DE112016006253T5

DE112016006253T5 - Bakterienkonsortium zur reduktion von perchlorat und/oder nitrat und dessen prozess

Info

Publication number: DE112016006253T5
Application number: DE112016006253.2T
Authority: DE
Inventors: Krishnakumar Bhaskaran; Anupama Vijaya Nadaraja
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2016-01-19
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2018-10-04
Also published as: WO2017125943A1; US11390547B2; US20210147269A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart einen neuartigen mikrobiellen Prozess zur Dekontamination von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen. Hauptbestandteil des Prozesses ist eine heterotrophe mikrobielle Mischkultur, die die für die (Per)Chlorat- und Nitratreduktion verantwortlichen funktionellen Gene exprimiert. Der vorliegende Prozess kann ein besserer Ersatz für bestehende Verfahren zur Dekontaminierung von mit Perchlorat kontaminiertem Treibmittel-Abwasser, Ionenaustauscherharz/Regeneratlösungen usw. sein.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Bakterienkonsortium zur Reduktion von Perchlorat und/oder Nitrat und dessen Prozess. Sie bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen mit Hilfe des Bakterienkonsortiums. Dieser Prozess findet Anwendung bei der Bioremediation von flüssigen oder festen Matrizen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Perchtorat-Ionen(ClO₄ ^-) und Chlorat-Ionen (ClO₃ ^-), die zusammen als (Per)Chlorat bezeichnet werden, sind neu entstehende Umweltkontaminanten, die in vielen Bereichen, insbesondere in der Rüstungsindustrie und in der Munitionsherstellung eingesetzt werden. Perchlorat stört die Funktion der Schilddrüse und führt zu Schilddrüsenunterfunktion (reduzierter Gehalt an Schilddrüsenhormonen, T3 und T4) und damit verbundenen Stoffwechsel- und physiologischen Störungen.
Gemäß den Richtlinien der Weltgesundheitsorganisation (WHO) beträgt die vorläufige maximal tolerierbare tägliche Aufnahme (PMTDI) von ClO₄ ^- im Trinkwasser 0,01 µg/kg Körpergewicht. Die amerikanische Umweltschutzbehörde (United States Environmental Protection Agency /US EPA) hat ClO₄ ^- als vorrangigen Kontaminanten aufgenommen und ein zulässiger Wert für ClO₄ ^- im Trinkwasser beträgt 15 µg/L. In vielen Staaten der USA liegt jedoch der zulässige Wert weit unter der US-EPA-Empfehlung. Perchlorat wurde in vielen Ländern in verschiedenen Matrizen (Nährböden) wie Boden, Wasser, Lebensmitteln und menschlichem Speichel nachgewiesen.
Unter Berücksichtigung der Toxizität und der negativen Auswirkungen von ClO₄ ^- auf die Umwelt wurden mehrere Ansätze zur Entfernung bzw. zum Abbau von (Per)Chlorat aus Wasser und Boden berichtet. Diese Verfahren lassen sich grob in nichtbiologische und biologische Verfahren einteilen.
Zu den nicht-biologischen Methoden gehören Verfahren wie Ionenaustausch, Umkehrosmose, Elektrodialyse, Nanofiltration, Adsorption, elektrochemische Reduktion, etc. Alle diese Verfahren haben jedoch aufgrund der Nicht-Selektivität, der hohen Betriebskosten und der Notwendigkeit einer Nachbehandlungsstrategie nur begrenzte Anwendungsmöglichkeiten. Außerdem entfernen viele der physikalisch-chemischen Verfahren nur physikalisch (kein Abbau zu ungiftigem Chlorid) (Per)Chlorat aus der kontaminierten Matrix.
Andererseits wurden biologische Ansätze (Bioremediation) als umweltfreundlich, wirtschaftlich und effektiv für die Aufbereitung von (Per)Chlorat beschrieben. Ein großer Vorteil der biologischen Methode zur (Per)Chlorataufbereitung ist die vollständige Reduktion von (Per)Chlorat zu nicht toxischem chlorid. Die biologische (Per)Chloratentfernung kann in-situ, ex-situ oder durch Phytosanierung erfolgen. Sowohl in in-situ als auch in ex-situ Verfahren werden dissimilierende (Per)Chlorat reduzierende Bakterien (PRB) eingesetzt, die hauptsächlich an der (Per)Chloratreduktion beteiligt sind. In der Phytoremedition hingegen wurden Land- oder Wasserpflanzen zur Entfernung von Perchlorat aus dem Boden bzw. Wasser verwendet.
Die PRBs nutzen unter anoxischen Bedingungen (Per)Chlorat als terminale Elektronensenke und reduzieren es schließlich zu Chlorid und Sauerstoff. (Per)Chlorat reduzierende Bakterien (PRBs) sind allgegenwärtig und werden hauptsächlich zur Detoxifizierung von (Per)Chlorat in biotechnologisch hergestellten Systemen und zur Bodensanierung eingesetzt.
Es gibt bereits umfassende Studien über die Diversität von (Per)Chlorat reduzienden Bakterien (PRBs), die Kinetik des PRB-Wachstums und der (Per)Chloratreduktion, den biochemischen Mechanismus und die Genetik des (Per)Chloratabbaus. PRBs sind in der Lage, eine Vielzahl von organischen und anorganischen Elektronenspendern zu verwenden.
