DE112011103687B4

DE112011103687B4 - Zentromerdetektor und Methode zur Bestimmung der Strahlenbelastung durch Chromosomabnormalitäten

Info

Publication number: DE112011103687B4
Application number: DE112011103687.6T
Authority: DE
Inventors: Peter Rogan; Joan Knoll; Akila Subashinghe; Jagath Samarabandu
Original assignee: Cytognomix Inc
Current assignee: Cytognomix Inc
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2017-01-05
Anticipated expiration: 2031-11-05
Also published as: US20130216118A1; US8605981B2; WO2012061669A3; WO2012061669A2; DE112011103687T5

Abstract

Methode zum Nachweis von Strahlungsbelastung aus in einer Probe vorhandenen Chromosomenanomalien, bestehend aus den folgenden Schritten: (a) Bestimmen einer Position zumindest eines Zentromers jedes Chromosoms in einer Zelle in einem Bild eines Metaphasenkerns durch: (i) Segmentieren einer akkurat gezogenen Chromosomenmittellinie jedes der Chromosomen in der Zelle, (ii) Selektieren eines Längsquerschnitts eines Chromosomenbildes mit minimaler Breite, Intensität oder einer Kombination von Merkmalen, die aus Breite und Intensität abgeleitet sind, worin in einem dizentrischen Chromosom, der Ort eines ersten Zentromers abgedeckt wird, um einen folgenden Längsquerschnitt mit einem zweitniedrigsten Minimum kombinierter Breite zu identifizieren; (b) Ermitteln der Anzahl der Zentromere in jedem Chromosom in jeder Zelle; (c) Zusammenzählen einer errechneten Häufigkeit dizentrischer Chromosomen in einer Zellpopulation; und d) Bestimmen einer Strahlungsdosis durch Vergleichen der errechneten Häufigkeit dizentrischer Chromosome mit einer zuvor bestimmten Dosis-Wirkungskurve aus einer kalibrierten Quelle ionisierender Strahlung.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Methode bezieht sich auf das Bestimmen von Strahlenbelastung. Konkret handelt es sich um eine Methode zum Analysieren einer Chromosomschädigungen in Zellen, welche einer ionisierenden Strahlung ausgesetzt wurden, durch Analysieren von Bilder ihres Zentromers.
Stand der Technik
Chromosomentests von Blut durch Mikroskopie und manuelle Auswertung sind gegenwärtig die höchsten Standards für die Bewertung der Strahlenbelastung von Menschen (Blakely WF u. a. in Health Phys. 89: 494–504, 2005). Jedoch kam es bei diesen Technologien zu Problemen beim Erreichen einer akkuraten Verarbeitungsmenge. Bei diesen wohlbekannten Methoden werden Blutzellkulturen als erstes mit Giemsa oder Bromodeoxyuridine/Hoechst 33258/Giemsa (Fluorescenz plus Giemsa; FPG) analysiert. Dies führt zur Färbung der Chromosomen im Metaphasenstadium. Die Färbung weitet sich aus, um die Häufigkeiten der zwei häufigsten Formen von Chromosomaberrationen zu bestimmen, die dizentrischen Chromosomen (DCC) und die azentrischen Chromosomen. Die Energiedosis wird im Weiteren durch Vergleich mit Zellularstandards bestimmt, die kalibrierten Strahlendosen ausgesetzt werden. Diese traditionelle Methode des Erkennens dizentrischer Chromosomen (DCC) schließt gegenwärtig Mikroskopie und manuelles Auswerten durch einen Zytogenetiker ein. Doch begrenzen diese manuellen, nicht-automatischen Technologien ganz erheblich die Verarbeitungsmenge der DCC-Untersuchung.
Das genaue Erkennen der DCC muss auch ausgeglichen werden durch die Notwendigkeit, Tausende von Metaphasebildern effizient zu analysieren für den Fall von schweren Strahlungszwischenfällen oder für Fälle, in denen Einzelpersonen durch Zufall medizinischer oder industrieller Strahlung übermäßig ausgesetzt sind. Man war also lange schon bestrebt gewesen, diese zytogenetische Analyse zu automatisieren, wegen der Auswirkung auf Durchlaufzeiten in der Folge solcher unglücklichen Ereignisse.
Im Handel stehen halbautomatische zytogenetische Systeme zur Verfügung. Diese Systeme sind grundsätzlich von vier Funktionen abhängig: (a) dem Finden von Metaphasenzellen, (b) der qualitativen Einstufung von Metaphasen, (c) dem Austausch von Metaphasen bei starker Vergrößerung sowie (d) der Fähigkeit von Systemen, analysierbare Metaphasen zu finden, die ansonsten wenig von einem Zytogenetiker beachtet werden (Korthof G & AD Carothers. Clin Genet. 40(6): 441–51, 1991).
Eine kürzlich erst mit einem handelsüblichen automatisierten System durchgeführte Analyse brachte schnell zur Bewertung zusammengetragene Bilder von Metaphasen hervor. Leider zeigte dieses System 50% Fehlklassifikation der DCC (Vaurijoux u. a. in Radiation Research 171: 541–548, 2009). Der Grund für die hohe Fehlerrate war ein fehlerhafter Algorithmus. Das System hatte einen Algorithmus verwendet, der normale Chromosomen als DCC bewertete, wenn eine geringe Strahlendosis vorhanden war (< 2 Gy), besonders in Zellen mit Chromosomen geringer Ausbreitung oder solcher, die überlappt waren (Schunck u. a. in Cytogenet Genome Res 104: 383–389, 2004). Von daher besteht die Notwendigkeit eines Ansatzes, der das falsche positive Auffinden von DCCs verringert, welches durch diese Kategorie von Metaphasezellen hervorgerufen wird.
Ein weiteres Problem bei den gegenwärtigen Methoden der Chromosomenanalyse ist, dass eine ungenaue Methode der Bildsegmentierung Anwendung findet, das Metaphasenbild eines Chromosoms in viele nicht-überlappende Bereiche zu unterteilen, welche einzelnen Chromosomobjekten entsprechen. Dies ruft Fehler hervor, weil Chromosomen auf Objekträgern eine große Vielgestaltigkeit aufweisen, was seine Ursachen im Wesentlichen in den Stadien des Zellzyklus, der Dauer des mitotischen Arrests, der Vorbereitung des Objekträgers und in den Bandenmustern hat. Dies stellt eine erhebliche Herausforderung für die automatisierte Segmentierung dar, und ebenso für das Extrahieren der Mittellinie eines Chromosoms, und hier ist Fachwissen erforderlich (Moradi M u. a. in ”Automatic locating the centromere on human chromosome pictures,” in 16th IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems, 2003; Moradi M und SK Saterandan, Pattern Recognition Letters, 27: 19–28, 2006).
Die meisten der vorhandenen Ansätze zur Chromosomsegmentierung stützen sich auf eine Form von Pixelschwellenwert (Graham J u. a. in Chromosome Analysis Protocols, 29: 141–185, 1994). Auf dem Schwellenwert beruht diese Punktverarbeitungsmethode, die gute Ergebnisse bei Bildern bringt, die aus Objekten bestehen, die gut durch Pixelintensität definiert sind, die sich in deutlichem Kontrast von Hintergrundwerten abheben. Bilder von Chromosomen verfügen in einem gewissen Umfang über diese Qualität. Otsus Methode (und Variationen dieses Verfahrens) ordnen Pixel entweder als Objekt oder als Hintergrundbereiche zu, auf einem einzigen Wert basierend, und sie wurde in der Anfangsphase der Segmentierung von Giemsa- und DAPI-gebänderten (4',6-diamidino-2-phenylindole) Chromosomen auf Bildern verwendet (Popescu M u. a. in Computers in Biology and Medicine, 29: 61–82, 1999; Wolf G. u. a. in ”A PC-based program for evaluation of comparative genomic hybridization (cgh) experiments (URL)”; Gajendran B und J. Rodriguez, in Intl Conf on Image Processing (ICIP), Seiten 24–27, 2004; Canny J, ”A computational approach to edge detection”, IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence (PAMI), 8(6), 1986; Ji, L. Cytometry, 17: 196–208, (1994). Global thresholding by pre-processing images with a median filter, followed by 4-connected component labeling removes noise in the binary image (Wang X. u. a. in J Biomedical Informatics, 41: 264–271, 2008; Wang X. u. a. in J Biomedical Informatics, Band 42: 22–31, 2009).
Weiterhin sind all diese Methoden fehleranfällig bezüglich der Auswirkungen ungleichmäßiger Beleuchtung, was vereinzelte Objekte segmentieren kann, die teilweise diskontinuierlich sind. Die Schwellenwertobjekte können infolge kleiner Variationen der Beleuchtungsstärke Löcher enthalten (besonders in der Fuoreszenzmikroskopie). Bei Verwendung lokaler oder adaptiver Schwellenwertmethode sind Bilder, auf Otsus Methode gestützt, in manuell vorgegebene Tesselierung in einer festgelegten Größe und in Schwellenwertmethode unterteilt worden (Enrico G u. a. in Proc. 29th Intnl Conf of IEEE EMBS, Seiten 23–26, 2007; Otsu, NA. IEEE Trans. on Systems, Man and Cybernetics, SMC-9 (1): 62–66. 1979). Schwellenwertbilder sind nach wie vor anfällig gegen Quantisierungsfehler, die sich dann im Digitalbild zeigen. Intensitäts-Fading wird ebenfalls ersichtlich. Es entsteht durch das Schneiden an den Rändern des Chromosomobjekts.
Der parametrische verzerrbare Modellansatz wurde auch bereits angewendet, um die Chromosomsegmentierung zu verbessern. Die auf dem Gradient Vector Flow (GVF) basierenden aktiven Konturen stellen einen Modellansatz dar, der für diese Objekte eine vermehrte Genauigkeit erbringt. Dieses Modell geht eine wesentliche Beschränkung bei den traditionellen aktiven Konturen an (Kass M u. a. in Intnl J of Computer Vision, 1(4): 321–331, 1988), indem es den Fangbereich von Umrissen ganz erheblich ausweitet (Xu C und JL Prince, ”Gradient vector flow: A new external force for snakes”, in Proc IEEE Comp Soc Conf on Computer Vision and Pattern Recognition, 1997).
Das GVF-Schlangenmodell verbessert die Chromosomsegmentierung beträchtlich, verglichen mit den Schwellenwerttechniken (Britto P. und G. Ravindran, Inform Tech Journal, 6 (1): 1–7, 2007; Li C u. a. in ”Segmentation of edge preserving gradient vector flow: An approach towards automatically initializing and splitting of snakes”, in Proc IEEE Comp Soc Conf on Computer Vision and Pattern Recognition, 2005). Da es sich ja um eine parametrische aktive Kontur handelt, ist das globale Minimum (einer objektiven Funktion) nicht garantiert, es sei denn, die Kontrollpunkte werden in der Nähe der gewünschten Kontur voreingestellt. Andernfalls könnte die Kontur zu einem ungewünschten lokalen Minimum zusammenlaufen, wie beispielsweise als ein Chromosomenband (das einen stabilen Intensitätsgradienten aufweist), auf einer nicht-chromosomalen Struktur oder sogar auf der Kontur eines anderen Chromosoms.
Die Mittellinie des Chromosoms ist ein Kennzeichen von Bedeutung, das als Referenzpunkt für zahlreiche Messungen dient. Das Merkmal Mittellinie ist von erheblicher Wichtigkeit für das Erkennen von Zentromeren und letztlich auch DCC. Es kann verwendet werden, um die Gesamtlänge des Chromosoms zu erhalten, ebenso die Lage des Zentromers sowie den Indexwert des Zentromers, die Koordinaten der telomerischen Regionen, sowie das Streifenmuster eines Chromosoms. All diese identifizieren und klassifizieren ein bestimmtes Chromosom. Mediale Achsenumformung (MAT – Medial Axis Transform) und morphologische Ausdünnung werden oft angewendet, um die Mittelachsen von Chromosomen zu lokalisieren. Der Randbereich des segmentierten Chromosombildes lässt sich durch morphologisches Schließen (Dilation mit anschließendem Erosionsbediener) glätten, bevor MAT zum Skelettieren und zum Erhalt der Mittellinie angewendet wird (Wolf G. u. a. ”A PC-based program for evaluation of comparative genomic hybridization (cgh) experiments (URL)”).
Die Mittellinie des Chromosoms erhielt man normalerweise in zahlreichen Verfahren, welche das Mapping des Chromosomskeletts umfasste. Im Chromosomskelett zeigen sich hier und da verästelte Strukturen. Diese müssen gerichtet werden. Bifurkationen im Skelett an den Enden des Chromosoms können durch Ableiten einer Linie von dem Dreieck, das aus den zwei Segmenten und dem telomerischen Randbereich des Chromosoms gebildet wird, gemildert werden (Moradi M und SK Saterandan, Pattern Recognition Letters, 27: 19–28, 2006). Dieses Vorgehen schlägt fehl, wenn sich in einiger Entfernung vom Telomer Verästelungen bilden, was bei gebogenen Chromosomen üblich ist. Ausdünnungsverfahren erzeugen nicht so oft Verästelungen wie dies beim Skelettieren der Fall ist; doch fehlen beim ausgedünnten Resultat oft Daten an den Chromosomenden (Lam L & SW Lee, IEEE Trans on Pattern Analysis & Machine Intelligence, 14: 869–885, 1992; Jang BK und TC Roland, ”Analysis of thinning algorithms using mathematical morphology,” IEEE Trans. on Pattern Analysis and Machine Intelligence (PAMI), 12(6), März 1990). Die morphologische Ausdünnung binarisierter und median-gefilterten Chromosomenbilder wird angewendet, um die Mittellinie zu erhalten (Gajendran B und J. Rodriguez, in Intl Conf on Image Processing (ICIP), Seiten 24–27, 2004; Wang X. u. a. in J Biomedical Informatics, Band 42: 22–31, 2009; Wang X. u. a. in Comp. Meth. & Programs in BioMedicine, 89: 33–42, 2008). Doch können diese Ansätze immer noch zu gelegentlichen Verästelungen sowie Bifurkationen in der Nähe von Telomeren führen. In Bildern mit groben Chromosomrandbereichen sind die gelegentlichen Verästelungen markant, wobei die Filtermethode unerheblich ist. Nachfolgendes Beschneiden dieser Äste ist die Hauptunzulänglichkeit sowohl von MAT als auch der Ausdünnungsmethode. Fernerhin erlangen beide Vorgehensweisen eine Reihe Raumpunkte (”Punkte mit einander verbinden”), eher als die parametrische Kurve, welche relevantere Informationen für eine automatisierte Chromosomenanalyse darstellt. Die Mittelachse ist auch in geraden Chromosomen ohne Skelettierung oder Ausdünnungsmethode lokalisiert worden. Chromosome werden rotiert, bis sie senkrecht ausgerichtet sind, und Mittelpunkte der horizontal befindlichen Chromosomenscheiben werden verbunden, um eine Mittelachse zu erhalten, welche dann gemildert wird (Piper, J u. a. in Cytometry, 16: 7–16. 1994).
Eine weitere Methode lokalisiert bestimmende Punkte des Chromosoms, um eine Mittellinie abzuleiten²⁵. Beide Ansätze sind nicht verlässlich, wenn Chromosomen stark gebogen oder verschwommen sind.
Stichproben von Chromosomen, unter Verwendung von Querschnitten bei verschiedenen Neigungswinkeln und kombinierten Mittelpunkten, lassen sich auch vornehmen, um eine etwaige Mittelachse zu erhalten (Ritter G. und G. Schreib, Pattern Recognition Journal, 4: 923–938, 2001). Gleichwohl ist der Nachteil dieser Methode, dass sie versucht, eine vieleckige Annäherung an die Mittelachse zu bekommen, statt die Mittelachse selbst, und mangelhafte Ergebnisse wurden erzielt, als die segmentierten Außenbereiche unregelmäßige Formen aufwiesen. Eine Methode zum genauen Zeichnen der Mittellinie wird benötigt, eine Methode, die sich als robust gegenüber verschiedenen Chromosomenmorphologien erweist.
Die Mittellinie des Chromosoms ist von entscheidender Bedeutung für das Erkennen von Zentromeren und, schließlich, DCC. Aus den oben genannten Gründen besteht ein Bedarf für eine automatisierte Methode zum Bestimmen von Strahlenbelastung, und konkret für eine Methode zum Analysieren von Chromosomschädigungen in Zellen, welche durch ionisierende Strahlung belastet wurden. Bilder ihrer Zentromere wären dabei zu analysieren.
Um die Anwendungsgrenzen des vorherigen Standes zu überwinden, wird eine neuartige und zuvor unbekannte Methode zur Verfügung gestellt zum Bestimmen von Strahlenbelastung aus Chromosomabweichungen, wie sie sich in einer Probe befinden. Sie besteht aus den folgenden Schritten:

