DE1130558B

DE1130558B - Process for making a measles vaccine

Info

Publication number: DE1130558B
Application number: DEU6049A
Authority: DE
Inventors: Gerald Emerson Underwood; Samuel John Musser
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1958-03-14
Filing date: 1959-03-07
Publication date: 1962-05-30

Description

Verfahren zur Herstellung eines Masernimpfstoffes Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Masernimpfstoffes aus dem in Gewebekulturen gezüchteten Masernvirus (Rubeolavirus).Method of Making a Measles Vaccine The invention relates to a method of making a measles vaccine from the tissue culture cultured measles virus (rubeola virus).

Masern (Rubeola) ist eine der Infektionskrankheiten von Kindern. Der Virus ist sehr infektiös und nur etwa 1,00/0 der anfälligen Kinder, die mit dem Virus in Berührung kommen, werden von dieser Krankheit nicht befallen. Fast jeder Erwachsene ist vor dem 20. Lebensjahr von dieser Krankheit befallen worden. Die Masern sind in großen Gemeinschaften gewöhnlich endemisch, und große Epidemien treten etwa alle 3 Jahre auf. Measles (rubeola) is one of the infectious diseases affecting children. The virus is very infectious and only about 1.00 / 0 of the susceptible children who are with come into contact with the virus will not be affected by this disease. Nearly every adult has been affected by this disease before the age of 20. Measles is usually endemic in large communities, and epidemics are large occur about every 3 years.

Gewöhnlich ist die Prognose für Masernpatienten gut, jedoch sind sekundäre, bakterielle Komplikationen, wie z. B. Mittelohrentzündung und Bronchopneumonie, nicht selten. Andere weniger häufige, jedoch um so verheerendere Folgeerscheinungen sind Krämpfe, Meningitis serosa und Masernencephalitis. Nach einer amtlichen Schätzung tritt die Masernencephalitis in jeweils 400 bis 1000 Fällen von Masern einmal auf. Usually the prognosis for measles patients is good, however secondary, bacterial complications such as B. otitis media and bronchopneumonia, not infrequently. Other less common but more devastating sequelae are convulsions, serosa meningitis, and measles encephalitis. According to an official estimate measles encephalitis occurs once in every 400 to 1000 cases of measles.

Die einzigen prophylaktischen Mittel, die bisher als wirksame Mittel zur Bekämpfung der Krankheit angewandt wurden, waren das Gammaglobulin und das hyperimmune Masernantiserum. Diese waren jedoch nicht vollkommen zufriedenstellend. Man verfügte daher über kein zufriedenstellendes Schutzmittel gegen die regelmäßig sich wiederholenden Masernepidemien, die das Leben von Kindern und Kleinstkindern gefährden und unter denen auch andere anfällige Personen zu leiden haben, sowie gegen die schädlichen Nachwirkungen. The only prophylactic agents that have so far been considered effective agents The gamma globulin and the hyperimmune were used to fight the disease Measles antiserum. However, these were not entirely satisfactory. One decreed therefore no satisfactory means of protection against the regularly repeating ones Measles epidemics that endanger the lives of children and young children and under which other susceptible people suffer as well, as well as the harmful ones Aftermath.

Anfang der vierziger Jahre wurden große Anstrengungen unternommen, um einen Masernimpfstoff aus einem in Kükenembryos gezüchteten Virus zu entwickeln. Die Forscher versuchten, einen geschwächten Masernvirus durch Reiheneinführung in bereits Embryonen enthaltenden Eiern zu entwickeln. Es fehlte jedoch der überzeugende Beweis dafür, daß sich der Virus an das Wachstum in dem Kükenembryo angepaßt hatte, und eine gleichmäßige Fortpflanzung konnte nicht festgestellt werden. Die klinische Bewertung des erzielten Impfstoffs ergab, daß die damit geimpften Kinder nicht gegen den epidemischen Masernvirus geschützt werden, und bei einem hohen Prozentsatz der Versuchspersonen kam die Krankheit zur Entfaltung. In the early 1940s, great efforts were made to to develop a measles vaccine from a virus grown in chick embryos. The researchers tried to serialize a weakened measles virus in to develop eggs that already contain embryos. However, the convincing one was missing Evidence that the virus had adapted to growth in the chick embryo, and uniform propagation could not be established. The clinical Evaluation of the vaccine obtained showed that the children vaccinated with it were not against the epidemic measles virus will be protected, and at a high percentage of the The disease developed in test subjects.

Erst durch die neueren Anstrengungen zur Entwicklung eines Poliomyelitisimpfstoffs konnte die Gewebekulturtechnik so weit verbessert werden, daß es möglich ist, eine gleichmäßige Vermehrung des Masernvirus in lebenden Gewebekulturen von menschlichen Zellen zu erzielen. Auf Grund dieser Fortschritte in der Gewebekulturtechnik waren verschiedene Forscher in der Lage, den Masernvirus gleichmäßig in Gewebekulturen, z. B. menschlichen Nierenzellen, menschlichen Konjunktivalzellen, menschlichen Amnionzellen sowie HeLa-Zellen zu züchten. Außerdem wurde auch von einem unregelmäßigen Wachstum in Gewebekulturen von Affennierenzellen berichtet. Diese unsicheren Ergebnisse, die bei den letztgenannten Wirtszellen erzielt wurden, scheinen jedoch mit einer Störung durch zahlreiche latente Viren (cytopathogene Organismen, die in den Geweben von Affennieren gefunden wurden), z. B. solchen, die bei der Erzeugung des Poliomyelitisvirus erkannt wurden, in Zusammenhang zu stehen. Not until the recent efforts to develop a poliomyelitis vaccine the tissue culture technique could be improved to the point where it is possible to produce a uniform multiplication of measles virus in living tissue cultures of human Cells to achieve. Because of these advances in tissue culture technology were various researchers have been able to detect the measles virus uniformly in tissue cultures, z. Human kidney cells, human conjunctival cells, human amniotic cells as well as growing HeLa cells. It was also characterized by irregular growth reported in tissue cultures of monkey kidney cells. These uncertain results which were achieved with the latter host cells, however, appear to be with one Interference from numerous latent viruses (cytopathogenic organisms that exist in the tissues found from monkey kidneys), e.g. B. those involved in the generation of the poliomyelitis virus were recognized to be related.

Durch die Erfindung wird nun ein Masernimpfstoff geschaffen, der einen inaktivierten Masernvirus enthält, der die Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern in den Geweben anfälliger Personen anregt. Es wird ein Gewebekulturverfahren geschaffen, mit dem sich eine gleichmäßige und konsistente Vermehrung des Masernvirus in Kulturen von Affennierenzellen erzielen läßt. Zur Gewinnung des Masernvirus aus Gewebekulturen wird ein bekanntes Verfahren verwandt, bei welchem der gewonnene Virus im wesentlichen frei von Serumeiweiß und Zelltrümmern ist. Zwecks Inaktivierung des Masernvirus wird sein Infektionsvermögen zerstört, seine Antigenwirkung jedoch erhalten. The invention now provides a measles vaccine which an inactivated measles virus containing the generation of neutralizing Stimulates antibodies in the tissues of susceptible individuals. It becomes a tissue culture procedure created, with which an even and consistent reproduction of the measles virus can be achieved in cultures of monkey kidney cells. To extract the measles virus from Tissue culture is a known method used in which the obtained Virus is essentially free of serum protein and cell debris. For inactivation of Measles virus destroys its ability to infect, but preserves its antigenic effect.

