Verfahren zur biochemischen Herstellung von 5'-Mononukleotiden, insbesondere
5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure Die Erfindung befaßt sich mit der Herstellung
von 5'-Mononukleotiden, insbesondere 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure, durch Züchten
von Mikroorganismen in üblichen Nährmedien.Process for the biochemical production of 5'-mononucleotides, in particular
5'-Guanylic Acid and 5'-Adenylic Acid The invention is concerned with manufacture
of 5'-mononucleotides, particularly 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid, by culturing
of microorganisms in common nutrient media.
Die 5'-Mononukleotide, wie 5'-Guanylsäure und 5'-Inosylsäure, sind
wertvolle Geschmacksstoffe, die in kleineren Mengen den Geschmack von Lebensmitteln,
Getränken und Gewürzen steigern. Es ist bekannt, daß diese Nukleotide durch enzymatischen
Abbau von Ribonukleinsäure hergestellt werden können. Dieses Verfahren eignet sich
jedoch nicht besonders für die Herstellung im technischen Maßstab, da die Ausgangssubstanz
und die einzeln gebildeten Produkte schwer zu isolieren und aufzutrennen sind.The 5'-mononucleotides, such as 5'-guanylic acid and 5'-inosylic acid, are
valuable flavors which, in smaller quantities, change the taste of food,
Boost beverages and spices. It is known that these nucleotides by enzymatic
Breakdown of ribonucleic acid can be produced. This method is suitable
but not particularly for production on an industrial scale, as the starting substance
and the individually formed products are difficult to isolate and separate.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, ein technisches
Verfahren für die Herstellung von 5'-Mononukleotiden, insbesondere 5'-Guanylsäure
und 5'-Adenylsäure, unter Verwendung von billigen und ohne weiteres verfügbaren
Ausgangssubstanzen zur Verfügung zu stellen.The object of the invention is to provide a technical
Process for the preparation of 5'-mononucleotides, especially 5'-guanylic acid
and 5'-adenylic acid, using inexpensive and readily available ones
To make starting substances available.
Obwohl der Auffindung von Verfahren für die Herstellung von 5'-Mononukleotiden
mittels Fermentation viel Forschungsarbeit gewidmet wurde, ist bisher die Anreicherung
von 5'-Guanylsäure oder von Gemischen aus dieser Säure und anderen 5'-Mononukleotiden
in technischem Maßstab noch nicht gelungen. Es konnte nun gefunden werden, daß durch
Verwendung des Bazillus der bei der American Type Culture Collektion Washington
unter der Nummer ATCC 14758 registriert wurde, oder des Bakteriums Kurthia ATCC
14757 als Mikroorganismus bei der Gärung in üblichen Nährmedien eine starke Anreicherung
von 5'-Mononukleotiden, insbesondere 5'-Guanynalsäure und 5'-Adenylsäure, in der
Nährlösung eintritt. Die Tatsache, daß 5'-Mononukleotide durch Züchtung dieser Bakterienstämme
hergestellt werden, läßt vermuten, daß diese Stämme ein spezifisches Stoffwechselregulationssystem
für die biosynthetische Bildung von Purin aufweisen. Es war bisher nicht bekannt,
daß 5'-Mononukleotide, insbesondere 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure unter den
gewöhnlichen Bedingungen einer Bakterienzüchtung in hoher Menge angereichert werden
können.Although the discovery of processes for the preparation of 5'-mononucleotides
Much research has been devoted to fermentation, so far has been enrichment
of 5'-guanylic acid or of mixtures of this acid and other 5'-mononucleotides
not yet succeeded on a technical scale. It could now be found that through
Use of the bacillus at the American Type Culture Collection Washington
registered under the number ATCC 14758, or the bacterium Kurthia ATCC
14757 as a microorganism during fermentation in common nutrient media, a strong accumulation
of 5'-mononucleotides, in particular 5'-guanynalic acid and 5'-adenylic acid, in the
Nutrient solution enters. The fact that 5'-mononucleotides by cultivating these bacterial strains
suggests that these strains have a specific metabolic regulation system
for the biosynthetic formation of purine. It was not previously known
that 5'-mononucleotides, especially 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid among the
ordinary conditions of bacterial growth can be accumulated in a large amount
can.
Die Tatsache, daß Guanin, Adenin und andere Abbauprodukte der 5'-Mononukleotide
nicht in nennenswerter Menge in der durch Züchtung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen
erhaltenen Nährlösung gefunden werden, läßt vermuten, daß die in den Zellen gebildeten
5'-Mononukleotide ausgeschieden und, ohne einen Abbau zu erleiden, in der Nährlösung
angereichert werden. Weiterhin geht daraus hervor, daß die Zellen der erfindungsgemäß
isolierten Stämme keine Permeabilitätsschranke gegenüber 5'-Mononukleotidverbindungen
aufweisen. Im allgemeinen ist die Permeabilität von Mikroorganismen sehr selektiv.
Nukleoside und andere Abbauprodukte der Mononukleotide besitzen eine ziemlich gute
Permeabilität, wohingegen dies bisher noch nicht für 5'-Mononukleotide bekannt war.
