DE1200019B

DE1200019B - Diagnostic reagent for determining factors of blood plasma coagulation and method for its use

Info

Publication number: DE1200019B
Application number: DEW33378A
Authority: DE
Inventors: Jane Grant Lenahan; Monroe Lloyd Miller; Raphael Cohen
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1962-11-21
Filing date: 1962-11-21
Publication date: 1965-09-02

Description

Diagnosereagens zur Bestimmung von Faktoren der Blutplasmakoagulation und Verfahren zu seiner Anwendung Die Erfindung bezieht sich auf ein Diagnosereagens, das zur Bestimmung von Blutkoagulationsfaktoren verwendbar ist, die durch Behandlung insbesondere von Menschen mit insbesondere oralen Koagulationshemmstoffen herabgesetzt sind, und auf ein Verfahren, mit dessen Hilfe Blutplasmakoagulationsfaktoren bestimmbar sind.Diagnostic reagent for determining factors of blood plasma coagulation and method for its application The invention relates to a diagnostic reagent, which is useful for determining blood coagulation factors obtained by treatment especially decreased by people with especially oral coagulation inhibitors are, and a method with the help of which blood plasma coagulation factors can be determined are.

Ein Erfindungsziel besteht in der Schaffung eines zusammengesetzten Diagnosereagens, das zur Verwendung nur mit Wasser angerichtet zu werden braucht. One aim of the invention is to create a compound Diagnostic reagent that only needs to be prepared with water for use.

Die Erfindung bezweckt auch noch die Schaffung eines Diagnosereagens sowie eines Verfahrens für Koagulationsbestimmung, die beide bei 48 Stunden lang oder noch länger aufbewahrtem Patientenplasma verwendbar sind. Another object of the invention is to provide a diagnostic reagent and a method for coagulation determination, both at 48 hours or patient plasma that has been stored for a longer period of time.

Ein weiteres Erfindungsziel besteht in der Schaffung eines Diagnosereagans in kombinierter Form zum Unterschied von Präparaten aus getrennt vorliegenden Einzelbestandteilen, die vor Zugabe zum Patientenplasma nicht vermischt sind. Another object of the invention is to provide a diagnostic response in combined form as opposed to preparations made from separately available individual components, which are not mixed before being added to the patient's plasma.

Noch ein anderes Erfindungsziel besteht in der Schaffung eines Diagnosereagens zur Kontrolle der Antikoagulierungsmitteltherapie, das eine Reduktion der Thrombozytenfaktoren im Blutplasma von Patienten zu entdecken ermöglicht, die unter Antikoagulationsmitteltherapie und gleichzeitig unter Behandlung mit anderen Drogen, wie Chinidin, stehen, die ebenfalls eine solche Reduktion hervorrufen. Still another object of the present invention is to provide a diagnostic reagent to control anticoagulant therapy, which results in a reduction in platelet factors Allows it to be detected in the blood plasma of patients taking anticoagulant therapy and are being treated with other drugs such as quinidine at the same time also cause such a reduction.

Die Erfindung schafft ein neuartiges, zusammengesetztes Diagnosereagens und ein Verfahren zur Bestimmung von Blutkoagulationsfaktoren. Beide sind - verglichen mit Standardmethoden zur Kontrolle von Antikoagulationsmitteltherapie - sowohl dem äußeren als auch dem gewöhnlichen, eigentlichen Koagulationssystem gegenüber empfindlich und können zur Untersuchung von gelagertem Patientenplasma verwendet werden. Hierbei wird erfindungsgemäß das Plasma mit einer Gewebethrombokinase, die gegenüber menschlichem Plasma schwache Aktivität besitzt, mit adsorbiertem Rinderplasma und Calciumion vermischt. The invention provides a novel composite diagnostic reagent and a method for determining blood coagulation factors. Both are - compared with standard methods of controlling anticoagulant therapy - both the sensitive to the external as well as the usual, actual coagulation system and can be used to examine stored patient plasma. Here according to the invention, the plasma with a tissue thrombokinase which is opposite to human Plasma has weak activity, with adsorbed bovine plasma and calcium ion mixed.