Erfindungsgemäß wird der Masernvirus in Kulturen von Nierenzellen von Affen, die im wesentlichen frei von latenten Viren sind, gezüchtet, anschließend der Virus in bekannter Weise in einem proteinfreien, parenteral annehmbaren Träger gewonnen und die Virussuspension der Wirkung chemischer und/oder physikalischer Mittel ausgesetzt, wodurch die infektiösen Eigenschaften des Virus zerstört werden, die Antigenwirkung jedoch unverändert bleibt. According to the invention, the measles virus is found in cultures of kidney cells bred by monkeys that are essentially free of latent viruses, then the virus in a known manner in a protein-free, parenterally acceptable carrier obtained and the virus suspension of the effect chemical and / or physical Exposed to agents, thereby destroying the infectious properties of the virus, however, the antigenic effect remains unchanged.

Der Edmonstonstamm des Masernvirus, der bei der Herstellung des neuen Impfstoffs verwendet worden ist, wurde aus dem Laboratorium von Dr. John F. Enders in der Harvard Medical School erworben. Bei der Gewinnung hatte der Virus 23mal hintereinander Kulturen von menschlichen Nierenzellen passiert. Der Virus wurde seitdem in Kulturen von menschlichen Nierenzellen (bei zwei Reiheneinführungen), in Kulturen von menschlichen Amnionzellen (bei vier Reiheneinführungen) und schließlich in Gewebekulturen von Affennierenzellen (bei fünf Reiheneinführungen) gezüchtet. The Edmonston strain of measles virus that was used in making the new Vaccine was used was taken from the laboratory of Dr. John F. Enders at Harvard Medical School. When recovered, the virus had 23 times cultures of human kidney cells happened one after the other. The virus was since then in cultures of human kidney cells (with two series introductions), in cultures of human amnion cells (with four serial introductions) and finally grown in tissue cultures of monkey kidney cells (at five series introductions).

Die Züchtung des Virus vom Edmonstonstamm in Kulturen von menschlichen Zellen ist zwar bekannt, die technische Herstellung des Impfstoffs aus diesem Virus ist jedoch sowohl ekelerregend wie auch unpraktisch. Ferner kann es hierbei zu unerwünschten Sensibilisierungsreaktionen kommen, und ebenso besteht die Möglichkeit einer Verunreinigung des Impfstoffs durch menschliche Viren. Alle Anstrengungen wurden daher auf das schwierige Problem der Züchtung des Masernvirus in Kulturen von Affennierenzellen gerichtet. Growing the Edmonston strain virus in cultures of human Cells are known to technically manufacture the vaccine from this virus however, it is both nauseating and impractical. It can also be undesirable Sensitization reactions occur and there is also the possibility of contamination of the vaccine by human viruses. All efforts were therefore directed towards the difficult problem of growing measles virus in cultures of monkey kidney cells directed.

Die erfolgreiche Züchtung des Poliomyelitisvirus in Kulturen von Affennierenzellen gab die Anregung, den Masernvirus ebenfalls in diesen Wirtszellen zu erzeugen. Es liegen sogar Berichte darüber vor, daß Nierengewebe gewisser Affenarten das Wachstum des Virus fördern. Wiederholte Versuche, den Edmonstonstamm des Masernvirus in Kulturen von Affennierenzellen zu züchten, waren jedoch infolge der störenden Tätigkeit latenter Viren im Körper der vorhandenen Rhesus- und Cynomolgusaffen erfolglos. Successful breeding of the poliomyelitis virus in cultures of Monkey kidney cells stimulated the measles virus in these host cells as well to create. There have even been reports that kidney tissue from certain species of monkeys promote the growth of the virus. Repeated attempts to find the Edmonston strain of measles virus to grow in cultures of monkey kidney cells, however, were due to the interfering Activity of latent viruses in the body of the existing rhesus and cynomolgus monkeys unsuccessful.

Es ist bekannt, daß zahlreiche latente Viren in Verbindung mit der technischen Herstellung des Poliolmyelitisvirus isoliert und gekennzeichnet wurden. Ihre Anwesenheit in den Gewebekulturen hat jedoch die Vermehrung des Poliomyelitisvirus nicht ernsthaft beeinträchtigt, da dieser Virus innerhalb einer kurzen Zeit eine dominante Infektion in den Kulturen aus Affennierenzellen verursacht. Dagegen zeigte es sich, daß der Masernvirus erst 4 bis 6 Tage nach der Impfung eine dominante Infektion in Kulturen von Affennierenzellen hervorruft. Gerade in dieser kritischen Zeit können sich leicht latente Affenviren entwickeln und die Erzeugung reiner Masernviruskulturen beeinträchtigen. It is known that numerous latent viruses are associated with the technical production of poliol myelitis virus were isolated and labeled. However, their presence in the tissue cultures has contributed to the proliferation of the poliomyelitis virus not seriously affected as this virus has a short period of time caused dominant infection in monkey kidney cell cultures. Against it showed It turns out that the measles virus does not become a dominant infection until 4 to 6 days after vaccination in cultures of monkey kidney cells. Especially in this critical time you can latent simian viruses easily develop and the production of pure measles virus cultures affect.

Es wurden daher Bemühungen darauf gerichtet, »reine« Rhesus-(Macaca rhesus) oder Cynomolgus-(Macaca cynomolgus) Affen zu beschaffen, d. h. Efforts have therefore been directed to "pure" rhesus (Macaca rhesus) or cynomolgus (Macaca cynomolgus) monkeys, d. H.

Affen, die im wesentlichen frei von latenten Viren sind, oder Affenarten ausfindig zu machen, bei denen diese bekannten latenten Virusinfektionen so gut wie nicht auftreten. Es wurde gefunden, daß die Nierenzellen von afrikanischen Vervetaffen (Cerco- pithecus lalandi) eine geeignete Wirtszelle für die Vermehrung des Masernvirus liefern. Bisher wurde bei den vielen Versuchen nur ein einziges Mal ein latenter Virus in Kulturen von Nierenzellen dieser Affen angetroffen, und daher sind die Nierenzellen dieser Affenart, d. h. der Vervetaffen, die bevorzugten Wirtszellen für das erfindungsgemäße Verfahren. Es können aber auch andere Affenarten, wie Rhesusaffen, Cynomolgusaffen, Totenkopfäffchen (Crysothrix sp.), oder auch Schimpansen, Paviane, verwendet werden, wenn diese im wesentlichen frei von latenten Viren sind.Monkeys that are essentially free of latent viruses or species of monkeys track down those known latent viral infections as well like not occurring. It has been found that the kidney cells of African vervet monkeys (Cerco- pithecus lalandi) a suitable host cell for the multiplication of the measles virus deliver. So far, in the many attempts, a latent one has only emerged once Virus found in cultures of kidney cells from these monkeys, and therefore the Kidney cells of this species of monkey, d. H. the vervet monkeys, the preferred host cells for the method according to the invention. But other species of monkeys, such as rhesus monkeys, Cynomolgus monkeys, squirrel monkeys (Crysothrix sp.), Or also chimpanzees, baboons, can be used if they are essentially free of latent viruses.