Im Falle der Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Mikroorganismen konnte jedoch
festgestellt werden, daß nur die 5'-Mononukleotide in ziemlich großer Menge ausgeschieden
werden.The fact that guanine, adenine and other degradation products of the 5'-mononucleotides
not in any significant amount in the amount obtained by cultivating the microorganisms according to the invention
obtained nutrient solution are found, suggests that the formed in the cells
5'-mononucleotides excreted and, without suffering degradation, in the nutrient solution
be enriched. It also emerges from this that the cells of the invention
isolated strains do not have a permeability barrier to 5'-mononucleotide compounds
exhibit. In general, the permeability of microorganisms is very selective.
Nucleosides and other degradation products of the mononucleotides have a pretty good one
Permeability, whereas this was not previously known for 5'-mononucleotides.
In the case of using the new microorganisms according to the invention, however, could
found that only the 5 'mononucleotides were excreted in fairly large quantities
will.
Die Tatsache, daß 5'-Guanylsäure und andere 5'-Nukleotide sich in
der Fermentationslösung anreichern und nicht zu einem wesentlichen Grad abgebaut
werden, deutet an, daß die neuen 5'-Mononukleotide erzeugenden Stämme keine enzymatische
Wirkung auf die angereicherten Mononukleotide ausüben. Diese Eigenschaft stellt
darum ein bedeutendes Merkmal der erfindungsgemäß zu verwendenden Stämme dar.The fact that 5'-guanylic acid and other 5 'nucleotides are in
enrich the fermentation broth and not degrade to any significant degree
indicates that the new 5 'mononucleotide producing strains are not enzymatic
Have an effect on the enriched mononucleotides. This property represents
therefore an important feature of the strains to be used according to the invention.
Die erfindungsgemäß sich für die Herstellung von 5'-Mononukleotiden
eignenden Mikroorganismenstämme wurden unter Verwendung eines auf- Guanin als essentiellen
Wuchsstoff angewiesenen Mutanten von B. Subtilis auf die folgende Weise aus natürliehen
Quellen
isoliert. Isolierte Bakterien oder Bazillusarten wurden auf feste Medien in Petrischalen
geimpft. Die dabei gebildeten Kulturen wurden nach kurzer Zeit durch Bestrahlung
mit ultraviolettem Licht zum Absterben gebracht und mit einem festen Medium überdeckt,
in welchem der obenerwähnte, auf Guanin angewiesene Mutant von B. Subtilis anthalten
war. Nach erfolgtem Wachstum wurde die Halo- oder Wachstumszone des Mutanten untersucht.
Die Größe und Dicke des um die Bakterienkultur gebildeten Halos hing von der Menge
der Guaninderivate ab, die durch diese besonderen Bakterien gebildet wurden. Die
für die Gewinnung von 5'-Mononukleotide, insbesondere 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure,
geeigneten Bakterienstämme werden auf Grund der Größe und Dicke des die Versuchskultur
umgebenden Halos selektiv bestimmt. Es konnte gefunden werden, daß große Mengen
an Ultraviolettlicht absorbierenden Substanzen mittels jedes der erfindungsgemäßen
Stämme in einem Medium angereichert werden konnten. Die Ultraviolettlicht absorbierenden
Substanzen waren 5'-Mononukleotide, insbesondere 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure.
Diese Verbindungen können ohne weiteres aus dem Kulturmedium isoliert und nach bekannten
Verfahren gereinigt werden. Auf diese Weise konnte das neue biochemische Verfahren
zur Herstellung von 5'-Mononukleotiden, insbesondere 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure,
aufgefunden werden.The invention is suitable for the production of 5'-mononucleotides
Appropriate strains of microorganisms were determined using an on-guanine as the essential
B. subtilis mutants in the following manner
sources
isolated. Isolated bacteria or bacillus species were placed on solid media in Petri dishes
vaccinated. The cultures thus formed were irradiated after a short time
made to die with ultraviolet light and covered with a solid medium,
in which the above-mentioned guanine-dependent mutant of B. Subtilis resides
was. After growth had taken place, the mutant's halo or growth zone was examined.
The size and thickness of the halo formed around the bacterial culture depended on the amount
of the guanine derivatives formed by these particular bacteria. the
for the production of 5'-mononucleotides, in particular 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid,
Suitable bacterial strains will be based on the size and thickness of the test culture
surrounding halos are selectively determined. It could be found that large amounts
substances absorbing ultraviolet light by means of any of the present invention
Strains could be enriched in a medium. The ultraviolet light absorbing
Substances were 5'-mononucleotides, in particular 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid.
These compounds can easily be isolated from the culture medium and according to known methods
Procedure to be cleaned. In this way the new biochemical process could
for the production of 5'-mononucleotides, in particular 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid,
be found.
Die morphologischen und physiologischen Merkmale des Bakteriums, das
inzwischen die ATCC-Nr. 14757 erhalten hat, sind unter Bezugnahme auf die merkmalbeschreibende
Karte in dem Handbuch »Microbiological Methods, 1957« wie folgt zu beschreiben
(1) Zellenform einer 18 Stunden alten Kultur bei 30'C auf mit Ochsenfleischextrakt
versehenem Agar
1. Vegetative
Zellen ...... Stäbchen von 0,8 bis 0,9 auf
4 bis 7 #t mit unverzweigten, ab-
gerundeten Enden, die einzeln
oder in Paaren und gelegentlich
in Ketten aus drei Stäbchen auf-
treten
2. Filamente ..... Werden in gewöhnlichem Me-
dium und innerhalb eines weiten
Temperaturbereiches gebildet.Die
Bildung wird nicht durch die
Zugabe von speziellen Nähr-
stoffen, wie Biotin, gestört. Die
gebildeten Filamente spalten sich
später in die gewöhnliche Art
von vegetativen Zellen auf. Die
Filamente haben eine Länge von
ungefähr 30 bis 300 #t.
