DE112015000456T5

DE112015000456T5 - Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung in der Behandlung inflammatorischer und Autoimmun-Krankheiten

Info

Publication number: DE112015000456T5
Application number: DE112015000456.4T
Authority: DE
Inventors: Owen J. McCarty; Norah Verbout; Halina Offner-Vandenbark; Erik I Tucker
Original assignee: Oregon Health Science University; US Department of Veterans Affairs VA
Current assignee: Oregon Health Science University; US Department of Veterans Affairs VA
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2016-10-06
Also published as: GB2537783B; US20170007681A1; CA2936065A1; GB201614318D0; US10137177B2; CA2936065C; WO2015112547A1; GB2537783A

Abstract

Vorliegend werden Verfahren zur Behandlung der Neuroinflammation durch die Verabreichung eines selektiven Protein-C-Aktivators, wie bspw. rekombinantes humanes WE Thrombin und ggf. eines oder mehreren von dessen Cofaktoren offenbart. Ferner sind pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in der Behandlung von Säugetieren offenbart, welche Symptome einer neurologischen Inflammation zeigen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen und die pharmakologische Dosis weisen eine sichere und effektive Menge an WE Thrombin auf.

Description

BEZUGNAHME AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Anmeldung nimmt die Priorität der US Provisional Application Nr. 61/930,231 in Anspruch, die am 22. Januar 2014 eingereicht wurde, und die durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen ist.
GEBIET
Die vorliegende Offenbarung betrifft die Behandlung von inflammatorischen und/oder Autoimmun-Krankheiten. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Offenbarung die Behandlung von neuroinflammatorischen Krankheiten, wie beispielsweise Multiple Sklerose, mit einer modifizierten Form von rekombinantem Thrombin.
BERÜCKSICHTIGUNG STAATLICHER UNTERSTÜTZUNGEN
Die vorliegende Erfindung wurde von staatlicher Seite unter den Förderungsnummern HL095315, HL117589 und HL109172 unterstützt, vergeben von den ”National Institutes of Health”. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
HINTERGRUND
Enzephalitis ist ein Sammelbegriff für akute, remittierende oder chronische neuro-inflammatorische Krankheiten des zentralen Nervensystems (ZNS), die durch die Zerstörung der Myelinscheiden, axonale Schädigung und neuronale Verletzung oder Tod gekennzeichnet sind. Es gibt dabei infektiöse oder nicht-infektiöse oder autoimmune Formen der Neuroinflammation. Verbreitete Beispiele einer nicht-infektiösen Neuroinflammation schließen die Alzheimer Erkrankung, Parkinson'sche Erkrankung und die Multiple Sklerose (MS) mit ein, wohingegen seltenere Formen die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) mit einschließen, sowie andere chronische neurologische Erkrankungen. Frühe pathologische Symptome bei den akuten/subakuten Formen der MS deuten auf die Entzündung der Blutgefäße innerhalb der neurovaskulären Einheit als anfängliches pathogenes Ereignis hin. Patienten mit einer Neuroinflammation, einschließlich MS, zeigen dauerhafte funktionale Defizite, die mit einer Demyelinisierung und einer Läsionen-Bildung einhergehen. Während symptomatische MS-Patienten irgendeine Form eines neurologischen Defizits entwickeln, gibt es im klinischen Erscheinungsbild, dem Krankheitsverlauf und den pathologischen Eigenschaften Unterschiede. So kann ein temporäres akutes Verschlimmern der Symptome bei der akuten oder remittierenden MS ganz besonders niederschmetternd sein. Gegenwärtige Behandlungen solcher Krisen, einschließlich von Kortikosteroiden oder Interferon, sind bis zu einem bestimmten Grad effektiv; einige Patienten ziehen hieraus jedoch nur einen geringen oder gar keinen Nutzen. Trotz dieser Heterogenität ist ein gemeinsames Merkmal der MS die Unterbrechung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die mit einem klinischen Relaps verbunden ist. Die frühesten Ereignisse, die mit der BHS-Unterbrechung verbunden sind, sind die Extravastation von Immunzellen, das Streuen von Blutproteinen und die Aktivierung von Mikroglia. Unter den Proteinen, die ins ZNS einwandern, sind Faktoren der Blutgerinnungskaskade.
Die Pathogenese der Neuroinflammation wurde mit einer lokalen Aktivierung des Gerinnungssystems und der Ablagerung von Fibrin in Verbindung gebracht. Blutgefäßverletzungen fördern die Blutgerinnungs-Aktivierung und Thrombogenese in einem starken Ausmaß. Die Analyse von Hirngewebe von MS-Patienten offenbarte, dass innerhalb von MS-Läsionen und um Blutgefäße herum Gerinnungsproteine vorliegen, einschließlich der Ablagerung von Fibrin, dem Produkt der Thrombin-vermittelten Spaltung von Fibrinogen. Unter diesen Gerinnungsproteinen befinden sich Prä-Gerinnungsenzyme, Gewebefaktoren, Protein-C-Inhibitoren und Fibrinogen. Fibrinogen ist ein klassischer Reaktant der akuten Phase, der Bindestellen für zelluläre Rezeptoren aufweist, die entzündliche Prozesse regulieren. Ferner ist es ein Hauptsubstrat für die prokoagulierende Serinprotease Thrombin. Die Verabreichung von Heparin, einem direkten Inhibitor von Thrombin, reduziert die Anzahl der MS-Entzündungsherde, was nahelegt, dass eine Anti-Koagulations-Behandlung im Rahmen einer MS-Therapie wirksam sein könnte. Experimentelle Modelle für die Neuroinflammation unterstützen diesen Ansatz, da weder Heparin noch der direkte Thrombin-Inhibitor Hirudin bei der experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) wirksam ist. Vergleichsstudien in Fibrinogen-defizienten Mäusen oder in Mäusen mit einer Fibrin-Depletion durch eine prophylaktische Verabreichung von Antikoagulanzien oder Batroxobin konnten auf ähnliche Weise zeigen, dass Fibrin zumindest ein Thrombin-Substrat ist, das das Fortschreiten und die Schwere der EAE-Erkrankung vorantreibt. Bis heute wurden jedoch keine klinischen randomisierten Kontrollstudien durchgeführt, um die Verwendung von Antikoagulanzien zur Verbesserung des Verlaufs von neuroinflammatorischen Krankheiten, einschließlich von MS, zu untersuchen.
Das aktivierte Protein C (APC) ist eine Plasma-Serin-Protease mit Antikoagulationseigenschaften. APC wird durch den molekularen Komplex aus Thrombomodulin und Thrombin auf der Oberfläche von Endothelzellen gebildet. Zusätzlich zur Reduzierung der Thrombingeneration fungiert APC auch als Signalmolekül und zeigt durch die Aktivierung des Protease-aktivierten Rezeptors I (PAR) und des endothelialen Protein-C-Rezeptors (EPCR) cytoprotektive, anti-inflammatorische und anti-apoptotische Effekte. Im Tiermodell bewirkte APC während einer Neuroimflammation positive Effekte im ZNS und der Peripherie, und zwar durch Unterdrückung des pro-inflammatorischen NF-κB-Signalwegs und der Apoptose in endothelialen, neuronalen und Immunzellpopulationen. Mutierte APC-Analoga mit einer reduzierten Antikoagulationsaktivität besaßen ebenfalls neuroprotektive Eigenschaften in Tiermodellen der ZNS-Verletzung. Die Möglichkeit, mit einer exogenen APC-Verabreichung neurologische Defizite zu reduzieren und eine Neuroinflammation im ZNS und der Peripherie in EAE zu unterdrücken, weist tatsächlich darauf hin, dass durch eine Verstärkung dieses Signalwegs ein therapeutisches Potential bei neuroinflammatorischen Erkrankungen, einschließlich MS, erreicht werden kann. Exogenes APC (Drotecogin alfa) ist jedoch für eine klinische Evaluierung nicht mehr verfügbar.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG
Vorliegend wird ein Verfahren zur Behandlung neuroinflammatorischer Krankheiten offenbart, wie beispielsweise MS, indem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die rekombinantes humanes WE(W215A/E217A)-Thrombin aufweist, verabreicht wird. In einigen Beispielen ist die pharmazeutische Zusammensetzung für eine intravenöse Verabreichung formuliert. In anderen Beispielen ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung einer Dosis von mindestens 2,5 μg/kg rekombinanten WE-Thrombin am Primaten oder mit 25 μg/kg an Nagetiere formuliert. In noch weiteren Beispielen wird das rekombinante WE-Thrombin über eine Expression in E. coli gewonnen.
Vorliegend werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in der Behandlung von Neuroinflammationen offenbart. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen schließen eine effektive Menge an WE-Thrombin und einen pharmazeutisch effektiven Träger mit ein. In einigen Beispielen schließt die pharmazeutische Zusammensetzung ferner Thrombomodulin mit ein. In weiteren Beispielen ist die pharmazeutische Zusammensetzung für eine intravenöse Verabreichung formuliert. In weiteren Beispielen ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung einer Dosis von mindestens 25 μg/kg rekombinanten WE-Thrombin an Nagetiere formuliert, oder 10- bis 20-fach weniger an Primaten, einschließlich Menschen. In noch weiteren Beispielen ist das rekombinante humane WE-Thrombin über eine Expression in E. coli gewonnen.
Das Vorstehende und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung eingehender beschrieben, welche zunächst auf die beigefügten Figuren Bezug nimmt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Einige der Figuren in der vorliegenden Offenbarung stellen fotografische Abbildungen dar, die in der Veröffentlichung einer Patentanmeldung nicht gut reproduziert werden können. Darüber hinaus können einige der fotografischen Abbildungen evtl. besser unter Einsatz von Farben verstanden werden, die ebenfalls nicht in Veröffentlichungen von Patentanmeldungen zur Verfügung stehen. Sämtliche fotografische Abbildungen, einschließlich Farbabbildungen, werden von den Anmeldern als Teil der ursprünglichen Offenbarung betrachtet, wobei vorbehalten wird, Abbildungen der hierin beschriebenen Figuren in hoher Qualität und/oder Farbe im weiteren Verfahren vorlegen zu dürfen.
1A ist ein Plot der mittleren Krankheitswerte von MOG/CFA/Ptx-immunisierten Mäusen. Am Höhepunkt des Krankheitsausbruchs, als die klinischen Werte > 2,5 erreichten, wurden die Mäuse jeden zweiten Tag mit einem Vehikel oder E-WE-Thrombin (25 μg/kg; i. v.) behandelt, da die effektive Dosis an humanem E-WE in Nagetieren 10- bis 20-fach höher ist als in Primaten. Die Mäuse wurden täglich bewertet und wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, eingestuft.
1B ist ein Säulendiagramm des kumulativen Krankheitsindex, welches zeigt, dass der kumulative Krankheitsindex für E-WE-Thrombin behandelte Mäuse signifikant niedriger war als der mit Vehikel behandelten Mäuse. Die dargestellten Daten stellen die Mittelwerte +/– SEM zweier unabhängiger Experimente dar, wobei n = 7–10, von welchem jeweils drei Mäuse pro Gruppe für eine ex vivo Analyse weiter untersucht wurden. Signifikante Unterschiede zwischen Vehikel- und E-WE-behandelten Gruppen wurden mit dem t-Test, p < 0,01 bestimmt.
2A ist ein Säulendiagramm, das die Häufigkeit der CD11b⁺CD45^hoch-Zellen in E-WE-Thrombin- und Vehikel-behandelten Mäusen zeigt, gemessen mittels FACS-Analyse. Die Daten stellen vereinigte ZNS-Zellen von fünf Mäusen dar.
2B ist ein Säulendiagramm, das die Häufigkeit von CD4⁺-Zellen in E-WE-Thrombin- und Placebo-behandelten Mäusen zeigt, gemessen durch FACS-Analyse. Die gezeigten Daten stellen vereinigte ZMS-Zellen von fünf Mäusen dar.
3A ist ein Säulendiagramm, das TNFα⁺-Makrophagen in E-WE-Thrombin- und Vehikel-behandelten Mäusen zeigt. Am Tag 30 wurden die Mäuse getötet und Splenozyten einer FACS-Analyse unterzogen. Um Makrophagen-Subpopulationen zu evaluieren, wurden die Zellen CD11b⁺ gegated. Die Daten sind die Mittelwerte +/– SEM von n = 3 Mäusen. Signifikante Unterschiede zwischen den mit Vehikel und mit E-WE-behandelten Gruppen wurden mittels des t-tests, *p < 0,01 bestimmt.
3B ist ein Säulendiagramm, das ICAM-1⁺-Makrophagen in mit E-WE-Thrombin und mit Vehikel behandelten Mäusen zeigt. Am Tag 30 wurden die Mäuse getötet und Splenozyten einer FACS-Analyse unterzogen. Um Makrophagen-Subpopulationen zu evaluieren, wurden die Zellen CD11b+ gegated. Die Daten sind die Mittelwerte +/– SEM von n = 3 Mäusen. Signifikante Unterschiede zwischen den mit Placebo und mit E-WE-behandelten Gruppen wurden mittels des t-tests, *p < 0,01 bestimmt.
4A stellt eine Abbildung des Thoraxrückenmarks einer E-WE-Thrombin-behandelten Maus dar. Das Rückenmark wurde mit Toluidin-Blau gefärbt und im Hinblick auf axonale Schädigung untersucht. Die Mäuse wurden mit MOG immunisiert und wie angezeigt behandelt. Die Bereiche der Gewebeschädigung sind eingekreist und die weißen Rechtecke grenzen einen vergrößerten und nachstehend beschriebenen Bereich ein.
4B ist eine Abbildung des Thoraxrückenmarks einer E-WE-Thrombin-behandelten Maus. Das Rückenmark wurde mit Toluidin-Blau gefärbt und hinsichtlich axonaler Schädigung untersucht. Die Mäuse wurden mit MOG immunisiert und wie angegeben behandelt. Die Bereiche der Gewebeschädigung sind eingekreist und die weißen Rechtecke grenzen einen vergrößerten und nachstehend beschriebenen Bereich ein. In den Gesamtschnitten beträgt der Maßstab 100 μm und in der hochaufgelösten Darstellung beträgt der Maßstab 10 μm.
5A stellt eine Abbildung von Lendenwirbelrückenmark von Mäusen dar, die mit Vehikel (links) und E-WE-Thrombin (rechts) behandelt wurden. Das Rückenmark wurde jeweils mit einem für Fibrin(ogen)-spezifischen Antikörper markiert. Der Maßstab beträgt 100 μM.
5B ist ein Säulendiagramm des Bereichs positiver Signale auf Rückenmarksschnitten, die, wie in 5A gezeigt, relativ zum Gesamtbereich des Schnittes markiert sind.
5C ist ein Säulendiagramm des Gesamtbereiches positiver Signale in Rückenmarksabschnitten, die, wie in 5A gezeigt, markiert sind.
SEQUENZPROTOKOLL
Die Aminosäuresequenz, wie sie in dem beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführt ist, ist unter Verwendung des Standard-Dreibuchstabencodes für Aminosäuren angegeben, wie in 37 C. F. R. 1.822 definiert. Das Sequenzprotokoll wird als ASCII-Textdatei eingereicht, welche am 31. Dezember 2014 mit 2,95 KB erstellt wurde, und welche hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist. In dem beigefügten Sequenzprotokoll bedeuten:
SEQ ID Nr. 1 eine exemplarische WE-Thrombin-Aminosäuresequenz.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
I. Abkürzungen