Der Masernvirus kann nach jedem geeigneten Gewebekulturverfahren gezüchtet werden, z. B. nach der Maitlandgewebekulturmethode, in submersen Kulturen von suspendierten Zellen oder in Glaszellkulturen. Im allgemeinen wird das letztgenannte Verfahren bevorzugt, wie es z. B. in »Journ. Exptl. Measles virus can be infected by any suitable tissue culture technique be bred, e.g. B. by the Maitland tissue culture method, in submerged cultures from suspended cells or in glass cell cultures. In general, the latter will be Method preferred as it is, for. B. in »Journ. Exptl.

Med., 99, S. 167 bis 182 (1954)« beschrieben ist.Med., 99, pp. 167 to 182 (1954) ".

Modifikationen dieses Verfahrens sind in »Proc. Soc.Modifications of this procedure are in "Proc. Soc.

Exptl. Biol. Med., 85, S. 202 (1954« beschrieben.Exptl. Biol. Med., 85, p. 202 (1954 ”).

Nach dem in der vorstehenden Literatur beschriebenen Verfahren werden Suspensionen von Affennierenzellen in einem Nährmedium hergestellt und durch Zellzählung standardisiert. Die Konzentration der Nierenzellen in der Stammsuspension kann weitgehend variieren, z. B. zwischen etwa 100000 und 5 000 000 Zellen je Kubikzentimeter, sie liegen vorzugsweise zwischen etwa 250000 und 1 000 000 Zellen je Kubikzentimeter Lösung. According to the procedure described in the literature above Suspensions of monkey kidney cells are prepared in a nutrient medium and counted by cells standardized. The concentration of kidney cells in the stock suspension can largely be vary, e.g. B. between about 100,000 and 5,000,000 cells per cubic centimeter, they are preferably between about 250,000 and 1,000,000 cells per cubic centimeter Solution.

Es wurde gefunden, daß sich eine ausreichende Vermehrung des Masernvirus erzielen läßt, wenn der Virus auf feststehende Kulturen von Affennierenzellen geimpft oder wenn eine Stammsuspension von Zellen in einem Nährmedium mit dem Virus geimpft wird. Bei dem erstgenannten Verfahren wird das Masernimpfmaterial etwa am fünften bis siebten Tag der Inkubationszeit in die Zellkulturen eingeführt, nach welcher Zeit sich ziemlich kontinuierliche Zellschichten gebildet haben. Bei dem zweiten Züchtungsverfahren wird das Impfmaterial mit der Stammsuspension der Nierenzellen im Nährmedium vermischt. Es wurde festgestellt, daß sich die Zellen entwickeln und gewöhnlich kontinuierliche Schichten bilden, bevor die Virusinfektion zu einem begrenzenden Faktor der Zellvermehrung wird. It has been found that there is sufficient replication of the measles virus can be achieved when the virus is inoculated on fixed cultures of monkey kidney cells or when a stock suspension of cells in a nutrient medium is inoculated with the virus will. In the former procedure, the measles inoculum is about the fifth introduced into the cell cultures until the seventh day of the incubation period, after which Fairly continuous layers of cells have formed over time. The second Cultivation method is the inoculum with the stock suspension of kidney cells mixed in the nutrient medium. The cells were found to develop and usually continuous layers form before the viral infection becomes a limiting one Cell multiplication factor.

Die Zellkulturen können mit verschiedenen Mengen des infektiösen Masernvirus geimpft werden. The cell cultures can contain different amounts of the infectious Measles virus vaccinated.

Werden niedrige Konzentrationen Impfvirus verwendet, so kann die Inkubationszeit verlängert und der höchst erzielbare Virustiter herabgesetzt werden.If low concentrations of the vaccine virus are used, the incubation period can extended and the highest achievable virus titer reduced.

Die Verwendung höherer Impfkonzentrationen dagegen führt zu kürzeren Inkubationszeiten und zu einem höheren maximalen Virustiter. So ergab z. B. die Impfung von Affennierenzellkulturen bei einem Virus- Zellen-Verhältnis von 1: 200, d. h. ein GKIDso (mittlere Gewebekulturinfektionsdosis) Virus je 200 Zellen in der Kultur, am elften Tage nach der Infektion einen Titer von 105e4 GKIDso je Kubikzentimeter, während die Impfung bei Verwendung eines Virus-Zellen-Verhältnisses von 1: 20 000 am fünfzehnten Tage nach der Infektion einen Titer von Maximum 104s4 GKIDso ergab.The use of higher vaccine concentrations, on the other hand, leads to shorter ones Incubation times and a higher maximum virus titer. So z. B. the Inoculation of monkey kidney cell cultures with a virus-cell ratio of 1: 200, d. H. one GKIDso (mean tissue culture infection dose) virus per 200 cells in the Culture, on the eleventh day after infection, a titer of 105e4 GKIDs per cubic centimeter, while vaccination using a virus to cell ratio of 1: 20,000 gave a titer of maximum 104s4 GKIDso on the fifteenth day after infection.

Gewöhnlich kann das Virus-Zellen-Verhältnis zwischen einer oberen Grenze von etwa 10 : 1 und einer unteren Grenze von etwa 1 : 20 000 variieren.Usually the virus-cell ratio can be between an upper Limit of about 10: 1 and a lower limit of about 1: 20,000.

Ein bevorzugter Bereich ist etwa 1:100 bis 1:1000.A preferred range is about 1: 100 to 1: 1000.

Da die Stoffwechselprodukte der Zellen sauer sind, wird der pu-Wert der Stammsuspension zweckmäßig neutral oder leicht alkalisch eingestellt, und das Medium, das zwar gepuffert ist, kann dann nach und nach auf einen niedrigeren pn-Wert abgleiten. Since the metabolic products of the cells are acidic, the pu value becomes the stock suspension expediently adjusted to neutral or slightly alkaline, and that Medium that is buffered can then gradually decrease to a lower pn value slide off.

Vorzugsweise wird das Nährmedium genügend oft (z. B. alle 3 bis 4Tage) ausgewechselt, um eine wesentliche Verschiebung des pu-Wertes zu verhindern, da eine solche das Zellwachstum und die Zellfunktion beeinträchtigt. The nutrient medium is preferably used sufficiently often (e.g. every 3 to 4 days) replaced in order to prevent a significant shift in the pu value because such impaired cell growth and function.