3. Motilität ...... Beweglich.
4. Endsporen .... Werden nicht gebildet.
5. Gramfärbung. . Positiv.
(2) Agarschicht, 20 Stunden alte Kultur auf mit
Ochsenfleischextrakt versehenem Agar bei 30'C
1. Wachstum .... Üppig.
2. Form ........ Zunahme oder Echinulat.
3. Glanz ........ Mattglänzend.
4. Farbbildung ... Schwach hellgrau bis schwach
hellgelb.
5. Geruch ....... Fäulnisgeruch oder Ammoniak-
geruch.
6. Konsistenz .... Buttrig oder schwach klebrig.
7. Medium ...... Unverändert.
(3) Agarkultur, 48 Stunden alte Kultur auf mit
Ochsenfleischextrakt versehenem Agar bei 30°C
1. Form ........ Kreisförmig.
2. Oberfläche .... Etwas glatt.
3. Rand ......... Mit Rissen versehen.
4. Erhebung ..... Leicht konvex.
5. Dichte ........ Undurchsichtig.
(4) Rindfleischetraktbrühe, 24 Stunden alte Kultur
in einer Fleischextraktbrühe bei 30°C
1. Oberflächen-
wachstum ... Bildet schwachen Ring.
2. Wolkenbildung Leicht trübe.
3. Wachstums-
umfang ..... Mäßig.
4. Sediment ..... Leichter Niederschlag wie eine
Wolke.
(5) Physiologische Merkmale
1. Gelatinever-
flüssigung ... Schnell verflüssigt; schichtenför-
mig.
2. Zuckerfermen-
tation ...... Säurebildung Gasbildung
Glucose ...... - -
Lactose ....... - -
Saccharose --
3. Anaerobe Fer-
mentation von
Glucose ...... Negativ.
4. Wirkung auf
Lackmusmilch
pH ......... Alkalisch.
Saurer »Curd«.. Negativ.
Rennet curd ... Negativ.
Peptonisierung Positiv.
Reduktion .... Negativ.
5. Nitratreduktion Negativ.
6.Indolbildung .. Negativ.
7. Schwefelwasser-
stoffbildung ... Positiv.
B. Beziehung zu
Sauerstoff' ..... Aerob.
9. Temperatur
Wachstums-
temperatur .... Optimale Temperatur in der Nähe
von 33'C.
Kein Wachstum bei 44°C.
Gutes Wachstum bei 20 bis 37°C.
Temperaturen
für thermisches
Absterben .... 10 Minuten bei 50°C.
10. pH
Optimales pH 10
Für das Wachs-
tum kritisches
pH ........... 5,0.
11. Farbbildung
Auf Gelatine .. Margaretengelb.
Auf Agar ..... Schwach hellgrau bis schwach
hellgelb.
Auf Kartoffeln Hautfarben (warm buff).
12. Voges-Pros-
kauer-Reaktion Negativ.
13. Methylrot-
Reaktion ..... Negativ.
14. Verwendung
von Citrat .... Positiv.
15. Verwendung
von Harnsäure Positiv.
16. Stärkehydrolyse Sehr schwach.
17. Caseinhydrolyse Positiv.
18. Urease ....... Positiv.
19. Katalase ...... Positiv.
20. Anreicherung
von 5'-Guanyl-
säure (und
5'-Adenylsäure) Positiv (starke Anreicherung).
Die Anreicherung von Nukleo-
tiden oder kleineren Derivaten
der Nukleinsäuren ist negativ.
24. Quelle ........ Aus dem Boden isoliert.
Es konnte festgestellt werden, daß der Stamm ATCC 14757 zur Familie der Brevibacteriaceae
gehört, die in Bergeys Handbuch »Determinative Bacteriology, 7th Edition«, beschrieben
werden, denn er ist grampositiv, besitzt die Form eines unverzweigten Stäbchens,
bildet keine Sporen und vergärt Glucose nicht anaerob. Diese Familie wird in zwei
Gattungen eingeteilt: Brevibacterium und Kurthia. Die erste besteht aus kurzen,
kokkenähnlichen, unverzweigten Stäbchen, die keine Fäden bilden und gewöhnlich aus
einfachen Kohlenhydraten Säure bilden. Auf der anderen Seite ist dieser Stamm ATCC
14757 unverzweigt, hat die Form von langen Stäbchen und Filamenten und bildet keine
Säure aus einfachen Kohlenhydraten. Demnach ist es klar, daß der Stamm ATCC 14757
nicht zu der Gattung von Brevibacterium, sondern zu derjenigen von Kirthia gehört.The morphological and physiological characteristics of the bacterium, which is now ATCC No. 14757 are to be described as follows with reference to the property-describing card in the manual “Microbiological Methods, 1957” ( 1) Cell shape of an 18-hour-old culture at 30 ° C on agar provided with ox meat extract 1. Vegetative
Cells ...... rods from 0.8 to 0.9 each
4 to 7 #t with unbranched, branched
rounded ends that are individually
or in pairs and occasionally
in chains of three rods
step
2. Filaments ..... are used in ordinary
dium and within a wide
Temperature range
Education is not going through that
Addition of special nutrients
substances such as biotin are disturbed. the
formed filaments split
later in the usual way
of vegetative cells. the
Filaments have a length of
about 30 to 300 #t.
