DE1193641B

DE1193641B - Process for obtaining a parathyroid hormone which lowers blood calcium levels

Info

Publication number: DE1193641B
Application number: DEC29832A
Authority: DE
Inventors: Douglas Harold Copp; Robert Lang Noble
Original assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Current assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Priority date: 1962-05-11
Filing date: 1963-05-02
Publication date: 1965-05-26

Description

Verfahren zur Gewinnung eines den Blutcalciumspiegel herabsetzenden Nebenschilddrüsenhormons Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die Calcitonin enthalten, das praktisch frei von Parathormon ist.Process for obtaining a blood calcium lowering agent Parathyroid hormone The invention relates to processes for the preparation of compositions, which contain calcitonin, which is virtually parathyroid hormone free.

Es ist bekannt, daß die Nebenschilddrüse in gewisser Weise für die Aufrechterhaltung des Calciumspiegels im Plasma, insbesondere im Blutplasma, verantwortlich ist. In der Literatur wurde beschrieben, daß ein Hormon, Parathormon, die Eigenschaft besitzt, den Calciumspiegel, wahrscheinlich durch Entfernung von Calcium aus dem Knochengerüst, zu erhöhen. Es wurde allgemein angenommen, daß die Regulierung von hohen Calciumblutspiegeln von einer Herabsetzung des Parathormonspiegels abhängt, doch wurde vermutet, daß ein zweiter Faktor vorhanden ist, der eine Demobilisierung von Plasmacalcium in die Knochen bewirkt.It is known that the parathyroid gland is in some way responsible for the Maintaining the calcium level in the plasma, especially in the blood plasma, is responsible is. In the literature it has been described that a hormone, parathyroid hormone, has the property owns calcium levels, likely by removing calcium from the Skeleton, to increase. It was widely believed that the regulation of high blood calcium levels is dependent on a decrease in parathyroid hormone levels, but it has been suggested that there is a second factor, demobilization caused by plasma calcium in the bones.

Es wurde nun gefunden, daß tatsächlich ein zweiter Faktor existiert, der die Fähigkeit besitzt, den Plasmacalciumspiegel zu erniedrigen. Es wurde ferner gefunden, daß dieser Faktor, dem der Name »Calcitonin« gegeben wird, in einer -Form isoliert werden kann, die frei von dem kompensierenden Parathormon ist und so ein außerordentlich wertvolles therapeutisches Mittel darstellt. Viele Arzneimittel, beispielsweise die Corticosteroide, besitzen eine Nebenwirkung, langsam Calcium aus den Knochen zu entfernen und eine Osteoporosis zu bewirken. Es besteht daher ein großes Bedürfnis nach einer Therapiemethode, diese unerwünschte Nebenwirkung zu korrigieren, und die erfindungsgemäß gewonnenen Mittel, die von dem kompensierenden Parathormon praktisch freies Calcitonin enthalten, eröffnen die Möglichkeit einer solchen Therapie.It has now been found that a second factor actually exists, which has the ability to lower plasma calcium levels. It was further found that this factor, which is given the name "calcitonin", is in a form that is free from the compensatory parathyroid hormone and such a represents an extremely valuable therapeutic agent. Many medicines for example the corticosteroids, have a side effect, slowly calcium remove from the bones and cause osteoporosis. It therefore exists there is a great need for a method of therapy to address this undesirable side effect to correct, and the means obtained according to the invention that of the compensating Parathyroid hormone containing practically free calcitonin, open up the possibility of one such therapy.