Die meisten der PRBs können auch alternative Elektronenakzeptoren wie Sauerstoff, Nitrat und Chlorat verwenden. Der gesamte biochemische Weg der (Per)Chloratreduktion umfasst zwei wichtige Atemwegsenzyme, die Perchloratreduktase, die die Perchlorat- und Chloratreduktion katalysiert, und die Chlorit-Dismutase (Cld), die die Spaltung von Chlorit (ClO2^-) in Chlorid und molekularen Sauerstoff katalysiert.
Die Anwesenheit der funktionellen Gene Perchloratreduktase und Chloritdismutase ist ein charakteristisches Merkmal von PRBs. PRBs sind phylogenetisch vielfältig mit Vertretern in allen Reichen außer Eukaryoten. Sie werden dominiert vom Proteobakterienstamm (α, β, γ und ε Unterklassen), die von der β Unterklasse dominiert werden.
Neuartige Perchlorat reduzierende Mikroben (Bakterien und Archaeen), die ihre phylogenetische Vielfalt erweitert haben, werden weiterhin aus vielen Umgebungen gemeldet. Dies wird dazu beitragen, ihr physiologisches Potenzial für die Anwendung in der Bioremediation zu erforschen. Eine Reihe von Studien berichteten über den (Per)Chloratabbau in Bioreaktorsystemen mit verschiedenen PRBs. Perchlorat belastete Abfälle/Ableitungen wie Altharz und Regeneratlösung können einen Salzgehalt von bis zu 15% haben (Chung et al., 2007) und einen pH-Wert haben, der je nach Art des verwendeten Ionenaustauscherharzes und Regenerats (wie FeCl4-) entweder alkalisch oder sauer ist (Gingras und Batista, 2002); Chung et al. J. Environ. Ing., 2007, 133(2): 157; Gingras et al., J. Environ. Monitor, 2002, 4: 96-101.
Die maximale beobachtete Salzgehaltstoleranz in PRMs lag bisher bei 11% bei einer akklimatisierten Mischkultur und das Wachstum wurde nicht über diesen Salzgehalt hinaus beobachtet (Logan et al., 2001).
Bisher haben Studien auch nur über eine ClO₄ ^--Reduktion innerhalb eines pH-Wertes von 5.0 bis 9.0 beobachtet (Wang et al., 2008; Wang et al., J. Hazard. Mater, 2008, 153(1-2): 663-669.
Nitrat wird insbesondere in landwirtschaftlichen Regionen als gleichzeitiger Kontaminant mit Perchlorat gemeldet und daher ist die gleichzeitige Beseitigung von beiden sehr vorteilhaft. Das Interesse an einem umweltfreundlichen und kostengünstigen Bioprozess zur Aufbereitung von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Lösungen bei hohem Salzgehalt und extremen pH-Werten, wie in diesem Patent beschrieben, ist daher immens.
Toxische Oxyanionen einschließlich Perchlorat, Chlorat, Chlorit und/oder Nitrat reduzierende neue Bakterien und Verfahren, die diese Organismen verwenden, wurden durch eine Reihe von Patenten wie unten beschrieben offenbart.
Die biochemische Reduktion von Perchlorat, Chlorat und geringer Nitratmenge unter anaeroben Bedingungen unter Verwendung von organischem Substrat durch Vibrio dechloraticans Cuznesove B-1168 wurde im US-Patent Nr. 3943055 offenbart. Dabei wird Perchlorat durch die Nitratreduktase der Kultur zu Chlorid reduziert.
Ein Verfahren zur Aufbereitung von Treibmittel-Abwasser mittels eines Bakteriums HAP-1 wurde im US-Patent Nr. 5302285 offenbart. Ein Verfahren zur Perchlorataufbereitung unter Verwendung des Bakteriums HAP-1, das aus einer Abwasseranreicherungskultur in einem Wasserstoff-Gas-Lift-Reaktor isoliert wurde, welches bei einem pH-Wert von 6,5-8,0 kultiviert wurde, sind in den US-Patenten Nr. 5948260, Nr. 5302285, Nr. 5,948,260 offenbart.
Im US-Patent Nr. 6,077,429 wurde ein Verfahren zum Abbau von Perchlorat und/oder Nitrat aus kontaminiertem Wasser und Boden durch ein gramnegatives, fakultatives anaerobes Bakterium - perclace, offenbart.
Venkatesh et al. haben im US-Patent Nr. 6066257 über ein Verfahren zur Konzentration und Zerstörung von Perchlorat und Nitrat in wässriger Lösung berichtet. Unter Verwendung einer gemischten Bakterienkultur, die Wolinella succinogenes enthält, wurde im Patent Nr. US 6077432 der biologische Abbau von energetischen Materialien wie Perchlorat, Nitrat, Hydrolysat und anderen energetischen Materialien offenbart.
Das Verfahren zur Reinigung von ammoniumperchlorathaltigem Wasser mit Mikroben, die zu den Gruppen Pseudomonas, Micrococcus, Denitribacillus, Spirillum, Achroniobacter gehören, wurde im US-Patent 6328891 B1 offenbart.
Logan (2001) berichtete von einer Perchloratreduktion unter Verwendung eines oxidierbaren Substrats durch Perchlorat respirierende Mikroorganismen in einem anaeroben Biofilmfiltersystem gemäß US-Patent Nr. 6214607 B1 .
Die Isolierung und Verwendung eines Bakterienstammes DM-17 (starke Ähnlichkeit mit Azoarens sp. Stamm BS2-3) zur Perchloratreduktion wurde in Patent Nr. WO 01/36689 A1 und US-Patent 6423533 B1 offenbart.