ALS

amyotrophe Lateralsklerose

APC

aktiviertes Protein C

BHS

Bluthirnschranke

CDI

kumulativer Krankheitsindex

ZNS

zentrales Nervensystem

EAE

experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis

EPCR

endothelialer Protein-C-Rezeptor

FACS

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

ICAM

interzelluläres Adhäsionsmolekül

MOG

Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein

MS

Multiple Sklerose

PAR

Protease-aktivierter Rezeptor

PMN

polymorpho-nucleäre Neutrophile

Ptx

Pertussis Toxin

TNF

Tumornekrosefaktor

II. Begriffe und Methoden
Sofern nicht anderweitig angegeben, werden technische Begriffe gemäß üblicher Verwendung eingesetzt. Definitionen allgemeiner Begriffe aus der Molekularbiologie können beispielsweise in Benjamin Lewin, Genes V, veröffentlicht durch Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (Herausgeber), The Encyclopedia of Molecular Biology, veröffentlicht durch Blackwell 10 Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); und Robert A. Meyers (Herausgeber), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, veröffentlicht durch VCR Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8), gefunden werden.
Sofern nicht anderweitig erklärt, haben sämtliche hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die üblicherweise von einem Fachmann, an welchen diese Offenbarung gerichtet ist, verstanden wird. Die einzelnen Begriffe ”ein”, ”eine” und ”das” schließen auch deren Mehrzahl mit ein, es sei denn, der Zusammenhang weist eindeutig auf anderes hin. Auf ähnliche Weise soll der Ausdruck ”oder” auch ”und” mit einschließen, es sei denn, der Zusammenhang weist eindeutig auf etwas anderes hin. Es sollte ferner klar sein, dass sämtliche Basengrößen oder Aminosäuregrößen, sowie sämtliche Molekulargewichte und Werte für die molekulare Masse, die für Nukleinsäuren und Polypeptide angegeben sind, Näherungswerte darstellen, und für Beschreibungszwecke hierin vorgesehen sind. Obgleich Verfahren und Materialien zur Ausführung oder Testung dieser Offenbarung eingesetzt werden können, welche ähnlich oder gleich mit den hierin beschriebenen sind, werden nachstehend geeignete Verfahren und Materialien beschrieben. Der Ausdruck ”umfasst” bedeutet ”schließt mit ein”.
Darüber hinaus sind die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich veranschaulichend und sollen nicht einschränkend sein. Um die Durchsicht der verschiedenen Ausführungsbeispiele der Offenbarung zu vereinfachen, werden die folgenden Erläuterungen spezifischer Begriffe aufgeführt:
Verabreichung: Einem Subjekt einen Wirkstoff, wie beispielsweise eine Zusammensetzung, die rekombinantes WE-Thrombin aufweist, mittels eines effektiven Verabreichungswegs bereitzustellen oder zu geben. Beispielhafte Verabreichungswege schließen eine Injektion (wie beispielsweise subkutan, intramuskulär, intradermal, intraperitoneal und intravenös) mit ein, sowie orale, sublinguale, rektale, transdermale, intranasale, vaginale und Inhalations-Verabreichungswege, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Autoimmun-Krankheit: Eine Erkrankung, in welcher das Immunsystem eine Immunantwort (beispielsweise eine B-Zell- oder T-Zell-Antwort) gegen ein endogenes Antigen hervorruft, mit nachfolgender Gewebeschädigung.
Demyelinisierung: Der Verlust oder die Schädigung von Myelin, oder beeinträchtigtes Wachstum oder Entwicklung der Myelinscheide. Die Demeylinisierung inhibiert die Übertragung von Signalen in betroffenen Nerven, wodurch eine Beeinträchtigung im Gefühl, der Bewegung, der Erkennung oder anderen Funktionen, bei denen Nerven beteiligt sind, verursacht wird. Demyelinisierungs-Erkrankungen haben eine Anzahl an unterschiedlichen Ursachen und können vererbt oder erworben sein. In manchen Fällen wird die Demyelinisierungs-Erkrankung durch einen infektiösen Wirkstoff verursacht, eine Autoimmunantwort, einen toxischen Wirkstoff oder eine traumatischen Verletzung. In anderen Fällen ist die Ursache der Demyelinisierungs-Erkrankung unbekannt, oder entwickelt sich aus einer Kombination von Faktoren.
Enzephalopathie: Eine Erkrankung oder Krankheit des Gehirns.
Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE): Ein Tiermodell für MS (siehe beispielsweise Gold et al., Brain 129: 1953–1971, 2006). EAE-Tiere zeigen charakteristische Plaques an Gewebeverletzungen, die im gesamten zentralen Nervensystem gestreut sind. Die Plaques zeigen die Unterwanderung von Nervengewebe durch Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, die eine Zerstörung der Myelinscheide verursachen können, welche die Nervenzell-Axone im Gehirn und im Rückenmark umgibt. In einigen Fällen wird die EAE durch Immunisierung von empfänglichen Tieren induziert, wie beispielsweise Mäusen, Ratten, Meerschweinchen oder nicht-humanen Primaten, mit entweder Myelin oder verschiedenen Komponenten von Myelin. So kann EAE beispielsweise durch eine Immunisierung mit Komponenten der Myelinscheide induziert werden, wie beispielsweise mit dem Myeln-basischen Protein, dem Proteolipid-Protein oder dem Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG). Die EAE ist ein nützliches und weit verbreitetes Modell zur Untersuchung von Mechanismen in Autoimmun-ZNS-Gewebeverletzungen und zur Erprobung potentieller Therapien für MS. EAE schließt auch ”passive EAE” mit ein, die auf gleiche Weise in Spendertieren induziert wird, beinhaltet jedoch den Transfer aktivierter T-Zellen, die aus Lymphknoten von Spendertieren gewonnen wurden, auf unbehandelte Empfängertiere.
Inflammation: Eine lokale, schützende Antwort, die durch eine Verletzung an Gewebe hervorgerufen wird, die dazu dient, Inflammationsstoffe zu binden. Eine Inflammation wird durch eine komplexe biologische Antwort von Gefäßgeweben auf schädliche Stimuli gesteuert, wie beispielsweise Pathogenen, geschädigten Zellen, oder Reizmittel. Es ist ein Schutzversuch des Organismus, um die verletzenden Stimuli zu entfernen, wie auch den Heilungsprozess des Gewebes zu initiieren. Eine Inflammationsreaktion ist durch eine Akkumulation weißer Blutzellen gekennzeichnet, und zwar entweder systemisch oder lokal an der Inflammationsstelle. Die Inflammationsreaktion kann durch viele im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden, wie beispielsweise anhand der Anzahl der weißen Blutkörperchen, der Anzahl an polymorpho-nucleären Neutrophilen (PMN), des Maßes des Grades der PMN-Aktivierung, wie beispielsweise der luminalen verstärkten Chemilumineszenz, oder des Maßes der Menge an vorliegendem Zytokin. Eine primäre Inflammationserkrankung ist eine Erkrankung, die durch die Inflammation selber verursacht wird. Eine sekundäre Inflammationserkrankung ist eine Inflammation, die das Ergebnis einer anderen Erkrankung ist. Eine Inflammation kann zu einer Vielzahl an Inflammationserkrankungen führen, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, entzündliche Lungenerkrankung (einschließlich der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung), entzündliche Darmerkrankungen (einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn), parodontale Erkrankungen, Polymyalgia rheumatica, Arteriosklerose, systemischer Lupus erythematodes, systemische Sklerose, Sjörgen's Syndrom, Astma, allergische Rhinitis und Hauterkrankungen (einschließlich Dermatomyositis und Psoriasis) und Ähnlichem. Autoimmun-Krankheiten, die eine entzündliche Komponente mit einschließen (einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt: Multiple Sklerose), werden auch als Inflammationskrankheiten betrachtet.
Multiple Sklerose: Eine Autoimmunerkrankung, die klassischerweise als eine Erkrankung der weißen Substanz des zentralen Nervensystems beschrieben wird, die über die Zeit und räumlich streut, und welche als schubförmig wiederkehrende Erkrankung in 80–85% der Patienten vorliegt. Die Diagnose kann durch Kernspintomografie des Gehirns und des Rückenmarks (MRI) vorgenommen werden, ferner durch die Analyse von somatosensorischen Erregungspotentialen, sowie der Analyse der Rückenmarks-flüssigkeit, um erhöhte Mengen an Immunglobulinen oder oligoklonalen Banden zu detektieren. MRI ist ein besonders sensitives diagnostisches Werkzeug. MRI-Abnormalitäten, die auf das Vorliegen oder die Progression von MS hinweisen, schließen hyperintense Signale der weißen Substanz in T2-gewichteten und ”FLAIR(fluid attenuated inversion recovery)-Abbildungen, Gadolinium-Verstärkung von Aktivaläsionen, hypointensive ”schwarze Löcher” (welche Gliose und axonale Pathologien darstellen), sowie eine Gehirnatrophie in T1-gewichteten Studien mit ein. Serielle MRI-Studien können dazu eingesetzt werden, um den Krankheitsverlauf anzuzeigen. Die schubförmig remittierende Multiple Sklerose (RRMS) ist ein klinischer Verlauf der MS, der durch klar definierte, akute Attacken mit voller oder teilweiser Gesundung und keiner Krankheits-Progression zwischen den Attacken charakterisiert ist. Die sekundär-progressive Multiple Sklerose (SPMS) ist ein klinischer Verlauf der MS, der anfänglich schubförmig remittierend ist, und dann in unterschiedlichem Maße progressiv wird, möglicherweise mit einem gelegentlichen Rückfall und kleinen Remissionen. Die primäre progressive Multiple Sklerose (PPMS) stellt die von Anfang an progressive Form dar.