Die Verfahren zur Herstellung solcher Mittel sind Ziel der vorliegenden Erfindung. Es wurden verschiedene Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen gefunden. Ein solches Verfahren besteht in der Extraktion von frischem Nebenschilddrüsengewebe mit Wasser bei einem pH-Wert von 6,7 bis 7,5. Das Nebenschilddrüsengewebe kann aus jeder beliebigen geeigneten Quelle stammen, gewöhnlich vom Rind oder Hund. Zweckmäßigerweise befindet es sich in Form von dünnen Schnitten, doch kann es auch zerhackt oder anderweitig fein zerkleinert sein. Eine zu feine Zerkleinerung macht die Abtrennung von dem Extrakt schwierig, während eine mangelhafte Zerkleinerung die Penetration des Gewebes vermindert. Da zur Freisetzung des Parathormons aus den Geweben Säure erforderlich ist, bleibt es zurück, und der neutrale Extrakt enthält Calcitonin in von Parathormon praktisch freier Form. Zur Erzielung bester Ergebnisse sollten vorzugsweise maximal 3 Volumina Wasser je Volumen Gewebe verwendet werden, da größere Mengen von Extraktionsmittel den Aktivbestandteil verdünnen. Konzentriertere Extrakte werden durch Verwendung geringerer Mengen Wasser oder auch durch Pressen der Gewebe zur Gewinnung des Plasmas aus diesen erhalten. Die Temperatur einer solchen Extraktion kann von 5°C bis zu etwa Zimmertemperatur schwanken, wobei niedrigere Temperaturen bevorzugt sind. Die Stabilität solcher Extrakte wird durch die Tatsache erläutert, daß sie gekocht werden können, um Proteinnebenprodukte auszufällen, ohne daß der aktive Bestandteil zerstört würde.The methods for making such agents are the objectives of the present invention Invention. Various methods have been used to prepare such compositions found. One such procedure is the extraction of fresh parathyroid tissue with water at a pH of 6.7 to 7.5. The parathyroid tissue can be made from from any suitable source, usually beef or dog. Appropriately it is in the form of thin cuts, but it can also be chopped up or otherwise be finely chopped. Too fine a comminution makes the separation of the Extract difficult, while inadequate comminution allows tissue penetration reduced. Because acid is required to release the parathyroid hormone from the tissues it is left behind, and the neutral extract contains calcitonin in parathyroid hormone practically free form. For best results you should preferably use a maximum of 3 volumes of water per volume of tissue are used as larger amounts of extractant are used dilute the active ingredient. More concentrated extracts are obtained by using smaller amounts of water or by pressing the tissue to obtain the plasma obtained from these. The temperature of such an extraction can range from 5 ° C up to about room temperature, with lower temperatures being preferred. the Stability of such extracts is illustrated by the fact that they are boiled able to precipitate protein by-products without destroying the active ingredient would.

Der aktive Bestandteil kann durch Einstellung des pH-Wertes auf 5,5 bis 6,5 mittels Säure, vorzugsweise mit O,ln-HCl, ausgefällt werden. Der gewählte pH-Wert sollte derjenige sein, bei welchem eine scharfe Ausfällung auftritt. Das ausgefällte aktive Material (durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert) kann leicht in Wasser bei neutralem pH gelöst werden. Eine weitere Reinigung kann durch Dialyse durch eine Cellophanmembran und durch Verdünnen mit Alkohol (bis zumindest 600/, Alkohol) durchgeführt werden, der weitere Proteinverunreinigungen ausfällt. Aus solchen Alkohollösungen fällt der aktive Bestandteil bei Verdünnen mit 2 bis 4 Volumina Äther in viel reinerer Form aus. Das oben beschriebene Verfahren ist eine Extraktion des im Nebenschilddrüsengewebe vorhandenen Calcitonins. Noch zweckmäßiger ist ein Verfahren zur Biosynthese von Calcitonin unter Verwendung von Nebenschilddrüsengewebe und einer physiologisch zuträglichen Flüssigkeit mit hohem Calciumgehalt. Eine solche Flüssigkeit bewirkt, daß das Gewebe mehr Calcitonin produziert, und der so gebildete Extrakt ist viel reicher an aktivem Bestandteil als ein einfacher Extrakt des Gewebes mit Wasser von neutralem pH.The active ingredient can be precipitated by adjusting the pH to 5.5 to 6.5 using an acid, preferably O, In-HCl. The pH chosen should be that at which sharp precipitation occurs. The precipitated active material (isolated by filtration or centrifugation) can easily be dissolved in water at neutral pH. Further purification can be carried out by dialysis through a cellophane membrane and by dilution with alcohol (up to at least 600 % alcohol), which precipitates further protein impurities. From such alcohol solutions, the active ingredient precipitates in a much purer form when diluted with 2 to 4 volumes of ether. The procedure described above is an extraction of the calcitonin present in the parathyroid tissue. A method for the biosynthesis of calcitonin using parathyroid tissue and a physiologically beneficial liquid with a high calcium content is even more expedient. Such a liquid causes the tissue to produce more calcitonin and the extract so formed is much richer in active ingredient than a simple extract of the tissue with water at neutral pH.