Der biologische Abbau von Oxyanionen, wie z.B. die Perchloratladung von Ionenaustauscherharzen, mittels Mischkultur aus kommunalem anaeroben Schlamm, Belebtschlamm und der BALI-Kultur, Wolinella succinogenes, Ideonella dechloratans und Acinetoacter thermotoleranticus, wurde im Patent Nr. WO 2005/ 012192 A2 offenbart.
Bently et al. (2006) haben ein Verfahren zur Aufbereitung von oxidierten Kontaminanten einschließlich Perchlorat, Chlorat und Chlorit mit elementarem Schwefel als Elektronenspender und entweder natürlich vorkommender oder inokulierter mikrobieller Population berichtet (US 2009/ 0292684). Die Perchloratreduktion in Wasser durch wasserstoffoxidierende Bakterien wurde im US-Patent Nr. 7186340 B1 offenbart.
Eine verbesserte Methode zur Zerstörung von Perchlorat und anderen Oxyanionen des Ionenaustauscherharzes durch Bioregeneration wurde im Patent Nr. WO 2007/ 140150 offenbart.
Die Aufbereitung von mit Perchlorat beladenem Ionenaustauscherharz wurde im US-Patent Nr. 7311843 B2 offenbart.
Ein Verfahren zur biologischen Reinigung einer wässrigen Lösung, die Ammoniumperchlorat und gegebenenfalls Nitrat enthält, unter Verwendung von perchloratreduzierenden Bakterien unter Verwendung von organischen kohlenstoffhaltigen Substraten und Nährstoffen wurde im Patent Nr. WO 2009/ 156673 beschrieben. Eine Mischkultur, umfassend Bakterien, die in städtischem anaeroben Schlamm, Belebtschlamm und der BALI-Kultur vorhanden sind, einschließlich Wolinella succinogenes, Ideonella dechloratans, Acinetobacter thermotoleranticus, Stamm CKB, Stamm PDA und KJ. Der Abbau von Oxyanionen wie Perchlorat auf Ionenaustauscherharz wurde im US-Patent 7407581 B2 offenbart. Die Reduktion von Perchlorat mit elementarem Schwefel als Elektronenspender und Muschelschalen als Alkalisierungsmittel in einem Bioreaktor durch ein autotrophes Bakterium wurde im US-Patent Nr. 7575686 offenbart.
Ein Membranbiofilmreaktor (MfBr) mit autotrophen perchloratreduzierenden Bakterien zur Entfernung von Perchlorat, Nitrat und anderen organischen Verunreinigungen wurde in der Druckschrift US 7931807 B2 beschrieben.
Wie aus den obigen Beschreibungen hervorgeht, besteht unmittelbarer Bedarf an verbesserten Verfahren und Systemen zur Aufbereitung von (per)chlorat- und nitrathaltigen Lösungen oder festen Matrizen.
Kürzlich haben wir einen neuen Bakterienstamm gemeldet, der eine wachstumsgekoppelte Perchloratreduktion aufweist (Anupama et al., 2013). Das Bakterium wurde als Serratia marcescens-Stamm identifiziert. Das Bakterium reduzierte Perchlorat vollständig mittels stöchiometrischer Chloridanreicherung. Das Vorhandensein von pcrA- und cld-Genen, die für wichtige Atmungsenzyme kodieren, die an der Perchloratreduktion beteiligt sind, wurde im Isolat bestätigt. Das Isolat tolerierte einen Salzgehalt von bis zu 15% NaCl, einen weiten pH-Bereich (4,0-9,0) und reduzierte gleichzeitig Nitrat und Perchlorat.
Im Vergleich zu diesem isolierten Bakterium (das Teil des Konsortiums ist), hat das Konsortium im vorliegenden Patent Vorteile wie hohe Anfangsperchloratwerte (≥.5g/L), fakultative anaerobe Natur, Toleranz gegenüber hohem Ammoniumgehalt (≥.5g/L), sowie eine breite Palette von Substraten. Die Eigenschaften des vorliegenden Konsortiums, wie z.B. große Substratbereiche, fakultativer anaerober Charakter und hohe Verträglichkeit gegenüber Perchlorat und Ammonium, werden insbesondere für die praktische Anwendung von großem Vorteil sein.
Ziel der Erfindung

1. Die Hauptaufgabe der Erfindung ist ein Bioprozess zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen zu erschaffen.
2. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Bioprozess zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen unter Verwendung einer gemischten Bakterienkultur, die im Wesentlichen aus Bakterien der Genien Serratia, Halomonas und Bacillus besteht.
3. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem verbesserten Bioprozess zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen unter hohen Salzgehalt und hohen pH-Werten.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuartigen Bioprozess zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen unter Verwendung einer von den Genien - Halomonas sp. NIIST-PRB-02 (MTCC 5911), Bacillus sp. NIIST-PRB-03 (MTCC 5912) und Serratia marcescens-Stamm NIIST5 (MTCC 5821) dominierten Bakterienkultur unter bestimmten Bedingungen.
Durch dieses Verfahren können Flüssigkeiten oder feste Matrizen, die (Per)chlorat und/oder Nitrat unter hohen Salzgehalten und breiten pH-Werten enthalten, behandelt werden.
Figurenliste

1. Agarose-Gel-Bild, welches A) 100 bp Leiter (Lane 1), verstärktes pcr A (Lane 2); B) 100 bp Leiter (Lane 1), verstärktes Cld Gen (Lane 2); C) 100 bp Leiter (Lane 1), verstärktes narG Gen (Lane 2) zeigt.