Das erfindungsgemäße Diagnosereagens zeichnet sich demgemäß durch die Komponenten: gegenüber menschlichem Plasma schwach aktive Gewebethromkokinase, adsorbiertes Rinderplasma und Calciumion aus, während ein Zusatz von Thrombozytenfaktor völlig unterbleibt. Dazu wird das verwendete adsorbierte Rinderplasma so behandelt, daß es die Faktoren, die, wie man weiß, bei antikoagulierender Behandlung herabgesetzt werden, nämlich Proconvertin (im äußeren System), Stuartfaktor (im äußeren und eigentlichen System) und Prothrombin, nur in nicht feststellbarer Konzentration enthält. Das adsorbierte Rinderplasma wird außerdem so ausgewählt und behandlet, daß es Proaccelerin und Fibrinogen in hohen und stabilisierenden Konzentrationen enthält. The diagnostic reagent according to the invention is accordingly characterized the components: tissue thrombocinase weakly active in relation to human plasma, adsorbed bovine plasma and calcium ion, while an addition of platelet factor completely omitted. For this purpose, the adsorbed bovine plasma used is treated in such a way that that it diminishes the factors that are known to be associated with anticoagulant treatment namely proconvertin (in the outer system), Stuart factor (in the outer and actual System) and prothrombin, only in undetectable concentration. That adsorbed bovine plasma is also selected and treated to be proaccelerin and contains fibrinogen in high and stabilizing concentrations.

Die Mischung aus der Thrombokinase und dem Plasma wird auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 gepuffert, um Änderungen in der Gerinnungsaktivität infolge Abweichung vom optimalen pH-Wert zu vermeiden. Die Mischung enthält fernerhin zur optimalen Aktivität ausreichendes Calciumion.The mixture of the thrombokinase and the plasma is adjusted to a pH value buffered from 7.2 to 7.6 to reflect changes in clotting activity due to variation from optimal pH to avoid. The mixture also contains the optimal Activity sufficient calcium ion.

Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsgemäße Diagnosereagens, das die erwähnten Bestandteile aufweist und so hergestellt wird, daß es von zugefügten Thrombozytenfaktoren, wie Cephalin oder dessen Ersatz, frei ist, Nachweisempfindlichkeit im eigentlichen System für eine Herabsetzung der Thrombozytenfaktoren durch Drogen, wie etwa Chinidin, besitzt, die gleichzeitig mit Antikoagulationsmitteln verabreicht werden; diese Eigenschaft besitzt keines der anderen bekannten Diagnosemittel zur Kontrolle der Antikoagulationstherapie. It has been found that the diagnostic reagent according to the invention, which has the mentioned ingredients and is manufactured so that it is of added Platelet factors, such as cephalin or its substitute, is free, detection sensitivity in the actual system for a reduction in platelet factors through drugs, such as quinidine, administered concurrently with anticoagulants will; none of the other known diagnostic agents has this property Control of anticoagulation therapy.

Man weiß allgemein, daß zahlreiche bei Herzkrankheiten angewandte Drogen als Nebenwirkung die Werlhofsche Krankheit, nämlich einen Blutzustand, hervorrufen, der durch Herabsetzung der Blutthrombozyten verursacht wird, die die Quelle für den Thrombozytenfaktor als wichtigem Bestandteil des eigentlichen Blutgerinnungssystems bilden (H u n t, J. C., und andere, Proceedings of the Staff Meeting of the Mayo Clinic, Bd. 33, Nr. 4, S. 87 [Februar 1958]). It is well known that many are used in heart disease Drugs cause Werlhof's disease, namely a blood condition, as a side effect, which is caused by a reduction in the number of blood platelets, which is the source of the platelet factor as an important part of the actual Blood coagulation system (H u n t, J. C., and others, Proceedings of the Staff Meeting of the Mayo Clinic, Vol. 33, No. 4, p. 87 [February 1958]).

Man hat fernerhin erkannt, daß die gleichzeitige Behandlung eines unter Antikoagulaflonstherapie stehenden Patienten mit solchen Drogen zu einer Herabsetzung von Thrombozytenfaktoren führen kann, die sich zwar nicht in der Werlhofschen Krankheit äußern, klinisch aber ähnliche Ergebnisse wie eine Überdosis Antikoagulationsmittel zeitigen (S u s s m a n, L. N., und andere, JAMA, Bd. 156, Nr. 7, S. 702, 15. Oktober 1954).It has also been recognized that the simultaneous treatment of one Patients on anticoagulant therapy using such drugs lead to a reduction of platelet factors, which may not result in Werlhof's disease express, clinically but similar results as an overdose of anticoagulants early (S u s s m a n, L. N., and others, JAMA, Vol. 156, No. 7, p. 702, October 15 1954).