(a) Bestimmen der Lage wenigstens eines Zentromers jedes Chromosoms in einer Zelle in einem Bild einer Metaphasenzelle durch: (i) Segmentieren einer genau gezogenen Chromosomenmittellinie für jedes einzelne Chromosom in der Zelle, (ii) Selektieren eines Längsschnitts von minimaler Breite, Intensität oder einer Kombination von Breite und Intensität aussuchen, worin in einem dizentrischen Chromosom eine Lage eines ersten Zentromers abgedeckt wird, um einen nachfolgenden Längsschnitt mit zweitniedrigster Mindestbreite oder Intensität zu identifizieren;
(b) Zählen der Anzahl der Zentromere in jedem Chromosom in jeder Zelle zählen;
(c) Zusammenzählen der Häufigkeit von dizentrischen Chromosomen in einer Zellpopulation und
(d) Bestimmen der Strahlendosis durch Vergleich der errechneten Häufigkeit von dizentrischen Chromosomen mit einer zuvor bestimmten Dosis-Wirkungs-Kurve aus einer kalibrierten Quelle.

Diese neuartige Vorgehensweise verwendet Bildsegmentierungsmethoden, welche optimale Metaphasezellen zwecks automatisierter Analyse partitionieren und identifizieren. Die Vorgehensweise verwendet auch Segmentierungsmethoden, die den Ort des Zentromers korrekt bestimmen. Außerdem werden von Fuzzy-Logik geprägte Algorithmen des maschinellen Lernens, die in diesem Fall Algorithmen sind, Computern ermöglichen, Verhalten zu entwickeln, das sich auf empirische Daten aus den Bildern gründen, auch verwendet, um DCC, azentrische Chromosomen und monozentrische Chromosomen zu identifizieren. Diese neuartige Vorgehensweise verwendet auch anders beschaffene Chromosomenfärbungsprozeduren, wie beispielsweise das DAPI- und Giemsa-Färben, zwecks optimaler automatisierter Feststellung von DCC. Und schließlich: Der Vorgang enthält auch das Erstellen eines Softwaresystems zur genauen Identifizierung von DCC auf optimal eingestuften Metaphasespektren.
Ziel dieser Erfindung ist es, einen Vorgang bereitzustellen, der Chromosomenmissbildungen analysiert, die in Zellen zu finden sind, welche ionisierender Strahlung ausgesetzt waren.
Ziel dieser Erfindung ist es, einen Vorgang bereitzustellen, der die falsche positive Feststellung von dizentrischen Chromosomen verhindert und/oder minimiert.
Ziel dieser Erfindung ist es, einen automatisierten Prozess bereitzustellen, der Strahlenbelastungen von Menschen mit Genauigkeit beurteilt.
Ziel dieser Erfindung ist es, einen Prozess bereitzustellen, der Aspekte der zytogenetischen Analyse automatisiert.
Eine weitere Ziel dieser Erfindung ist es, dass sie die Ortung von Zentromeren verbessert.
Ziel dieser Erfindung ist es, einen Prozess bereitzustellen, der Bildverarbeitung und Ansätze maschinellen Lernens zur unterschiedlichen Behandlung von DCCs anwendet.
Diese u. a. Ziele, Merkmale und Vorzüge dieser Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und angefügten Ansprüchen erheblich deutlicher werden, oder sie können durch das Praktizieren der Erfindung erlernt werden, so wie es im Folgenden ausgeführt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Damit die Art und Weise, in der die oben aufgeführten u. a. Vorteile und Ziele der Erfindung erreicht werden, wird eine mehr ins Einzelne gehende Beschreibung der Erfindung, die oben nur kurz gegeben wurde, hier durch Bezug auf spezifische Darstellungen davon erbracht, welche in den angefügten Zeichnungen veranschaulicht werden. Es wird vorausgesetzt, dass diese Zeichnungen lediglich als Abbildungen typischer Darstellungen der Erfindung zu verstehen sind und daher nicht als ihren Gültigkeitsbereich begrenzend anzusehen sind, und so wird die Erfindung mit zusätzlicher Genauigkeit und Detailliertheit beschrieben und erklärt. Dies geschieht durch die Verwendung der begleitenden Zeichnungen, worin:
Die 1A, 1B und 1C Ergebnisrankings darstellen, wobei ein akzeptables Bild ist, das nicht-überlappt und nicht übermäßig ausgebreitet ist, ein überdecktes Bild und ein übermäßig ausgebreitetes Bild ist;
2 eine Trellisstruktur und einen skizzierten Überblick von GVF darstellt;
3 den Nachweis von Zentromeren (Punkte und Pfeile) durch Algorithmen mit DAPI-Färbung darstellt;
4 den Nachweis von Zentromeren (Punkte und Pfeile) durch Algorithmen mit Giemsa-Färbung darstellt;
5 denaturierte Chromosomen nach DAPI-Einfärbung darstellt;
6 dizentrische Punktezählung (Scoring) von Zentromeren nach Giemsa-Färbung darstellt;
7 solch ein statisches Vektorfeld darstellt, das unter Verwendung der Laplace-Gleichung in stabilem Zustand errechnet wurde;
8 die Stufen der Dickenabtastung an einem Konturlage des Chromosoms darstellt;
9 den Aufbau der Reihenstichprobennahme (L1, L2, L3 ...) für einen inneren Mittellinienpunkt P2 darstellt;
10 die 'ResW'-Eingangszugehörigkeitsfunktion darstellt;
11 die 'ResDA'-Eingangszugehörigkeitsfunktion sowie die Informationen zu Umriss und Parameter der Fuzzy-Zugehörigkeitsfunktion am Ausgang darstellt;
12 die 'ResInt'-Eingangszugehörigkeitsfunktion sowie die Informationen zu Umriss und Parameter der Fuzzy-Zugehörigkeitsfunktion am Ausgang dar stellt;
13 die Fuzzy-Logik-Installation vereinfacht darstellt;
14 einen neuartigen Prozess entsprechend der vorliegenden Erfindung darstellt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Kurz dargestellt, umfasst eine Methode zur Bestimmung von Strahlenbelastung aufgrund von Chromosomenstörungen, welche in einer Probe vorliegen, vier aufeinander folgende Schritte:

(a) Bestimmen einer Lage zumindest eines Zentromers jedes Chromosoms in einer Zelle in einem Bild einer Metaphasenzelle, indem eine genau gezeichnete Chromosomenmittellinie jeder der Chromosomen in der Zelle segmentiert und ein Längsschnitt mit minimaler Breite, Intensität oder einer Kombination von Breite und Intensität gewählt wird;
(b) Zählen der Anzahl der Zentromere in jedem Chromosom in jeder Zelle;
(c) Zusammenzählen der Häufigkeit von dizentrischen Chromosomen in einer Zellpopulation; und
(d) Bestimmen der Strahlungsdosis durch Vergleichen der errechneten Häufigkeit dizentrischer Chromosomen mit einer zuvor festgelegten Dosis-Wirkungs-Kurve aus einer kalibrierten Quelle. Im Fall eines dizentrischen Chromosoms wird die Lage eines ersten Zentromers maskiert, um einen folgenden Längsschnitt mit einer zweitniedrigsten minimalen Breite oder Intensität zu identifizieren. Jeder dieser Schritte wird unten ausführlicher beschrieben.

Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Gesamtanzahl der Chromosomen” soll typischerweise 46 Chromosomen bei Menschen bedeuten, es sei denn, dass Schädigungen vorliegen, wodurch diese Anzahl um ein oder einige Chromosomen ansteigt oder sich verringert.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Ausmaß der Überlagerung” soll die Anzahl der Chromosomen bedeuten, bei welcher ein Teil eines Chromosoms entweder auf oder unter einem anderen Chromosom liegt.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Konfidenzniveau eines Zentromers” soll einen Prozentwert bedeuten, der die wahrscheinliche Genauigkeit der Zentromernachweis-methode für jedes Chromosom abbildet.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Standardabweichung des Bereichs” soll die Standardabweichung des Bereichswertes aller nachgewiesenen Werte im Bereich des Objekts bedeuten.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Querschnittsverhältnis” soll das Verhältnis zwischen der Breite des Bildes und seiner Höhe bedeuten.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Gesamtbereich” soll den gesamten Pixelbereich der Objekte bedeuten. Dieser Wert kann aus einer einfachen Pixelzählung in dem Bereich ermittelt werden.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Verhältnis erheblicher Überlagerung” soll das Verhältnis sich überlagernder Objekte zu der Gesamtzahl der Objekte bedeuten.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Helligkeit” soll die Leuchtdichte des interessierenden Objekts oder das Bild bedeuten, und sie wird direkt durch die Pixelintensitäten dargestellt.
Der in dieser Spezifikation verwendete Ausdruck ”Kontrast” soll den Unterschied von Bildintensitätspegel zwischen dem Objekt und seinem Hintergrund bedeuten.
Vorauswahl optimaler Bilder von Metaphase-Chromosomen
Die Vorauswahl optimaler Bilder von Metaphasenchromosomen reduziert falsche positive Identifikationen von DCC beträchtlich, was in vorherigen Versuchen, ihren Nachweis zu automatisieren, auch festgestellt wurde. Beim Vorgang der Vorauswahl wird die Analyse von Zellen mit zahlreichen sich überlagernden Chromosomen und Bildern von übermäßig ausgebreiteten Zellen mit unvollständiger Chromosomenmenge minimiert. Der Nachweis normaler (und abnormaler) Chromosomen wird bei Metaphasezellen mit nur wenigen sich überlagernden oder übermäßig ausgebreiteten Chromosomen erleichtert. Ähnliche Vorgehensweisen der Metaphasekennzeichnung sind bei biologischen Dosimetriestudien, ausgeführt in routinemäßiger manueller Interpretation, eine Routineangelegenheit. Wir hatten zuvor ein automatisiertes System zur Auswahl optimaler Metaphasezellen für solche zytogenetischen Analysen bereits entwickelt (Yanala u. a. in Am. Soc. Human Genet. Ann. Meeting, 2004).
Unser automatisiertes System stufte Metaphasenausbreitungen unter Verwendung eines inhalts- und klassifikationsbasierten Ranking(CCBR)-Algorithmus ein, was Beziehungen zwischen Merkmalen hervorhob, die aus Metaphasechromosomen extrahiert worden waren (Kobayashi T u. a. in ”Content and classication based ranking algorithm for metaphase chromosome images”, IEEE Conference on Multimedia Imaging and Expo., Juni 2004). Das CCBR ist aus von Zytogenetikern festgelegten Qualitätsmetriken abgeleitet und stuft Bilder entsprechend diesen fachspezifischen Kriterien entsprechend ein.
Bilder werden entweder als ”in Ordnung”, ”überlagert” oder ”übermäßig ausgebreitet” kategorisiert und dann subklassifiziert. Bilder, die in Ordnung sind, erhalten die höchsten Ränge, gefolgt von überlagerten und übermäßig ausgebreiteten Chromosomen. Übermäßig ausgebreitete Bilder weisen häufig unvollständige Karyotypen auf. 17 verschiedene Merkmale werden unter Verwendung von morphologischen Bildverarbeitungstools extrahiert (Serra JP, Image Analysis and Mathematical Morphology. New York: Academic, 1982; Haralick, RM u. a. in IEEE Trans. System, Man, Cybernetics 3: 610–621, 1973). Beispiele eingestufter Bilder sind in 1 zu sehen.
Beim CCBR definieren wir E als Chromosomeneinheit. Wenn ein Chromosom andere nicht überlagert, ist E selbst das Chromosom; wenn ein Chromosom tatsächlich überlagert, ist E das mit benachbarten Chromosomen verbundene Chromosom. Wir definieren jedes Bild I als die Menge aller Es in einer Zelle. Unter den Merkmalen, die aus jedem Bild extrahiert wurden, befanden sich durchschnittliche und Standardabweichung von Bereich, Länge, Umfang, Querschnittsverhältnis und paarweiser Abstand aller Es. Zu den globalen Merkmalen gehören die Gesamtbereiche von Es, die Zählung der Es, die Bilddichte (Größe des kleinsten alle Es enthaltenden Rechtecks) sowie der Anteil erheblicher Überlagerungen (der Anteil aus der Anzahl der sich überlagernden Es bei der Zählung der Es) und das Verhältnis Helligkeit/Kontrast (Proportion der Pixel mit Grauskala < 0.1) aller Es.
Neun dieser Merkmale waren ausreichend für das Einordnen des Bildes in eine der Kategorien. Der Merkmalsvektor eines akzeptablen (”in Ordnung”) Bildstandards ist der Mittelwert aller Merkmalsvektoren mit akzeptablem (”in Ordnung”) Bildstandards in der Datenbank mit Vorgabebildern.
Sobald die Bilder eingeordnet sind, werden sie in einer Kategorie eingestuft, die auf dem Gesamtbereich, Anteil erheblicher Überlagerungen, mittleren paarweisen Abstand sowie Helligkeit und Kontrast basieren. In den Kategorien ”in Ordnung” und ”überlagert” erhalten Bilder mit erheblichen Überlagerungen oder Verschwommenheit niedrigere Ränge. Der lokale Rang eines Bildes in der Kategorie ”in Ordnung” und ”überlagert” basiert auf dem Gesamtbereich von Es, dem Anteil erheblicher Überlagerungen, sowie auf der Helligkeit und dem Kontrast. Der lokale Rang von Bildern in der Kategorie ”überlagert” wird durch die Gesamtzählung der Es bestimmt ebenso wie durch die mittlere und Standardabweichung ihrer paarweisen Abstände. Bilder mit mehr Chromosomeneinheiten und kleinerem Durchschnittsabstand paarweise vorhandener Chromosomen werden hoch eingestuft.

Diese automatisierte Metaphaseneinstufungsmethode weist eine durchschnittliche Genauigkeit von 88,8% auf, [echt pos/(echt pos + falsch pos)] mit einer 80%-igen Rückruf[echt pos/(echt pos + falsch neg)]-Rate entsprechend der Einstufung durch einen erfahrenen Zytogenetiker (Yanala P u. a. in Am. Soc. Hum Genet Ann. Conf., Programm Nr. 997, 2004), gestützt auf 443 Bilder, die von 8 verschiedenen Objektträgern erfasst wurden. Die 25% der besteingestuften Bilder und die 15% der schlechtesteingestuften Bilder wurden weiter untersucht. Die Resultate zeigten die 30 besteingestuften Bilder auf jedem Objektträger ohne falsch Positive. Von den 265 Bildern aus den 25% der besteingestuften Bilder waren 19 falsch als ”in Ordnung” klassifiziert worden. Die meisten dieser falschen Klassifizierungen waren von Zellkernen in später Zwischenphase, welche als Metaphasenzellen interpretiert worden waren. Sie können durch Nachweis der Krümmung der Kernmembran ausgeschlossen werden, welche in diesen Zellen intakt ist. Von den 179 schlechtesteingestuften Bildern waren 23 falsch als mangelhaft klassifiziert worden, wenngleich sie einen kompletten Satz sich nicht überlagernder Chromosomen besaßen. Mikrokerne, die auf diesen selben Bildern anzutreffen sind, werden unrichtigerweise als sich überlagernde Chromosomen klassifiziert, wodurch ihr Rang verringert wird. Diese Strukturen werden in der nächsten Version des Algorithmus identifiziert und maskiert. Tabelle: Einstufungsresultate DAPI-gefärbte Metaphasezellen bei 100 x Vergrößerung

Objekt träger ID	Anzahl der Bilder	Anzahl der Metaphasen (echt pos.)	Anzahl der pseudo-pos.	% pseudo-pos. Objekte	Pseudo positive Bilder unter den 50 besteingestuften Bildern	Falsch positive Bilder unter den 50 besteingestuften Bildern	Identifizierung/Bemerkungen zu pseudo-pos. Objekten
3041	468	390	78	16%	0	0	Kleine Kern-Cluster, Ablagerungen, nicht zentrierte Metaphasen + kleine Kerne
3068	93	78	15	16%	0	0	Helle Kernkörperchen, nicht zentrierte Metaphasen + Kerne
2947	115	99	16	13%	5	0	Ablagerungen, Helle Kernkörperchen, kleine Kern-Clusters, Prometaphasenzellen
3039	119	107	12	10%	1	0	Ablagerungen, Antifade-Aufbau-Artifact
2951	142	96	46	32%	1	0	Total bleiche DAPI-Färbung, helle Kernkörperchen, Prometaphasenzellen
3473	104	99	5	4%	0	0	Verdünnteres Zellpräparat mit Kernen einheitlicher Größe; weniger pseudo-pos.
3017	524*	467	57	11%	Nicht eingestuft	Nicht eingestuft	Ablagerungen, kleine Kern-Clusters
3468	77**	63	14	18%	Nicht eingestuft	Nicht eingestuft	Unscharfe Kerne und Chromosomen***, konzentriertes Zellpräparat, dickes Antifade