Für die Züchtung der Affennierenzellen kann zwar jedes beliebige komplette Gewebekulturnährmedium, wie z. B. Medium 199 (Morgan, Morton und Parker, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 73, S. 1 bis 8 [1950]), Eagle's Medium (Eagle, Science, 122, S. 501 [1955]), Medium NCTC 107 (Evans u. a., Cancer Research, 16, 77 [19563) u. dgl., verwendet werden; es hat sich jedoch gezeigt, daß es für die Zellvermehrung vorteilhaft ist, wenn man dem künstlichen Gewebekulturnährmedium etwa 5 bis 10 Volumprozent eines filtrierten Säugetierserums einverleibt. Für diesen Zweck eignen sich z. B. For the cultivation of the monkey kidney cells, any one can be used complete tissue culture medium, e.g. B. Medium 199 (Morgan, Morton and Parker, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 73, pp. 1 to 8 [1950]), Eagle's Medium (Eagle, Science, 122, p. 501 [1955]), Medium NCTC 107 (Evans et al., Cancer Research, 16, 77 [19563) and the like, can be used; however, it has been shown to be essential for cell reproduction It is advantageous if about 5 to 10 percent by volume are added to the artificial tissue culture medium incorporated into a filtered mammalian serum. For this purpose z. B.

Rinderserum, vorzugsweise Kalbserum oder Pferdeserum, die beide leicht erhältlich sind. Die Inkubationszellkulturen werden zweckmäßig etwa 5 bis 12 Tage lang, bevor sie geerntet werden, auf einer Temperatur von etwa 25 bis 400 C, vorzugsweise bei etwa 32 bis 380 C, gehalten. Beef serum, preferably calf serum or horse serum, both of which are light are available. The incubation cell cultures are expediently about 5 to 12 days long before they are harvested, at a temperature of about 25 to 400 C, preferably at about 32 to 380 ° C.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Virusernte in der Weise, daß man das Nährmedium, das zweckmäßig ein Säugetierserum enthält, durch ein parenteral annehmbares Vehikel, z. B. Medium 199, Eagle's Medium, Medium NCTC 107 u. dgl., ersetzt. Das Serum braucht diesen Medien selbstverständlich nicht hinzugefügt zu werden, wenn letztere selbst als parenteral annehmbarer Träger verwendet werden sollen. Die aus den infizierten Zellen freigesetzten Virusteilchen sammeln sich in der parenteral annehmbaren Trägerflüssigkeit, die anschließend aus dem System entfernt und für die nächste Ernte durch eine neue Trägerflüssigkeit ersetzt wird. Die Ernte kann in Abständen, z. B. alle 8 oder 12 Stunden oder auch täglich erfolgen, bis keine lebenden Zellen mehr in den Kulturen sind. According to the method according to the invention, the virus is harvested in the Way that you the nutrient medium, which appropriately contains a mammalian serum, through a parenterally acceptable vehicle, e.g. B. Medium 199, Eagle's Medium, Medium NCTC 107 and the like. Of course, the serum does not need to be added to these media when the latter itself is used as a parenterally acceptable carrier should. The virus particles released from the infected cells collect in the parenterally acceptable carrier fluid, which is subsequently removed from the system removed and replaced with a new carrier liquid for the next harvest. The harvest can take place at intervals, e.g. B. take place every 8 or 12 hours or even daily, until there are no more living cells in the cultures.

Das Gewebekulturmedium 199 erwies sich als ein besonders geeignetes Erntemedium, jedoch können auch andere Nährmedien, die sich zur Injektion in den menschlichen Körper eignen, verwendet werden. Tissue culture medium 199 was found to be particularly useful Harvest medium, however, can also contain other nutrient media suitable for injection into the human body are suitable to be used.

Nach der Ernte können die in der Trägerflüssigkeit enthaltenen Zelltrümmer, z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren, entfernt werden. Für diesen Zweck eignen sich z. B. nichtrostende Stahlfilter mit einer maximalen Porengröße von 5 bis 10 p. After the harvest, the cell debris contained in the carrier fluid, z. B. by centrifugation or filtration, can be removed. Suitable for this purpose z. B. stainless steel filters with a maximum pore size of 5 to 10 p.

Nachdem der Masernvirus aus den Affennieren-Zellkulturen gewonnen und die betreffenden Zelltrümmer entfernt wurden, muß die Virussuspension einer Behandlung unterworfen werden, um den Virus nichtinfektiös zu machen. Die Inaktivierung des Virus kann nach bekannten Verfahren erfolgen. After the measles virus is obtained from the monkey kidney cell cultures and the cell debris in question has been removed, the virus suspension must have a Treatment must be given to make the virus non-infectious. The inactivation of the virus can be carried out according to known methods.

Zur Erzielung eines zuverlässigen und wirksamen Impfstoffs ist es jedoch erforderlich, daß der Virus vollkommen inaktiviert wird und die Antigenwirkung des Virus unverändert bleibt oder nicht wesentlich vermindert wird. Zur Inaktivierung des Masernvirus eignen sich eine Reihe bekannter chemischer Mittel, wie Formaldehyd, ß-Propiolacton, Senfgas oder Chlor. Eine bevorzugte Art der Inaktivierung besteht in der Anwendung von physikalischer Energie, z. B. in Form von Wärme oder ionisierender oder nichtionisierender Strahlung.In order to obtain a reliable and effective vaccine it is however, required that the virus be completely inactivated and the antigenic action of the virus remains unchanged or is not significantly reduced. For inactivation of the measles virus, a number of well-known chemical agents are suitable, such as formaldehyde, ß-propiolactone, mustard gas or chlorine. There is a preferred type of inactivation in the application of physical Energy, e.g. B. in the form of heat or ionizing or non-ionizing radiation.

Der Masernvirus kann durch Erhitzen der Virussuspension inaktiviert werden. Eine Selbstinaktivierung tritt mit gewöhnlichen Temperaturen, z. B. 10 bis 500 C ein, wenn der Virus genügend lange erhitzt wird. Überraschenderweise werden die antigenen Eigenschaften des Masernvirus durch diese Wärmeinaktivierung jedoch nicht ernsthaft verschlechtert. The measles virus can be inactivated by heating the virus suspension will. Self-inactivation occurs at ordinary temperatures, e.g. B. 10 to 500 C if the virus is heated long enough. Surprisingly be however, the antigenic properties of the measles virus through this inactivation of heat not seriously deteriorated.