Im Handel ist ein kombiniertes Diagnosereagens erhältlich, das aus gegenüber menschlichem Plasma schwach aktiver Thrombokinase aus Rinder-, Pferde-oder Schweinehirn, adsorbiertem Rinderplasma, Cephalin und Calciumchlorid besteht und auf einen pH-Wert von 6 bis 8 gepuffert ist. Es steht gefriergetrocknet in Ampullenform zur Verfügung. Man hat festgestellt, daß die Verwendung dieses Präparates infolge der Zugabe der Cephalinkomponente eine quantitative Messung der Herabsetzung der Plasmathrombokinasenkomponente (Christmasfaktor, Faktor IX) gestattet. Es wurde somit der Fortschritt erzielt, daß dieses Reagens in einem einzigen Test die gleichzeitige und kombinierte Bestimmung der Blutkoagulierbarkeit ermöglicht, die erwiesenermaßen für die spezifischen Faktoren Proconvertin, Prothrombin, Stuartfaktor und Christmasfaktor (Faktor IX) gleich schnell fortschreitet. A combined diagnostic reagent is commercially available which consists of Thrombokinase from bovine, horse or low levels of activity compared to human plasma Pig brain, adsorbed bovine plasma, cephalin and calcium chloride consists and is buffered to a pH of 6 to 8. It is freeze-dried in ampoule form to disposal. It has been found that the use of this preparation as a result the addition of the cephalin component gives a quantitative measurement of the reduction in the Plasma thrombokinase component (Christmas factor, factor IX) permitted. It was thus the progress achieved that this reagent in a single test the simultaneous and combined determination of blood coagulability that has been proven for the specific factors proconvertin, prothrombin, Stuart factor and Christmas factor (Factor IX) progresses at the same rate.

Das im Handel befindliche Reagens gestattet es jedoch nicht, die Herabsetzung des Christmasfaktors (des Faktors IX) auf kritisch niedrige Werte in der Größenordnung von 100/o und darunter zu messen. However, the commercially available reagent does not allow the Reduction of the Christmas factor (factor IX) to critically low values in of the order of 100 / o and below.

Andererseits trägt bekanntlich Cephalin zur vollständigen Unempfindlichkeit des Diagnosereagens gegen Herabsetzung der Thrombozytenfaktoren bei, für die Cephalin definitionsgemäß ein Ersatz ist. Der variable, nämlich zwischen 6 und 8 liegende pH-Bereich dieses Materials, das zusammen mit einer gegenüber menschlichem Plasma schwachen Thrombokinase verwendet wird, läßt die Ergebnisse infolge des Abgehens vom optimalen, erwiesenermaßen im unmittelbaren Bereich von 7,2 bis 7,6 liegenden pH-Wert der Blutgerinnungsreaktion ungenau werden. Unter diesen Umständen werden Ergebnisse geliefert, die eine Wirkung der Therapie vortäuschen, während sie tatsächlich vollständig auf Mängeln im Reagenssystem beruhen. Somit kann im Endeffekt die Verwendung eines Cephalin enthaltenden Diagnosereagens Erscheinungen überdecken, die durch gleichzeitige und zur Antikoagulationstherapie zusätzliche Therapie hervorgerufen werden. Infolge der Überdeckung dieser Erscheinungen wird womöglich eine solche gleichzeitige Therapie fortgesetzt, die dann ihrerseits Blutung hervorrufen können, wenn nicht die überdeckte Erscheinung selbst schon blutungserregend sein kann.On the other hand, as is well known, cephalin contributes to complete insensitivity of the diagnostic reagent against lowering of platelet factors for the cephalin is by definition a replacement. The variable, namely between 6 and 8 pH range of this material, along with an opposite to human plasma weak thrombokinase is used negates the results as a result of going off from the optimal, proven to be in the immediate range of 7.2 to 7.6 pH of the blood clotting reaction become inaccurate. Under these circumstances it will be Delivered results that simulate an effect of the therapy while actually doing it based entirely on deficiencies in the reagent system. Thus, in the end, the use of a diagnostic reagent containing cephalin mask symptoms caused by simultaneous therapy and therapy in addition to anticoagulation therapy will. As a result of the obscuration of these phenomena there is possibly one continued simultaneous therapy, which in turn may cause bleeding, unless the masked appearance itself can cause bleeding.

Wie bereits vorstehend erwähnt wurde, können einheitliche Präparate mit Cephalin als einem Bestandteil nicht zur Feststellung einer Thrombozytenherabsetzung verwendet werden; auf der anderen Seite ist das erfindungsgemäße Präparat zur Feststellung einer Herabsetzung all jener Komponenten geeignet, die auch durch das handelsübliche Präparat wrikungsvoll gemessen werden können. As already mentioned above, uniform preparations with cephalin as an ingredient not for the determination of platelet depletion be used; on the other hand, the preparation according to the invention is for detection a reduction of all those components suitable, which also by the commercially available Preparation can be measured effectively.