2. Perchlorat-Reduktionsprofil des verdünnten Industrieabwassers mit unterschiedlicher Anfangskonzentration an ClO₄ ^- bei 5% NaCl durch das vorliegende Konsortium.
3. Schematische Darstellung des Verfahrens zur Dekontamination von (per)chlorat- und/oder nitratbelastetem Wasser (A) Bioreaktor mit Suspensions-Biomasse; (B) Fixfilm-Bioreaktor.
4. Reduktion von Perchlorat allein und einer Mischung aus Perchlorat und Nitrat durch das vorliegende Konsortium in Batchkultur.
5. Reduktion von Perchlorat in Gegenwart von Ammonium bei unterschiedlicher Anfangskonzentration in Batchkultur.
6. Reduktionsprofil von Perchlorat in einem Mini-Fermenter mit dem unter aeroben Bedingungen entwickelten Konsortium.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuartigen Bioprozess zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen unter Verwendung einer von den Genien - Halomonas sp. NIIST-PRB-02 (MTCC 5911), Bacillus sp. NIIST-PRB-03 (MTCC 5912) und Serratia marcescens-Stamm NIIST5 (MTCC 5821) dominierten Bakterienkultur unter bestimmten Bedingungen.
Durch dieses Verfahren können Flüssigkeiten oder feste Matrizen, die (Per)chlorat und/oder Nitrat unter hohen Salzgehalten und breiten pH-Werten enthalten, dekontaminiert werden.
Dieses Verfahren findet Anwendung bei der Aufbereitung von perchlorat- und nitratbelastetem Wasser, Treibmittel-Abwasser, Ionenaustauscherharz-Regenerierlösung, etc.
Die vorliegende Erfindung offenbart einen neuartigen Bioprozess zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Lösungen oder festen Matrizen unter Verwendung einer gemischten Bakterienkultur (Konsortium), die von Bakterien dominiert wird, die im Wesentlichen aus den Genien Halomonas, Bacillus und Serratia bestehen. Die Erfindung weist hauptsächlich zwei Komponenten auf, (1) das spezifische Bakterienkonsortium und (2) das Verfahren zur Dekontaminierung (per)chlorat- und/oder nitratkontaminierter Matrizen. Die folgende Beschreibung bezieht sich auf beide.
Bakterienkonsortium, zur Reduktion von (Per)Chlorat und/oder Nitrat:
Das gegenwärtige Konsortium besteht hauptsächlich aus drei Bakterien der Genien Halomonas, Bacillus und Serratia. Die Kulturen dieser drei Stämme wurden in der Datenbank MTCC mit folgenden Angaben hinterlegt: Halomonas sp. NIIST-PRB-02 (MTCC 5911), Bacillus sp. NIIST-PRB-03 (MTCC 5912) und Serratia marcescens-Stamm NIIST5 (MTCC 5821). Alle drei Bakterien im Konsortium können gemeinsam oder einzeln kultiviert und gepflegt werden. Alle Bakterien exprimieren die für die Reduktion von (Per-)Chlorat und/oder Nitrat spezifischen Gene, so dass dieses Konsortium effektiv für die Aufbereitung von mit (Per-)Chlorat und/oder Nitrat kontaminierten flüssigen/festen Matrizen eingesetzt werden kann. Dieses Konsortium ist fakultativ anaerob, so dass es sowohl unter aeroben als auch unter anoxischen Bedingungen agieren kann.
Das Konsortium kann zur (Per)Chlorat- und Nitratreduktion in Batchkulturen oder in kontinuierlich beschickten Bioreaktoren eingesetzt werden. Darüber hinaus kann das Konsortium in einem künstlich hergestellten biologischen System (Bioreaktor) entweder als Suspensions-Biomasse kultiviert oder auf inerten Substraten zu einem festen Film gebunden werden. Das Konsortium verträgt eine hohe Konzentration von Perchlorat (bis zu 5,0 g/L), hohen Salzgehalt (>15%), hohen Ammoniumgehalt (0,5 g/L) und einen extremem pH-Wert (4 -9), was es ideal für die Dekontamination von Ionenaustausch-Regeneratlösungen macht.
Das Konsortium verwendet für das Wachstum, organische Substrate darunter Zucker, organische Säuren, Alkohole etc. Es bevorzugt jedoch Azetat als Elektronenspender zur Reduktion von Perchlorat zu Chlorid und Sauerstoff.
Verfahren zur Reduktion von (Per)Chlorat und/oder Nitrat:
Bei dem vorliegenden Verfahren wird die mit (Per)Chlorat und/oder Nitrat kontaminierte Matrix (flüssig oder fest) für einen bestimmten Zeitraum in einem geeigneten Bioreaktorsystem dem oben beschriebenen Bakterienkonsortium unter anoxischer Umgebung ausgesetzt.
Zur Unterstützung der bakteriellen Aktivität werden dem Reaktor ein organisches Substrat und Nährstoffe zugeführt.
Bei diesem Verfahren kann das Bakteriensystem entweder als suspendierte (fluidisierte) Biomasse oder als fester Film auf inerten Substraten wie Kunststoff, Ton, Glas etc. kultiviert werden. Das Verfahren kann zur Aufbereitung von Abwasser oder Lösungen oder fester Matrizen, die mit (Per-)Chlorat und/oder Nitrat kontaminiert sind, eingesetzt werden.
So stellt die vorliegende Erfindung ein Bakterienkonsortium zur Verfügung, das für die Detoxifikation von (Per-)Chlorat und/oder Nitrat nützlich ist. Es besteht im Wesentlichen aus Halomonas sp. NIIST-PRB-02 (MTCC 5911), Bacillus sp. NIIST-PRB-03 (MTCC 5912) und Serratia marcescens-Stamm NIIST5 (MTCC 5821).