So wurden beispielsweise brauchbare Impfstoffe erzielt, wenn man die Virussuspensionen 200 Stunden auf 25° C, 75 Stunden auf 37° C und 30 Stunden auf 45° C erhitzte. Die Wirksamkeit dieser Impfstoffe wurde durch die Erzielung einer zufriedenstellenden Antigenwirkung bei Meerschweinchen bestätigt. Die bakteriellen und mykotischen Verunreinigungen des Impfstoffes sind jedoch, insbesondere bei niedrigeren Temperaturen, etwas unter Kontrolle zu halten. Zur Vermeidung eines etwaigen Bakterien- oder Pilzwachstums verleibt man dem Impfstoff daher ein geeignetes Mittel ein, z. B. Penicillin, Streptomycin, Mycostätin, Oxybenzoesäuremethylester, Oxybenzoesäurepropylester (»Methylparaben«, »Propylparaben«) oder Gemische davon.For example, useful vaccines have been obtained by using the Virus suspensions for 200 hours at 25 ° C, 75 hours at 37 ° C and 30 hours 45 ° C heated. The effectiveness of these vaccines was achieved by obtaining a confirmed satisfactory antigenic activity in guinea pigs. The bacterial and mycotic contaminants of the vaccine are, however, especially at lower levels Temperatures to keep something under control. To avoid any bacterial or fungal growth, a suitable agent is therefore incorporated into the vaccine, e.g. B. penicillin, streptomycin, mycostatin, methyl oxybenzoate, propyl oxybenzoate (»Methyl paraben«, »propyl paraben«) or mixtures thereof.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Virus mittels ionisierender Strahlen, z. B. Kathodenstrahlen, Betastrahlen, Gammastrahlen, Protonen und Alphateilchen,inaktiviert. Diese Formen physikalischer Energie sind ein wirksames Mittel zur Inaktivierung des Masernvirus, da die Menge der absorbierten Energie leicht reguliert und ihre Wirkung auf die gewünschte Einwirkungszeit begrenzt werden kann. Es erfolgt also keine fortlaufende Zersetzung wie bei chemischen Mitteln. Gleichzeitig werden etwa in der Suspension vorhandene Bakterien und Schimmelpilze abgetötet. In a preferred embodiment, the virus is ionized by means of Rays, e.g. B. cathode rays, beta rays, gamma rays, protons and alpha particles, inactivated. These forms of physical energy are powerful means of inactivation of the measles virus as the amount of energy absorbed is easily regulated and their Effect can be limited to the desired exposure time. So it happens no continuous decomposition as with chemical agents. At the same time be about Bacteria and mold present in the suspension are killed.

Die inaktivierten Virusimpfstoffe nach der Erfindung wurden z. B. in der Weise erfolgreich hergestellt, daß man Suspensionen des Masernvirus mit energiereichen Elektronenstrahlen behandelte. Geeignete energiereiche Elektronenstrahlen können z. B. durch verschiedene Arten von Elektronenbeschleunigern, z. B. durch ein Betatron, Capacitron, erzeugt werden. So wurden erfindungsgemäße Impfstoffe beispielsweise unter Verwendung eines durch einen Van-de-Graaff-Generator erzeugten Elektronenstrahlbündels mit einer mittleren Teilchenenergie von etwa 2,0 106 eV hergestellt. Zur Inaktivierung des Masernvirus wurden Dosierungen von 5,0 104 bis zu 8,0 106 reps angewendet. Brauchbare Impfstoffe wurden bei einer Strahlungsintensität erzielt, die das fünf- bis zehnfache der Intensität beträgt, die alle lebenden Viren vernichtet. Die Kathodenstrahleninaktivierung erlaubt daher eine über das gewünschte Maß hinaus gehende Inaktivierung, ohne daß ein wesentlicher Verlust an Antigenwirkung eintritt. Es ist zu bemerken, daß selbstverständlich auch höhere oder niedrigere Strahlungsdosierungen als die obenerwähnten angewendet werden können je nach den bei der Durchführung der Inaktivierung vorliegenden Bedingungen. Als eine dieser variablen Bedingungen ist der physikalische Zustand des Virus zu erwähnen, d. h. ob er als flüssige Suspension, als gefrorene Suspension oder. in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt, oder ob er in Klumpen vorhanden ist oder sich in geschlossenen Behältern. z. B. aus Glas oder einem plastischen Material z. B. The inactivated virus vaccines according to the invention have been e.g. B. Successfully prepared in such a way that suspensions of the measles virus with high energy Electron beams treated. Suitable high-energy electron beams can z. B. by various types of electron accelerators, e.g. B. by a betatron, Capacitron. For example, vaccines according to the invention have been made using an electron beam generated by a Van de Graaff generator with a mean particle energy of about 2.0 106 eV. For inactivation of measles virus, dosages of 5.0 104 up to 8.0 106 reps were used. Useful Vaccines were obtained at levels of radiation five to ten times that the intensity that destroys all living viruses. The cathode ray inactivation therefore allows an inactivation beyond the desired level without there is a substantial loss of antigenic activity. It should be noted that of course higher or lower radiation doses than those mentioned above are also used depending on the conditions prevailing when the inactivation is carried out. One of these variable conditions is the physical state of the virus too mention d. H. whether it is as a liquid suspension, as a frozen suspension or. in Is in the form of a lyophilized powder, or whether it is in lumps or in closed containers. z. B. made of glass or a plastic material z. B.

Polyäthylen von geringer Dichte, befindet.Low density polyethylene.

Ein weiterer Vorteil der Inaktivierung mittels Kathodenstrahlen besteht darin, daß alle Arten von verunreinigenden Bakterien oder Schimmelpilzen bei dieser Behandlung zerstört werden, wodurch etwaige aus diesen Quellen stammende Verunreinigungen ferngehalten werden. Die Inaktivierung mittels Kathodenstrahlen kann bei in flüssigem, gefrorenem oder lyophilisiertem Zustand vorliegenden Virussuspensionen durchgeführt werden. Die beiden letzten Zustandsformen erfordern jedoch eine etwas höhere Strahlungsintensität, um eine vollständige Inaktivierung zu erzielen. Another advantage of inactivation by means of cathode rays is there in that all kinds of contaminating bacteria or molds in this Treatment will be destroyed, eliminating any contamination from these sources be kept away. Inactivation by means of cathode rays can occur in liquid, virus suspensions present in the frozen or lyophilized state will. The last two forms of state, however, require a slightly higher radiation intensity, to achieve complete inactivation.

Für die erfindungsgemäße Inaktivierung kann jede beliebige Betastrahlenquelle mit Energien von mehr als etwa 5,0 105 eV verwendet werden. Dies bedeutet, daß eine Quelle von energieschwachen Elektronen bei einer dünnen Schicht der Virussuspension so lange angewendet werden kann, daß der gleiche Inaktivierungsgrad erzielt wird, wie er mit den energiereichen Elektronen in einer verhältnismäßig kürzeren Zeit erzielt wird. Any beta radiation source can be used for the inactivation according to the invention with energies greater than about 5.0 105 eV can be used. This means that a Source of low-energy electrons in a thin layer of the virus suspension can be used so long that the same degree of inactivation is achieved, like him with the energetic electrons in a relatively shorter time is achieved.