3. Motility ...... flexible.
4. Terminal spores .... are not formed.
5. Gram stain. . Positive.
(2) Agar layer, 20 hour old culture on with
Ox meat extract with agar at 30'C
1. Growth .... Abundant.
2. Form ........ increase or echinulate.
3. Gloss ........ Matt gloss.
4. Color formation ... Slightly light gray to weak
light yellow.
5. Odor ....... putrid smell or ammonia
odor.
6. Consistency .... Buttery or slightly sticky.
7. Medium ...... Unchanged.
(3) Agar culture, 48 hour old culture on with
Ox meat extract with agar at 30 ° C
1. Shape ........ circular.
2. Surface .... Slightly smooth.
3rd edge ......... with cracks.
4. Elevation ..... Slightly convex.
5. Density ........ Opaque.
(4) Beef tract broth, 24 hour old culture
in a meat extract broth at 30 ° C
1. Surface
growth ... Forms a weak ring.
2. Cloud formation Slightly cloudy.
3. growth
circumference ..... moderate.
4. Sediment ..... Light precipitation like one
Cloud.
(5) Physiological characteristics
1. Gelatine
liquid ... quickly liquefied; stratification
mig.
2. Sugar Fermen
tation ...... Acid formation Gas formation
Glucose ...... - -
Lactose ....... - -
Sucrose -
3. Anaerobic Fer-
mentation of
Glucose ...... negative.
4. Effect on
Litmus milk
pH ......... Alkaline.
Sour "curd" .. Negative.
Rennet curd ... Negative.
Peptonization positive.
Reduction .... negative.
5. Nitrate reduction negative.
6. Indole formation .. Negative.
7. Sulphurous water
substance formation ... positive.
B. Relationship to
Oxygen ' ..... aerobic.
9. Temperature
Growth
temperature .... Optimal temperature nearby
from 33'C.
No growth at 44 ° C.
Good growth at 20 to 37 ° C.
Temperatures
for thermal
Die ... 10 minutes at 50 ° C.
10. pH
Optimal pH 10
For the wax
tum critical
pH ........... 5.0.
11. Color formation
On gelatine .. Margaret yellow.
On agar ..... faintly light gray to faint
light yellow.
Skin color on potatoes (warm buff).
12. Voges Pros-
kauer reaction negative.
13. methyl red
Reaction ..... negative.
14. Use
of citrate .... positive.
15. Use
of uric acid positive.
16. Starch hydrolysis Very weak.
17. Casein hydrolysis positive.
18. Urease ....... Positive.
19. Catalase ...... positive.
20. Enrichment
of 5'-guanyl-
acid (and
5'-adenylic acid) positive (strong accumulation).
The enrichment of nucleo-
tides or smaller derivatives
the nucleic acid is negative.
24. Source ........ Isolated from the ground.
It was found that the strain ATCC 14757 belongs to the family of Brevibacteriaceae, which are described in Bergey's handbook "Determinative Bacteriology, 7th Edition", because it is gram-positive, has the shape of an unbranched rod, does not form spores and does not ferment glucose anaerobic. This family is divided into two genera: Brevibacterium and Kurthia. The first consists of short, coke-like, unbranched rods that do not form threads and usually form acid from simple carbohydrates. On the other hand, this ATCC 14757 strain is unbranched, has the shape of long rods and filaments, and does not form acid from simple carbohydrates. Accordingly, it is clear that the ATCC 14757 strain does not belong to the genus of Brevibacterium but to that of Kirthia.
Gemäß dem Handbuch von B e r g e y, »Determinative Bacteriology, 7th
Edition«, gehören drei Arten zur Gattung von Kurthia. Die eine, Kurthia bessonii,
vermag Gelatine zu verflüssigen, wohingegen die beiden anderen Arten dies nicht
tun. Da dieser Stamm Gelatine verflüssigt, ist er unter den drei beschriebenen Arten
von Kurthia demjenigen von Kurthia bessonii besonders ähnlich. Der vorliegende Stamm
ATCC 14757 unterscheidet sich jedoch von Kurthia bessonii in den beiden folgenden
Merkmalen
Kurthia ATCC
bessonii 14757
1. Schwefelwasserstoff keine Bildung
Bildung
2. Erhebung auf Agarkultur Delle gewölbt
Dieser Stamm muß darum als eine neue Spezies aufgefaßt werden, die zur Gattung von
Kurthia gehört. Durch diesen neuen Stamm Kurthia ATCC 14757 wird unter geeigneten
Züchtungsbedingungen nicht nur eine große Menge an 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure,
sondern zumindest auch etwas 5'-Uridylsäure, 5'-Cytidylsäure und 5'-Xanthylsäure
angereichert.According to Bergey's handbook, "Determinative Bacteriology, 7th Edition," three species belong to the genus Kurthia. One, Kurthia bessonii, can liquefy gelatin, whereas the other two types do not. Since this strain liquefies gelatin, it is particularly similar to that of Kurthia bessonii among the three types of Kurthia described. However, the present ATCC 14757 strain differs from Kurthia bessonii in the following two characteristics Kurthia ATCC
bessonii 14757
1. Hydrogen sulfide no formation
education
2. Elevation on agar culture dent domed
This tribe must therefore be viewed as a new species belonging to the genus of Kurthia. This new strain Kurthia ATCC 14757 enriches not only a large amount of 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid, but also at least some 5'-uridylic acid, 5'-cytidylic acid and 5'-xanthylic acid under suitable cultivation conditions.