Demgemäß schafft die Erfindung ein neuartiges, zusammengesetztes Diagnosereagens, das aus gegenüber menschlichem Plasma schwacher Gewebethrom- bokinase, adsorbiertem Rinderplasma und Calciumion besteht, auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 gepuffert ist, gegen Änderungen im äußeren, aber auch nach üblichen Meßmethoden gegen Änderungen im eigentlichen Koagulationssystem empfindlich ist und dabei auch auf Komponenten im eigentlichen System, wie etwa Thrombozytenfaktoren, anspricht, die während der Antikoagulationstherapie durch gleichzeitige Behandlung mit Chinidin oder anderen Drogen reduziert werden. Auch andere Drogen, die bei Darreichung an unter Antikoagulationsmitteltherapie stehenden Patienten die Werlhofsche Krankheit als Nebenwirkung hervorrufen, können eine Reduktion der Thrombozytenfakto-ren - her-vorrufen, was sich mit Hilfe des Verfahrens und des Diagnosemittels nach der vorliegenden Erfindung entdecken läßt. Accordingly, the invention provides a novel composite Diagnostic reagent, which is derived from tissue thrombus, which are weak in relation to human bokinase, adsorbed bovine plasma and calcium ion, to a pH of 7.2 to 7.6 is buffered against changes in the external, but also according to conventional measurement methods is sensitive to changes in the actual coagulation system and is also sensitive to it responds to components in the actual system, such as platelet factors, those during anticoagulation therapy by concomitant treatment with quinidine or other drugs are reduced. Also other drugs when administered Patients on anticoagulant therapy developed Werlhof's disease cause as a side effect, a reduction in platelet factors - evoke what happens with the help of the procedure and the diagnostic means after the lets discover the present invention.

Somit besteht eines der Hauptmerkmale der vorliegenden Erfindung darin, daß mit einem einheitlichen, einstufigen Verfahren eine Reduktion der Thrombozytenfaktoren während der Antikoagulationstherapie, wenn der Patient zusätzlich einer Ergänzungstherapie etwa mit Chinidin unterworfen wird, festgestellt werden kann. Thus, it is one of the main features of the present invention in the fact that with a uniform, one-step process, a reduction in platelet factors during anticoagulation therapy, if the patient is also taking complementary therapy subjected to about with quinidine, can be determined.

Herstellung des Diagnosereagens Beispiel 1 Zu 1 Volumen an Bariumsulfat adsorbiertem, oxalierte Rinderplasma werden 1 Volumen destilliertes Wasser, 1 Volumen einer Lösung, die 0,15 Mol Natriumchlorid und 0,025 Mol Calciumchlorid enthält, 1 Volumen eines wäßrigen Extraktes aus acetonbehandeltem Pferdehirngewebe sowie so viel Puffersubstanz hinzugegeben, daß die Gesamtmischung auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 gebracht wird. Preparation of Diagnostic Reagent Example 1 To 1 volume of barium sulfate adsorbed, oxalated bovine plasma are 1 volume of distilled water, 1 volume a solution containing 0.15 mol of sodium chloride and 0.025 mol of calcium chloride, 1 volume of an aqueous extract from acetone-treated horse brain tissue and so much buffer substance added that the total mixture to a pH of 7.2 to 7.6 is brought.

Beispiel II Zu 1 Volumen an Bariumsulfat adsorbiertem, oxaliertem Rinderplasma werden 1 Volumen destilliertes Wasser, 1 Volumen einer Lösung, die 0,15 Mol Natriumchlorid und 0,025 Mol Calciumchlorid enthält, 1 Volumen eines wäßrigen Extraktes aus acetonbehandeltem Pferdehirngewebe, der in bezug auf Calciumchlorid 0,O5molar und in bezug auf Natriumchlorid 0, 15molar gemacht worden ist, sowie so viel Puffersubstanz hinzugegeben, daß die Gesamtmischung auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 gebracht wird. Example II To 1 volume of barium sulfate adsorbed, oxalated Bovine plasma will be 1 volume of distilled water, 1 volume of a solution that Contains 0.15 mol of sodium chloride and 0.025 mol of calcium chloride, 1 volume of an aqueous Extract from equine brain tissue treated with acetone, which with respect to calcium chloride 0.05 molar and with respect to sodium chloride 0.15 molar, as well as so a lot of buffer substance was added so that the total mixture had a pH of 7.2 to 7.6 is brought.