Außer den Kathodenstrahlen können auch andere Formen von ionisierender Strahlung verwendet werden. Es kann auch nichtionisierende Strahlung, z. B. Ultraviolettstrahlung, angewendet werden. Auch eine Kombination teilweiser Inaktivierungen mit den vorgenannten Strahlungsarten kann durchgeführt werden, um den erfindungsgemäßen Gesamtinaktivierungsgrad zu ergeben. Besides the cathode rays, other forms of ionizing can also be used Radiation can be used. It can also be non-ionizing radiation, e.g. B. Ultraviolet Radiation, be applied. Also a combination of partial inactivations with the aforementioned Radiation modes can be carried out to achieve the total degree of inactivation according to the invention to surrender.

Die Zugabe eines Schutzmittels (oder einer Kombination von Schutzmitteln) zu dem fertigen Impfstoffprodukt ist sehr zweckmäßig, insbesondere wenn das Produkt in Mehrfachdosisbehältern verpackt wird. Beispiele geeigneter Schutzmittel sind Oxybenzoesäuremethylester, Oxybenzoesäurepropylester, Benzäthoniumchlorid, Natriumäthylmercurithiosalicylat (»Merthiolat«). The addition of a protective agent (or a combination of protective agents) to the finished vaccine product is very useful, especially if the product is packaged in multi-dose containers. Examples of suitable protective agents are Methyl oxybenzoate, propyl oxybenzoate, benzethonium chloride, sodium ethyl mercurithio salicylate ("Merthiolate").

Der neue Masernimpfstoff ist zuverlässig und wirksam, wenn er anfälligen Personen verabreicht wird. Er kann in Verbindung mit den drei Pflichtimpfstoffen des Kindesalters, nämlich dem Keuchhusten-, Tetanus- und Diphtherieimpfstoff, oder auch in Verbindung mit anderen Impfstoffen, wie dem Salk-Polioimpfstoff, verabreicht werden. The new measles vaccine is reliable and effective when prone to it Is administered to people. It can be used in conjunction with the three mandatory vaccines of childhood, namely whooping cough, tetanus and diphtheria vaccine, or also given in conjunction with other vaccines, such as the Salk polio vaccine will.

Beispiel 1 Züchtung des Masernvirus in Affennierenzellkulturen Einem afrikanischen Vervetaffen wurden die Nieren herausgenommen. Die Nebennieren und Kapseln wurden abgezogen und die Hiliusstrukturen herausgeschnitten und weggeworfen. Die Rindensubstanz der beiden Nieren wurde zerschnitten und die Stücke dreimal mit Hanks' Salzlösung (BSS) (Hanks, Jour. Cell. Comp. Physiol., 31, S. 235 [1948]), die 100 Einheiten Penicillin, 100 mcg Streptomycin und 40 Einheiten Mycostatin je Kubikzentimeter Lösung enthielt, gewaschen, um das Blut zu entfernen. (Der Einfachheit halber wird diese BSS-Lösung in der nachfolgenden Beschreibung als BSSa bezeichnet.) Die gewaschenen Stücke wurden dann dreimal mit jeweils 75 ccm frischer 0,250/0iger Trypsinlösung (die durch Lösen von 0,25 g Trypsinpulver mit einer Wirksamkeit von 1: 250 in 100 com BSSa hergestellt wurde) 15 Minuten bei 370 C digeriert. Nach jeder Digerierung wurde die überstehende Flüssigkeit, die die Zellen in Suspension enthielt, aufbewahrt. Die mit Trypsin digerierten Stücke wurden in einem Eisbad auf etwa 0 bis 4" C gekühlt und durch ein Käsetuch filtriert. Das Filtrat wurde 30 Minuten bei 200 U/min zentrifugiert und die absedimentierten Zellen zweimal mit je 100 ccm BSSa gewaschen. Example 1 Cultivation of measles virus in monkey kidney cell cultures African vervet monkeys had their kidneys removed. The adrenal glands and Capsules were peeled off and the hilum structures excised and discarded. The cortical substance of the two kidneys was cut up and the pieces with it three times Hanks' saline solution (BSS) (Hanks, Jour. Cell. Comp. Physiol., 31, p. 235 [1948]), the 100 units of penicillin, 100 mcg of streptomycin and 40 units of mycostatin each Cubic centimeters of solution was washed to remove the blood. (The simplicity this BSS solution is referred to as BSSa in the following description.) The washed pieces were then three times with 75 ccm of fresh 0.250 / 0iger Trypsin solution (obtained by dissolving 0.25 g of trypsin powder with an effectiveness of 1: 250 in 100 com BSSa) digested at 370 C for 15 minutes. After every Digestion was the supernatant fluid that made the cells in suspension contained kept. The trypsin digested pieces were brought to about 0 in an ice bath Chilled to 4 "C and filtered through cheesecloth. The filtrate was left for 30 minutes centrifuged at 200 rpm and the cells which have settled out twice with 100 ccm each time BSSa washed.

Die Zellen wurden dann in 100 Raumteilen Nährmedium dispergiert und in Portionen von je 60 ccm in Rouxflaschen gebracht. Das Nährmedium bestand aus BSS, das 5 Volumprozent Pferdeserum und 0,5 Volumprozent Lactalbuminhydrolysat enthielt. Das Medium wurde mit Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und durch einen 03 Selas-Filter filtriert. Die in den Rouxflaschen befindlichen Nierenzellkulturen wurden 4 Tage bei 37"C ohne Rühren inkubiert, wonach das Nährmedium durch frisches Medium ersetzt wurde. Nach 3 Tagen (einer Gesamtinkubationszeit von 1 Woche) wurde das Medium nochmals gewechselt, und 2 ccm einer 104 5 GKIDSO-Masernvirussuspension je Kubikzentimeter wurden in jede Flasche gegeben. Die Inkubation der mit dem Virus geimpften Kulturen wurde 4 Tage bei 37° C fortgesetzt, in welcher Zeit sich Klumpen von mehrkernigen Riesenzellen gebildet hatten (diese Flächen entarteten mit der Ausbreitung der Infektion zu Plaques von nekrotischen Zellen). Sämtliche Spuren Serum wurden durch dreimaliges Waschen mit jeweils 40 ccm BSSa aus den Kulturen entfernt. Zu dieser Zeit waren die Innenflächen der Rouxflaschen mit einer nahezu festen Zellschicht überzogen. Die einzelnen Flaschen wurden jeweils mit 60 ccm Medium 199 beschickt und 24 Stunden bei 37t C inkubiert. Das Medium 199 wurde dann gewonnen und in einem Kühlschrank aufbewahrt. In jede Flasche wurden dann 60 ccm frisches Medium 199 gegeben. Nach sieben solcher Tagesernten war die Kultur frei von lebenden Zellen und nicht mehr brauchbar. Die Tagesernten wurden vereinigt und 45 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit enthielt (bei HeLa-Zellenversuchen) 104fix GKIDso Masernvirus je Kubikzentimeter. Sie wurde auf einen pH-Wert von 7,1 eingestellt und in Serumflaschen verschlossen. The cells were then dispersed in 100 parts by volume of nutrient medium and brought in portions of 60 cc each in Roux bottles. The nutrient medium consisted of BSS containing 5 volume percent horse serum and 0.5 volume percent lactalbumin hydrolyzate. The medium was adjusted to pH 7.3 with sodium bicarbonate and filtered through an 03 Selas filter. The kidney cell cultures in the Roux bottles were incubated for 4 days at 37 "C without stirring, after which the nutrient medium by fresh Medium has been replaced. After 3 days (a total incubation time of 1 week) was the medium changed again, and 2 cc of a 104 5 GKIDSO measles virus suspension per cubic centimeter were added to each bottle. Incubation with the virus inoculated cultures were continued for 4 days at 37 ° C, during which time clumps formed of multinucleated giant cells (these surfaces degenerated with the Spread of infection to plaques of necrotic cells). All traces Serum were obtained from the cultures by washing three times with 40 cc BSSa each time removed. At that time, the inner surfaces of the Roux bottles were nearly with one solid cell layer coated. The individual bottles were each filled with 60 cc medium 199 and incubated at 37 ° C for 24 hours. Medium 199 was then collected and stored in a refrigerator. Each bottle was then filled with 60 cc Medium 199 given. After seven such daily harvests, the culture was devoid of living Cells and no longer usable. The daily crops were pooled and 45 minutes centrifuged at 2000 rpm. The supernatant fluid contained (in HeLa cell experiments) 104fix GKIDso measles virus per cubic centimeter. It was adjusted to a pH of 7.1 set and sealed in serum bottles.