Merkmale von Chromosomen definieren und Mittellinie bestimmen
Unsere Prämisse ist, dass das Erkennen von DCC von präziser und akkurater Lokalisierung von Zentromeren abhängig ist. Das Zentromer ist die komprimierteste und zusammengezogenste Region eines Chromosoms, an welche die Spindelfaser während der Mitose angebunden ist (Zellteilung) (Wang X. u. a. in Comp. Methods and Programs in Bio Medicine, 89: 33–42, 2008). Diese Beschränkung ist nicht immer offensichtlich, besonders bei gebogenen Chromosomen. Die Schwierigkeit, Zentromere zu identifizieren, ist abhängig von ihrer Lage, ihrer Chromosomenlänge und der morphologischen Variabilität von Chromosomen. Die Mittelachse des Chromosoms verkörpert diese Eigenschaften, und dies ist eine unabdingbare Voraussetzung für die korrekte Aufgabenlösung bezüglich Zentromeren. Wir haben eine neuartige Methode zur Mittellinienbestimmung entwickelt. Unsere Arbeit unterscheidet sich von den zuvor diskutierten Ansätzen dahingehend, dass sie gute Ergebnisse bei kurzen, langen oder stark gebogenen Chromosomen erbringt.
Um die Mittellinie eines Chromosoms herzuleiten, ist es zu allererst erforderlich, seine Konturen genau zu definieren. Fluoreszente Metaphasenbilder von DAPI-gefärbten Chromosomen wurden zur Chromosomensegmentierung vorbehandelt. Nach der Grauskala-Umwandlung wurden Abweichungen bei der Ausleuchtung überall auf einem Bild verringert, indem ein rechteckig ausgebildetes Fenster, welches den Chromosom- sowie den Nahbereichhintergrund einschloss, extrahiert wurde. Die Intensitäten wurden durch Abgleich der Fenstermitte normalisiert und wurden sodann über das Gesamtspektrum möglicher Pixelwerte ausgearbeitet. Ein einfacher Schwellenwert wurde dann nach Otsu's Methode angesetzt (was ein Binärabbild erstellt). Weil mit Fuoreszenzmikroskopie generierte Binärabbilder zu Unregelmäßigkeiten führen (Kozubek M, Image Acquisition and its Automation in Fluorescence Microscopy. Springer, Niederlande, V3, 2006), wurde das Schwellenwertergebnis nur zur Vorabsegmentierung verwendet. Die Bilder wurden unserem Einstufungsalgorithmus unterworfen (Kobayashi T u. a. in ”Content and classification based ranking algorithm for metaphase chromosome images”, IEEE Conference on Multimedia Imaging and Expo., Juni 2004), wodurch optimale Chromosome ausgewählt werden und die insgesamte Genauigkeit bei den Schritten der Weiterbehandlung verbessert werden. Ein An dem mit Schwellenwert bearbeitetem Bild wurde eine Skalierung angewendet, wodurch bei höher eingestuften Bildern eine Untersegmentierung eingeführt und die Möglichkeit Cluster von Chromosomen als Segmentierungsergebnis zu erhalten reduziert wurde.
Das Gegenstück zum DAPI-gefärbten Bild wird gemeinhin verwendet, um ein breites Spektrum von Bildintensitätsinformationen, wie Banden-/Streifenmustern von Chromosomen zu illustrieren. Nach dem Eliminieren des Schrot- bzw. Aufnahmerauschens (Tropfen < 10 Pixel) wurde das Chromosom aus dem Binärbild durch ein Markieren verbundener Komponenten auf einem 4-fach verbundenen Graphen extrahiert. Dies entfernte Diskontinuitäten, die sich innerhalb und im Randbereich des Objekts zeigten. Der ursprüngliche Chromosomenumriss wurde durch Verwendung einer 3 × 3-Umgebung (Image Processing Toolbox (URL)) ausfindig gemacht, welche Randinformationen speicherte. Dann wurde ein aktiver Umriss (oder eine Schlange) angewendet, um den Chromosomenumriss zu bestimmen. Von einer anfänglichen Menge Kontrollpunkte aus konvergiert die Schlange iterativ zu den nächsten lokalen Minima in Bildsteigungen. Kurven in Metaphasenchromosomen können konkave Ränder schaffen, welche die Konvergenz konventioneller Schlangen verhindern. Der Fangbereich der Schlange kann durch das Glätten der Randabbildung eines Bildes mit einem Gauß'schen Kern (GVF-active contour) (Xu C und JL Prince, ”Gradient vector flow: A new external force for snakes”, in Proc IEEE Comp Soc Conf on Computer Vision and Pattern Recognition, 1997). Das Iterieren der GVF-Umrissprozedur führte zu chromosomendefinierten Rändern, die mit Genauigkeit nachgewiesen wurden (Canny J, ”A computational approach to edge detection”, IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence (PAMI), 8(6), 1986).
Nachweis der Mittellinie. Die Mittellinie eines Objekts ist die Menge aller Punkte, welche die Mitte von Kreisen sind, welche die Bildoberfläche an mehr als einem Punkt berühren (Blum H, in Models for the Perception of Speech and Visual Form, Seiten 362–380, MIT 1967). Die Mittellinie eines Chromosoms stellt eine Skelettgestalt dar und vermittelt topologische Informationen, wie sie im ursprünglichen Chromosom zu finden sind. Der akkurate Nachweis der Mittellinie eines Chromosoms ist ein entscheidender Vorgang in vielen Karyotypisierungsalgorithmen (Popescu M u. a. in Computers in Biology and Medicine, 29: 61–82, 1999; Piper, J u. a. in Cytometry, 16: 7–16. 1994; Ritter G und G. Schreib, Pattern Recognition Journal, 4: 923–938, 2001; Kao JH u. a. in The Journal of Pattern Recognition Society, 41: 77–89, 2008). Morphologische Verdünnung oder Skelettierung wird üblicherweise angewendet, um die Mittellinie zu extrahieren, doch bringt die Variabilität von Metaphasenchromosomen Fehler mit sich. Vereinzelte Äste im Skelett müssen beschnitten werden, entweder während des Ableitens des Skeletts oder beim Nachverarbeiten. Wir haben uns eine Beschneidungsmethode angeeignet über Discrete Curve Evolution (DCE) (Latecki LJ und R. Lakämper, Comp Vision and Image Understanding, 73: 441–454, 1999; Bai X u. a. in IEEE Trans. on Pattern Analysis and Machine Intelligence (PAMI), 29(3), 2007), welches das Skelett als ein Vieleck mit einer vorgegebenen Anzahl von Eckpunkten modelliert. Die DCE-Beschneidung wurde bei Chromosomen mit Skeletten angewendet, die länger als 35 Skelettpunkte waren; kürzere, gerade Chromosomen wurden mit konventionellem Verdünnen bearbeitet (Lam L & SW Lee, IEEE Trans on Pattern Analysis & Machine Intelligence, 14: 869–885, 1992). DCE-Konturen wurden in Polygonabschnitte unterteilt, dann beschnitten, indem alle Skelettpunkte entfernt wurden, was Punkte im selben Polygonabschnitt generierte. Da das geringste Vieleck ein Dreieck ist, wird das sich ergebende Skelett den einen oder anderen Ast bzw. Zweig aufweisen. DCE beseitigt Eckpunkte, ohne sie zu bewegen. Eine Dislozierung von Merkmalspunkten gibt es nicht, und/oder auch keine Dislozierung des Skeletts (Bai X u. a. in IEEE Trans. on Pattern Analysis and Machine Intelligence (PAMI), 29(3), 2007; Latecki LJ und R. Lakämper, in Proc of 2^nd Intl Conf on Scale-Space Theories in Computer Vision. Seiten 398–409, 1999).
Diese Methode gibt einen guten Anfangspunkt zum Identifizieren der echten Längsachse des Chromosoms.
Wenn auch Verdünnungs- oder Skelettieralgorithmen ein verbundenes, 1 Pixel dickes Skelett generieren (Jang BK und TC Roland, ”Analysis of thinning algorithms using mathematical morphology,” IEEE Trans. on Pattern Analysis and Machine Intelligence (PAMI), 12(6), März 1990), so gibt es doch keine Garantie dafür. Das DCE-beschnittene Skelett wurde unter Verwendung einer modifizierten Verdünnungsoperation bearbeitet, die ”morphologisches Hit & Miss”-Maskieren anwendete, woraufhin das Resultat vom Binärbild des Skeletts subtrahiert wurde. Es stellte sich heraus, dass, wenn der kürzeste Skelettast abgeschnitten wurde, dies die richtige Mittellinie für Skelette von Chromosomen verschieder Formen und Längen erbrachte. Ein Kurvenanpassungsschritt (Interpolation von kubischen Splines, passend zu einem Polynom dritter Ordnung) wurde sodann angewendet, um eine sanfte, gleichmäßige Kurve vom Skelett her zu bekommen. Passpunkte wurden vom beschnittenen Skelett abgefragt, um ein Overfitting zu verhindern, wobei die fundamentalen Informationen zur Form adäquat repräsentiert wurden. Auf Expertenurteil fußend, stellte sich die DCE-basierte Methode als dem konventionellen Beschneiden von 20 aus 68 getesteten Chromosomen überlegen dar, und Entsprechendes galt für den Rest (Subasinghe A. u. a. in ”An image processing algorithm for accurate extraction of the centerline from human metaphase chromosomes”, IEEE International Conference on Image Processing, 2010, im Druck).
Nachweis von Zentromeren. Wir haben vor kurzem der Öffentlichkeit (hier angefügt) einen neuartigen Algorithmus zur genauen Ermittlung der Mittelachse von Chromosomen sowie zum Identifizieren von Zentromeren und Telomeren vorgestellt, und wir haben gezeigt, dass Distanzmessungen von DNA-Sonden bezüglich dieser Chromosommerkmale bestimmbar sind (Subasinghe A u. a. in Canadian Conf. on Computer & Robot Vision, Seiten 223–230, DOI: 10.1109/CRV.2010.36, 2010). Die am Ende beschnittene Mittellinie wird als Referenz zur Lokalisierung des Zentromers verwendet. Die Wahl des Referenzliniensegments hat den Zentromernachweisprozess drastisch vereinfacht, da es die extremen Enden des Chromosoms ausschließt. Gitterliniensegmente (trellis line segments) wurden senkrecht zum beschnittenen Mittelliniensegment in Einheitslängen-intervallen gezeichnet. Die Querschnittsbreite ist die Länge eines Gitterliniensegments. Die Probenintensitäten entlang des Gitters wurden mit einer Gauß'schen Funktion gewichtet, was Bild- und Randgeräusch aufheben sollte ebenso wie unerwünschte Effekte, zu denen es durch das Biegen des Chromosoms gekommen war. Obwohl das Sammeln (sampling) von Intensitäten am Gitter entlang auf dem gefilterten DAPI-Bild durchgeführt wurde, wurde über die Längen der Gittersegmente aufgrund des Binärergebnisses entschieden, das man aus der GVF erhalten hatte. Die Verwendung des GVF-Ergebnisses aufgrund des Binärabbildes hat Randcharakteristika besser definiert als ein einfaches auf Schwellenwert (threshold) erarbeitetes Binärbild, welches die Verengung am Zentromer ausgeprägter ausfallen lässt. Das Zentromer wurde unter Verwendung des Breitenprofils (Wp) des Chromosoms entlang dem Gitter auf der Mittelachse des GVF-Binärbildes lokalisiert bzw. geortet, und das Intensitätsprofil (Ip) erhielt man über den ermittelten gewichteten Durchschnitt von Intensitätswerten des DAPI-Bildes (gestützt auf eine Gauß'sche Funktion) entlang dem GVF-begrenzten Gitter.
Der Antragsteller nutzt einen neuartigen Ansatz mit der Bezeichnung ”Intensitätsintegrierte Dickenmessung nach Laplace” zum Erhalten des Dicken-/Breitenprofils von Metaphasenchromosomen beim Menschen. Der Laplace Operator (Δ) erbringt die Divergenz des Gradienten einer Funktion im euklidischen Punktraum. In anderen Worten liefert er den Unterschied des Gradienten oder die Ableitung ersten Grades einer Funktion oder eines Bildes. Dies kann wie folgt angegeben werden, wobei ∇ die erste Ableitung oder der Differentialoperator in jeglicher Richtung ist. Δf = div(∇f) = ∇·∇f
Bei Anwendung auf ein Bild erbringt der Laplace Operator die Ableitung zweiten Grades des Bildes, welches die Rand- oder Konturinformationen herausstellt. Dieser Operator kann auch zum Erhalten oder Erreichen des kontinuierlichen Wärmeflusses oder einer solchen Spannungsverteilung zwischen zwei erwärmten/aufgeladenen Oberflächen verwendet werden.
Der in diesem Werk vorgeschlagene Dickenmessprozess verwendet die folgenden Informationen, welche wir in den vorherigen Phasen erhielten:

1. Die nur 1 Pixel breite Kontur des segmentierten interessierenden Objekts. Die Kontur sollte Koordinatenverortungen, sortiert auf Grund von Konnektivität, enthalten.
2. Trennung der Objektkontur mit Hilfe der Mittellinie des Objekts. Dies kann durch Errechnen der Koordinaten der Schnittpunkte zwischen der Mittellinie und der Objektkontur abgeleitet werden.
3. Das extrahierte Objekt des Chromosoms, das die Intensitätsinformation im Objekt enthält.

,I' soll das Intensitätsbild sein, welches das Objekt des Interesses enthält. Dann können wir ein zweites Bild ,B' mit identischen Dimensionen erstellen und ein Konturliniensegment auf ein Potential von 1 Volt einstellen, während wir beim anderen das Grundpotential (0 Volt) beibehalten. Dann kann per definitionem der Laplace Operator von Bild ,B' mit der Gleichung
dargestellt werden.
Die Anwendung der Standard-Laplace-Gleichung auf Bild ,B' führt dazu, dass die Spannung des höheren Potentialhöhenliniensegments sich über den Objektkörper auf die untere Potentialhöhenlinie verteilt. Hier breiten sich die höheren Potentialwerte durch den Objektkörper auf das untere Potentialliniensegment aus, während sie allmählich die Größe des Objektkörpers verringern. In stabilem Zustand können diese Potentialwerte verwendet werden, um ein statisches Vektorfeld zu errichten, das zum Überqueren von einer Konturpartition zur nächsten im kürzest möglichen Abstand verwendet wird. 7 stellt solch ein statisches Vektorfeld dar, in stabilem Zustand mittels der Laplace-Gleichung errechnet. Bezogen auf 7, wurde das statische Vektorfeld (Pfeile) mittels der Laplace-Gleichung auf die Information bezüglich des Chromosomenrandes errechnet. Die Pfeile bezeichnen die Richtung des Gradienten des Systems in stabilem Zustand.
Der Vorgang des Errechnens der Potentialwerte in stabilem Zustand kann leicht als iterativer Prozess in der digitalen Ebene modelliert werden. Mittels einer 3 × 3-Umgebung kann die iterative Laplace-Operationsgleichung für Pixelkoordinaten (x, y) am Beispiel i + 1 durch die folgende Gleichung dargestellt werden:
Und doch würde die obige Anwendung allein von den Informationen zu den Randkonturen abhängen. Das Segmentieren eines Objektes ist ein Prozess, der in hohem Maße durch Geräusche im Randbereich des Objekts beeinflusst wird. Daher würde eine lärmbelastete Objektkontur ein unerwünschtes Dicke-/Breite-Profil erbringen. Informationen zur Intensität können nutzbar gemacht werden, um Dickenmessungen von strukturierten Objekten in Abbildungen von Chromosomen zu unterstützen. Die meisten dieser Intensitätsmuster liefern Informationen zu der Richtung, in welche die Dickenmessungslinien sich ausbreiten sollten. Daher wenden die Anwender einen Algorithmus an, um Informationen zur Intensität in die Berechnung des standardmäßigen statischen Vektorfeldes mittels der Laplace-Gleichung einfließen zu lassen. Die Informationen zur Intensität in der vorgeschlagenen Methode wurden einfach verwendet, um den Bereich auf das gewünschte Intensitätsmuster hin zu lenken. Dies gelang durch Anwendung des unten beschriebenen Gewichtungsschemas.
Integration der Bildintensität
Bildintensitäten werden gewöhnlich im typischen Fall verwendet, um ein Bild in Regionen zu segmentieren oder, um Kantenfragmente durch Anwendung des Konzepts des Lichtstroms pro Einheitsfläche zu finden. In diesem neuartigen Prozess wird Bildintensität zusammen mit der Laplaceschen Formel für Dickenmessungen verwendet, um die Konturen des Chromosoms nachzuweisen.
Zunächst einmal wurden insgesamt 8 Matrizes auf Grund von Konnektivität und richtungsweisenden Gradienten von Intensität erstellt. Deren identische Dimensionen zu ,I' waren wie folgt: D_up(x, y) = abs[I(x, y) – I(x, y – 1)] D_dw(x, y) = abs[I(x, y) – I(x, y + 1)] D_lf(x, y) = abs[I(x, y) – I(x – 1, y)] D_rt(x, y) = abs[I(x, y) – I(x + 1, y)] D_lu(x, y) = abs[I(x, y) – I(x – 1, y – 1)] D_ru(x, y) = abs[I(x, y) – I(x + 1, y – 1)] D_lh(x, y) = abs[I(x, y) – I(x – 1, y + 1)] D_rh(x, y) = abs[I(x, y) – I(x + 1, y + 1)]
Jede der obigen Matrizes erfasst die Intensitätsschwankungen in vorgegebener Richtung im Digitalabbild. Zwecks Vereinfachung und Verdeutlichung werden die übrigen Schritte beschrieben, indem nur eins der obigen 8 Bilder (D_up) verwendet wird. Als nächstes wurden alle Bilder mittels des maximalen, absoluten Intensitätsunterschieds in jener Richtung normalisiert. Hierbei wurde die folgende Gleichung verwendet:
Daher werden die Werte in der Matrix ,D_up' zum Intervall hin (0,1) normalisiert. Da Chromosomen ähnliche Intensitätsgebiete, die für die Kontur normal sind, aufweisen, sollte das Gewichtungsschema auf ähnliche Intensitäten ausgerichtet sein. Um dies zu erreichen, wurden die Matrixwerte innerhalb des gleichen Bereichs von (0,1) umgekehrt, indem jeder Matrixwert von der Werteinheit subtrahiert wurde. Die Matrix 'D_up' wird nunmehr Werte erbringen, die nahezu einheitlich sind, wobei der Intensitätspegel in der Umgebung ähnlich ist. In vergleichbarer Weise werden die Matrizes ebenfalls kleinere Werte (nahe bei 0) für Pixel mit hohen Intensitätsgradienten in der Umgebung erbringen. Dadurch begünstigt der Algorithmus die Streuung der Potentialwerte in die Richtung der Intensitätsähnlichkeit. Da die Informationen zur Intensität als ein bloßer richtungslenkender Faktor verwendet werden mussten, wurde jede der Matrizes (etwa ab D_up) mittels einer Variablen ,b', wie unten angegeben, maßstäblich neu geändert: D_up = D_up × (1 – b) + b
Ein niedrigerer Wert für ,b' wird den Einfluss der Informationen zur Intensität steigern und umgekehrt. Ein Wert von '1,0' für die Variable ,b' wird daher das standardmäßige Laplacesche Vektorfeld ohne Beeinflussung seitens der Intensitätswerte kalkulieren. Dieser Wert muss, auf Grund dessen, wie markant und konsistent die Intensitätsmuster im jeweiligen Bild sind, eingestellt werden. Für diese Anwendung wurde der Wert der Skaliervariablen ,b' auf 0,9 eingestellt.
Sobald diese Mengen von Matrizes zu Intensitätsgewichtungsfaktoren errechnet sind, können diese Werte direkt verwendet werden, um den Weg zu ändern, auf dem das Laplace'sche statische Feld bei jeder Iteration errechnet wird. Anders als bei der standardmäßigen Laplace'schen Feldkalkulation variiert der Beitrag der Pixel aus der Umgebung von Pixel zu Pixel. Die Spannungs- oder Wärmewerte in der Umgebung des Pixels (x, y) werden entsprechend der folgenden Gleichung gewichtet:
Die Konvergenz oder der stabile Zustand des obigen iterativen Prozesses kann mittels der kumulativen Variation von Werten im statischen Vektorfeld gemessen werden. Falls die kumulative Änderung im Vektorfeld für das Bild niedriger als ein kleiner Schwellenwert (1 × 10^–10 in diesen Experimenten) ist, wird der iterative Prozess abgesetzt, und der stabile Zustand ist somit erreicht. Sobald dieser stabile Zustand eingetreten war, wurden die Gradienten an jedem Pixelort 'Φ' entlang der zwei Hauptachsen (x und y) mit Pixelwerten aus der Umgebung, wie unten dargestellt, errechnet: Φ(x, y) / Δx = (B(x + Δx, y) – B(x + Δx, y)) / 2Δx Φ(x, y) / Δx = (B(x, y + Δy) – B(x, y – Δy)) / 2Δy
Jede dieser Gradientenkomponenten wurde dann normalisiert und in den Matrizes N_x und N_y mittels des Vektorausmaßes bei jedem Pixel gespeichert. Die Matrizes N_x und N_y enthalten die intensitätsgelenkten Vektorkomponenten des Laplace'schen statischen Feldes für die Richtungen der Achsen x und y.
Sobald das beabsichtigte intensitätsintegrierte Laplace'sche statische Feld abgeleitet ist, müssen die entsprechenden Konturpunkte und die Distanz zwischen ihnen errechnet werden. Für die obige Aufgabe war Eulers Methode angewendet worden. Eulers Methode ist ein einfacher und doch wirkungsvoller Weg, ein Vektorfeld zu durchqueren, so wie es in der folgenden Gleichung angegeben ist, die auf Richtung und Größe des lokalen Vektorfeldes fußt. x = x + Δx y = y + y'∙Δx
Hier ist y' die erste Ableitung an dem Ort, der von N_y(x, y)/N_x(x, y) erstellt wird.
8 stellt die Schritte beim Nachverfolgen der Dicke an einem Konturort des Chromosoms dar. Sobald die Maße für Dicke und Intensität, ausgehend von ausgewählten Punkten auf einer Seite der Objektkontur errechnet sind, wählen wir das globale Minimum des kombinierten Profils als den Anwärterort für das Zentromer. Die Wahl der Konturpunkte wurde bei 80% der Gesamtlänge der Kontur vorbereitet, um das Messen der Dickenwerte in den telomerischen Regionen zu vermeiden. Zu 8, die Stufen des Nachverfolgens der Dicke (Sterne) an einem Konturort des Chromosoms. Der Endwert der Dicke wird errechnet durch Ermittlung der Summe aller Längen dieser kleinen Schritte.
Wir haben ein 'Zentromerkonfidenzniveau' (CCF) zum Messen der wahrscheinlichen Genauigkeit des automatisierten Nachweisprozesses für Zentromere errechnet. CCF wird als Prozentsatz ausgedrückt, der sehr nahe beim Konfidenzniveau des nachgewiesenen Ortes liegt. CCF stützt sich auf Wp(i) und Ip(i), die jeweiligen Breiten- und Intensitätsprofile der Mittellinienpunkte i = 1, 2 ... N eines Chromosoms. Sp ist das globale Minimum (ausgewählt als Zentromer) des kombinierten Profils. Dann werden die Werte W_m und I_m als Minimalwerte in Wp(i) und Ip(i) definiert. Der Vektor, Vwp, der alle Mittellinienpunkte mit dem Wert der Minimalbreite enthält, ist: Vwp = {u ∈ Wp(i)|Wp(i) = W_m, ∀ i = 1, 2 ... N}. Der Wert Wid_Wp wird als die Kardinalität von Vwp errechnet.
Wir definieren:
CCF ist hoch, wenn die Summe der Minima bei den Profilen der Breite und der Intensität gleich sind oder näher am gewählten kombinierten Minimalpunkt (Zentromer). Falls die Gittersegmente die echte zentromerische Verengung infolge extremer Biegungen oder Störungen in der Mittellinie verfehlen, kann das Breitenprofil etliche Punkte mit einem globalen Minimalwert (Wid_Wp > 1) enthalten. Der F_c-Term reduziert CCF im Falle des Vorhandenseins von mehrfachen globalen Minima. Von 41 normalen Chromosomen wurde das Zentromer in genau 25 Fällen bestimmt. In 12 Fällen war es geringfügig von der Mitte entfernt, jedoch im richtigen Chromosomenband geortet worden, und 4 waren inkorrekt (10%). Die CCF-Messung wird zukünftig weiter verbessert. Ein Ansatz besteht darin, einen (+/–) % Randwert der minimalen Breite hinzuzufügen, womit der Vektor Vwp berücksichtigt wird.
Dieser zuvor entwickelte Algorithmus betraf lediglich die Einstufung von Metaphasenabbildern. Eine Motivation, Zentromere zu analysieren, hatte nicht bestanden. Zum Zeitpunkt des Ausfüllens dieses vorläufigen Antrags haben die Antragsteller denaturierte und nicht denaturierte DAPI-gefärbte Chromosomen mit einander verglichen und haben Daten gesammelt, die belegen, dass das Einfärben von Zentromeren zusammen mit anderen Methoden wie C-Banding, CENPB-Immunfärbung und zentromerischem FISH durchführbar ist.
Automatisiertes Erkennen dizentrischer (und azentrischer) Chromosomen wird maximal effektiv bei bestmöglicher Genauigkeit durch koordinierte Bewertung von Chromosomfärbemethoden und durch passende bildgebende Verfahren. Biodosimetrieproben/-daten werden zur Verfeinerung von Segmentierungsmethoden zum Kennzeichnen optimaler Chromosomenbilder verwendet. Wir analysieren Bilder durch Segmentieren sowie durch Ansätze zum maschinellen Lernen zwecks genauer Unterscheidung monozentrischer, dizentrischer und azentrischer Chromosomen. Wir bewerten und selektieren dann Chromosomfärbemethoden, die den automatisierten Nachweis dieser Chromosomenabnormitäten verbessern. Die Methoden mit der besten Leistung werden in einem Softwaresystem chiffriert, um Bilddaten von Metaphasenchromosomen aus automatisierten Mikroskopiesystemen einzustufen, zu analysieren und zu verwalten sowie, um die Häufigkeit von DCC zu bestimmen.
Automatisch interpretiert und stuft Software die Bilder von Metaphasenchromosomen ein (Wang X u. a. in J Biomedical Informatics, Band 42: 22–31, 2009) und weist abnormale DCC nach. Das automatisierte Mikroskopiesystem lokalisiert die optimalen Metaphasenzellen zu Analysezwecken und lokalisiert anschließend jene, die DCC enthalten und bestimmt deren Häufigkeit. Die Algorithmen, welche wir zum Nachweisen des Zentromers auf dem Chromosomenbild entwickelt haben, verwenden in erster Linie zwei visuelle Hinweise: Verengungen und Färbeintensität. Wir bestimmen eingangs die Verteilung von CCF-Werten für Metaphasen, die von unserem Mikroskopiesystem erfasst wurden für jede Probe bei jeder Methode des Vorbereitens/Färbens von Chromosomen, um die Verlässlichkeit aktueller Algorithmen einzuschätzen. Die Antragsteller haben dies bezüglich mono- und dizentrischer Chromosomen durchgeführt. Die azentrischen Bruchstücke können mittels der CCF-Gleichung nachgewiesen werden, und ein Fachmann würde bei Anwendung dieser Formel erwarten, dass sie azentrische von mono- und dizentrischen Bruchstücken unterscheiden würde.