Neurodegenerative Erkrankungen: Jede Art von Erkrankung oder Krankheit, die mit dem progressiven Verlust motorischer, sensorischer und/oder perzeptueller Funktionen verbunden ist, und bei welcher oftmals Verhaltens- und kognitive Defizite involviert sind. Neurodegenerative Krankheiten sind typischerweise durch den progressiven Verlust der Struktur oder Funktion von Neuronen charakterisiert, wie beispielsweise von Neuronen innerhalb des zerebralen Kortex, der basalen Ganglien, des Zerebellums, des Hirnstamms oder des Bewegungssystems. Neurodegenerative Erkrankungen schließen Alzheimer Erkrankung, Parkinson'sche Erkrankung, Huntington's Erkrankung, ALS, Multiple Sklerose, Lewy-Body-Demenz, vaskuläre Demenz, progressive supranukleäre Lähmung, kortikobasale Degeneration, Multiple-System-Atrophie und frontotemporale Demenz mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Neuroinflammation: Entzündung des Nervengewebes. Neuroinflammation kann als Antwort auf eine Vielzahl an unterschiedlichen Signalen auftreten, einschließlich Infektionen, traumatische Verletzungen des Gehirns, toxische Metaboliten, Alterung oder Autoimmunität (wie beispielsweise Multiple Sklerose). Die Neuroinflammation ist typischerweise chronisch und resultiert aus einer anhaltenden Aktivierung von Gliazellen und der Rekrutierung anderer Immunzellen ins Gehirn. Das zentrale Nervensystem ist typischerweise eine immunologisch privilegierte Stelle, da periphere Immunzellen durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) üblicherweise blockiert werden. Dennoch können zirkulierende periphere Immunzellen eine beeinträchtigte Blut-Hirn-Schranke überschreiten und Neuronen und Gliazellen begegnen, die Haupthistokompatibilitätskomplex-Moleküle exprimieren, wodurch die Immunantwort weitergeführt wird.
Pharmazeutisch akzeptierbare Träger: Die eingesetzten pharmazeutisch akzeptierbaren Träger sind herkömmlicher Art. Remington's ”Pharmaceutical Sciences” von E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19. Auflage, 1995, beschreibt Zusammensetzungen und Formulierungen, die für die pharmazeutische Verabreichung der hierin offenbarten Zusammensetzungen geeignet sind. Ganz allgemein wird die Art des Trägers von der bestimmten und eingesetzten Verabreichungsart abhängen. So weisen beispielsweise parenterale Formulierungen gewöhnlicherweise injizierbare Fluide auf, die pharmazeutisch und physiologisch akzeptierbare Fluide mit einschließen, wie beispielsweise Wasser, physiologische Saline, ausbalanzierte Salzlösungen, wässrige Dextrose, Glycerol oder Ähnliches als Vehikel. Bei festen Zusammensetzungen (wie beispielsweise Pulver, Pillen, Tabletten oder Kapselformen) können herkömmliche nicht-toxische feste Träger beispielsweise Mannitol, Laktose, Stärke oder Magnesiumstearat in pharmazeutischer Qualität mit einschließen. Zusätzlich zu biologisch neutralen Trägern können die verabreichten pharmazeutischen Zusammensetzungen kleine Mengen an nicht toxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie beispielsweise Benetzungsmittel oder Emulgierstoffe, Konservierungsstoffe und pH-Pufferstoffe und ähnliche, wie beispielsweise Natriumazetat oder Sorbitanmonolaurat.
Polypeptide: Jede Aminosäurenkette, unabhängig von der Länge oder von posttranslationaler Modifizierung (wie beispielsweise Glykosylierung, Methylierung, Ubiquitinierung, Phosphorylierung oder Ähnlichem). In einer Ausführungsform ist ein Polypeptid ein WE-Thrombin-Polypeptid. ”Polypeptid” wird hierin austauschbar mit ”Protein” verwendet, und wird dazu verwendet, auf ein Polymer an Aminosäureresten zu verweisen. Ein ”Rest” bezieht sich auf eine Aminosäure oder ein Aminosäure-Mimetikum, die/das über eine Amidbindung oder Amid-Mimetikum-Bindung in ein Polypeptid eingebaut ist.
Protein-C-Aktivierungs-Cofaktor: Im Zusammenhang der vorliegenden Offenbarung ist ein ”Protein-C-Aktivierungs-Cofaktor” ein Molekül, wie beispielsweise ein Protein, das mit Thrombin (einschließlich WE-Thrombin) zusammenarbeitet, um Protein-C zu aktivieren. In einigen hierin offenbarten Ausführungsformen ist der Protein-C-Aktivierungs-Cofaktor Thrombomodulin.
Rekombinant: Eine rekombinante Nukleinsäure oder ein rekombinantes Polypeptid ist eines, das eine Sequenz aufweist, die nicht natürlich vorkommt, oder eine Sequenz besitzt, die durch eine künstliche Kombination zweier oder mehrerer sonst getrennter Sequenzsegmente hergestellt ist. Diese künstliche Kombination wird oftmals durch eine klinische Synthese oder durch die künstliche Manipulation isolierter Nukleinsäuresegmente erreicht, wie beispielsweise durch gentechnische Verfahren.
Sichere und effektive Menge: Eine Menge eines Stoffes, wie beispielsweise rekombinantes WE-Thrombin, das ausreichend ist, um eine gewünschte Antwort hervorzurufen, wie beispielsweise die Reduktion oder Eliminierung eines Anzeichens oder Symptoms eines Krankheitszustands oder einer Erkrankung, wie beispielsweise Neuroinflammation. Bei Verabreichung an ein Subjekt wird üblicherweise eine Dosierung verwendet, mit welcher eine sichere antithrombotische Aktivität in Primaten in vivo erreicht wird. In einigen Beispielen ist eine ”effektive Menge” eine Menge, mit welcher ein oder mehrere Symptome und/oder zugrundeliegende Ursachen irgendeiner Art an entzündlicher und thrombotischer Erkrankung oder Krankheit, wie beispielsweise Multiple Sklerose, behandelt werden kann (einschließlich Prophylaxe). Eine effektive Menge kann eine therapeutisch effektive Menge sein, einschließlich einer Menge, die das Auftreten eines oder mehrerer Anzeichen oder Symptome einer bestimmten Erkrankung oder Krankheitszustand verhindert, wie beispielsweise eines oder mehrerer Zeichen oder Symptome, die mit Neuroinflammation assoziiert sind.
Sequenzidentität/-ähnlichkeit: Die Identität/Ähnlichkeit zwischen einer oder mehreren Nukleinsäuresequenzen oder zweier oder mehrere Aminosäuresequenzen wird durch die Identität oder Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen ausgedrückt. Eine Sequenzidentität kann durch den Prozentsatz an Identität gemessen werden; je höher der Prozentsatz ist, desto identischer sind die Sequenzen. Eine Sequenzähnlichkeit kann durch den Prozentsatz an Ähnlichkeit gemessen werden (der konservierte Aminosäuresubstitutionen berücksichtigt); je höher der Prozentsatz ist, desto ähnlicher sind die Sequenzen.
Verfahren zum Sequenzalignment für Vergleichszwecke sind im Stand der Technik bekannt. Verschiedene Programme und Alignment-Algorithmen sind beschrieben in: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 237–44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881–90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155–65, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24: 307–31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–10, 1990, offenbart eine detaillierte Beschreibung von Verfahren zum Sequenzalignment und für Homologie-Berechnungen.
Das ”NCBI Basic Local Alignment Search Tool” (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–10, 1990) ist bei verschiedenen Quellen verfügbar, einschließlich des ”National Center for Biological Information” (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Raum 8N805, Bethesda, MD 20894) sowie im Internet, zur Verwendung in Verbindung mit den Sequenzanalyseprogrammen Blastp, Blastn, Blastx, Tblastn und Tblastx. Weitergehende Informationn können auf der NCBI-Website gefunden werden. BLASTN wird eingesetzt, um Nukleinsäuresequenzen zu vergleichen, während BLASTP eingesetzt wird, um Aminosäuresequenzen zu vergleichen. Wenn die zwei zu vergleichenden Sequenzen eine Homologie teilen, wird die bestimmte Ausgangsdatei die Homologieregionen als alignte Sequenzen präsentieren. Wenn die beiden zu vergleichenden Sequenzen keine Homologie teilen, wird die bestimmte Ausgangsdatei keine alignten Sequenzen darstellen.
Bei einem Alignment wird die Anzahl der Treffer durch die Anzahl der Positionen bestimmt, an welchen identische Nukleotid- oder Aminosäurereste in beiden Sequenzen vorliegen. Der Prozentsatz an Sequenz-Identität wird bestimmt, indem die Anzahl der Treffer entweder durch die Länge der in der identifizierten Sequenz angegebenen Sequenz geteilt wird, oder durch eine festgesetzte Länge (wie beispielsweise 100 aufeinander folgende Nukleotid- oder Aminosäurereste von einer Sequenz, die in einer identifizierten Sequenz angegeben ist), gefolgt von einer Multiplizierung des sich ergebenden Wertes um 100. So ist beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz, die 1166 Übereinstimmungen in einem Alignment mit einer Testsequenz, die 1154 Nukleotide besitzt, hat, zu 75 Prozent identisch mit der Testsequenz (1166 ÷ 1554·100 = 75,0). Der Prozentwert der Sequenzidentität wird auf das nächstliegende Zehntel gerundet. So werden beispielsweise 75,11, 75,12, 75,13, und 75,14 auf 75,1 abgerundet, wohingegen 75,15, 75,16, 75,17, 75,18, und 75,19 auf 75,2 aufgerundet werden. Der Wert der Länge wird immer ganzzahlig sein. In einem anderen Beispiel weist eine Zielsequenz, die eine 20-Nukleotideregion besitzt, die ein übereinstimmendes Alignment mit 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von einer identifizierten Sequenz wie folgt besitzt, eine Region auf, die eine 75-prozentige Sequenzidentität mit der identifizierten Sequenz teilt (das heißt 15 ÷ 20·100 = 75).
Für Vergleichszwecke von Aminosäuresequenzen, die länger sind als 30 Aminosäuren, wird die Bast 2 Sequenzfunktion eingesetzt, unter Einsatz der vorgegebenen BLOSUM 62-Matrix, die auf vorgegebene Parameter festgesetzt ist (”gap existence cost” von 11, und pro ”residue gap cost” 5 von 1). Homologe Werte werden typischerweise durch eine 70%-ige Sequenzidentität charakterisiert, gemessen über ein Gesamtlängen-Alignment mit einer Aminosäuresequenz unter Einsatz des NBCI Basic Blast 2,0, gapped blastp mit Datenbanken, wie nr oder der Swissprot Datenbank. Anfragen, die mittels de blastn Programms vorgenommen werden, werden mit DUST gefiltert (Hancok und Armstrong, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 67–70). Andere Programme verwenden SEG. Darüber hinaus kann ein händisches Alignment durchgeführt werden. Proteine mit noch größerer Ähnlichkeit werden ansteigende Prozentsätze in der Identität zeigen, wenn sie mittels dieses Verfahrens untersucht werden, wie beispielsweise mindestens ungefähr 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit einem Protein.