Beispiel 2 Züchtung des Masern virus in Kulturen von Affennierenzellen Einem afrikanischen Vervetaffen wurden die Nieren herausgenommen. Die Nebennieren und Kapseln wurden abgezogen, und die Hilusstrukturen wurden herausgeschnitten und weggeworfen. Die Rindensubstanz der beidenNieren wurde zerschnitten, und die Stücke wurden dreimal mit BSSa gewaschen, um das Blut zu entfernen. Die Stücke wurden mit 150 ccm 0,250/oiger Trypsinlösung der im Beispiel I beschriebenen Art 5 Stunden bei 6" C unter mäßigem Rühren digeriert. Nach der Digerierung ließ man die größeren Klumpen und Teilchen sich absetzen, und die überstehende Flüssigkeit, die einzelne Zellen, kleine Klumpen von Zellen und Zelltrümmer enthielt, wurde dekantiert. Es wurde dann eine zweite Digerierung für die Dauer von 16 Stunden bei 6° C durchgeführt und die überstehende Flüssigkeit wie oben dekantiert. Die beiden digerierten Partien wurden vereinigt, in einem Eisbad gekühlt und durch ein Käsetuch filtriert. Das Filtrat wurde 30 Minuten bei 200 U/min zentrifugiert und die absedimentierten Zellen mit 100 ccm BSSa plus 5 Volumprozent Kalbserum vermischt. Diese Suspension wurde 30 Minuten bei 200 U/min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit weggeschüttet. Example 2 Cultivation of measles virus in cultures of monkey kidney cells The kidneys were removed from an African vervet monkey. The adrenal glands and capsules were peeled off, and the hilum structures were excised and thrown away. The bark of the two kidneys was cut up and the pieces were washed three times with BSSa to remove the blood. The pieces were with 150 ccm of 0.250% trypsin solution of the type described in Example I for 5 hours Digested at 6 "C. with moderate stirring. After the digestion, the larger ones were left Lumps and particles settle out, and the supernatant fluid becomes individual Cells containing small clumps of cells and cell debris were decanted. It A second digestion was then carried out for 16 hours at 6 ° C and the supernatant liquid decanted as above. The two digested parts were combined, chilled in an ice bath and filtered through cheesecloth. That The filtrate was 30 minutes centrifuged at 200 rpm and the sedimented Cells mixed with 100 cc BSSa plus 5 volume percent calf serum. This suspension was centrifuged at 200 rpm for 30 minutes and the supernatant liquid was discarded.

Die absedimentierten Zellen wurden in 100 ccm eines Nährmediums suspendiert, das aus dem Medium 199. und 10 Volumprozent Kalbserum bestand. Bei der Herstellung dieses Mediums wurde das Kalb serum unter Druck durch einen Asbestfilter filtriert. Die Konzentration der Zellen in der Suspension wurde mit Hilfe einer Zählkammer ermittelt und betrug 5,1 106 Zellen je Kubikzentimeter. Die Suspension wurde dann mit 240 ccm des Nährmediums verdünnt und ergab eine Zellzählung von etwa 1,5 106 Zellen je Kubikzentimeter. The sedimented cells were suspended in 100 ccm of a nutrient medium, which consisted of medium 199 and 10 volume percent calf serum. In the preparation of From this medium, the calf serum was filtered under pressure through an asbestos filter. The concentration of the cells in the suspension was determined using a counting chamber determined and was 5.1 106 cells per cubic centimeter. The suspension was then diluted with 240 cc of the nutrient medium and gave a cell count of about 1.5 106 Cells per cubic centimeter.

30 ccm dieser standardisierten Zellsuspension wurden mit 30 ccm Medium 199 verdünnt. Diese verdünnte Suspension wurde als Kontrollkultur in eine Rouxflasche gegeben. Die Kontrollkultur wurde in der gleichen Weise behandelt wie die mit dem Virus geimpften Kulturen. 30 cc of this standardized cell suspension were mixed with 30 cc of medium 199 diluted. This diluted suspension was placed in a Roux bottle as a control culture given. The control culture was treated in the same way as that with the Virus inoculated cultures.

300 ccm der restlichen standardisierten Zellsuspensionen wurden mit 300ccm Medium 199 geimpft, das 103 GKIDSO Masernvirus je Kubikzentimeter enthielt. Die mit dem Virus geimpfte Zellsuspension wurde in Portionen zu je 60 ccm in Rouxflaschen gegeben und bei 37° C inkubiert. 300 cc of the remaining standardized cell suspensions were with 300cc of medium 199 containing 103 GKIDSO measles virus per cubic centimeter. The cell suspension inoculated with the virus was poured into Roux bottles in portions of 60 ccm each given and incubated at 37 ° C.

Nach einer Inkubationszeit von 5 Tagen waren die Innenflächen der Flaschen mit einer nahezu festen Zellschicht überzogen; es war jedoch keine merkliche Virusinfektion in den Kulturen festzustellen. In diesem Zeitpunkt wurde das ursprüngliche Nährmedium entfernt, und die Kulturen wurden dreimal hintereinander mit jeweils 40 ccm BSSa gewaschen, um alle Spuren Serum zu entfernen. Nach der dritten Waschung wurden 60 ccm Medium 199a (das Medium 199, das 100 Einheiten Penicillin, 100 mg Streptomycin und 40 Einheiten Mycostatin je Kubikzentimeter enthält) über die Zellkultur geschüttet. After an incubation period of 5 days, the inner surfaces were the Bottles covered with an almost solid layer of cells; however, it was not a noticeable one Detect viral infection in the cultures. At that point it became the original Culture medium removed, and the cultures were grown three times in a row with each Washed 40 cc of BSSa to remove all traces of serum. After the third wash 60 cc of medium 199a (medium 199, 100 units of penicillin, 100 mg Contains streptomycin and 40 units of mycostatin per cubic centimeter) via the cell culture poured.