Gemäß einer Ausführungsform, wird ein Bioprozess zur Detoxifikation von (Per)Chlorat und/oder Nitrat enthaltenden Matrizen unter Verwendung eines bakteriellen Konsortiums dargestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a. Kultivieren des Bakterienkonsortiums und Bereitstellung von Substraten/Nährstoffen zur Unterstützung der mikrobiellen Aktivität in einem Bioreaktor;
b. Inkontaktbringen der mit (Per)Chlorat und/oder Nitrat kontaminierten Matrix mit dem Bakterienkonsortium im Bioreaktor von Schritt (a) bei einem Redoxpotential unter -200 mV, neutralem pH-Wert und 30±5 °C für einen Zeitraum von 3 bis 12 Stunden, um detoxifizierte Matrizen zu erhalten.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform, gehören in einem Verfahren Bakterien des Bakterienkonsortiums den Genien Serratia, Halomonas und Bacillus an, welche aus salzangepasstem Schlamm aus einem Bioreaktor isoliert wurden und in der Datenbank MTCC mit Halomonas sp. NIIST-PRB-02 (MTCC 5911), Bacillus sp. NIIST-PRB-03 (MTCC 5912) und Serratia marcescens-Stamm NIIST5 (MTCC 5821) hinterlegt wurden.
In einer weiteren Ausführungsform werden Bakterien in Suspension gehalten oder auf einer geeigneten inerten Oberfläche wie Glas, Kunststoff oder Keramik für eine dauerhafte Aktivität angebracht.
In einer weiteren Ausführungsform, können (per)chlorat- und/oder nitrathaltige Matrizen in Treibmittel-Abwässern, die Perchlorat, Ammoniak, einen hohen Salzgehalt und einen sauren oder alkalischen pH-Wert enthalten, oder feste Matrizen mit einem Salzgehalt bis zu 15 % und einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 10 und Perchlorat bis zu 5 g/l dekontaminiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform, bestehen die Nährstoffe gemäß Schritt (a) aus einem Mineralsalzmedium, das (g/L Wasser) K2HPO40.22, KH2PO40.22, (NH4)2SO40.22, MgSO4.7H2O0.05, CaCO30.005, FeSO4.7H2O0.005, KClO4-1.5 g/L und Spurenmetall-Lösung1.0 ml enthält.
In einer weiteren Ausführungsform findet die Reduktion von Perchlorat in einem Bereich von ≥5g/L statt.
In einer weiteren Ausführungsform findet die Reduktion von Nitrat in einem Bereich von ≥5g/L statt.
In einer weiteren Ausführungsform wurde die Reduktion von Nitrat und Perchlorat mittels gemischter Bakterienkulturen optional in Anwesenheit von Ammonium ausgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform wurde die Reaktion mit Hilfe eines Bakterienkonsortiums in Gegenwart von (Per)Chlorat und/oder Nitrat bei einer Konzentration von ≥ 5 g/L durchgeführt.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die besten Verfahrensweisen für die vorliegende Erfindung aufzuzeigen und sollten nicht als Einschränkung des Erfindungsumfangs ausgelegt werden:
Beispiel 1: Das Bakterienkonsortium; seine Eigenschaften, Aufbereitung und Pflege
Das Bakterienkonsortium (Mischkultur), das in diesem Prozess verwendet wurde, wurde von Bakterien dominiert, die zu Halomonas sp. NIIST-PRB-02 (MTCC 5911), Bacillus sp. NIIST-PRB-03 (MTCC 5912) und Serratia marcescens- Stamm NIIST5 (MTCC 5821) gehören. Alle drei Bakterien wurden aus einem Bioreaktor im Labormaßstab zur Reduktion von (Per)chlorat und/oder Nitrat isoliert.
Das Konsortium kann in Mineralsalzmedium mit (g/L Wasser) K₂HPO₄0.22, KH₂PO₄0.22, (NH₄)₂SO₄0.22, MgSO₄.7H₂O0.05, CaCO₃0.005, FeSO₄.7H₂O0.005, KClO₄-1.5 g/L und Spurenmetalllösung-1.0 ml angebaut und kultiviert werden. Ein höheres Perchlorat/Azetat-Verhältnis wie 1:2 war für die vollständige Reduktion von (Per)chlorat und/oder Nitrat erforderlich. Das Konsortium kann sowohl unter aeroben als auch unter anoxischen Bedingungen kultiviert werden. Unter optimalen Bedingungen von pH-Wert (~7), Temperatur (30±3°C) und anoxischem Zustand betrug die spezifische Wachstumsrate (µ) des Konsortiums in den genannten Nährmedien 0,025/h. Alternativ kann das Konsortium auch in einer Nährbouillon oder auf Luria Bertani-Nährböden entwickelt und kultiviert werden.
Das Konsortium wurde auf sein Potenzial zur Reduzierung von Perchlorat und/oder Nitrat untersucht. Dazu wurde das Vorhandensein von Stoffwechselgenen analysiert, die für Perchlorat und/oder Nitrat verantwortlich sind. Es wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit spezifischen Primern für Perchloratreduktase (pcrA-Gen) und Chlorit-Dismutase (cld-Gen) durchgeführt, die am vollständigen Abbau von Perchlorat beteiligt sind. Das erhaltene Genprodukt wurde sequenziert und durch eine Ähnlichkeitsprüfung mit dem BLAST (NCBI)-Algorithmus bestätigt. Ebenso wurde das Vorhandensein des Nitrat-Reduktase-Gens (narG) bestätigt. Die PCR-Bilder wurden in 1 dargestellt.