Die Merkmale des Bacillus ATCC 14758 werden an Hand der beschreibenden
Karte im Handbuch »Mierobiological Methods, 1957«, wie folgt angegeben: (1) Zellenform,
20 Stunden alte Kultur, die auf mit Ochsenfleischextrakt versehenem Agar bei 30°C
gezüchtet wurde
1. Vegetative
Zellen ........ Stäbchen: 1,0 bis 1,3 auf 3 bis
5 p. im Durchschnitt, mit abge-
rundeten Enden, die unverzweigt
sind und einzeln oder auch in
Paaren auftreten. Auf einem glu-
cosehaltigen Agarnährboden ist
das Wachstum üppiger, die Stäbe
sind größer, länger und weisen
mehr Vakuoler auf. Sie bilden
Spindel- oder Keilformen leich-
ter als auf Nährbodenagar.
2. Motilität ...... Schwach beweglich.
3. Sporangien .... Nicht deutlich angeschwollen.
4. Sporen ....... Im Durchschnitt 1,0 auf 1,2 #t,
oval, zentral bis terminal, nach
24 Stunden üppig.
5. Gramfärbung . . Positiv.
(2) Agarstreifen, 20 Stunden alte Kultur auf mit
Ochsenfleischextrakt versehenem Agar bei 30°C
1. Wachstum .... Üppig.
2. Form ........ Glatt, nimmt zu (alte Zellen
sind zusammengeschrumpft).
3. Glanz ........ Schimmernd.
4. Farbbildung ... Sahnefarben bis schwach gelb.
5. Konsistenz .... Buttrig.
6. Medium ...... Unverändert.
(3) Ochsenfleischextraktbrühe, 48 Stunden alte Kultur
einer Ochsenfleischextraktbrühe bei 30'C
1. Oberflächen-
wachstum ..... Keines.
2. Wolkenbildung Stark, gleichmäßige Trübheit.
3. Wachstums-
umfang ....... Üppig.
4. Sediment ..... Mäßig.
(4) Agarkultur, 20 Stunden alte Kultur in mit Ochsen-
fleischextrakt versehenem Agar bei 30'C
1. Form ........ Kreisförmig.
2. Oberfläche .... Glatt.
3. Rand ......... Ganz.
4: Erhebung .... Konvex bis hervorstehend.
5. Dichte ........ Undurchsichtig.
(5) In Schrägkultur angebaute Sojabohnen-Agarkultur
Üppiges Wachstum.
(6) NaCI-Nährbrühe
Kein Wachstum in 2°/aigem NaCl.
(7) Physiologische Eigenschaften
1. Gelatinever-
flüssigung ..... langsame Verflüssigung;
infundibuliform
2. Zuckerfermen-
tation (Medium
nach Ayers)
Säurebildung Gasbildung
Arabinose .... - -
Xylose ....... -f- -
Glucose ...... -I- -
Galactose ..... -f- -
Fructose ...... -h -
Saccharose .... -
Mannit ....... -
Lactose ....... -F -
3. Reduktion
von Nitrat .... Positiv.
4. Anaerobe Bil-
dung von Gas
aus Nitrat .... Positiv.
5. Voges-Pros-
kauer-Reak-
tion** ........ Schwach positiv.
6. Methylrot-
reaktion ...... Positiv.
7. Zitratverbrauch Positiv.
Bacillus megaterium Baciilus cereus Bacillus ATCC 14758
Vegetative Zellen normale Stäbchenform, normale Stäbehenform,
junge Zellen haben normale
keine Spindel- oder Keil- keine Spindel- oder Keil- Stäbchenform;
alte Zel-
form form len haben Spindel- oder
Keilform
Agarkultur ganz und konvex oder nach flach und unregelmäßig
ganz und konvex oder nach
oben ragend oben hervorragend
Voges-Proskauer-Reaktion negativ positiv schwach positiv
Stärkehydrolyse positiv positiv sehr schwach
Fermentation von Mannit positiv negativ positiv
Anaerobe Bildung von Gas negativ positiv - positiv
aus Nitrat
Anreicherung von 5'-Gua- negativ negativ positiv
nylsäure und von 5'-Ade-
nylsäuren
Somit wird der Stamm ATCC 14758 weder als zu Bacillus megaterium noch als zu Bacillus
cereus gehörig betrachtet, sondern als eine neue Art, die zur Familie Bacillus gehört.
Mit Hilfe dieses Stammes können sowohl 5'-Guanylsäure als auch 5'-Adenylsäure angereichert
werden. Darüber hinaus wird aber auch 5'-Cytidylsäure, 5'-Uridylsäure und 5'-Xanthylsäure
unter geeigneten Bedingungen angereichert. Beispiel 1 Der aus einer Bodenprobe isolierte
Stamm Bacillus ATCC 14758 wurde in einem Kulturmedium mit den folgenden Komponenten
pro ein Medium unter Schütteln herangezüchtet:
B. Stärkehydrolyse Sehr schwach.
9. Caseinhydro-
lyse .......... Positiv.
10. Schräg angelegte
Tyrosin-Agar-
kultur ........ Unverändert.
11. Catalase ...... Positiv.
12. Anreicherung
von 5'-Guanyl-
säure und von
5'-Adenylsäure Positiv (starke Anreicherung).
Anreicherung von Nucleosiden
oder von kleineren Derivaten
von Nukleinsäuren ist negativ.