Bei dem Alignment kurzer Peptide (weniger als ungefähr 30 Aminosäuren) wird das Alignment unter Verwendung der Blast 2 Sequenzfunktionen durchgeführt, unter Einsatz der PAM30-Matrix, die auf vorgegebene Parameter eingestellt ist (open gap 9, extension gap 1 penalties). Proteine mit noch größerer Ähnlichkeit zu der Referenzsequenz werden ansteigende Prozentsätze der Identität zeigen, wenn sie durch dieses Verfahren bestimmt werden, wie beispielsweise ungefähr 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit einem Protein. Wenn weniger als die Gesamtsequenz zum Zwecke der Bestimmung der Sequenzidentität vergeben wird, werden Homologe typischerweise mindestens 70% Sequenzidentität über kurze Längen von 10–20 Aminosäuren aufweisen, und können Sequenzidentitäten von zumindest 85%, 90%, 95% oder 98% aufweisen, in Abhängigkeit von ihrer Identität zu der Referenzsequenz. Verfahren zur Bestimmung der Sequenzidentität über solche kurzen Längen werden auf der NCBI-Website beschrieben.
Ein Anzeichen, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nahe miteinander verwandt sind, liegt darin, dass die beiden Moleküle unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren, wie oben beschrieben. Nukleinsäuresequenzen, die keinen hohen Grad an Identität besitzen, können trotzdem für viele identische oder ähnliche (konservierte) Aminosäuresequenzen kodieren, und zwar aufgrund der Degeneration des genetischen Codes. Änderungen in einer Nukleinsäuresequenz können unter Einsatz dieser Degeneration vorgenommen werden, um verschiedene Nukleinsäuremoleküle herzustellen, die alle im Wesentlichen für das gleiche Protein kodieren. Ein alternatives (und nicht notwendigerweise kumulatives) Anzeichen, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, liegt darin, dass das Polypeptid, für welches die erste Nukleinsäure kodiert, immunologisch kreuzreagiert mit dem Polypeptid, für das die zweite Nukleinsäure kodiert.
Dem Fachmann wird offensichtlich sein, dass die Bereiche der bestimmten Sequenzidentitäten lediglich als Leitfaden zur Verfügung gestellt werden; es ist möglich, dass stark signifikante Homologe gewonnen werden können, die außerhalb der hierin beschriebenen Bereiche fallen.
Subjekt: Ein lebender multizellulärer Wirbelorganismus, eine Kategorie, die beispielsweise Säugetiere und Vögel mit einschließt. Ein ”Säugetier” schließt sowohl humane als auch nicht-humane Säugetiere mit ein, wie beispielsweise Mäuse oder nicht-humane Primaten. In einigen Beispielen ist ein Subjekt ein Patient, wie beispielsweise ein Patient, der Multiple Sklerose hat oder bei dem das Risiko besteht, dass er Multiple Sklerose entwickelt.
Therapeutisch effektive Menge: Eine Dosierung, die ausreichend ist, das Fortschreiten der Erkrankung zu verhindern, oder eine Regression der Erkrankung zu bewirken, oder welche dazu in der Lage ist, durch die Krankheit verursachte Symptome zu reduzieren, wie beispielsweise bei einer Multiplen Sklerose.
Thrombomodulin: Ein integrales Membranprotein, das auf der Oberfläche von endothelialen Zellen exprimiert wird, und das als Cofaktor in der Thrombin-induzierten Aktivierung von Protein-C dient. Thrombomodulin (TM) ist auch als CD141 oder BDCA-3 bekannt.
Behandlung einer Erkrankung: Die Inhibierung der vollen Entwicklung einer Erkrankung oder eines Krankheitszustands, wie beispielsweise in einem Subjekt, das eine Erkrankung, wie beispielsweise Multiple Sklerose hat, oder bei dem das Risiko besteht, dass es die Krankheit entwickelt. ”Behandlung” bezieht sich auf jeden therapeutischen Eingriff, der ein Anzeichen oder ein Symptom einer Erkrankung oder eines pathologischen Krankheitszustands, wie beispielsweise Neuroinflammation, verbessert. Der Ausdruck ”Verbesserung” in Bezug auf eine Erkrankung oder einen pathologischen Krankheitszustand, bezieht sich auf jeden beobachtbaren positiven Effekt der Behandlung. Der positive Effekt kann beispielsweise durch einen verzögerten Ausbruch der klinischen Symptome der Erkrankung in einem empfänglichen Subjekt beobachtet werden, in einer Reduktion der Schwere einer oder aller klinischer Symptome der Erkrankung, einer langsameren Progression der Erkrankung, einer Verbesserung des Gesundheitszustands oder des Wohlergehens des Subjekts, oder durch andere klinische oder physiologische Parameter, die mit einer bestimmten Erkrankung assoziiert sind. Eine ”prophylaktische” Behandlung ist eine Behandlung, die an einem Subjekt vorgenommen wird, welches keine Anzeichen einer Erkrankung zeigt, oder welches lediglich Frühanzeichen zeigt, und zwar zum Zwecke der Risikoverminderung zur Entwicklung einer Pathologie. Eine ”therapeutische” Behandlung ist eine Behandlung, die nach der Entwicklung signifikanter Zeichen oder Symptome der Erkrankung verabreicht wird.
WE-Thrombin: Eine Form von humanen Thrombinen, welche eine Mutation des Tryptophans (W) am Rest 215 und des Glutamats (E) am Rest 217 aufweist, einschließlich aller Homologen davon, mit äquivalenter oder ähnlicher Aktivität. In einem Beispiel weist das WE-Thrombin eine W→A-Mutation und/oder eine E→A-Mutation auf. Ein Beispiel einer WE-Thrombinsequenz ist die SEQ ID Nr. 1. E coli-abgeleitetes WE-Thrombin ist äquivalent zu WE-Thrombin, das durch andere Verfahren produziert wird; auf dieses wird wechselweise als ”EWE-Tthrombin”, ”EWE”, oder ”WE” hierin Bezug genommen. WE-Thrombin wird detailliert in Gruber et al. beschrieben, US Patent 6,706,512 , das hierin eingeschlossen ist durch Bezugnahme. In manchen Ausführungsformen ist das WE-Thrombin zumindest 80%, zumindest 85%, zumindest 90%, zumindest 95%, zumindest 96%, zumindest 97%, zumindest 98% oder zumindest 99% identisch mit SEQ ID Nr. 1, und weist ein Alanin (A) an den Positionen 215 und 217 auf. In besonderen Beispielen weist das WE-Thrombin die folgende Aminosäuresequenz auf oder besteht aus dieser:
TFGSGEADCGLRPLFEKKSLEDKTERELLESYIDGRIVEGSDAEIGMSPWQVMLFRKSPQ ELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDKNFTENDLLVRIGKHSRTRYERNIEKISMLEKIYI HPRYNWRENLDRDIALMKLKKPVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYKGRVTGWGNLK ETWTANVGKGQPSVLQVVNLPIVERPVCKDSTRIRITDNMFCAGYKPDEGKRGDACEGD SGGPFVMKSPFNNRWYQMGIVSAGAGCDRDGKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDQFGE (SEQ ID Nr. 1).
III. Einleitung
Der Einsatz einer APC-Infusion zur Behandlung von Neuroinflammation kann Blutungen verursachen, da es zu einer systemischen antihämostatischen Antikoagulation führt. Die Aktivierung des endogenen Proteins C unter Verwendung einer Protein-C-Aktivator-Verbindung könnte jedoch diesen Nachteil von APC, Heparin oder anderen fluiden Antikoagulanzien überwinden. Der Effekt dieser Aktivatoren ist auf die intraluminale Oberfläche von Blutgefäßen beschränkt, wo endogenes Protein C lokalisiert ist, und zwar gebunden an seinen Rezeptor EPCR. Das Protein-C-Aktivatorenzym WE-Thrombin und Homologe hiervon, ebenso wie Aktivierungs-Cofaktoren, wie beispielsweise flüssiges Thrombomodulin, werden hierin als sichere Alternativen zur rekombinanten APC oder anderen Antikoagulanzien offenbart.
WE(W215A/E217A)-Thrombin ist ein humanes rekombinantes Thrombinanalogon, das zwei Mutationen enthält, und das ein Molekül mit signifikant reduzierter Prokoagulant-Aktivität generiert. Menschliche WE-Thrombin-Aktivität gegenüber humanem Fibrinogen und PAR-1 ist jeweils 19.000 und 1.200-fach reduziert (Cantwell and Di Cera, J Biol Chem 275: 39827–39830, 2000; und Gruber et al, US Patent 6,706,512 , die hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen sind). WE-Thrombon besitzt 10% der Thrombomodulin-abhängigen Antikoagulant-Funktion von Thrombin. Aufgrund dieses neuen Designs des Moleküls aktiviert WE-Thrombin Protein C selektiv in Gegenwart seines Cofaktors, Thrombomodulin, um APC zu bilden. Die Verabreichung von WE-Thrombin an nicht-humane Primaten bewirkte eine Aktivierung des endogenen Proteins C und die Inhibierung akuter Gefäßgraft-Thrombose ohne irgendein Anzeichen von Wund-Blutung oder anderen nachteiligen Wirkungen. Auf ähnliche Weise ist die Verabreichung seines Cofaktors, Thrombomodulin, im gleichen Modell antithrombotisch, indem die Aktivierung des Oberflächen-assoziierten Proteins C auf den endothedialen Protein-C-Rezeptoren (EPCR) unterstützt wird, auch einschließlich apoER2. Die Konzentration von APC, die nach Verabreichung von WE-Thrombin oder Thrombomodulin im Plasma detektiert wird, ist signifikant niedriger als die Konzentration an exogenen APC, die benötigt wird, um einen äquivalenten Antikoagulant-Effekt hervorzurufen. Dies ist ein bedeutender Sicherheitsvorteil der endogenen Protein-C-Aktivierung gegenüber einer APC-Verabreichung, da es das Blutungsrisiko einer Protein-C-Aktivatorbehandlung reduziert, im Vergleich zur Verabreichung von rekombinantem APC oder anderen herkömmlichen Antikoagulanzien, die inhärent antihämostatisch sind, da sie sich in einem fluiden Zustand befinden.
IV. Verfahren zur Behandlung von Neuroinflammationen