Ein solches Verfahren besteht in der Perfusion von isolierten Schilddrüsen-Nebenschilddrüsen in lebenden Hunden mit an zugesetztem Calcium reichem Blut und anschließender Zentrifugation des Blutes zur Gewinnung des Plasmas, das die Calcitoninaktivität enthält. Ein hierzu ähnliches Verfahren besteht darin, geschnittenes frisches Nebenschilddrüsengewebe mit Blut oder anderen physiologisch verwendbaren Flüssigkeiten, die zugesetztes Calcium enthalten, zu verrühren. In jedem Falle ist das zugesetzte Calcium mehr als die 10 mg je 100 ccm, die normalerweise im Plasma gefunden werden. Es sollten nur 3 bis 5 mg zugegeben werden, da größere Mengen toxische Wirkungen auf das Gewebe oder auf das Tier hervorrufen. Zu physiologisch verwendbaren Flüssigkeiten gehören neben Gesamtblut Plasma, Kulturmedien und isotonische Salzlösungen. In jedem Falle bewirkt das zugesetzte Calcium, daß das Nebenschilddrüsengewebe mehr Calcitonin produziert, während das Parathormon in dem Gewebe gebunden bleibt, und der Extrakt enthält die Calcitoninaktivität ohne Parathormonaktivität. Nach der gleichen Methode, jedoch unter Verwendung von Flüssigkeiten mit einem verhältnismäßig niedrigen Calciumgehalt (5 bis 8 mg) können die Gewebe in entsprechender Weise zur Bildung von Parathormon, das frei von Calcitonin ist, angeregt werden.One such procedure is the perfusion of isolated thyroid-parathyroid glands in live dogs with blood rich in added calcium followed by centrifugation of the blood to obtain the plasma which contains the calcitonin activity. One about this Similar procedure is to cut fresh parathyroid tissue with blood or other physiologically usable liquids that have been added Contain calcium, stir. In any case, the added calcium is more than the 10 mg per 100 cc normally found in plasma. It should only 3 to 5 mg are added, as larger amounts have toxic effects on the tissue or to evoke the animal. Physiologically acceptable fluids include in addition to whole blood plasma, culture media and isotonic saline solutions. In any case The added calcium causes the parathyroid tissue to have more calcitonin produced while the parathyroid hormone remains bound in the tissue, and the extract contains the calcitonin activity without parathyroid hormone activity. Using the same method, however, using liquids with a relatively low calcium content (5 to 8 mg) can the tissues in a corresponding way to the formation of parathyroid hormone, which is free of calcitonin can be stimulated.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen behalten ihre Aktivität bis zu 10 Tage lang bei, wenn sie gekühlt werden. Die Aktivität wird, wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt, durch Injektion bei einem Hund, den man fasten ließ, geprüft. Der Calciumspiegel muß in den folgenden 20 bis 30 Minuten um mindestens 0,3 mg absinken. Gewöhnlich dauert die Wirkung etwa 1 Stunde, und der Calciumspiegel ist nach dieser Zeit normal. Wenn Parathormon vorhanden ist, zeigt sich eine viel langsamere Wirkung, wobei sich ein Anstieg des Blutcalciums über den normalen Wert ergibt, nachdem 1 Stunde vergangen ist.The compositions of the invention retain their activity until for 10 days when refrigerated. The activity will be as in the following Examples shown tested by injection in a fasted dog. The calcium level must drop by at least 0.3 mg in the next 20 to 30 minutes. Usually the effect lasts for about 1 hour and the calcium level is after this Time normal. When parathyroid hormone is present, the effect is much slower, resulting in an increase in blood calcium above normal after 1 Hour has passed.

