darf nicht zu stark sein, d. h., ihre Ionisationskonstante darf nicht größer als etwa 10~² sein, da die Säure sonst das pH des Albumins rasch herabsetzen und auf diese Weise ein schnelles Verschwinden der für die positive Reaktion charakteristischen basischen Farbe des Farbstoffes verursachen würde.The acid must not be too strong, that is, its ionization constant must not be greater than about 10 ~ ² , otherwise the acid will rapidly lower the pH of the albumin and in this way cause the basic color of the dye, which is characteristic of the positive reaction, to disappear quickly would.

Das im Rahmen der Erfindung verwendete Cellulosepulver kann von verschiedenen Ausgangsstoffen, wie z. B. Holz. Baumwolle usw., herstammen. Die folgenden besonderen pulverförmigen Celluloseprodukte haben sich für die Zwecke der Erfindung als geeignet erwiesen: Grobkörniges Cellulosepulver der Sorte B, Standardcellulosepulver der Sorte B (beide hergestellt von der Firma W. & R. Baistom, Ltd.), und α-Cellulose (hergestellt von der Brown so Company unter der Marke »Solka Floc BW-100«). Die Produkte brauchen nicht unbedingt weiß zu sein; je heller jedoch ihre Farbe ist, desto leichter ist der Farbumschlag festzustellen.The cellulose powder used in the context of the invention can be made from various starting materials, such as B. wood. Cotton, etc. The following particular powdered cellulose products have proven to be suitable for the purposes of the invention: Coarse-grained cellulose powder of type B, standard cellulose powder of type B (both manufactured by W. & R. Baistom, Ltd.), and α-cellulose (manufactured by the Brown so Company under the trademark "Solka Floc BW-100"). The products don't necessarily have to be white; however, the lighter its color, the lighter it is the color change is to be determined.

B e i s ρ i e 1 1B e i s ρ i e 1 1

Die bevorzugte Zusammensetzung für den erfindungsgemäßen Indikator für diagnostische Zwecke St die folgende: GewichtsteileThe preferred composition for the indicator according to the invention for diagnostic purposes St the following: parts by weight

Salicylsäure 600Salicylic acid 600

Bromphenolblau 1Bromophenol Blue 1

Gepulverte Holzcellulose 500Powdered wood cellulose 500

Maisstärke 26Corn starch 26

Diese Bestandteile werden in den angegebenen ds Mengen granuliert, getrocknet, innig miteinander vermischt und zu Tabletten von ungefähr 11,1 mm Durchmesser verpreßt, von denen eine jede etwa 0,30 g wiegt. Die Maisstärke dient als Bindemittel bei der Tablettenherstellung. Gegebenenfalls kann man an Stelle der Maisstärke auch andere proteinfreie Bindemittel, wie Rohrzucker oder Dextrose, verwenden.These components are specified in the specified ds Quantities granulated, dried, intimately mixed together and made into tablets of approximately 11.1 mm Crimped diameters, each weighing about 0.30 g. The corn starch serves as a binding agent in tablet production. If necessary, other protein-free products can be used instead of corn starch Use binding agents such as cane sugar or dextrose.

Example 2

Eine andere Ausführungsform der Erfindung wird durch die folgende Zusammensetzung veranschaulicht, wobei die Bestandteile nach Beispiel 1 zu Tabletten verpreßt werden:Another embodiment of the invention is illustrated by the following composition, where the ingredients according to Example 1 are compressed into tablets:

GewicnMeileWeight mile

Natriumcitrat · 2 H₂O 70Sodium citrate · 2 H ₂ O 70

Wasserfreie Citronensäure 180Citric Acid Anhydrous 180

Tetrabromphenolphthaleinäthylester 0,1Tetrabromophenolphthalein ethyl ester 0.1

Cellulosepulver (Whatman Sorte »B«) 300Cellulose powder (Whatman type "B") 300

Rohrzucker 26Cane sugar 26

Bei der Untersuchung einer Flüssigkeitsprobe auf Albumin bringt man einen Tropfen der Probe auf eine nach den obigen Vorschriften hergestellte Tablette auf. Sobald der Tropfen absorbiert ist, bringt man 2 Tropfen Wasser auf die Tablette auf. Ist Albumin in der Probe enthalten, so wird es an der Oberfläche der Tablette adsorbiert, während die Flüssigkeit (z. B. Urin) in die Masse der Tablette einsickert. Durch den Zusatz der beiden weiteren Tropfen Wasser werden alle Stoffe außer dem Albumin und dem damit umgesetzten Farbstoff von der Oberfläche der Tablette weggewaschen, so daß ein durch die Anwesenheit von Albumin hervorgerufener Farbumschlag deutlich zu bemerken ist. Die Gegenwart von Albumin gibt sich daran zu erkennen, daß man an der Oberfläche der Tablette die basische Farbe des Indikators beobachtet. In Abwesenheit von Albumin findet keine Farbänderung statt, sondern es bleibt die saure Farbe des Farbstoffes bestehen.When testing a liquid sample for albumin, one drop of the sample is applied a tablet prepared according to the above regulations. Once the drop is absorbed, put 2 drops of water on the tablet. If there is albumin in the sample, it will turn on The surface of the tablet is adsorbed, while the liquid (e.g. urine) is absorbed into the bulk of the tablet infiltrates. By adding the two more drops of water, all substances except the Albumin and the dye reacted with it washed away from the surface of the tablet, so that a color change caused by the presence of albumin is clearly noticeable. the The presence of albumin can be recognized by the fact that the base is on the surface of the tablet Color of the indicator observed. In the absence of albumin there is no change in color, instead, the acidic color of the dye remains.

Claims

Patent claims:

1. Indicator for the detection of albumin and related substances in liquids, which comprises an acidic substance and a dye, characterized in that it contains a larger proportion of a solid organic acid or an acidic salt, which or which does not act as a precipitant for the protein component acts and an ionization has no greater than about 10 ^-2, a minor proportion "includes a a" protein error-containing indicator dye and a carrier of a known type for the acid-reacting substance and the dye formed by finely divided cellulose, and that all the ingredients in a are intimately mixed in a known manner and compressed into tablets.

2. Indicator according to claim 1, characterized in that it further comprises corn starch, cane sugar or contains dextrose as a protein-free binder for the remaining ingredients.

3. Indicator according to claim 1 or 2, characterized in that the acid-reacting substance has an ionization constant between about ⁵ and 10 IO ~ ² only.

4. Indicator according to one of claims 1 to 3, characterized in that it contains the dye an amount of about 0.02 to 0.3 percent by weight and the finely divided cellulose in one Amount of at least 25 percent by weight and

preferably 25 to 75 percent by weight, all based on the total mixture.

5. Indicator according to one of claims 1 to 4, characterized in that it is a solid organic Acid benzoic acid, adipic acid, salicylic acid or 2,5-dioxybenzoic acid and as a dye Bromophenol blue, bromocresol green, tetrabromophenol blue ^ tetrabromophenolphthalein ethyl ester or contains the sodium salt of m- (p-anilinophenylazo) -benzenesulfonic acid.

6. Indicator according to claim 5, characterized in that it contains salicylic acid in combination with bromophenol blue contains.

7. Indicator according to claim 2, characterized in that it consists of about 600 parts by weight Salicylic acid, about 1 part by weight of bromophenol blue, about 500 parts by weight of cellulose powder and consists of about 26 parts by weight of corn starch.

8. Indicator according to claim 2, characterized in that it consists of about 70 parts by weight of sodium citrate dihydrate, about 180 parts by weight of anhydrous citric acid, about 0.1 part by weight of tetrabromophenolphthalein ethyl ester, about 300 parts by weight Cellulose powder and about 26 parts by weight of cane sugar.

Considered publications:

Austrian Patent No. 68,346;

Biochem. Journal, 21, 1909. p. 131; 22, 1909, P. 352;

Chemisches Zentralblatt, 1960, p. 13799 (Ref. Rice and C icon e);

H. R ö m ρ ρ, Chemie - Lexikon, 4th edition, pp. 3562/3563.

509 757/350 11.65509 757/350 11.65