Das vorliegende Konsortium konnte sowohl Perchlorat als auch Nitrat gleichzeitig unter anoxischen Bedingungen mit Azetat als Substrat (Elektronenspender) reduzieren. Es war in der Lage, Perchlorat bei ppb (µg/L-Level) auf g/L-Level zu tolerieren und zu reduzieren.
Beispiel 2: Reduktion von Perchlorat in Ablaufsole mit dem Konsortium in Batchkultur
Das vorliegende Konsortium wurde auf die Reduktion von Perchlorat in einer industriellen Ablaufsole (Abwasser) getestet. Für die Aufbereitungsstudie wurde das Abwasser einer Ammoniumperchlorat (Raketentreibstoff)-Herstellungsanlage verwendet. Das Abwasser bestand aus Perchlorat-70g/L, Ammonium-17.9g/L, Salzgehalt 5%, pH-Wert 6.0 und einem TOC-Wert 9.46 mg/L. Dieses Abwasser wurde mit Wasser verdünnt, um die Perchlorat- und Ammoniumkonzentration sowie den Salzgehalt zu senken.
Das Batch-Experiment wurde mit verdünnter Industriesole (ClO₄ ^- bei 100-500 mg/L-Level) durchgeführt. Für die Aufbereitungsstudie wurde das auf 5% NaCl akklimatisierte Konsortium verwendet.
Dies geschah durch langsame Anpassung des Konsortiums an hohe Salzbedingungen. Das Batch-Experiment wurde in 25 ml Crimpkappenfläschchen durchgeführt. Im Experiment wurde das in Beispiel 1 beschriebene mineralische Nährmedium (mit Ausnahme des Gehalts an KClO₄ und CH₃COONa) verwendet. Im Nährmedium gelöster Sauerstoff wurde durch Durchperlen von luftfreiem Stickstoff aus einem Zylinder, der durch 0,22 µm Filter (Millipore) gefiltert wurde, für 10 Minuten ausgestoßen. Die Fläschchen wurden bei 30±3 °C über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert.
Das Konsortium aus einer anoxisch gewachsenen Kultur in der späten Log-Phase wurde pelletiert (8000 x g), gewaschen und in entgastem mineralischem Medium im Fläschchen resuspendiert (initialer Wert OD₆₀₀ 0.03 - 0.05). Die Fläschchen wurden bei 30±3 °C inkubiert und alle 12 Stunden Proben mit einer Spritze zur Bestimmung des Gehalts an ClO₄ ^-, Cl^- und OD₆₀₀ entnommen.
Perchlorat und Chlorid wurden durch den IC (Dionex-1100) mit AS 11-Säule und den selbstregenerierendem Anionen-Suppressor (ASRS 300, 4 mm) bei NaCO₃:NaHCO₃ (1:4,8 mM) Puffer als mobile Phase bei einer Flussrate von 1,5 mL/min bestimmt.
Die Reduktion von Perchlorat in einem industriellen Abwasser mit hohem Salz- und Ammoniakgehalt ist in dargestellt. Es wird gezeigt, dass das vorliegende Konsortium zur Aufbereitung von mit Perchlorat belasteten Abwässern unter hohem Salzgehalt und in Gegenwart von Ammonium eingesetzt werden kann.
Beispiel 3: Dekontamination von Perchlorat in Wasser mit Hilfe des Konsortiums in Durchlauf-Bioreaktoren
In 3 ist ein Prozessablaufdiagramm zur Dekontamination von Perchlorat in einem kontaminierten wässrigen System unter Verwendung des vorliegenden Bakterienkonsortiums dargestellt. Das Bakterienkonsortium wurde als suspendierte Biomasse in einem 3-Liter-Glasbehälter (Arbeitsvolumen 2,5 Liter) kultiviert. Die absolut anoxische Atmosphäre im Reaktor wurde zunächst durch Durchperlen mit luftfreiem Stickstoff für 10 Minuten erzeugt. Die Biomasse-Füllmenge im Reaktor entsprach etwa 10 g Trockengewicht. Die langsame Vermischung der Biomasse erfolgte über ein Laufrad. Die Temperatur im Reaktor lag bei 30±3 °C. Das Bakterienwachstum im Reaktor wurde durch die Bereitstellung einer Nährlösung wie in Beispiel 1 beschrieben unterstützt.
Perchlorathaltiges Wasser mit 10 mg/L wurde in einem Kunststoffbehälter gelagert. Es wurde mit einer Peristaltikpumpe (Watson-Marlow) in den Bioreaktor eingebracht. Die Nährlösung wurde mit dem Zufluss vermischt, bevor sie in den Reaktor eingebracht wurde. Das mit Perchlorat verunreinigte Wasser wird während seiner Verweildauer im Reaktor vom Konsortium genutzt und zu nicht toxischen Chloriden und Sauerstoff reduziert. Das aufbereitete Abwasser wird gesammelt und auf Restperchlorat und Chloridaufbau untersucht. Perchlorat und Chlorid wurden mit einem DIONEX Ionenchromatographie-System mit DIONEX AS16 Säule, Anionen-Suppressor und 50 mM NaOH mobil bei 1 ml/min analysiert. Bei diesem Experiment wurde eine vollständige Reduktion von Perchlorat beobachtet.