Verfahren zur genauen Bestimmung der Plasmacalciumkonzentration Die Prüfung auf Calcitonin hängt von einer sehr genauen Bestimmung der Plasmacalciumkonzentration ab. Diese wird durch eine halbautomatische Modifikation der Methode von F a 1 e s (J. Biol. Chem., 204; 577, 1953) erzielt und ergibt eine bessere Reproduzierbarkeit als 0,20/, bei 0,2-ml-Proben, die 10 bis 20 mg Calcium enthalten. Die Methode besteht in einer photometrischen Titration des Calciums mit Äthylendiamintetraessigsäure unter Verwendung von purpursaurem Ammonium als Indikator. Die 0,2-ml-Probe wird mit einer Präzisionsmikropipette in 5 ml destilliertes Wasser in einem Klett-Summerson-Kolorimeterrohr übergeführt, und 1 Tropfen halbgesättigtes NaOH und 3 Tropfen einer 0,1 °/oigen Lösung von purpursaurem Ammonium werden zugegeben. Das Rohr wird in ein Klett-Summerson-Kolorimeter mit einem 500-A-Interferenzfilter zweiter Ordnung eingebracht. Das Kolorimeter ist so modifiziert, daß der Ausgang, von dem normalerweise das Galvanometer gespeist wird, zu einem potentiometrischen Millivolt-Registriergerät (Sargent Modell SR 3 Recorder mit 1-mV-Stöpselbereich oder Beckman Laboratory Potentiometeric Recorder Nr. 93 500) geführt wird, das mit einer konstanten Geschwindigkeit von 25,4 mm (1 inch) pro Minute arbeitet. Zum Mischen der Lösungen in dem Rohr wird ein Rührei verwendet. 0,02 °/o Äthylendiamintetraessigsäure (Dinatriumäthylendiamintetraacetat) werden aus einer Spritzbürette mit konstanter Abgabegeschwindigkeit (Havard Instrument Co. Nr. 1100, tragbare Infusionsabzugspumpe mit einem Motor mit 8 UpM. und 10-ml-Spritze) zugegeben. Das potentiometrische Aufzeichnungsgerät und die Spritzbürette werden gleichzeitig eingeschaltet, und es wird eine Aufzeichnung der Erhöhung des Lichtdurchgangs und des Potentials erhalten, wenn das Calcium titriert wird. Am Endpunkt tritt ein scharfer Knick in der Titrationskurve auf. Der Abstand vom Anfangspunkt zum Endpunkt wird auf dem Registrierstreifen gemessen, und er ist dem in der Probe vorhandenen Calcium direkt proportional.Procedure for the Accurate Determination of Plasma Calcium Concentration The Testing for calcitonin depends on a very accurate determination of plasma calcium concentration away. This is achieved through a semi-automatic modification of the method of F a 1 e s (J. Biol. Chem., 204; 577, 1953) and gives better reproducibility than 0.20 /, for 0.2 ml samples containing 10 to 20 mg calcium. The method is there in a photometric titration of calcium with ethylenediaminetetraacetic acid using purple acid ammonium as an indicator. The 0.2 ml sample will with a precision micropipette in 5 ml of distilled water in a Klett-Summerson colorimeter tube transferred, and 1 drop of semi-saturated NaOH and 3 drops of 0.1% Solutions of purple acid ammonium are added. The tube is in a Klett-Summerson colorimeter introduced with a 500 A second order interference filter. The colorimeter is modified so that the output from which normally the galvanometer is fed becomes a potentiometric millivolt recorder (Sargent Model SR 3 Recorder with 1 mV plug range or Beckman Laboratory Potentiometeric Recorder No. 93 500), which is guided at a constant speed of 25.4 mm (1 inch) works per minute. A scrambled egg is used to mix the solutions in the tube used. 0.02% ethylenediaminetetraacetic acid (disodium ethylenediaminetetraacetate) are from a syringe burette with constant delivery rate (Havard Instrument Co. No. 1100, portable infusion evacuation pump with an 8 RPM motor. and 10 ml syringe) admitted. The potentiometric recorder and the spray burette will be turned on at the same time, and there is a record of the increase in light transmission and the potential obtained when the calcium is titrated. Occurs at the end point sharp bend in the titration curve. The distance from the start point to the end point is measured on the chart and it is the one present in the sample Calcium directly proportional.