Anwendungsverfahren Durch Venenpunktierung wird Patientenblut beschafft, das oxaliert und zentrifugiert und unmittelbar darauf in ein silikonüberzogenes Röhrchen eingebracht wird. Gleiche Mengen des Reagens gemäß Beispiel I und des Patientenplasmas werden je für sich 3 bis 5 Minuten lang auf 37"C erwärmt. Anschließend werden 0,05 ccm zu prüfendes Patientenplasma zu 0,25 ccm Reagens hinzugegeben und die zur Fibrinbildung benötigte Zeit aufnotiert. Diese Fibrinbildungszeit wird mit einer Kurve verglichen, die man durch Verdünnen von normalem Plasma mit physiologischer Kochsalzlösung oder Wasser auf verschiedene Höhen aufgestellt hat, und die Aktivität des Patientenplasmas wird unter Bezugnahme auf die Eichkurve auf Prozente normaler Aktivität berechnet. Method of application The patient's blood is obtained by venipuncture, the oxalated and centrifuged and immediately afterwards in a silicone-coated Tube is introduced. Equal amounts of the reagent according to Example I and the patient plasma are each heated to 37 ° C for 3 to 5 minutes. Then 0.05 ccm of patient plasma to be tested is added to 0.25 ccm of reagent and that for fibrin formation required time noted. This fibrin formation time is compared with a curve which can be obtained by diluting normal plasma with normal saline or Water at different levels and the activity of the patient's plasma is calculated for percent normal activity with reference to the calibration curve.

Normalbereich . . . . . . . . . 100°/o Aktivität, Therapeutischer Bereich.. 10 bis 300/o Aktivität. Normal range. . . . . . . . . 100 per cent activity, more therapeutic Range .. 10 to 300 / o activity.

In oben beschriebener Weise erhaltenes und gelagertes Patientenblutplasma sowie eine entsprechende Menge des Präparates gemäß Beispiel II werden je für sich 3 bis 5 Minuten lang auf 37°C erwärmt. Patient blood plasma obtained and stored in the manner described above as well as a corresponding Amount of the preparation according to Example II are each heated to 37 ° C for 3 to 5 minutes.

0,1 ccm des zu untersuchenden Patientenplasmas wird zu 0,5 ccm Reagens hinzugegeben und die zur Fibrinbildung benötigte Zeit aufnotiert. Diese Fibrinbildungszeit wird mit einer Kurve verglichen, die man durch Verdünnen von normalem Plasma mit physiologischer Kochsalzlösung oder Wasser auf verschiedene Höhen aufgestellt hat, und die Aktivität des Patientenplasmas wird unter Bezugnahme auf die Eichkurve auf Prozente normaler Aktivität berechnet.0.1 cc of the patient's plasma to be examined becomes 0.5 cc of reagent added and the time required for fibrin formation noted. This fibrin formation time is compared to a curve obtained by diluting normal plasma with has placed physiological saline solution or water at different levels, and the activity of the patient's plasma is determined with reference to the calibration curve Percentage of normal activity calculated.

Normalbereich . . . . @ @ @ @ @ 1000/o Aktivität, Therapeutischer Bereich.. 10 bis 30 0/o Aktivität. Normal range. . . . @ @ @ @ @ 1000 / o activity, therapeutic Range .. 10 to 30 0 / o activity.

Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß die Erfindung ein neues Präparat sowie ein Verfahren für die Bestimmung der Blutkoagulationsfaktoren schafft. From the foregoing it can be seen that the invention is novel Creates preparation and a method for determining blood coagulation factors.

Claims

Claims: 1. Diagnostic reagent for determining factors the blood plasma coagulation, d u r c h marked that it is from opposite to human Plasma of weakly active tissue thrombokinase, adsorbed bovine plasma and calcium ion exists and is characterized by freedom from platelet factors.

2. Reagent according to claim 1, characterized in that it is on a pH is buffered from about 7.2 to 7.6.

3. reagent according to claim 1 or 2, characterized in that the weak thrombokinase from an aqueous extract from acetone-treated horse brain consists.

4. reagent according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that the adsorbed bovine plasma practically freed from all factors by adsorption is that of oral anticoagulant therapy in its concentration in human Patient plasma are reduced, and that there are known coagulation factors, which are not influenced by this therapy, contains in high concentration.

5. Reagent according to claim 4, characterized in that the factors from which the adsorbed bovine plasma is practically free, prothrombin, Stuart factor, Proconvertin and Christmas factor (factor IX) are.

6. method for determining factors of blood plasma coagulation, characterized in that the patient's plasma is compared with human plasma weakly active tissue thrombokinase, adsorbed bovine plasma and calcium ion mixed and measures the length of time required for fibrin formation.