Wenn diese Methode auch ein guter Anfangspunkt für den Nachweis von DCC ist, benötigt sie doch weitere Auswertalgorithmen, um ihre Leistung zu verbessern. Der abschließende Algorithmus weist die folgenden Schritte auf: (1) Einstufung der Zellen und Nachweis von Chromosomenüberlagerung sowie Trennung von Schwesterchromatiden; (2) Generieren von Anwärterorten von Zentromeren sowie von azentrischen Bruchstücken; (3) Verfeinerung von Anwärterorten.
Auswahl optimaler Metaphasenchromosomenspreads zur automatisierten Analyse.
Um optimale Bilder bestrahlter Chromosomen auszuwählen, werden mit dem Mikroskopiersystem erstellte Bilder nach Chromosomenverteilung, Schärfe und dem Grad der Überlagerung eingestuft. Der aktuelle Algorithmus, der FISH-Bilder aufgrund von Inhaltsklassifizierung einstuft (Kobayashi T u. a. in ”Content and classification based ranking algorithm for metaphase chromosome images”, IEEE Conference on Multimedia Imaging and Expo., Juni 2004), ist so modifiziert, dass er Cluster von Mikrokernen, die mitunter als Metaphasenstreuungen (spreads) fehlinterpretiert werden, ausschließt und maskiert. Weitere Messungen können vorgenommen werden, um einige einzigartige Aspekte und Erfordernisse von bestrahlten Chromosomen anzusprechen.
Akkurate Biodosimetrie erfordert Zellen, die lediglich eine einzige mitotische Teilung nach einer Bestrahlung durchgemacht haben, weil die Häufigkeit von DCC bei Folgeteilungen geschwächt werden kann. Zellen, die eine einzige mitotische Teilung abgeschlossen haben, haben beide Chromatiden homogen mittels der FPG-Technik (und FPG plus anschließendes DAPI-Färben) gefärbt. Zellen mit Mehrfachteilungen weisen Chromatide mit variabler Färbung auf.
Die Querschnitte der Metaphasenbilder mit hohem Stellenwert werden weiter analysiert, um diejenigen zu elimininieren, in denen Schwesterchromatiden desselben Chromosoms nicht homogen sind. Weiterhin wenden wir auch veröffentlichte Algorithmen an, die uns ermöglichen, überlagerte und nebeneinander befindliche Chromosomen zu trennen (Agam G & Dinstein I. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 19(11): 1212–1222, 1997; Grisan E u. a. in IEEE Transactions on Information Technology in Biomedicine, 13(4): 575–581, 2009). Die Krümmung der Chromosomenkontur wird analysiert, um Punkte zu identifizieren, an denen Chromosomen sich überschneiden und, um diese Punkte an den Überlagerungsstellen miteinander zu verbinden. Wir untersuchen die Leistung dieser Algorithmen und wenden einen geeigneten Algorithmus an, der es uns ermöglicht, sich überlagernde Chromosomen zu identifizieren und Schwesterchromatiden zu trennen. Das letztere ist von besonderer Bedeutung, da es die Gestalt des Chromosoms eher deutlich verändert. Wir legen auch Abnahmekriterien auf Grund all dieser Maße fest, die zur Auswahl von Bildern angewendet werden, welche sodann in den darauf folgenden Schritten bearbeitet werden.
Orte von Zentromeren bestimmen; maschinelles Lernen zum Unterscheiden von Chromosomen mit unterschiedlichen Anzahlen von Zentromeren.
Wir generieren Anwärterpositionen für Zentromere, wodurch wir den falsch-negativen Nachweis zu Lasten eines erhöhten Anteils an falsch-positiven minimieren. Unser Anfangspunkt ist der Vorgang, der zum Nachweis von Zentromeren in FISH-Bildern entwickelt worden war (Subasinghe A u. a. in Canadian Conf. on Computer & Robot Vision, Seiten 223–230, DOI: 10.1109/CRV.2010.36, 2010). Mittels kalibrierter Biodosimetriedaten, wird die Leistung dieses Algorithmus für Bilder mit unterschiedlichen Zellfärbungen und Bildgebungsbedingen verglichen mit der Beurteilung seitens eines Zytogenetikers.
Sobald den Zentromeranwärtern ihre Positionen zugewiesen wurden, können Algorithmen auf Grund von Merkmalsauslese angewendet werden, um die Hypothese zu testen, dass ein Objekt ein DCC ist. Unter den visuellen Anhaltspunkten, die von Zytogenetikern eingesetzt werden, um DCCs in einem Zellabbild nachzuweisen, finden sich die Anzahl und das Ausmaß von Verdünnungen, Intensitätsschwankungen (falls vorhanden) und das Vorhandensein von azentrischen Chromosomen, sehr langen oder Ringchromosomen, welche in den DCC enthaltenden Metaphasen anzutreffen sind. Algorithmen würden diese Merkmale an den Anwärterpositionen feststellen. Zum Beispiel haben azentrische Chromosomen, welche keine zentromerische Konstruktion aufweisen, eine hohe Kardinalität für W_m (Wid_Wp ≈ N). Diese Merkmale sollten uns ermöglichen, falsche Positive zu reduzieren und daher die Spezifizität, Zellen mit DCC nachzuweisen, zu erhöhen.
Wir bewerten sodann die Leistung von Algorithmen für die Merkmalsklassifizierung zum Ermitteln fehlender oder inkorrekt platzierter Zentromere und für das angemessene Zuordnen ihrer korrekten Positionen. Dieser Ansatz funktioniert am besten, wenn der Ermittlungsprozess vielfache Anhaltspunkte ebenso wie Fähigkeiten der Entscheidungsfindung verwendet, die sich auf Ausbildung und Erfahrungen in der Vergangenheit begründen. Infolge ihrer erheblichen Vielgestaltigkeit sind die Breite und die Intensitätsprofile von Chromosomen geräuschempfindlich. Diese Störungsanfälligkeit kann bei Giemsa-gefärbten Bildern auffällig sein. Daher kann, gestützt allein auf die oben genannten zwei Merkmalsprofile, eine Entscheidung nicht getroffen werden. Der Prozess erwägt Mehrfach-Inputs, um über das Vorhandensein von DCC zu entscheiden. Wir würden dann weitere Merkmalsdetektoren, die sich auf visuelle Anhaltspunkte stützen, wie sie ein Genetiker verwendet, einsetzen. Zu solchen Detektoren gehören: (a) Relativer Abstand zwischen beiden Stellen, an denen sich Zentromere befinden, (b) Bildauswertung des lokalen Umfelds der Stellen, an denen Zentromere festgestellt wurden, (c) Distanz zwischen den Stellen, an denen sich Zentromere befinden, (d) Mögliches Vorhandensein azentrischer Chromosomenbruchstücke (was von Bedeutung sein wird für das Einstufen und Auswählen bevorzugter Bilder zum Auswerten, bei einer einzigen erfolgten mitotischen Teilung), und (e) das Vorhandensein von Ringchromosomen, falls zutreffend, sowie die Bestimmung ihrer Häufigkeit.
In diesem Prozess sind wir auch bestrebt, aus Entscheidungen der Vergangenheit zu lernen und lassen diese Informationen in die letzte Entscheidungsetappe einfließen. Die maschinellen Lernverfahren unterstützen im Allgemeinen unsere Hypothese oder weisen sie zurück. Sie lautet: ”Jedes Chromosom ist ein DCC”. Das System des maschinellen Lernens würde dann die obigen Merkmalsdetektoren verwenden und lernen, DCCs, gestützt auf manuelle Klassifizierung durch einen Genetiker, zu klassifizieren. Im ersten Schritt werden die Merkmale bestimmt, die zum maschinellen Lernen verwendet werden. Support Vektor Maschinen (SVM) und Artifizielle Neuronale Netze (ANN/Artificial Neural Networks) sind die hierzu zu verwendenden primären Algorithmen für maschinelles Lernen. SVM wird ANN vorgezogen, und das deshalb, weil SVM ein Klassifikator für große Abstände ist und weil es nachgewiesenermaßen eine bessere Leistung als die ANNs mit ihren Fehlerfortpflanzungen hat. Wenn auch Entscheidungsbäume nicht die Granularität von SVMs oder ANNs aufweisen, so können sie doch mit kategorischen Daten arbeiten (z. B. Labels statt Zahlenwerten). Die Erklärung dafür, warum einer dieser Algorithmen bessere Wiederaufrufe erbringen könnte als ein anderer wird gewöhnlich durch die Dimensionalität des Problems bestimmt (Anzahl der Merkmale und ihrer Eigenschaften) sowie durch die Verbreitung der Merkmale inmitten der Bildmenge.
In Fällen, in welchen Techniken des maschinellen Lernens die Leistung beim DCC-Nachweis nicht verbessern, würden wir dann Fuzzy-Inferenzsysteme eingliedern, die auf Regeln basiert sind, welche das Erscheinen von Abbildmerkmalen vorschreiben, die von Zytogenetikern festgestellt wurden. Der Parameterraum für Klassifizierungen kann bei der Verwendung dieser Systeme auch begrenzt sein. Expertenwissen drückt sich als ein unscharfes Regelwerk der Kategorie ”falls-dann” aus, die für DCC, basierend auf dem Auftreten dieser Bildmerkmale, zutreffen. Eine teilweise Trennung von Schwesterchromatiden, anders als eine Trennung von Zentromeren und eine vorzeitige Zentromertrennung bringt Fehler in die Chromosomenmittellinie. Ein regelgebundener Test auf Konkavität von Chromosomenkonturen in dieser Region weist diese Strukturen nach. Eine Erosion dieser Strukturen würde dann falsche positive Zentromerzuordnungen eliminieren. Eine weitere Regel, die auf Kosegration dizentrischer und azentrischer Chromosome in derselben Metaphase hindeutet, vergrößert auch die Genauigkeit dizentrischen Nachweises. Solche Ansätze sortieren bekanntermaßen falsche Positive aus und erhöhen die Spezifizität.
Vergleich der Leistung verschiedener Vorbereitungsprozeduren für Chromosomen zum optimalen automatisierten dizentrischen Nachweis.
Nach dem Erhalt gefärbter Zellpräparate auf Objektträgern und von Suspensionen ungefärbter, fixierter Zellen aus Blutproben, denen eine Reihe bestimmter Strahlendosen verabreicht wurden, werden diese analysiert. Die Zellsuspensionen werden auf Objektträgern verteilt und gefärbt. Metaphasenzellen werden automatisch mittels eines Metasystems oder auch mittels Genetix Mikroskopiesystemen für jede Präparation erfasst. Der erste Teil mitotischer Zellen (100–500) wird manuell selektiert und auf die Häufigkeit von DCCs hin untersucht. Eine Analyse beliebiger Proben findet statt. Abgebildete Zellen werden mit den neu erfundenen Algorithmen zum Nachweis von Zentromeren analysiert und die Häufigkeit von DCCs mit der Grundverifizierung verglichen (Errechnen durch einen Zytogenetiker).
Zum Erstellen einer Biodosimetriekurve wird das gesamte Blut von 5 gesunden Spendern ohne Vorgeschichte ionisierender Strahlungsbelastung verschieden lang und aus verschieden weiten Abständen mit einer Kobalt-60 Quelle bestrahlt. Die Quelle ist mit einer Ionisationskammerrate kalibriert worden (cGy pro Minute), nachweisbar im National Research Council of Canada (INMS/Kanadischen Landesforschungsrat). Das Kobaltbestrahlungsgerät hat eine feste Strahlausrichtung nach oben mit Bestrahlungsaufbauschale zur Zellbestrahlung. Die 1000 Ci Quelle generiert maximal eine Dosisrate von ~200 cGy oder 2 Gray pro Minute. Die Dosisraten können in verschiedenen Distanzen vom Zugangsport zur Quelle reduziert werden oder durch Anbringen von Schutzschichten aus Blei.
Eine Dosis-Wirkung-Kalibrierungskurve im Dosisbereich von 0–5.0 Gy wird aus kultivierten und geernteten bestrahlten Proben erstellt, indem die standardmäßige 48 Stunden Kulturmethode mit FPG[Fluoreszensmittel plus Giemsa]-Färbung eingesetzt wird (Wilkins RC, u. a. in Interlaboratory comparison of the DCC assay for radiation biodosimetry in masscasualty events”, Radiation Research 169: 551–560, 2008). Zellsuspensionen werden auf die Objektträger aufgetragen und eingefärbt. Metaphasenzellen werden automatisch unter Verwendung unseres Metasystems oder von Genetix Mikroskopiesystemen für jede Präparation erfasst. Der erste Teil der mitotischen Zellen (100–500) wird manuell selektiert und auf die Häufigkeit von DCCs hin bewertet (Wilkins RC u. a. in Interlaboratory comparison of the DCC assay for radiation biodosimetry in mass casualty events. Radiation Research 169: 551–560, 2008). Diese FPG-Methode führt zu einheitlich Giemsa-gefärbten Chromosomen mit an Zentromeren nachgewiesenen Einengungen.
Um die optimale Färbemethode für Chromosomen zu bestimmen, welcher jenen höchstgradigen Nachweis von DCCs durch Algorithmen zur Bildver-/bearbeitung erbringt, werden wir intrinsische Merkmale des Zentromers nutzen, die zu Färbungsunterschieden zwischen diesem und dem Rest des Chromosoms führen. Unsere Befunde mit DAPI-gefärbten Chromosomen legen nahe, dass die Texturen, hergestellt in zentromerischer DNA-Sequenz und Proteinzusammensetzung, den Nachweis von DCC mittels automatisierter Methoden verbessern können. Beispiele werden in 5 gezeigt. Zellen aus bestrahlten Proben, welche mit Standardmethoden der Biodosimetrie kultiviert und fixiert wurden, werden nach der Fixierung verschiedenen Färbemethoden unterworfen, um ein zentromerisches Erscheinungsbild zu akzentuieren. Durch Begrenzen der Modifizierungen an Zellen, die standardmäßig kultiviert und fixiert wurden, werden sie wahrscheinlicher von anderen Laboratorien zum DCC-Nachweis angenommen.