Alternativ wurde auch ein Bioreaktor mit festem Film zur Aufbereitung von mit Perchlorat belastetem Wasser eingesetzt. Für die Herstellung des Bioreaktors wurde eine Acrylsäule mit 4,5 cm Innendurchmesser und 60 cm Höhe verwendet. Bis zu 40 cm Höhe wurden inerte Medien wie Kunststoffringe oder Glasperlen als Oberfläche für das Biofilmwachstum verwendet. Die Reduktion von Perchlorat war vergleichbar mit dem suspendierten Wachstumssystem.
Beispiel 4: Gleichzeitige Reduktion von Perchlorat und Nitrat durch das Konsortium
In Batch-Kulturen wurde die gleichzeitige Reduktion von Nitrat und Perchlorat durch das vorliegende Konsortium nachgewiesen. Das Experiment wurde in 25 ml Crimpkappenfläschchen durchgeführt. Im Experiment wurde das in Beispiel 1 beschriebene mineralische Nährmedium (mit Ausnahme des Gehalts an Perchlorat und Azetat) verwendet. Im Nährmedium gelöster Sauerstoff wurde durch Durchperlen von luftfreiem Stickstoff aus einem Zylinder, der durch 0,22 µm Filter (Millipore) gefiltert wurde, für 10 Minuten ausgestoßen. Das Konsortium aus einer anoxisch gewachsenen Kultur in später Log-Phase wurde pelletiert (8000 x g), gewaschen und in entgastem mineralischem Medium im Fläschchen resuspendiert (initialer Wert OD₆₀₀ 0.03 - 0.05). Die Fläschchen wurden bei 30±3 °C inkubiert und alle 12 Stunden über einen Zeitraum von 72 Stunden Proben mit einer Spritze zur Ermittlung des Gehalts an ClO₄ ^-, Cl^- und OD₆₀₀ entnommen. Perchlorat und Chlorid wurden durch den IC (Dionex-1100) mit AS 11-Säule und den selbstregenerierendem Anionen-Suppressor (ASRS 300, 4 mm) bei NaCO₃:NaHCO₃ (1:4,8 mM) Puffer als mobile Phase bei einer Flussrate von 1,5 mL/min ermittelt.
Dem anorganischen mineralischen Nährmedium, das Perchlorat und Azetat enthält (10 mg/L bzw. 20 mg/L), wurde Nitrat (als KNO₃;10 mg/L NO₃ ^-) zugesetzt. Parallel wurden nitratfreie Positivkontrollen und hitzebeständige (nicht biologische) Kontrollen durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass sowohl Nitrat als auch Perchlorat gleichzeitig reduziert wurden. Allerdings wurde Nitrat im Vergleich zu Perchlorat schneller abgebaut. Das Ergebnis der vorliegenden Studie ist in 4 dargestellt.
Beispiel 5: Reduktion von Perchlorat in Gegenwart von Ammonium
Das vorliegende Konsortium wurde auf Perchloratreduktionsaktivität in Gegenwart von Ammonium in verschiedenen Anfangskonzentrationen getestet. Das Experiment wurde in Crimpkappenfläschchen mit 25 ml Fassungsvermögen unter Verwendung des Mineralsalzmediums wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Dem Nährmedium wurde Ammonium als (NH₄OH) in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, um die endgültige Ammoniumkonzentration im Bereich von 100-800 mg/L zu erreichen. Der pH-Wert des Nährmediums wurde anschließend durch Zugabe von 0,1M HCl auf den neutralen Bereich eingestellt. Die Fläschchen wurden bei 30±3 °C über einen Zeitraum von 72 h inkubiert und Proben mit einer Spritze alle 12 Stunden zur Ermittlung von ClO₄ ^- entnommen. Perchlorat wurde durch den IC (Dionex-1100) mit AS 11-Säule und den selbstregenerierendem Anionen-Suppressor (ASRS 300, 4 mm) bei NaCO₃:NaHCO₃ (1:4,8 mM) Puffer als mobile Phase bei einer Flussrate von 1,5 mL/min ermittelt.
Eine signifikante ClO₄-Reduktion (über 85%) wurde bei NH4⁺-Konzentrationen bis zu 500 mg/L beobachtet. Eine weitere Erhöhung des Ammoniums auf 800 mg/L führte jedoch zu einem Rückgang der Reduktion auf 41%. Das Ergebnis der Studie ist in 5 dargestellt.
Beispiel 6: Fakultatives anaerobes Konsortium, das in der Lage ist, Perchlorat zu reduzieren
Der fakultative anaerobe Charakter des vorliegenden Konsortiums wurde in einem 500 ml Mini-Fermenter (Applikon) getestet. Das Konsortium aus einem Vorrat wurde in Nährmedium (100 ml) in einem 500 ml Kegelkolben inokuliert und unter aeroben Bedingungen in einem Rotationsschüttler (150 U/min) für 48 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 48 Stunden wurde das Pellet durch Zentrifugation abgetrennt, mit sterilem Mineralsalzmedium gewaschen und in dem als Inokulum verwendeten Mineralsalzmedium (50 ml) wieder suspendiert. Rund 400 ml Mineralsalzmedium mit einer Zugabe von Perchlorat bei 10 mg/L und Azetat bei 30 mg/L wurden im Fermenterbehälter aufgenommen und unter anoxischen Bedingungen unter kontinuierlicher Durchmischung (100 U/min) und bei 30°C inkubiert. Der gelöste Sauerstoff und der pH-Wert werden kontinuierlich überwacht. Proben wurden alle 12 Stunden entnommen, um das Restperchlorat im Nährmedium zu ermitteln. Es wurde beobachtet, dass der gelöste Sauerstoff im Nährmedium in <12 Stunden auf Null sank und anschließend die Perchloratreduktion langsam eingeleitet wurde und der Perchloratgehalt nach 72 Stunden nicht mehr nachweisbar war. Die anfängliche Verzögerung bei der Reduktion von Perchlorat war auf das Vorhandensein von Restsauerstoff im Nährmedium zurückzuführen. Die Bakterienzellen beginnen mit der Aufnahme von Perchlorat, wenn der gelöste Sauerstoff vollständig aufgebraucht ist. Im vorliegenden Experiment wurde das Konsortium unter aeroben Bedingungen entwickelt, seine Perchloratreduktionseigenschaft wurde nicht beeinträchtigt, nachdem es anschließend unter anoxischen Bedingungen inkubiert wurde (fakultativ anaerob). Die Daten des Experiments sind in 6 dargestellt.