Hierin offenbart sind Verfahren zur Behandlung von Neuroinflammation in einem Subjekt. In einigen Ausführungsformen schließt das Verfahren die Auswahl eines Objekts mit Neuroinflammation mit ein, sowie die Verabreichung einer effektiven Menge an WE-Thrombin an das Subjekt, wodurch die Neuroinflammation behandelt wird. Weiterhin sind Verfahren zur Behandlung von Multiple Sklerose in einem Subjekt offenbart, mit der Auswahl eines Subjekts mit Multipler Sklerose und der Verabreichung einer effektiven Menge an WE-Thrombin an das Subjekt, wodurch die Multiple Sklerose behandelt wird. In einigen Ausführungsformen schließt das Verfahren die intravenöse Verabreichung des WE-Thrombins mit ein. In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren die Verabreichung einer Dosierung von mindestens 25 μg/kg WE-Thrombin. In einigen Beispielen umfasst das Verfahren den Einsatz von WE-Thrombin, abgeleitet aus der Expression in E. coli.
Ferner werden Verfahren zur Behandlung einer inflammatorischen und/oder Autoimmun-Krankheit oder Erkrankung einem Subjekt offenbart, indem rekombinantes WE-Thrombin verabreicht wird. In einigen Ausführungsformen ist die inflammatorische und/oder Autoimmun-Krankheit oder Erkrankung systemischer Lupus erythematosus, Sjörgren's Syndrom, rheumatoide Arthritis, Typ I Diabetes Mellitus, Wegener's Granulomatose, entzündliche Darmerkrankung, Polymyostose, Dermatomyostose, multiples Endokrin-Versagen, Schmidt Syndrom, Autoimmun-Uveitis, Zöliakie, Addisons Erkrankung, Adrenalitis, Graves-Erkrankung, Thyreoiditis, Hashimoto's Thyreoiditis, Autoimmun-Thyreoiditis, perniziöse Anämie, gastrische Atrophie, chronische Hepatitis, lupoide Hepatitis, Arteriosklerose, präsenile Demenz, demylierende Erkrankungen, subakuter kutaner Lupus erythematosus, Hypoparathyreoidismus, Dressler Syndrom, Myasthenia gravis, Autoimmun-Thrombozytopenie, idiopatische Thrombozytopenische Purpura, hämolytische Anämie, Pemphigus Vulgaris, Pemphigus, Dermatitis Herpetiformis, Alopezia arcata, Pemphigoid, Skleroderma, progressive systemische Sklerose, CREST Syndrom (Calcinose, Raynaud-Syndrom, Ösophageale Dysmotilität, Sklerodaktylie und Teleangiektasie), Erwachsenen-Diabetes Mellitus (Typ II Diabetes), männliche und weibliche Autoimmun-Unfruchtbarkeit, Spondylitis ankylosans, Colitis ulcerosa, Crohn's Erkrankung, kombinierte Erkrankung des Bindegewebes, Polyarteriitis nodosa, systemische nekrotisierende Vaskulitis, juvenile rheumatoide Arthritis, Glomerulonephritis, atopische Dermatitis, atopische Rhinitis, Goodpasture's-Syndrom, Chagas Erkrankung, Sarkoidose, rheumatisches Fieber, Asthma, wiederkehrende Abtreibung, Anti-Phospholipid-Syndrom, Farmerlunge, Erythema multiforme, Postkardiotomie-Syndrom, Cushing's-Syndrom, autoimmune chronische aktive Heptatitis, Vogelhalterlunge, allergische Erkrankung, allergische Enzephalomyelitis, toxische epidermale Nekrolyse, Alopezia, Alport's-Syndrom, Alveolitis, allergische Alveolitis, fibrosierende Alveolitis, interstitielle Lungenerkrankung, Erythema Nodosum, Pyoderma Gangrenosum, Transfusionsreaktion, Lepra, Malaria, Leishmaniose, Trypanosomiasis, Takayasu's Arthritis, Polymyalgie rheumatica, temporäre Arthritis, Schistosomiasis, Riesenzellarthritis, Askariose, Aspergillose, Sampter's Syndrom, Ekzem, lymphatoide Granulomatose, Behcet Erkrankung, Caplan-Syndrom, Kawasaki's Erkrankung, Dengue, Enzephalomyelitis, Endokarditis, endomyokardiale Fibrose, Endophthalmitis, Erythema elevatum et diutinum, Psoriasis, Erythroblastose fetalis, eosinophile Faciitis, Shulman-Syndrom, Felty's-Syndrom, Filariose, Zyklitis, chronische Zyklitis, heterochronische Zyklitis, Fuch's Zyklitis, IgA Nephropathie, Henoch-Schönlein Purpura, Glomerulonepritis, ”graft-versus-host-disease”, Transplantatabstoßung, Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus, Echovirus Infektion, Cardiomyopathie, Alzheimer's Erkrankung, Parvovirus-Infektion, Rötelnvirus-Infektion, Post-Vakzinierungssyndrome, kongenitale Röteln-Infektion, Hodgkin's und Non-Hodgkin's Lymphom, Nierenzellenkarzinom, multiples Myelom, Eaton-Lambert-Syndrom, wiederkehrende Polychondritis, malignes Melanom, Cryoglobulinemie, Waldenstrom's Makroglobulemie, Epstein-Barr-Virusinfektion, Rubulavirus oder 5 Evan's-Syndrom.
Weitere inflammatorische Erkrankungen, die behandelt werden können, schließen Osteoarthritis, entzündliche Lungenerkrankung (einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung), Paradontalerkrankung, Polymyalgie Rheumatica, Artherosklerose, systemische Sklerose, allergische Rhinitis, und Hauterkrankungen (einschließlich Dermatomyostose und Psoriasis) und Ähnliches mit ein.
In anderen Ausführungen hat das Subjekt eine Retina-Erkrankung, wie beispielsweise eine Retina-Degeneration, wie beispielsweise Retinitis Pigmentosa, Zapfenstäbchen-Dystrophie, kongenitale Leberamaurose, oder Makulopathie (beispielsweise altersbezogene Makuladegeneration, Stargardt-ähnliche Makuladegeneration, vitelliforme Makuladystrophie (Best Erkankung), Malattia Leventinese (Doyne's Wabenkörper Netzhautdystrophie), diabetische Makulapathie, verborgene Makuladystrophie oder cellophane Makulopathie. In anderen Beispielen schließt eine Netzhauterkrankung eine Retinopathie, wie beispielsweise Autoimmun-Retinopathie, mit ein, diabetische Retinopathie oder Gefäß-Retinopathie. In noch weiteren Beispielen schließt eine Netzhauterkrankung Netzhautablösung oder Glaukom mit ein. Netzhauterkrankungen können progressiv sein (beispielsweise eine Retina-Degeneration oder Glaukom) oder akut (wie beispielsweise Netzhautablösung). In weiteren Beispielen ist das Subjekt ein Subjekt mit Uveitis oder optischer Neuritis. In anderen Ausführungsformen hat das Subjekt einen Schlaganfall (wie beispielsweise einen ischämischen Schlaganfall oder einen hämorrhagischen Schlaganfall). In noch weiteren Beispielen ist das Subjekt ein Subjekt mit Drogensucht, beispielsweise ein Subjekt mit kognitiver oder neuropsychiatrischer Beeinträchtigung, ausgelöst durch Drogensucht, einschließlich Methamphetamin- und Alkoholmissbrauch.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Behandlung von Neuroinflammation in einem Subjekt bereitgestellt, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Subjekt umfasst, welche eine sichere und effektive Menge an rekombinantem WE-Thrombin oder Homologen hiervon aufweist. In einigen Beispielen schließt das Verfahren ferner den Schritt der Auswahl eines Subjekts mit Neuroinflammation mit ein. Die Neuroinflammation kann durch irgendeine einer Vielzahl an unterschiedlichen Erkrankungen, Krankheiten oder Umweltbedingungen verursacht sein, wie beispielsweise einer Infektion, einer traumatischen Hirnverletzung, toxischen Metaboliten, Alterung oder Autoimmunität (beispielsweise Multiple Sklerose). In einigen Beispielen umfasst die Neuroinflammation eine Enzephalopathie oder Demyelinisierung. In bestimmten, nicht einschränkenden Beispielen hat das Subjekt Multiple Sklerose.
In einigen Ausführungsformen der offenbarten Verfahren ist die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins zumindest 80%, zumindest 85%, zumindest 90%, zumindest 95%, zumindest 96%, zumindest 97%, zumindest 98% oder zumindest 99% identisch mit SEQ ID Nr. 1, und weist an den Positionen 215 und 217 ein Alanin auf. In bestimmten Beispielen besteht die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins aus SEQ ID Nr. 1 oder weist diese auf.
In bestimmten Ausführungsformen ist die pharmazeutische Zusammensetzung für eine intravenöse Verabreichung formuliert.
In bestimmten Ausführungsformen ist das Subjekt ein Primat und die pharmazeutische Zusammensetzung ist zur Verabreichung einer Gesamtdosis von mindestens 1,25 μg/kg WE-Thrombin formuliert.
In einigen Ausführungsformen ist das rekombinante WE-Thrombin aus der Expression in E. coli abgeleitet.
In einigen Ausführungsformen werden dem Subjekt ferner eines oder mehrere Protein-C-Aktivierungscofaktoren verabreicht. In besonderen Beispielen umfassen der eine oder mehrere Protein-C-Aktivations-Cofaktor(en) Thrombomodulin, wie beispielsweise rekombinantes lösliches humanes Thrombomodulin.
Das WE-Thrombin kann mit einem geeigneten festen oder flüssigen Träger formuliert werden, je nach der ausgewählten Verabreichungsart.
V. Pharmazeutische Zusammensetzung
Hierin offenbart sind pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in der Behandlung von Neuroinflammation in einem Subjekt, wie beispielsweise einen Subjekt mit Multipler Sklerose. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen weisen eine effektive Menge an WE-Thrombin auf. In einigen Ausführungsformen ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung formuliert. In einigen Ausführungsformen ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung einer Dosis von 25 μg/kg rekombinatem WE-Thrombin formuliert. In einigen Beispielen weist die pharmazeutische Zusammensetzung E. coli-abgeleitetes WE-Thrombin auf.
Hierin offenbart ist eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung von Neuroinflammation in einem Subjekt. In einigen Ausführungsformen schließt die pharmazeutische Zusammensetzung eine effektive Menge an rekombinantem WE-Thrombin oder einem Homolog davon mit ein; sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
In einigen Ausführungsformen ist die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins zumindest 80%, zumindest 85%, zumindest 90%, zumindest 95%, zumindest 96%, zumindest 97%, zumindest 98% oder zumindest 99% identisch mit SEQ ID Nr. 1, und weist an Position 215 und 217 ein Alanin auf. In bestimmten Beispielen weist die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins die SEQ ID Nr. 1 auf oder besteht aus dieser.
In einigen Ausführungsformen ist die pharmazeutische Zusammensetzung für die intravenöse Verabreichung formuliert.
In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt ein Primat und die pharmazeutische Zusammensetzung ist zur Verabreichung einer Gesamtdosis von mindestens 1,25 μg/kg WE-Thrombin ausgebildet.