13. Quelle ........ Aus einem Boden isoliert.
**) Pepton-Wasser-Medium, weil ATCC 14758 nicht in einem
Proteose-Pepton-Glucose-Medium wachsen kann.
Der Stamm ATCC 14758 wird als zu der Familie von Bazillus gehörig betrachtet, wie
im Handbuch von B e r g e y, »Determinative Bacteriology, 7th Edition«, beschrieben,
weil er grampositive, sporenbildende, stäbchenförmige Zellen aufweist, die Katalase
enthalten. Die Sporangien dieses Stammes sind nicht deutlich angeschwollen. In jungen,
leicht angefärbten Zellen sind Vakuolen im Protoplasma vorhanden. Weiterhin beträgt
der Durchmesser der vegetativen Zelle 0,9 #t oder mehr. Entsprechend ist der Stamm
ATCC 17758 Bacillus megaterium oder Bacillus cereus äußerst ähnlich. Weiterhin unterscheidet
sich dieser Stamm von Bacillus megaterium oder von Bacillus cereus in den folgenden
Merkmalen:
KZHP04 .......................... 7,0 g
KHZP04 ..............:........... 3,0 g
(NH4)1S04 ........................ 1,0 g
M9S04 - 7 H20 .................... 0,2 g
Natriumcitrat ...................... 0,5 g
Casaminosäure ..................... 10,0 g
Glucose .............................. 20,0 g
Thiamin .......................... 100 y
Riboflavin ......................... 100 y
Pyridoxin ......................... 200,y
Ca-pantothenat .................... 20 y
Nicotinsäure ....................... 20 y
p-Aminobenzoesäure ..............: 17
Biotin ............................ 2,5y
Nach 4tägiger Vermehrung bei 28°C wurden die Zellen abgetrennt
und die 5'-Guanylsäure und die 5'-Adenylsäure aus dem Kulturmedium gemäß bekannten
Verfahren gewonnen. Die Ausbeuten waren wie folgt:
pH zu pH am 5'-Guanylsäure 5'-Adenylsäure
Beginn Ende
mg/100 ml
mg/100 ml
6,8 I 6,0 I 20,6 I 17,6
Beispiel 2 Der aus einer Bodenprobe isolierte neue Stamm Kurthia ATCC 14757 wurde
unter Schütteln in einem Medium aus 80 g/1 Glucose, 20 g/1 Säurehydrolysat von Casein
und aus den anderen gleichen Komponenten wie im Beispiel 1 wachsen gelassen. Nach
einer 5tägigen Vermehrung bei 28'C wurden 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure gemäß
bekannten Verfahren aus dem Kulturmedium gewonnen. Die Ausbeuten waren wie folgt:
PH zu pH am 5'-Guanylsäure 5'-Adenylsäure
Beginn Ende mg/100 ml
mg/100 ml
7,0 I 5,8 I 48,1 I 85,3
Beispiel 3 Das Bakterium Kurthia ATCC 14757 wurde unter Schütteln in einem Medium
aus 250 g/1 Getreidenährlösung an Stelle von Caseinhydrolysat, aus 40 g/1 Glucose
und aus den anderen im Beispiel 1 beschriebenen Komponenten wachsen gelassen. Nach
einer 9tägigen Vermehrung bei 28'C wurden 5'-Guanylsäure, 5'-Adenylsäure, 5'-Cytidylsäure,
5'-Uridylsäure und 5'-Xanthylsäure gemäß bekannten Verfahren aus dem Kulturmedium
gewonnen. Die Ausbeuten waren wie folgt:
pH zu pH am 5'-Guanylsäure 5'-Adenylsäure 5'-Cytidylsäure 5'-Uridylsäure
5'-Xanthylsäure
Beginn
Ende
mg/100 ml
mg/100 ml
mg/100 ml
mg/100 ml
mg/100 ml
6,8 I 9,2 I 70,4 I 110,5 I 69,0 I 48,6 I 17,5
Beispiel 4 Kurthia ATCC 14757 wurde unter Schütteln in einem Medium aus 10 g/1 Caseinhydrolysat,
80 g/1 Glucose, 0,4 g/1 MgS04 - 7 H20 und aus den anderen im Beispiel l beschriebenen
Komponenten wachsen gelassen. Nach einer 7tägigen Vermehrung bei 28'C wurde gemäß
den bekannten Verfahren lediglich 5'-Guanylsäure aus dem Kulturmedium gewonnen.