Wesentliche Vorteile der Erfindung:

1. Das vorliegende Verfahren mit dem mikrobiellen Mischsystem kann zur Dekontamination von Perchlorat in einem weiten Konzentrationsbereich von Level ppb (Mikrogramm/L) bis g/L eingesetzt werden.
2. Das mikrobielle Mischsystem des vorliegenden Verfahrens zur Dekontamination von Perchlorat kann Ammoniak tolerieren, so dass es zur Aufbereitung von perchlorat- und ammoniakhaltigem Treibmittel-Waschwasser eingesetzt werden kann.
3. Das vorliegende auf das mikrobielle Mischsystem gestützte Verfahren kann zur Dekontamination von Abfällen, die gleichzeitig (Per)Chlorat und/oder Nitrat enthalten, eingesetzt werden.
4. Das vorliegende Verfahren kann zur Aufbereitung von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Lösungen bei einem breiten pH-Bereich (sauer bis alkalisch) und hohen Salzkonzentrationen eingesetzt werden.
5. Die mikrobielle Mischkultur des vorliegenden Verfahrens ist fakultativ anaerob, so dass sie unter aneroben und anoxischen Bedingungen kultiviert werden kann.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Bakterienkonsortium zur Detoxifikation von (Per)Chlorat und/oder Nitrat im Wesentlichen bestehend aus Halomonas sp. NIIST-PRB-G2 (MTCC Nr. 5911), Bacillus sp. NIIST-PRB -03 (MTCC Nr.5912) und Serratia marcescens-Stamm NHST5 (MTCC-Nr. 58.).
Bioprozess zur Detoxifikation von (per)chlorat- und/oder nitrathaltigen Matrizen unter Verwendung eines Bakterienkonsortiums, wobei der Prozess die folgenden Schritte umfasst: a. Kultivieren eines Bakterienkonsortiums und Bereitstellung von Substraten/Nährstoffen und Bedingungen zur Aufrechterhaltung der mikrobiellen Aktivität b. Kontaktierung der mit (Per)Chlorat und/oder Nitrat kontaminierten Matrix mit dem Bakterienkonsortium bei Redoxpotential unter -200 mV, neutralen pH-Wert und 30 ± 5° C über eine Zeitdauer im Bereich von 3 bis 36 Stunden, um detoxifizierte Matrizen zu erhalten.
Bioprozess nach Anspruch 2, wobei das Bakterienkonsortium fakultativ anaerob ist und im Wesentlichen aus den Bakterien der Genien Serratia, Halomonas und Bacillus besteht, welche aus salzangepasstem Schlamm aus einem Bioreaktor isoliert wurden, mit der Zugangs-Nr. MTCC-Nr. 5911, MTCC-Nr. 5912 und MTCC-Nr. 5821).
Bioprozess nach Anspruch 2, wobei die Bakterien in Suspension kultiviert oder an eine geeignete inerte Oberfläche wie Glas, Kunststoff oder Keramik für eine dauerhafte Aktivität gebunden werden.
Bioprozess nach Anspruch 2, wobei (per)chlorat- und/oder nitrathaltige Matrizen in Treibmittel-Abwässern, die Perchlorat, Ammoniak, einen hohen Salzgehalt und einen sauren oder alkalischen pH-Wert enthalten, oder feste Matrizen mit einem Salzgehalt bis zu 15% und einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 10 und Perchlorat bis zu 5g/L, dekontaminiert werden können.
Bioprozess nach Anspruch 2, bei dem mit (Per)chlorat kontaminiertes Bodensickerwasser mit diesem Konsortium aufbereitet werden kann.
Bioprozess nach Anspruch 2, wobei der Nährstoff in Schritt (a), ein Mineralsalz-Nährmedium ist, das (g/LWasser) K₂HPO₄-0.22, KH₂PO₄-0.22, (NH₄)₂SO₄-0.22, MgSO₄.7H₂O-0.05, CaCO₃-0.005, FeSO₄.7H₂O-0.005, KClO₄-1.5 g/L und Spurenmetalllösung -1.0 ml enthält.
Bioprozess nach Anspruch 2, wobei das Konsortium Perchlorat im Bereich von ≥ 5 g/L und Nitrat im Bereich von > 5g/L reduzieren kann.
Bioprozess nach Anspruch 8, wobei die Reduktion von Nitrat und Perchlorat unter Verwendung von gemischter Bakterienkultur optional in Gegenwart von Ammonium durchgeführt wurde.
Bioprozess nach Anspruch 1, wobei das Bakterienkonsortium mit (Per)Chlorat und/oder Nitrat in einer Konzentration von ≥ 5 g/L kontaktiert wurde.