In einigen Ausführungsformen ist das rekombinante WE-Thrombin aus der Expression in E. coli abgeleitet.
In einigen Ausführungsformen weist die Neuroinflammation eine Enzephalopathie oder Demyelinisierung auf.
In einigen Ausführungsformen ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung eines Subjekts mit Multipler Sklerose.
In einigen Ausführungsformen weist die pharmazeutische Zusammensetzung ferner eine oder mehrere Protein C Aktivierungs-Cofaktoren auf. In einigen Beispielen umfasst der eine oder mehrere Cofaktoren Thrombomodulin wie beispielsweise rekombinantes lösliches humanes Thrombomodulin.
In einigen Ausführungsbeispielen wird einem Subjekt eine effektive Menge einer Zusammensetzung verabreicht, welche rekombinantes WE-Thrombin oder einen wirksamen Abschnitt hiervon aufweist. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die das hierin offenbarte rekombinante Polypeptid aufweisen, können mit einem geeigneten festen oder flüssigen Träger formuliert werden, je nach der bestimmten ausgewählten Verabreichungsart. Die pharmazeutisch akzeptierbaren Träger und Exzipienten, die im Rahmen dieser Offenbarung nützlich sind, sind hekömmlich (siehe beispielsweise Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Herausgeber Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 21. Auflage (2005). So schließen beispielsweise parenterale Formulierungen injizierbare Fluide mit ein, die pharmazeutisch und physiologisch akzeptierbare flüssige Vehikel sind, wie beispielsweise Wasser, physiologische Saline, andere ausbalancierte Salzlösungen, wässrige Dextrose, Glycerol oder Ähnliches. Bei festen Zusammensetzungen (beispielsweise Pulver, Pillen Tabletten, oder Kapselformen) können herkömmliche, nicht-toxische feste Träger beispielsweise Mannitol, Laktose, Stärke oder Magnesiumstearat in pharmazeutischer Qualtiät miteinschließen.
Zuzüglich zu biologisch-neutralen Trägern können die zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen kleinere Mengen an nicht-toxischen Hilfssubstanzen aufweisen, wie beispielsweise Benetzungsstoffe oder Emulgierstoffe, Konservierungsstoffe, pH-puffernde Stoffe oder Ähnliches, wie beispielsweise Natriumazetat oder Sorbitan Monolaurat. Exzipienten, die mit aufgenommen werden können, sind beispielsweise andere Proteine, wie beispielsweise humanes Serumalbumin oder Plasmazubereitungen. Die Dosierungsform der pharmazeutischen Zusammensetzung wird anhand der ausgewählten Verabreichungsart zu bestimmen sein. So können zusätzlich zu injizierbaren Fluiden beispielsweise auch topische, Inhalations-, orale und Zäpfchen-Formulierungen eingesetzt werden. Topische Präparate können Augentropfen, Salben, Sprays, Pflaster und Ähnliches sein. Inhalations-Präparationen können flüssig sein, beispielsweise Lösungen oder Suspensionen) und Sprühnebel, Sprays und Ähnliches mit einschließen. Orale Formulierungen können flüssig sein (beispielsweise Sirupe, Lösungen oder Suspensionen), oder fest (beispielsweise Pulver, Pillen, Tabletten oder Kapseln). Zäpfchenpräparate können auch fest sein, in Gel- oder Suspensions-Form. Bei festen Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische feste Träger Mannitol, Laktose, Stärke oder Magnesiumstearat in pharmazeutischer Qualität mit einschließen. Die tatsächlichen Herstellungsverfahren solcher Dosierungsformen sind bekannt oder werden dem Fachmann offensichtlich sein.
In einigen Beispielen wird die pharmazeutische Zusammensetzung durch irgendeine Art verabreicht, mit der der beabsichtigte Zweck erreicht wird. Mengen und Verabreichungsarten für die rekombinanten Polypeptide oder Abschnitte davon (oder einer Nukleinsäure, die für solche Polypeptide codiert) können durch den zuständigen Kliniker bestimmt werden. Effektive Dosen für eine therapeutische Anwendung werden je nach Art und Schwere des zu behandelnden Krankheitszustands variieren, ferner in Abhängigkeit vom Alter und dem Zustand des Patienten und anderen klinischen Faktoren. In einigen Fällen wird der Dosisbereich von ungefähr 0,1 μg/kg Körpergewicht bis ungefähr 100 mg/kg Körpergewicht reichen. Andere geeignete Bereiche schließen Dosen von ungefähr 10 μg/kg bis ungefähr 50 mg/kg Körpergewicht, ungefähr 20 μg/kg bis ungefähr 25 μg/kg Körpergewicht, einschließlich 25 μg/kg oder mehr mit ein. Der Dosierungsplan kann von einmal wöchentlich bis täglich variieren, je nach Anzahl der klinischen Faktoren, wie beispielsweise die Sensitivität des Subjekts gegenüber dem Protein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die das offenbarte rekombinante WE-Thrombin mit einschließen, können in Einheitsdosierungsformen formuliert sein, die für eine individuelle Verabreichung präziser Dosierungen geeignet sind. In einem spezifischen, nicht-einschränkenden Beispiel kann eine Einheitsdosierung von ungefähr 1 ng bis ungefähr 5 g des rekombinanten Polypeptids enthalten (wie beispielsweise 10 μg bis 1 g oder ungefähr 10 mg bis 100 mg). Die Menge an zu verabreichenden aktiven Verbindungen wird von dem zu behandelnden Subjekt abhängen, ferner von der Schwere des Leidens sowie der Verabreichungsart. Innerhalb dieser Schranken wird die zu verabreichende Formulierung eine Menge der aktiven Verbindung(en) enthalten, die effektiv ist, um den erwünschten Effekt in dem behandelten Subjekt zu erreichen.
Das rekombinante WE-Thrombin kann an Menschen oder andere Tiere verabreicht werden, auf deren Gewebe dieses auf verschiedene Arten effektiv ist, wie beispielsweise topisch, oral, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, intradermal, intrathekal, subkutan, intraokular, durch Inhalation oder Zäpfen. In einem Beispiel werden die Verbindungen dem Subjekt subkutan verabreicht. In einem anderen Beispiel werden die Verbindungen dem Subjekt intravenös verabreicht.
In einigen Ausführungsformen ist das rekombinante WE-Thrombin in einer inerten Matrix zur topischen Anwendung mit eingeschlossen. In einigen Beispielen wird die Formulierung ins Auge injiziert, beispielsweise für eine intravitreale Injektion. Als ein Beispiel für eine inerte Matrix können Liposomen hergestellt werden, und zwar aus Dipalmitoyl-Phyosphatidylcholin (DPPC), wie beispielsweise Ei-Phosphatidylcholin (PC). Liposomen, einschließlich kationischer und anionischer Liposome, können unter Einsatz von Standardverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Liposomen, die das rekombinante WE-Thrombin mit einschließen, können topisch angewandt werden, entweder in Form von Tropfen oder einer wässrig basierten Creme, oder können intraokulär injiziert werden. In einer Formulierung für eine topische Anwendung wird das rekombinante WE-Thrombin langsam über die Zeit freigesetzt, wenn die Liposomen-Kapsel durch Abnutzung von der Augenoberfläche abgebaut wird. In einer Formulierung für eine intraokuläre Injektion baut sich die Liposomenkapsel aufgrund zellulärer Verdauung ab. Beide dieser Formulierungen bieten die Vorteile eines langsamen Freisetzungsverabreichungssytems, was es ermöglicht, das Subjekt einer im Wesentlichen konstanten Konzentration des rekombinanten WE-Thrombins über die Zeit auszusetzen. In einem Beispiel kann das rekombinante WE-Thrombin in einem Verabreichungssystem mit eingeschlossen sein, das an verschiedenen Stellen im Auge implantiert werden kann, je nach Größe, Form und Formulierung des Implantats, sowie der Transplantationsverfahrensart. Geeignete Stellen schließen die Vorderkammer, den vorderen Augenabschnitt, die Hinterkammer und den hinteren Augenabschnitt mit ein, sowie den Glaskörperraum, den suprachoroidalen Raum, die Subkonjunktiva, episklerale, intracorneale, epicorneale und sklerale Stellen.
In einigen Beispielen kann eine effektive Menge (beispielsweise eine therapeutisch effektive Menge) eines offenbarten rekombinanten WE-Thrombins die Menge an WE-Thrombin sein, die notwendig ist, um eine Erkrankung in einem Subjekt zu behandeln oder zu inhibieren (wie beispielsweise eine entzündliche und/oder Autoimmun-Erkrankung). In anderen Beispielen kann eine therapeutisch effektive Menge eines offenbarten WE-Thrombins die Menge an WE-Thrombin sein, die notwendig ist, um eine Retina-Erkrankung, einen Schlaganfall oder Erkrankungen, die mit Drogenmissbrauch assoziiert sind (wie beispielsweise kognitive oder neuropsychiatrische Beeinträchtigung, resultierend aus dem Drogenmissbrauch) zu behandeln oder zu inhibieren.
Die vorliegende Offenbarung schließt auch Kombinationen des rekombinanten WE-Thrombins mit einem oder mehrerer anderer Stoffe mit ein, die in der Behandlung einer Erkrankung nützlich sind. In einigen Beispielen kann das rekombinante WE-Thrombin mit effektiven Dosen eines oder mehrerer Therapien für entzündliche oder Autoimmun-Erkrankungen verabreicht werden, einschließlich antientzündliche Arzneimittel, Kortikosteroide, Methotrexat, Anti-TNF-Verbindungen, Mykopheonlat, Aminoslicylate, Antibiotika, Interferone, Glatiramer-Azetat, Antikörpertherapien (wie beispielsweise Rituximab oder Milatuzumab), oder Immunsuppressiva oder immunmodulatorischer Verbindungen, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. In anderen Beispielen können die rekombinanten Polypeptide in Kombination mit effektiven Dosen einer oder mehrerer Therapien für Retina-Erkrankungen verabreicht werden, einschließlich der Gentherapie, Vitamin- oder Mineralergänzungsmittel (wie beispielsweise Vitamin A, C und/oder E, oder Zink und/oder Kupfer), anti-angiogene Therapien (wie beispielsweise Ranibizumab oder Bevacizumab), Photokoagulation, photodynamische Therapie, Lutein oder Zeaxanthin, Kortikosteroide oder Immunsuppressiva, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Eine geeignete Kombinationstherapie für eine bestimmte Erkrankung kann durch einen Fachmann ausgewählt werden. Der Ausdruck ”Verabreichung in Kombination” oder ”Co-Verabreichung” bezieht sich sowohl auf eine gleichzeitige als auch aufeinanderfolgender Verabreichung der Wirkstoffe.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte besondere Merkmale und/oder Ausführungsbeispiele darzustellen. Diese Beispiele sollen nicht ausgelegt werden, um die Offenbarung auf die beschriebenen besonderen Merkmale oder Ausführungsformen zu beschränken.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sollen die offenbarten Verfahren darstellen. Im Lichte dieser Offenbarung wird ein Fachmann erkennen, dass auch Variationen dieser Beispiele und anderer Beispiele der offenbarten Verfahren ohne unangemessenes Experimentieren möglich sind.