Die Inkubation wurde 4 Tage bei 37° C fortgesetzt, zu welcher Zeit eine ausgedehnte Virusinfektion in den geimpften Kulturen beobachtet wurde. Das Medium, das von den infizierten Zellen freigegebene Virusteilchen enthielt, wurde dekantiert und in einem Kühlschrank aufbewahrt. Den Kulturen wurde frisches Medium 199a hinzugefügt. Die Ernte und Auswechslung des Nährmediums wurde 5 Tage hintereinander wiederholt. Die Tagesernten an Medium 199a, das den infektiösen Masernvirus enthielt, wurden vereinigt und 45 Minuten bei 40 C und 2000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde erneut 45 Minuten lang bei 2000U/min zentrifugiert, auf einen pH-Wert von 7,1 gebracht und in aliquoten Teilen von 1,1 ccm in dicht verschlossene 5-com-Glasampullen gebracht. Incubation was continued for 4 days at 37 ° C, at which time widespread viral infection was observed in the inoculated cultures. That Medium containing virus particles released from the infected cells was used decanted and stored in a refrigerator. The cultures were given fresh medium 199a added. The harvest and change of the nutrient medium was 5 days in a row repeated. The daily harvests of medium 199a, which contained the infectious measles virus, were combined and centrifuged for 45 minutes at 40 ° C. and 2000 rpm. The protruding Liquid was centrifuged again for 45 minutes at 2000 rpm, on one Brought pH 7.1 and aliquots of 1.1 cc in tightly closed Brought 5 com glass ampoules.

Beispiel 3 Inaktivierung des Masernvirus mit Kathodenstrahlen Gruppen von sechs Ampullen des Beispiels 2 wurden mit Betastrahlen unter Anwendung der nachstehenden Strahlungsenergien behandelt: 1,0 105, 2,0 105, 4,0 105, 6,0 105, 8,0- 105 und 10,0 105 reps. Die Bestrahlung wurde unter Verwendung eines Van-de-Graaf-Beschleunigers durchgeführt, der einen Elektronenstrahl mit einer mittleren Energie von 2,0 106 eV erzeugte. Nach der Bestrahlung wurde der Inhalt von je drei Ampullen einer jeden Gruppe vereinigt und die Austeilung gegenüber Kulturen von HeLa-Zellen bei half-log Verdünnungen bis zu 10-5 bestimmt. Die Endpunktverdünnung einer jeden Gruppe wurde auf eine Kultur gebracht, um den Inhalt auf die Anwesenheit von infektiösen Viren zu untersuchen. Diejenigen Ampullen, die mit einer Intensität von 4,0105 oder darüber bestrahlt worden waren, enthielten keinen infektiösen Virus. Durch Umrechnung des Gewebekulturinfektionstiters mit der Strahlungsintensität in reps wurde festgestellt, daß eine vollständige Inaktivierung des Virus mit einer Strahlungsenergie von 2,0 105 bis 4,0 105 reps erzielt wurde. Example 3 Inactivation of measles virus with cathode ray groups of six ampoules of Example 2 were beta-rayed using the following Radiant energies treated: 1.0 105, 2.0 105, 4.0 105, 6.0 105, 8.0-105 and 10.0 105 reps. The exposure was using a Van de Graaf accelerator performed using an electron beam with a mean Energy of 2.0 106 eV generated. After the irradiation, the contents of three vials of each Group pooled and the distribution to cultures of HeLa cells at half-log Dilutions up to 10-5 are determined. The endpoint dilution of each group was brought to a culture to check the contents for the presence of infectious viruses to investigate. Those ampoules with an intensity of 4.0105 or above irradiated did not contain any infectious virus. By converting the Tissue culture infection titers with the radiation intensity in reps were found that a complete inactivation of the virus with a radiation energy of 2.0 105 to 4.0 105 reps has been achieved.

Der mit sämtlichen oben angegebenen Strahlungsmengen inaktivierte Virus zeigte bei Meerschweichen, die damit behandelt wurden, eine hohe Antigenwirkung, wie an Hand des Neutralisationsvermögens der Sera festgestellt wurde. Die Neutralisationstiter der Sera lagen durchweg zwischen 1 : 64 und 1 : 256.The inactivated with all of the above-mentioned amounts of radiation Virus showed a high antigenic effect in guinea pigs treated with it, as determined on the basis of the neutralizing power of the sera. The neutralization titre the sera were consistently between 1: 64 and 1: 256.

Beispiel 4 Inaktivierung des Masernvirus durch Gammastrahlen Eine Suspension von infektiösem Masernvirus in Medium 199a wurde in Portionen von je 5 ccm in 5-ccm-Glasampullen, welche verschlossen wurden, gefüllt. Gruppen von je sechs Ampullen wurden mit Gammastrahlen aus einer Cobalt-60-Quelle mit einem Strom von etwa 180 000 bis 200 000 Röntgen je Stunde unter Anwendung folgender Strahlungsenergien behandelt: 1,0 105, 2,0- 105, 3,0 105, 4,0 los, 5,0 105, 7,5 105, 1,0 106, 2,0 106 reps. Example 4 Inactivation of Measles Virus by Gamma Rays One Suspension of infectious measles virus in medium 199a was made in portions of 5 cc in 5 cc glass ampoules which have been sealed. Groups of each six vials were gamma-rayed from a cobalt-60 source with a current from about 180,000 to 200,000 roentgen per hour using the following radiation energies treated: 1.0 105, 2.0-105, 3.0 105, 4.0 lot, 5.0 105, 7.5 105, 1.0 106, 2.0 106 reps.

Die bei diesen Strahlungsenergien erhaltenen Impfstoffe ergaben bei Meerschweinchen Serumneutralisationstiter von etwa 1 : 256.The vaccines obtained at these radiant energies gave at Guinea pig serum neutralization titre of approximately 1: 256.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the manufacture of a measles virus vaccine, which causes the production of antibodies in the tissues of susceptible individuals and renders them insensitive to measles, characterized by the fact that the rubeola virus in tissue cultures of kidney cells from great apes or other species of monkeys, the are free from latent viruses, the live virus grows from it in a parenteral manner recovers acceptable carrier fluid, essentially removes cell debris and destroys the infectious capacity of the virus.

2. The method according to claim 1, characterized in that as Active cells for the multiplication of the measles virus Kidney cells from African vervet monkeys (Cercopithecus lalandi) used.

3. The method according to claim 1, characterized in that the Infectious ability of the virus by means of physical energy (thermal energy, non-ionizing or ionizing radiation, electron radiation, cathode radiation, Gamma radiation) destroyed.

Documents considered: German Auslegeschrift No. 1 003 398.