Die Ausbeute war wie folgt:
PH zu Beginn pH am Ende 5'-Guanylsäure
I mg/100 ml
6,8 [ 5,8 I 10,3
Beispiel 5 Der Bazillus ATCC 14758 wurde unter Schütteln in einem Medium aus 100g/1
Getreidenährbrühe an Stelle von Caseinhydrolysat, 30 g/1 Glucose und aus im übrigen
den anderen im Beispiel 1 angegebenen Komponenten wachsen gelassen. Nach einer Vermehrung
der Kultur während 9 Tagen bei 28'C wurden gemäß bekannten Verfahren 5'-Guanylsäure,
5'-Adenylsäure, 5'-Cytidylsäure, 5'-Uridylsäure und 5'-Xanthylsäure aus dem Kulturmedium
gewonnen. Die Ausbeuten waren wie folgt:
PH zu pH am 5'-Guanylsäure 5'-Adenylsäure 5'-Cyridylsäure 5'-Uridylsäure
5'-Xanthylsäure
Beginn
Ende
mg/100 ml
mg/100 ml
mg/100 ml
mg/100 ml
mg/100 ml
7,0 I 8,8 ( 43,2 1 52,7 I 40,5 I 28,1 I 8,5
Beispiel 6 Bazillus ATCC 14758 wurde unter Schütteln in einem Kulturmedium aus 5g/1
Pepton, 5g/1 Bern-Steinsäure, 7,353 g/I (NH4)2HP04, 0,493 g/1 M9S04 -7H20, 1,49g/1
KCI, 0,147g/1 CaC12 - 2H20, 40g/1 Glucose und 11 einer als Lösungsmittel für das
Medium dienenden Sojabohnenextraktlösung wachsen gelassen.The characteristics of the Bacillus ATCC 14758 are given on the basis of the descriptive map in the manual "Mierobiological Methods, 1957" as follows: (1) Cell shape, 20-hour-old culture which was grown on agar provided with ox meat extract at 30 ° C 1. Vegetative
Cells ........ rods: 1.0 to 1.3 to 3 to
5 p. on average, with
rounded ends that are unbranched
are and individually or also in
Couples occur. On a glu-
agar medium containing cosine
the growth more luxuriant, the bars
are bigger, longer and wise
more vacuoles. they form
Spindle or wedge shapes easily
ter than on agar.
2. Motility ...... Poor mobility.
3. Sporangia .... Not significantly swollen.
4. Spores ....... On average 1.0 to 1.2 #t,
oval, central to terminal, after
24 hours lush.
5. Gram stain. . Positive.
(2) Agar strips, 20 hour old culture on with
Ox meat extract with agar at 30 ° C
1. Growth .... Abundant.
2. Shape ........ Smooth, increasing (old cells
have shrunk).
3. Shine ........ Shimmering.
4. Color formation ... Cream-colored to pale yellow.
5. Consistency .... Buttery.
6. Medium ...... Unchanged.
(3) beef extract broth, 48 hour old culture
a beef extract broth at 30'C
1. Surface
growth ..... none.
2. Cloud formation Strong, even cloudiness.
3. growth
scope ....... lush.
4. Sediment ..... Moderate.
(4) Agar culture, 20 hour old culture in with ox
Agar with meat extract at 30'C
1. Shape ........ circular.
2. Surface .... Smooth.
3rd margin ......... whole.
4: Elevation .... convex to protruding.
5. Density ........ Opaque.
(5) Soybean agar culture slanted
Abundant growth.
(6) NaCl nutrient broth
No growth in 2% NaCl.
(7) Physiological properties
1. Gelatine
liquid ..... slow liquefaction;
infundibuliform
2. Sugar Fermen
tation (medium
after Ayers)
Acid formation. Gas formation
Arabinose .... - -
Xylose ....... -f- -
Glucose ...... -I- -
Galactose ..... -f- -
Fructose ...... -h -
Sucrose .... -
Mannitol ....... -
Lactose ....... -F -
3. Reduction
of nitrate .... positive.
4. Anaerobic images
generation of gas
made of nitrate .... positive.
5. Voges Pros-
kauer-reac-
tion ** ........ Slightly positive.
6. methyl red
reaction ...... positive.
7. Citrate consumption positive.
Bacillus megaterium Baciilus cereus Bacillus ATCC 14758
Vegetative cells normal rod shape, normal rod shape, young cells have normal ones
no spindle- or wedge- no spindle- or wedge-rod shape; old cell
form form len have spindle or
Wedge shape
Agar culture whole and convex or flat and irregular whole and convex or after
protruding above outstanding
Voges-Proskauer reaction negative positive weak positive
Starch hydrolysis positive positive very weak
Fermentation of mannitol positive negative positive
Anaerobic formation of gas negative positive - positive
from nitrate
Enrichment of 5'-Gua negative negative positive
nylic acid and from 5'-Ade-
nylon acids
Thus, the ATCC 14758 strain is not regarded as belonging to either Bacillus megaterium or Bacillus cereus, but as a new species belonging to the Bacillus family. With the help of this strain, both 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid can be enriched. In addition, however, 5'-cytidylic acid, 5'-uridylic acid and 5'-xanthylic acid are also enriched under suitable conditions. Example 1 The Bacillus ATCC 14758 strain isolated from a soil sample was grown with shaking in a culture medium with the following components per one medium: B. Starch hydrolysis Very weak.
9. Casein hydro
lyse .......... positive.
10. Inclined
Tyrosine agar
culture ........ unchanged.
11. Catalase ...... positive.
12. Enrichment
of 5'-guanyl-
acid and from
5'-adenylic acid positive (strong accumulation).
Enrichment of nucleosides
or of smaller derivatives
of nucleic acids is negative.
13. Source ........ Isolated from a soil.
**) Peptone-water medium, because ATCC 14758 is not in one
Proteose-Peptone-Glucose Medium can grow.