Beispiel 1 – Experimentelle Verfahren
Dieses Beispiel beschreibt die Materialien und experimentellen Verfahren für die in den Beispielen 2–5 beschriebenen Studien.
Expression und Reinigung von WE-Thrombin
Humanes WE (W215A/E217A) Präthrombin-2 (SEQ ID Nr. 1) wurde in E. Coli als Inclusion Bodies exprimiert. Nach der Lyse der Inclusion Bodies wurde der Präthrombin-2 Vorläufer wieder gefaltet, durch Affinitätschromatographie auf Heparin SEPHAROSE^TM gereinigt, durch proteolytische Spaltung unter Verwendung von Ecarin aktiviert und mittels Heparin- und Ionenaustauschchromatographie weiter aufgereinigt. Die Proteinlösung wurde mit Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel (Pierce) behandelt, um mögliche Endotoxin-Verunreinigungen zu entfernen. Der Detoxi-Gel-behandelte Pool wurde anschließend konzentriert und in 20 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8 zum Lagern diafiltriert. Die enzymatische Aktivität des sich ergebenden Proteins bezüglich Protein C wurde unter Einsatz eines chromogenen Assays bestimmt.
Induktion aktiver EAE und Behandlung mit WE-Thrombin
Unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein(MOG)-Resten 35-55(MOG_35-55) wurde EAE induziert. MOG_35-55 wurde mit Freund'schem kompletten Adjuvans kombiniert, das Hitze-inaktivierte M. tuberculosis enthielt, wie zuvor beschrieben kombiniert. Allen Mäusen wurden 75 ng und 200 ng Pertussis-Toxin (Ptx) an den Tagen 0 und 2 in Bezug auf die Immunisierung intraperitoneal injiziert. Die Mäuse wurden hinsichtlich Anzeichen der EAE gemäß der folgenden Skala eingeteilt: 0, normal; 1, schlaffer Schwanz oder milde Hintergliedmaßenschwäche; 2, moderate Hintergliedmaßenschwäche oder milde Ataxie; 3, moderat schwere Hintergliedmaßenschwäche; 4, schwere Hintergliedmaßenschwäche oder milde Vordergliedmaßenschwäche oder moderate Ataxie; 5, Querschnittslähmung mit nicht mehr als moderater Vordergliedmaßenschwäche; und 6, Querschnittslähmung mit schwerer Vordergliedmaßenschwäche oder schwerer Ataxie oder verendendem Zustand. Beim Ausbruch klinischer Anzeichen der EAE (zwischen den Tagen 10–13) als die klinischen Werte ≥ 2 waren) wurden die Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt und entweder mit Saline-Kontrolle oder mit 25 μg/kg WE-Thrombin intravenös behandelt. Die Mäuse wurden hinsichtlich Veränderungen in den Krankheitswerten solange beobachtet, bis sie für die ex vivo-Analysen getötet wurden.
Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
Vier-Farben-Fluoreszenz-Durchflusszytometrie-Analysen wurden zur Bestimmung der Phänotypen der Zellen durchgeführt, indem allgemeine Antikörper-Färbeverfahren angewandt wurden. Für Splenozyten wurden Einzelzellsuspensionen der Milzen durch Homogenisierung des Gewebes durch ein feinmaschiges Netz hergestellt. Mononukleare Zellen aus dem ZNS wurden mittels PERCOLLTM-Gradientenzentrifugation isoliert. Die Zellen (10⁶) wurden mit Färbemedium (PBS, enthaltend 0,1% NaN₃ und 1% Kälberserumalbumin; Sigma) gewaschen und mit Kombinationen der folgenden monoklonalen Antikörper inkubiert: CD4, CD45, ICAM-1 und CD11b, zur Phänotypen-Analyse.
Immunhistochemie
Die Mäuse wurden mit Isofluran stark betäubt, heparinisiert und mit 100 ml an 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) perfundiert, und bei 4°C 24 Stunden lang fixiert. Das Rückenmark wurde aus den Wirbelsäulen herausgeschnitten und 1–2 mm lange Schnitte aus der Thorax- und dem Lendenwirbelbereich entnommen. Die Gewebe wurden in 5% Glutaraledehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) drei Tage lang bei 4°C fixiert, mit 1% Osmiumtetroxid über 3,5 Stunden nachfixiert, rehydriert in Ethanol und in Plastik eingebettet. Semi-Dünnschnitte (0,5 μm) wurden mit Toluidin blau gefärbt und unter einem Lichtmikroskop fotografiert. Die Abbildungen wurden kompiliert, um eine vollständige Konstruktion des gesamten Rückenmarksschnitts zu kreieren. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden von einem Untersucher analysiert, der über den Behandlungsstatus und über die axonale Schädigung sowie die bestimmte Demyelinisierung nicht informiert war.
Immunfluoreszenz
Fibrin(ogen)-Ablagerungen in den Lendenwirbelbereichen wurden unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen menschliches Fibrinogen) detektiert. Die Schnitte wurden fixiert, in Paraffin eingebettet, unterteilt und entwachst. Die Objektträger wurden in 10% NGS, 1% BSA, 0,025% Triton-X 45 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen Fibrin(ogen) (MP Biomedicals, LLC) über Nacht bei 4°C, in Ziegenserum 1:50 verdünnt und anschließend mit Ziegen-Anti-Kaninchen IgG (Molecular Probes; ALEXA FLUOR^TM 488) inkubiert. Die Objektträger wurden gewaschen und unter wässriges Medium gesetzt. Als Negativkontrolle wurden Objektträger eingesetzt, die wie oben beschrieben ohne den primären Antikörper behandelt wurden. Die Schnitte wurden unter 20-facher Vergrößerung fotografiert, und die Abbildungen unter identischen Bedingungen unter Einsatz von Slidebook prozessiert.
Die Analyse des Fibrin(ogen) wurde unter Einsatz des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Fluoreszenzintensität wurde in einer 10-μm², nicht zellulären Region gemessen, gemittelt, um eine mittlere Hintergrund-Fluoreszenz zu erhalten, und von jeder Abbildung abgezogen. Die Signalintensität von Fibrinogen) wurde begrenzt durch Messung eines unspezifischen Färbens in einer Negativkontrolle (ohne den primären Antikörper). Dieser Wert wurde dazu eingesetzt, um das untere Limit der Kalibrierungsskala für alle nachfolgenden Messungen zu setzen. Daher wurde lediglich eine Fluoreszenz überhalb des Hintergrunds und getrennt von einem unspezifischen Färben visualisiert. Die Abbildungen wurden in Photoshop kompiliert, um eine vollständige Konstruktion des gesamten Rückenmarksschnitts zu konstruieren. Die Färbung des Fibrinogens) in repräsentativen Lendenwirbelabschnitten wurde durch Messung des Gesamtbereiches des Rückenmarkabschnitts in um² evaluiert. Der Bereich des positiven Signals über dem Grenzwert innerhalb dieses Bereiches wurde anschließend gemessen, um den Prozentsatz an Bereich zu bestimmen, der für das Signal und das Gesamtsignal pro μm² positiv ist.
Statistische Analyse
Sämtliche Daten sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Der statistische Unterschied zwischen Vehikel- und Behandlungsgruppe für die Krankheitswerte wurde mittels des Mann-Whitney U-Tests evaluiert. Der kumulative Erkrankungsindex, die Zellfrequenz und der Fibrin(ogen)-Gehalt in den Lendenwirbelabschnitten wurden unter Verwendung des Student's t-Tests analysiert. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant eingestuft. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des GraphPad Prism, Version 5,01 für Windows, GraphPad Software, San Diego, California, USA, vorgenommen.
Beispiel 2 – WE-Thrombin macht die klinischen Anzeichen einer EAE rückgängig
Um die Wirksamkeit der E-WE-Verabreichung nach dem Ausbruch klinischer Anzeichen der EAE (Tag 10–13) zu evaluieren, wurden die Mäuse täglich mit entweder 100 μl an Vehikel oder E-WE Thrombin (25 μg/ml; intravenös) behandelt und 8 Tage lang beobachtet. Im Vergleich zu den Vehikel-behandelten Kontrollmäusen waren die Leistungs-Werte für die E-WE-behandelten Mäuse signifikant verbessert (1A). Die Kontrollmäuse hatten einen kumulativen Erkrankungsindex (CDI von 27,4 ± 2,2, wohingegen die E-WE-behandelten Mäuse einen signifikant reduzierten CDI von 14,3 ± 2,2 besaßen (1B). Der Spitzen-Krankheitswert für E-WE-behandelte Mäuse war ebenfalls signifikant reduziert im Vergleich zu Vehikel-behandelten Mäusen (3,7 ± 0,2 gegenüber 2,5 ± 0,2; p < 0,05).
Beispiel 3 – WE-Thrombin reduziert Entzündungsmarker in EAE
Da Mikrogliose ein Kennzeichen einer ZNS-Inflammation ist, wurde die Identität und Menge der mononukleären Zellen in vereinigten Hirn-Proben der Vehikel- und E-WE-behandelten Mäusen bestimmt. Eine E-WE-Behandlung reduzierte die absolute Anzahl an Makrophagen signifikant (CD11b/CD45 Hoch-Zellen) von 18880 auf 9912 Zellen in Vehikel- gegenüber WE-behandelten Mäusen (Tabelle 1). Die Frequenz der CD11b/CD45 Hoch-Zellen sank von 5,9% auf 3,5% in Vehikel-gegenüber E-WE-behandelten Mäusen (2A). Darüber hinaus konnte eine Behandlung mit E-WE sowohl die absolute Anzahl als auch den Prozentsatz an CD4+-Zellen im Hirn reduzieren (2B und Tabelle 1).
Ferner reduzierte die Behandlung mit E-WE sowohl die TNF-α- als auch die ICAM-1-Expression auf CD11b⁺-Makrophagen in EAE (3A und 3B). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass E-WE die Inflammationsmarker im Hirn und der Milz von Mäusen während einer EAE reduziert. Tabelle 1. Wirkung der E-WE-Thrombinbehandlung auf Inflammationszellen im Hirn