Die zur Erzielung einer Erniedrigung des Plasmacalciums von minimal 0,3 mg erforderliche Menge an Calcitonin beträgt etwa 5 mg/kg Körpergewicht des aktiven Produkts (etwa 1 g), das in der Lösung enthalten ist, die durch neutrale Wasserextraktion (300 ccm) von 100 g frischem Rindernebenschilddrüsengewebe nach Sieden, Ausfällen mit Säure, Wiederauflösen in neutraler Lösung und Abfiltrieren des Unlöslichen erhalten wird.The one to achieve a lowering of the plasma calcium of minimal 0.3 mg required amount of calcitonin is about 5 mg / kg body weight of the active product (about 1 g) contained in the solution by neutral Water extraction (300 cc) from 100 g of fresh bovine parathyroid tissue after Boiling, precipitation with acid, redissolving in neutral solution and filtering off of the insoluble is obtained.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel l Ganze gefrorene Rindernebenschilddrüsen werden aufgetaut und fein zerkleinert. 100g des Produkts werden mit 100 ccm destilliertem Wasser von neutralem pH bei einer Temperatur von etwa 10°C behandelt. Der Wasserextrakt wird aus dem Drüsenmaterial ausgepreßt, und die gleiche Extraktion wird weitere zweimal wiederholt. Zweckmäßigerweise wird diese Extraktion kontinuierlich durchgeführt, indem die 300 ccm Wasser im Kreislauf durch die zerkleinerte Drüse geführt werden.The following examples illustrate the invention. Example l whole Frozen bovine parathyroid glands are thawed and finely chopped. 100g des Product are mixed with 100 cc of distilled water of neutral pH at a temperature treated at about 10 ° C. The water extract is pressed out of the gland material, and the same extraction is repeated two more times. Appropriately is this extraction is carried out continuously by circulating the 300 cc of water passed through the crushed gland.

Die Extrakte werden vereinigt, auf den Siedepunkt gebracht und filtriert (durch grobes Filterpapier). Der pH-Wert des Filtrats wird mit 0,1 n-HCl auf etwa 6 eingestellt, bei welchem die Ausflockung eines leichten Niederschlags auftritt. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und in 25 ccm destilliertem Wasser wieder aufgelöst, wobei der pH-Wert der erhaltenen Lösung mit einigen Tropfen 0,1n-NaOH auf neutral eingestellt wird. Diese neutrale Lösung wird erneut filtriert, um inaktive Rückstände abzutrennen. Dieses Filtrat enthält etwa 1 g (auf Trockengewichtbasis) Material mit Calcitoninaktivität. Bei einem Versuchshund erzeugte die Injektion dieses Materials in einer Dosis von etwa 5 mg je Koligramm Körpergewicht eine positive Calcitoninprobe, wie sie bei der Prüfungsmethode definiert ist, und zeigt sich frei von Parathormonaktivität.The extracts are combined, brought to the boiling point and filtered (through coarse filter paper). The pH of the filtrate is adjusted to approx 6, at which the flocculation of light precipitation occurs. This precipitate is filtered off and redissolved in 25 ccm of distilled water, the pH of the solution obtained with a few drops of 0.1N NaOH to neutral is set. This neutral solution is filtered again to remove inactive residues to separate. This filtrate contains approximately 1 g (on a dry weight basis) of material with calcitonin activity. In a test dog, the injection produced this material a positive calcitonin sample at a dose of about 5 mg per coligram of body weight, as defined in the test method and is shown to be free of parathyroid hormone activity.

Eine weitere Reinigung kann wie folgt durchgeführt werden: 4 Volumina Alkohol werden zu 1 Volumen des obigen Endfiltrats (oder eine zur Erzielung von zumindest 60 °/o Alkohol ausreichende Menge) zugegeben. Es bildet sich eine inaktive Ausfällung, die abfiltriert wird (inaktive Ausfällung). 3 Volumina Äther werden dann zu 1 Volumen der wäßrigalkoholischen Lösung zugesetzt; der aktive Bestandteil scheidet sich als Niederschlag ab. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und mit destilliertem Wasser von pH 6,0 gewaschen.Further purification can be carried out as follows: 4 volumes Alcohol add to 1 volume of the final filtrate above (or one to make at least 60% alcohol sufficient amount) was added. An inactive precipitate forms, which is filtered off (inactive precipitation). 3 volumes of ether then become 1 volume added to the aqueous alcoholic solution; the active ingredient separates as Precipitation from. This precipitate is filtered off and washed with distilled water washed from pH 6.0.