(i) C-Banding-Verfahren (Sumner AT. Exp Cell Res 75: 304–306, 1972) denaturieren Chromatin mit Bariumhydroxid. Heterochromatin, das sich in erster Linie in Zentromeren befindet, erhält mit Giemsa eine dunkle Einfärbung. Der Rest der Chromosomen weist eine schwache Färbung auf. Während die Methode einfach und schnell ist, enthält ein nicht-zentromerischer Anteil der Y-Chromosomen auch Heterochromatin. Regelbasierte Inferenz ist erforderlich, um diese potenzielle Quelle falscher positiver DCCs in männlichen Zellen zu eliminieren.
(ii) Färben von durch Wärme denaturierten Chromosomen mit DAPI, einem fluoreszenten Färbemittel mit einer erhöhten Affinität zu A/T-reichen Sequenzen, führt zu charakteristischem 'Banding' am Chromosom entlang mit erhöhten Fluoreszenzintensitäten an Zentromeren und auf dem Y-Chromosom. Während es auch einfach und schnell vonstatten geht, kann variables Färben von Zentromeren beim selben Chromosom sich in Zellen auf verschiedenen Abschnitten der Metaphasenpartition des Zellzyklus' ereignen.
(iii) Fluorescence in situ hybridization (FISH; J. Knoll und P. Lichter, Abschnitt 4.3, Current Protocols in Human Genetics, Wiley, NY, 1994, 2006 überarbeitet) hat hybridisierende Chromosomen mit einer panzentromerischen, fluoreszenten DNA-Untersuchung, in Ergänzung zu allen Zentromeren zum Thema. Hybridisierungen von Zentromeren sind ohne weiteres erkennbar; doch können sie in der Größe, wie allein aus DAPI ersichtbar, variieren. FISH ist robust, hat eine hohe Sensibilität, und wird routinemäßig durchgeführt, benötigt jedoch zusätzliche 4–24 Stunden zur Hybridisierung und zum Nachweis, bevor man sich an die Untersuchung auf DCC begeben kann.
(iv) Immunohistochemistry (IHC) with a fluorescent antibody directed against CENPB, a centromere-specific Protein (Earnshaw W u. a. in Chromosoma 98: 1–12, 1989). CENPB ist in allen Zentromeren vorhanden und wird durch seine Fluoreszenz bei DAPI-gefärbten Chromosomen nachgewiesen. Diese Methode ist sensibel, fügt der Prozedur jedoch einige weitere Stunden hinzu. Während Zentromere mit FISH und IHC von allen anderen chromosomalen Gebilden unterschieden werden können, könnte doch die Menge sowie der Kostenfaktor von DNA-Untersuchungen und CENPB-Antikörpern im Falle eines Großunfalles ihre Anwendung begrenzen.