Absolute Zellzahl in vereinigten Hirnproben (n = 5)

Zellart Vehikel E-WE-Thrombin

CD11b⁺/CD45^high 18880 9912

CD4⁺ 11552 3192
Beispiel 4 - WE-Thrombin reduziert eine ZNS-Pathologie in mit MOG35-55 immunisierten Mäusen
Die Wirksamkeit von WE zur Reduzierung einer axonalen Schädigung und einer Demyelinisierung im Rückenmarksgewebe wurde ebenfalls bestimmt. In Übereinstimmung mit EAE-assoziierter Pathologie zeigten die Rückenmarksproben der Vehikel-behandelten Mäuse eine subpiale und perivaskuläre Entzündung und Demyelinisierung (4). Rückenmarksproben der mit WE behandelten Mäuse zeigten eine dramatische Absenkung in den infiltrierenden Zellen und der Demyelinisierung.
Beispiel 5 – Fibrin(ogen)-Ablagerung
Durch die Immunfluoreszenz konnte ein positives Färben hinsichtlich Fibrin(ogen) im Lendenwirbelbereich des Rückenmarks von Vehikel-behandelten Mäusen gezeigt werden. Die Verteilung des Fibrinogens) in Rückenmarksschnitten war in Übereinstimmung mit vorherigen Daten, die Fibrin in der weißen Substanz von EAE-Mäusen zeigten. Im Vergleich zur Vehikelkontrolle schien das Signal für Fibrin(ogen) in E-WE-behandelten Mäusen reduziert zu sein (5A). Um Fibrin(ogen) zu quantifizieren, wurde der Prozentsatz an positiven Bereichen gemessen. Die Daten wiesen darauf hin, dass die Fibrin(ogen)-Färbung von 14,3% im Vehikel auf 10,5% in W-WE reduziert war (5B). Auf ähnliche Weise war das Gesamtsignal des Bereichs pro μm² auf nahezu die Hälfte von 74,7 auf 40,5 in jeweils Vehikel- und E-WE-behandelten Gruppen reduziert (5C).
In Anbetracht der vielen möglichen Ausführungsformen, auf welche die Prinzipien der offenbarten Erfindung angewandt werden können, sollte erkennbar sein, dass die dargestellten Ausführungsformen lediglich bevorzugte Beispiele der Erfindung sind, und nicht eine Einschränkung des Schutzbereichs der Erfindung sein sollen. Der Schutzbereich der Erfindung wird vielmehr durch die nachfolgenden Ansprüche definiert. Als Erfindung wird daher alles beansprucht, was innerhalb des Bereichs und Grundgedankens dieser Ansprüche fällt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Behandlung von Neuroinflammation in einem Subjekt, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine sichere und effektive Menge an rekombinantem WE-Thrombin oder ein Homolog davon aufweist, an das Subjekt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins zumindest 90% identisch mit SEQ ID NO: 1 ist und an den Positionen 215 und 217 ein Alanin aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins zumindest 95% identisch mit der SEQ ID NO: 1 ist und an den Positionen 215 und 217 ein Alanin aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins zumindest 99% identisch mit der SEQ ID NO: 1 ist und an den Positionen 215 und 217 ein Alanin aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins aus SEQ ID NO: 1 besteht oder diese aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung formuliert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Subjekt ein Primat ist und die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung einer Gesamtdosis von mindestens 1,25 μg/kg WE-Thrombin formuliert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das rekombinante WE-Thrombin aus der Expression in E. coli abgeleitet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, wobei die Neuroinflammation Enzephalopathie oder Demyelisierung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, wobei das Subjekt Multiple Sklerose hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–10, das ferner die Verabreichung von einem oder mehreren Protein-C-Aktivierungs-Cofaktoren an das Subjekt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der eine oder mehrere Cofaktoren Thrombomodulin aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Thrombomodulin rekombinantes lösliches humanes Thrombomodulin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung von Neuroinflammation in einem Subjekt, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung Folgendes aufweist: eine effektive Menge an rekombinantem WE-Thrombin oder einem Homolog davon sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins mindestens 90% identisch mit der SEQ ID NO: 1 ist und an den Positionen 215 und 217 ein Alanin aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins mindestens 95% identisch mit der SEQ ID NO: 1 ist und an den Positionen 215 und 217 ein Alanin aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins mindestens 99% identisch mit der SEQ ID NO: 1 ist und an den Positionen 215 und 217 ein Alanin aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuresequenz des WE-Thrombins mindestens die SEQ ID NO: 1 aufweist oder aus dieser besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14–18, wobei sie zur intravenösen Verabreichung formuliert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14–19, wobei das Subjekt ein Primat ist und wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Abgabe einer Gesamtdosis von mindestens 1,25 μg/kg WE-Thrombin ausgebildet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14–20, wobei das rekombinante WE-Thrombin aus der Expression in E. coli abgeleitet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14–21, wobei die Neuroinflammation Enzephalopathie oder Demyelinisierung umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14–22, wobei das Subjekt Multiple Sklerose hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14–23, die ferner einen oder mehrere Protein-C-Aktivierungs-Cofaktoren aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei der eine oder mehrere Cofaktoren Thrombomodulin aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Thrombomodulin rekombinantes lösliches humanes Thrombomodulin ist.