Diese Ausfällung (etwa 0,7 g) kann in destilliertem Wasser von neutralem pH zur Verwendung wieder gelöst werden und besitzt hohe Calcitoninaktivität. Das Produkt ist vollständig frei von Parathormonaktivität. Die isolierte, gereinigte Wirksubstanz behält ihre Calcitoninaktivität etwa 10 Tage lang bei, wenn sie bei etwa 4'C gekühlt aufbewahrt wird.This precipitate (about 0.7 g) can be dissolved in distilled water of neutral pH can be redissolved for use and has high calcitonin activity. That Product is completely free of parathyroid hormone activity. The isolated, purified Active substance retains its calcitonin activity for about 10 days when it is at about 4'C is kept refrigerated.

Obwohl die isolierte, gereinigte Wirksubstanz die Calcitoninaktivität nur etwa 10 Tage lang beibehält, ist das erfindungsgemäß erhaltene Produkt für die Medizin von erheblicher Bedeutung. Dieses Produkt ist nämlich während dieses Zeitraumes von etwa 10 Tagen ein biologisch aktives Prinzip, dessen Aktivität nach keiner anderen Arbeitsweise erzielbar ist. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erstmalig ein Wirkstoff zur Verfügung gestellt, welcher den Plasmacalciumspiegel erniedrigt. Dieser Wirkstoff ist praktisch frei von dem kompensierenden Parathormon und stellt daher ein außerordentlich wirksames therapeutisches Mittel dar.Although the isolated, purified active substance has the calcitonin activity Maintains only about 10 days, the product obtained according to the invention is for the Medicine of considerable importance. This product is namely during this period of about 10 days a biologically active principle, its activity after no other Working method is achievable. The method according to the invention is the first an active ingredient made available, which lowers the plasma calcium level. This active ingredient is practically free from the compensating parathyroid hormone and provides therefore an extremely effective therapeutic agent.

Nach Wissen der Patentinhaberin gab es bisher kein Wirkstoffprinzip, welches die unerwünschte Nebenwirkung, nämlich langsam Calcium aus den Knochen zu entfernen und eine Osteoporosis zu bewirken, korrigiert.As far as the patent owner is aware, there has not yet been an active ingredient principle which is the unwanted side effect, namely calcium slowly from the bones too remove and cause osteoporosis, corrected.

Da, wie gesagt, der erfindungsgemäß erhaltene Wirkstoff nach einem anderen Verfahren nicht herstellbar ist, hat man mit der Erfindung ein therapeutisch wichtiges Problem gelöst. Beispiel 2 100m1 frisch entnommenes Blut von einem Menschen, Hund oder einem anderen Tier wird durch Zugabe von 0,5m1 Heparin ungerinnbar gemacht, und 1 bis 2 mg Calcium in Form von Calciumchlorid oder Calciumgluconat werden zugegeben, um den Plasmacalciumspiegel auf 12 bis 14 mg zu erhöhen. 20 ml dieses Blutes werden in ein großes Reagensglas übergeführt, das in ein Wasserbad bei 37°C eingebracht ist. Das Blut wird sachte gerührt, und es wird durch vorsichtiges Durchleiten von Sauerstoff mit Sauerstoff versorgt. Nebenschilddrüsen vom Hund, Rind oder einer anderen geeigneten Quelle werden rasch entnommen und mit einem Rasiermesser zu Scheiben von 1 bis 3 mm Dicke zerschnitten. Diese werden innerhalb von 5 Minuten in das Blut mit hohem Calciumgehalt eingebracht und mit diesem Blut 1 bis 2 Stunden inkubiert. Die Calcitoninaktivität findet sich in dem Plasma, das von den Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Die Ausbeute aus 10 bis 20 mg Hundenebenschilddrüsengewebe entspricht der aus mehreren Gramm frischen Rindernebenschilddrüsen erhaltenen.Since, as I said, the active ingredient obtained according to the invention after a If other processes cannot be produced, the invention provides a therapeutic one important problem solved. Example 2 100m1 freshly drawn blood from a human Dog or other animal is made incoagulable by adding 0.5m1 of heparin, and 1 to 2 mg calcium in the form of calcium chloride or calcium gluconate are added, to increase plasma calcium levels to 12-14 mg. 20 ml of this blood will be Transferred to a large test tube which was placed in a water bath at 37 ° C is. The blood is gently stirred, and by carefully passing it through Oxygen supplied with oxygen. Parathyroid glands from dogs, beef or one other suitable source are quickly removed and sliced with a razor cut from 1 to 3 mm thick. These will be in the blood within 5 minutes with a high calcium content and incubated with this blood for 1 to 2 hours. The calcitonin activity is found in the plasma removed from the cells by centrifugation is separated. The yield from 10 to 20 mg of canine parathyroid tissue is equivalent obtained from several grams of fresh bovine parathyroid glands.