The ATCC 14758 strain is considered to belong to the Bacillus family as described in the Bergey Handbook, Determinative Bacteriology, 7th Edition, because it has gram-positive, spore-forming rod-shaped cells containing catalase. The sporangia of this trunk are not significantly swollen. In young, lightly stained cells, vacuoles are present in the protoplasm. Furthermore, the diameter of the vegetative cell is 0.9 t or more. Accordingly, the ATCC 17758 strain is extremely similar to Bacillus megaterium or Bacillus cereus. Furthermore, this strain differs from Bacillus megaterium or from Bacillus cereus in the following characteristics: KZHP04 .......................... 7.0 g
KHZP04 ..............: ........... 3.0 g
(NH4) 1S04 ........................ 1.0 g
M9S04 - 7 H20 .................... 0.2 g
Sodium citrate ...................... 0.5 g
Casamino acid ..................... 10.0 g
Glucose .............................. 20.0 g
Thiamine .......................... 100 y
Riboflavin ......................... 100 y
Pyridoxine ......................... 200, y
Ca pantothenate .................... 20 y
Nicotinic acid ....................... 20 y
p-aminobenzoic acid ..............: 17
Biotin ............................ 2.5y
After propagation for 4 days at 28 ° C., the cells were separated off and the 5'-guanylic acid and the 5'-adenyl acid were obtained from the culture medium according to known methods. The yields were as follows: pH to pH at 5'-guanylic acid 5'-adenylic acid
Beginning end
mg / 100 ml
mg / 100 ml
6.8 I 6.0 I 20.6 I 17.6
Example 2 The new Kurthia ATCC 14757 strain isolated from a soil sample was grown with shaking in a medium of 80 g / 1 glucose, 20 g / 1 acid hydrolyzate of casein and the other same components as in Example 1. After propagation for 5 days at 28'C, 5'-guanylic acid and 5'-adenylic acid were obtained from the culture medium according to known methods. The yields were as follows: PH to pH at 5'-guanylic acid 5'-adenylic acid
Start end mg / 100 ml
mg / 100 ml
7.0 I 5.8 I 48.1 I 85.3
Example 3 The bacterium Kurthia ATCC 14757 was grown with shaking in a medium from 250 g / 1 cereal nutrient solution instead of casein hydrolyzate, from 40 g / 1 glucose and from the other components described in Example 1. After propagation for 9 days at 28'C, 5'-guanylic acid, 5'-adenylic acid, 5'-cytidylic acid, 5'-uridylic acid and 5'-xanthylic acid were obtained from the culture medium according to known methods. The yields were as follows: pH to pH at 5'-guanylic acid 5'-adenylic acid 5'-cytidylic acid 5'-uridylic acid 5'-xanthylic acid
Beginning
end
mg / 100 ml
mg / 100 ml
mg / 100 ml
mg / 100 ml
mg / 100 ml
6.8 I 9.2 I 70.4 I 110.5 I 69.0 I 48.6 I 17.5
Example 4 Kurthia ATCC 14757 was grown with shaking in a medium of 10 g / 1 casein hydrolyzate, 80 g / 1 glucose, 0.4 g / 1 MgSO 4 - 7 H 2 O and the other components described in Example 1. After 7 days of propagation at 28'C, only 5'-guanylic acid was obtained from the culture medium according to the known methods. The yield was as follows: PH at the beginning pH at the end 5'-guanylic acid
I mg / 100 ml
6.8 [5.8 I 10.3
Example 5 The bacillus ATCC 14758 was allowed to grow with shaking in a medium made from 100 g / 1 cereal broth instead of casein hydrolyzate, 30 g / 1 glucose and the other components specified in Example 1. After the culture had been multiplied for 9 days at 28 ° C., 5'-guanylic acid, 5'-adenylic acid, 5'-cytidylic acid, 5'-uridylic acid and 5'-xanthylic acid were obtained from the culture medium in accordance with known methods. The yields were as follows: PH to pH at 5'-guanylic acid 5'-adenylic acid 5'-cyridylic acid 5'-uridylic acid 5'-xanthylic acid
Beginning
end
mg / 100 ml
mg / 100 ml
mg / 100 ml
mg / 100 ml
mg / 100 ml
7.0 I 8.8 (43.2 1 52.7 I 40.5 I 28.1 I 8.5
Example 6 Bacillus ATCC 14758 was shaken in a culture medium of 5g / 1 peptone, 5g / 1 succinic acid, 7.353 g / I (NH4) 2HP04, 0.493 g / 1 M9S04 -7H20, 1.49g / 1 KCI, 0.147g / 1 CaC12-2H20, 40g / 1 glucose and 11% of a soybean extract solution serving as a solvent for the medium was allowed to grow.
Die Lösung des Sojabohnenextraktes wurde wie folgt zubereitet: 5 g/1
entfettete Sojabohnen wurden mit 100 ml einer 0,1°/oigen NaOH-Lösung auf dem siedenden
Wasserbad während einer Stunde extrahiert. Die dabei gebildete obere flüssige Schicht
wurde mit destilliertem Wasser auf 11 aufgefüllt. Nach einer Vermehrungsdauer von
8 Tagen bei 28'C wurde 5'-Guanylsäure gemäß gewöhnlichen Verfahren aus dem Kulturmedium
gewonnen. Die Ausbeute war wie folgt:
pH zu Beginn pH am Ende
5'-Guanylsäure
I mg/100 ml
7,2 I 5,8 I 13,7
The solution of the soybean extract was prepared as follows: 5 g / l defatted soybeans were extracted with 100 ml of a 0.1% NaOH solution on a boiling water bath for one hour. The resulting upper liquid layer was made up to 11 with distilled water. After a propagation period of 8 days at 28'C, 5'-guanylic acid was obtained from the culture medium in accordance with customary methods. The yield was as follows: pH at the beginning pH at the end
5'-guanylic acid
I mg / 100 ml
7.2 I 5.8 I 13.7