Das gleiche Verfahren kann angewendet werden, um Parathormon zu erzeugen, wobei an Stelle der Zugabe von Calcium zu dem Blut eine Menge von Äthylendiamintetraessigsäure, die 1 bis 2 mg Calcium äquivalent ist, je 100 ml Gesamtblut zugegeben wird, um den Plasmacalciumspiegel um 2 bis 4 mg (auf 6 bis 8 mg) herabzusetzen. Beispiel 3 Man läßt einen Hund über Nacht hungern und anästhesiert ihn mit Nembutal. Die Schilddrüsen-Nebenschilddrüse wird chirurgisch freigelegt, und die Muskeläste der oberen Schilddrüsenarterie werden unterbunden und durchschnitten. Eine 100-ml-Probe von arteriellem Blut wird abgenommen, und 0,5 ml 1 °/oiges Heparin werden zur Verhinderung der Koagulation zugegeben. Hierzu werden 1 bis 2 mg Calcium in Form von Calciumchlorid oder Calciumgluconat zugesetzt, um den Plasmacalciurnspiegel um 2 bis 4 mg zu erhöhen. Das Blut wird durch ein Kunststoffrohr mittels einer Perfusionspumpe mit Geschwindigkeitsregelung (Sigmamotor Co. Modell TM-11) zu einer Kanüle geleitet, die in die Arteria carotis unterhalb des Ausgangs der oberen Schilddrüsenarterie eingesetzt und zu dieser hin gerichtet ist. Die Arteria carotis wird nun unterbunden und oberhalb des Austritts der oberen Schilddrüsenarterie durchtrennt, und alle Äste der letzteren, außer denjenigen zu der Schilddrüse und Nebenschilddrüse, werden unterbunden und durchtrennt. Die Drüsen werden aus dem Körper entfernt und in eine Perfusionskammer mit einem von warmem Wasser umströmten Mantel (37°C) eingebracht. Das aus den durchschnittenen Venen stammende Blut wird gesammelt und kontinuierlich zu dem Vorratsbehälter zurückgeführt und durch vorsichtiges Durchleiten von Sauerstoff' mit Sauerstoff' versehen. Die Perfusion wird 1 Stunde lang durchgeführt, und das Plasma, das die Calcitoninaktivität enthält, wird dann durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Aktivität ist nach Lagerung in einem Kühlschrank unverändert.The same procedure can be used to produce parathyroid hormone, wherein instead of adding calcium to the blood, an amount of ethylenediaminetetraacetic acid, which is equivalent to 1 to 2 mg calcium, per 100 ml of whole blood is added to the Decrease plasma calcium levels by 2 to 4 mg (to 6 to 8 mg). Example 3 Man starves a dog overnight and anesthetizes it with nembutal. The thyroid parathyroid is surgically exposed, and the muscle branches of the upper thyroid artery are exposed prevented and cut through. A 100 ml sample of arterial blood is drawn and 0.5 ml of 1% heparin are added to prevent coagulation. For this, 1 to 2 mg calcium in the form of calcium chloride or calcium gluconate added to increase plasma calcium levels by 2 to 4 mg. The blood will through a plastic tube using a perfusion pump with speed control (Sigmamotor Co. Model TM-11) to a cannula inserted into the carotid artery inserted below the exit of the upper thyroid artery and towards it is directed. The carotid artery is now tied off and above the outlet the upper thyroid artery severed, and all the branches of the latter except those to the thyroid and parathyroid glands, are ligated and severed. the Glands are removed from the body and placed in a perfusion chamber with one of warm water flowing around jacket (37 ° C) introduced. That from the intersected Blood derived from veins is collected and continuously returned to the reservoir and 'oxygenated' it by carefully bubbling oxygen through it. the Perfusion is carried out for 1 hour, and the plasma showing the calcitonin activity is then separated by centrifugation. The activity is after storage unchanged in a refrigerator.

Die gleiche Methode kann zur Herstellung von Parathormon angewendet werden, wenn an Stelle der Zugabe von Calcium zu dem Blut in dem Vorratsbehälter eine ausreichende Menge Äthylendiamintetraessigsäure, um 1 bis 2 mg Calcium als Chelat zu binden, zu 100 ml Blut in dem Vorratsbehälter zugegeben wird und so der Spiegel des nicht durch Äthylendiamintetraessigsäure gebundenen Calciums auf 6 bis 8 mg herabgesetzt wird. Prüfung der Calcitoninaktivität Das Versuchstier der Wahl ist ein Hund, den man fasten ließ, auf Grund der Stabilität des Plasmacalciumspiegels bei diesem Tier. Das Tier wird zumindest 4 Tage lang vor seiner Verwendung mit einer Diät mit niedrigem Calciumgehalt (0,04 °/o Ca) ernährt. Man läßt den Hund über Nacht hungern, anästhesiert ihn mit Nembutal und entnimmt Blutproben in Abständen von 15 Minuten für eine Kontrollzeit von einer Stunde. Die Plasmacalciumwerte sollten während dieser Zeitspanne nicht mehr als um 0,05 mg von dem Durchschnittswert für diese Kontrollzeit abweichen.The same method can be used to produce parathyroid hormone if instead of adding calcium to the blood in the reservoir a sufficient amount of ethylenediaminetetraacetic acid to contain 1 to 2 mg calcium To bind the chelate, add to 100 ml of blood in the reservoir and so on Level of calcium not bound by ethylenediaminetetraacetic acid to 6 to 8 mg is reduced. Testing of calcitonin activity The test animal of choice is a fasted dog due to stability in plasma calcium levels with this animal. The animal is treated with a for at least 4 days prior to use Diet with low calcium content (0.04% Ca) fed. The dog is left overnight starve, anesthetize him with Nembutal and take blood samples at intervals of 15 minutes for a control time of one hour. The plasma calcium levels should during this period not more than by 0.05 mg of the average value for this control time may differ.

Das Testmaterial wird intravenös injiziert, und Blutproben werden anschließend nach 10, 20, 30, 45, 60, 90 und 120 Minuten entnommen. Das Vorliegen von Calcitoninaktivität zeigt sich durch einen Abfall von zumindest 0,4 mg 20 Minuten nach Injektion des Testmaterials und einen Wiederanstieg in einen Bereich von 0,1 mg um den Kontrollplasmacalciumspiegel bei 60 Minuten. Wenn das Material mit Parathormon verunreinigt ist, so ist der Calciumspiegel in der 60-Minuten-Probe um zumindest 0,3 mg über den Kontrollspiegel erhöht und ist in der 90-Minuten-Probe noch höher.The test material is injected intravenously, and blood samples are taken then removed after 10, 20, 30, 45, 60, 90 and 120 minutes. The presence of calcitonin activity is shown by a decrease of at least 0.4 mg for 20 minutes after injection of the test material and an increase again to a range of 0.1 mg around the control plasma calcium level at 60 minutes. If the material with parathyroid hormone is contaminated, the calcium level in the 60-minute sample is at least around 0.3 mg increased above the control level and is even higher in the 90-minute sample.

Claims

Claims: 1. Method for obtaining the blood calcium level Depressing parathyroid hormone calcitonin, which is practically produced by parathyroid hormone is free from parathyroid glands, d a d u r c h characterized that one is the parathyroid tissue extracted with water at a pH between 6.5 and 7.5.

2. Procedure according to Claim 1, characterized in that the extract thus obtained is boiled, the the precipitate which separates out is filtered off and discarded, the filtrate obtained adjusts to pH 5.5 to 6.5 and isolates the calcitonin precipitate formed.

3. The method according to claim 2, characterized in that the calcitonin precipitate Dissolves in water from pH 6.5 to 7.5 and ethanol to a minimum concentration of 60% alcohol is added, the inert impurities which have precipitated are separated off and if necessary, the solution is mixed with 2 to 4 volumes of ether and the calcitonin precipitate isolated.

4. The method according to claim 1, characterized in that there is a perfusion of living parathyroid tissue with a physiologically usable fluid carries out, which contains 13 to 15 mg calcium per 100 ml, and this perfusion fluid separates from any solids.