Diese Methoden können an bestrahlten Zellen durchgeführt werden, und Kalibrierungskurven für Dosiswirkungen (Bereich 0–5.0 Gy (Wilkins RC, u. a. in Interlaboratory comparison of the DCC assay for radiation biodosimetry in masscasualty events. Radiation Research 169: 551–560, 2008)) werden durch Ausführung linearer Regression von DCC-Zählungen bei jeder Dosis erstellt. Durch das Vergleichen von Gefällen und Rückständen für verschiedene Färbemethoden können wir bestimmen, welche Methoden gleichwertig oder sensibler sind als die Standard-FPG zum DCC-Nachweis. Diese Methoden würden dann zur Entwicklung automatisierter Prozeduren zur Segmentierung und zur Ausbildung verwendet werden, wie wir in Schritt (2) beschrieben haben. Die beobachteten DCCs aus den sensibelsten Färbeprotokollen werden dann mit erwarteten Messungen der Grundverifizierung verglichen. Die von der Software wahrgenommene Anzahl der Aberrationen wird mit der erwarteten Anzahl verglichen, die sich auf die erwarteten Häufigkeiten bei jeweils verabreichten Dosen stützt. Aberrationsdaten entsprechen einer Poissonschen Verteilung. Die statistische Bedeutung (bei 95% Konfidenz) zwischen den beobachteten und den erwarteten Aberrationen wird durch eine Probeninferenz für die Poissonsche Verteilung, eine kleine Stichprobe, beurteilt; die Grenzwertmethode (Rosner B. Hypothesis testing: one sample inference. One sample inference for the Poisson Distribution, Seiten 237–243. In: Fundamentals of Biostatistics, Duxbury Press, Belmont, CA, 1995). Die Stichprobe kann bedeutende Unterschiede aufzeigen, wenn die Software mehr falsche positive DCCs produzieren kann, wenn sich überlagernde Chromosomen nicht richtig segmentiert werden. Die Software kann mehr echt positive DCCs nachweisen, wenn die automatisierten Zellselektionskriterien nicht so stringent sind wie sie es für manuelles Auswerten sind.
Software zum genauen Identifizieren von DCC in optimal eingestuften Metaphasenspreads.
Ein einzelnes integriertes Softwareprogramm kann sodann zum Image-Ranking, Segmentieren von Chromosomen und zum Nachweisen dizentrischer (und azentrischer) Chromosomen implementiert werden, basierend auf den leistungsstärksten Methoden zur Chromosomenbildanalyse und zum Färben. Dies wird das Einbringen einzelner Programme in eine einzige Anwendung, wie in den Schritten 1 & 2 dargelegt, erfordern (vorzugsweise einschließlich eines vektorisierten Codes).
Automatisierte Zentromerverfeinerung an Metaphasenchromosomen mittels Fuzzy-Inferenzsystemen
Prozesse für den Nachweis von Zentromeren sind im allgemeinen anfällig für erhebliche Nachweisfehler. J. Piper und E. Granum, ”On fully automatic feature measurement for banded chromosome classification”, Cytometry, Band 10, Seiten 242–255, 1989. X. Wang u. a. in ”A rule-based computer scheme for centromere identification and polarity assignment of metaphase chromosomes”, Computer Methods and Programs in Bio Medicine, Band 89, Seiten 33–42, 2008. M. Moradi und S. K. Saterandan, ”New features for automatic classification of human chromosomes: A feasibility study”, Pattern Recognition Letters, Nr. 27, Seiten 19–28, 2006. P. Mousavi und R. Ward, ”Feature analysis and centromere segmentation of human chromosome images using an iterative fuzzy algorithm”, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, Band 49, Nr. 04, April 2002. M. Moradi u. a. in ”Automatic locating the centromere on human chromosome pictures”, in 16th IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems, 2003.
Die meisten dieser Nachweisfehler entstehen infolge von Geräuschen in der aufgefundenen Mittellinie des Chromosoms. Diese Geräuschdatenpunkte führen typischerweise dazu, dass die Messungen des Breitenprofils die drastische Veränderung an der Verengung verpassen. Dies führt zu einer anderen Position am Zentromer. In ihrer Mehrzahl sind diese Abweichungen (Deviationen) ihrer Natur nach lokal; d. h., die vorgefundene Position und die gewünschte Position liegen dicht bei einander. Und doch können diese geringfügigen Abweichungen viele Messungen nachteilig beeinflussen, wie beispielsweise Polaritätszuordnung (Zuordnung von p- und q-Arm) usw. Beim Nachweis von dizentrischen Chromosomen ist das Wichtigste, die Anzahl der Zentromerpositionen zu finden, im Gegensatz zu ihren jeweiligen Positionen. Jedoch kann jede eventuell falsche positive Zentromerposition jeden Klärungsprozess zum Aufspüren eines dizentrischen Chromosoms nachteilig beeinflussen. Daher haben wir ein neues Verfahren zum verbessern der Zentromere vorgeschlagen, das bestrebt ist, diese geringfügigen Abweichungen an den aufgefundenen Positionen zu korrigieren. Dies wiederum wird die Fähigkeit verbessern, dizentrische Chromosomen genau zu identifizieren. Der vorgeschlagene Verbesserungsschritt nutzt Informationen, die im Verlauf vorausgegangener Stufen unseres Algorithmus gesammelt worden waren. S. A. Akila u. a. in ”An accurate image processing algorithm for detecting FISH probe locations relative to chromosome landmarks on DAPI stained metaphase chromosome images”, Seventh Canadian Conference on Computer and Robot Vision (CRV 2010), Mai–Juni 2010.
Das vorgeschlagene Verbesserungs- bzw. Verfeinerungsverfahren basierte auf einem Breitenprofil des Chromosoms entlang der Mittellinie sowie des Intensitäts- oder gewichteten Intensitätsprofils entlang der Mittellinie. Diese Selektion erhöht die Anpassbarkeit des vorgeschlagenen Verfeinerungsprozesses in Richtung auf viele vorhandene Algorithmen zum Nachweis von Zentromeren.
Zunächst wurde der Suchraum für unseren verbesserungs- bzw. Verfeinerungsalgorithmus definiert. Die Größe dieses Suchraums steht in direkter Beziehung zur Leistung des Algorithmus. Die folgenden Erfordernisse mussten durch Festsetzen dieses Wertes erfüllt werden: Die Region muss groß genug sein, um die gewünschten Zentromerposition einzuschließen, und die Region darf auch nicht die anderen Zentromerposition einschließen (in dizentrischen Chromosomen).
Der Wert wurde empirisch auf 0,20 festgesetzt (von der Gesamtlänge des Chromosoms), um einen Kompromiss zwischen den obigen Konditionen zu schließen. Fußend auf dem aktuellen Zentromerort wurde eine Menge Mittellinienpunkte selektiert, von der Mittellinie als Suchraum aus. Sodann wurden insgesamt 72 Liniensegmente, welche die gesamten 360° abdeckten, durch jeden dieser extrahierten Mittellinienpunkte gezogen. Diese Mengen von Linien wurden gezogen, um möglichst annähernd alle möglichen Orientierungen abzudecken. Die Endpunkte dieser Liniensegmente wurden ausfindig gemacht durch Anwendung der zuvor extrahierten Binärobjektkontur. Diese Kontur erhielt man durch Verwendung der aktiven Konturen des Steigungsvektorverlaufs (gradient vector flow/GVF) und von lokalem 'Thresholding' (S. A. Akila u. a. in ”An accurate image processing algorithm for detecting FISH probe locations relative to chromosome landmarks on dapi stained metaphase chromosome images”, Seventh Canadian Conference on Computer and Robot Vision (CRV 2010), Mai–Juni 2010.) Dann wurden für jedes Liniensegment die folgenden drei Maße aufgezeichnet (vgl. 9). 9 stellt die Vorbereitung des Linienstichprobenverfahrens dar (L1, L2, L3 ...), für eine innere Mittellinie, Punkt P2. Bezogen auf 9, ist O–X die Horizontalachse, und Q–R ist die Senkrechte zu P1–P3, durch P2. Auch Winkelmessung für das Liniensegment L1 ist abgebildet. In 9 stellen P1, P2 und P3 jegliche 3 aufeinander folgende Punkte auf einer gestutzten Chromosomenmittellinie dar. L1, L2 und L3 sind durch P2 hindurch gezogene Linien, die 2,5 Grad von einander entfernt liegen.

1) ResW Die relative Breite des Liniensegments, basierend auf der Binärobjektkontur. Der ResW-Wert wurde als ein Verhältnis zwischen zwei Maßen errechnet als –
Daher werden die 'ResW'-Werte eher ein relativer Maßstab als ein direkter Messwert sein. Und daher bildet ein bestimmter Wert von 'ResW' unter 1,0 einen einigermaßen geeigneten Anwärter für das Zentromer.
2) ResDA Der Winkelunterschied oder Achsversatz (θ_off) zwischen der Richtung des Liniensegments und der erwarteten Richtung, angegeben durch Q–R (vgl. 9). Dieses Merkmal würde die Informationen hinsichtlich des Abweichens von der ursprünglichen Gitterstruktur (siehe 9) erbringen.
3) ResInt Die durchschnittliche Pixelintensität in einer 5 × 5-Umgebung um das Anwärtermittellinienpixel. Dieser Wert wurde wie folgt normalisiert:

9 zeigt die Vorbereitung der Linienbeprobung (L1, L2, L3 ...) für einen inneren Mittellinienpunkt P2. Bezogen auf 9, ist O–X die Horizontalachse, und Q–R ist die Senkrechte zu P1–P3, durch P2. Auch die Winkelmessung für das Liniensegment L1 ist abgebildet.
Alle Dateneingaben wurden aufgrund des 'ResW'-Wertes sortiert, und die zwei besten (mit den niedrigsten ResW) Werte wurden zusammen mit den ResDA- und ResInt-Werten für jeden ausgewählten Punkt selektiert. Die Auswahl von zwei Besteingaben zielte darauf ab, zu vermeiden, im abschließenden Datensatz falsche Negative zu bekommen, wobei sie möglicherweise den optimalen Anwärter enthielten. Daher haben wir am Ende (2 × n) Anwärterlösungen, bei denen ,n' die Größe des Suchraums ist.
Als nächstes müssen wir eine Methode formulieren zum Selektieren der besten Position für das Zentromer aus dem obigen Kreis der Anwärter heraus. Die betreffende Methode muss imstande sein, ”Expertenwissen” in den Selektionsprozess einzuschließen. Dies wird den Nachweis des Zentromers ermöglichen, was eine schwierige Aufgabe selbst für ein menschliches (unausgebildetes) Auge sein kann. ”Fuzzy-Logik-Systeme” stellen eine wohlbekannte Methode dar, formuliert, um einen Satz ”linguistischer Regeln” in den Entscheidungsprozess einzuschließen. Daher haben wir in dieser Forschungsarbeit ein ”Fuzzy-Logik-System” des Typs ”zadeh – mamdani” als das Bezugssystem unserer Entscheidungsfindung verwendet.

Dreieckige Fuzzy-Zugehörigkeitsfunktionen, die wir verwendeten, waren für die Mehrheit der Inputs und den Output. Die Umrisse und die Parameter dieser Zugehörigkeitsfunktionen sind in den 10, 11 und 12 wiedergegeben. Ein Fuzzy-Set von Regeln musste formuliert werden, was entsprechend den Lösungsraum für das Gerät definiert (die Ausgangsvariable). Von den Merkmalen, die verwendet wurden, sind 'ResDA' und 'ResInt' im wesentlichen dazu da, das Endergebnis in eine Richtung zu lenken, wobei man sich im wesentlichen darauf verlässt, den Nachweis für die Verengung aus dem 'ResW'-Wert zu erbringen. Das durchschnittliche Intensitätsmerkmal ('ResInt') im besonderen wurde verwendet, um in die Richtung der höheren Intensitensitätswerte zu lenken (im umgekehrten DAPI-Bild). Diese Aufgabenstellung macht unseren vorgeschlagenen Algorithmus robust beim Nachweis von dizentrischen Zentromeren, da die Trennung der Schwesterchromatiden eventuell Informationen zum ”Banding” weniger missverständlich werden lässt. Diese Vorkehrungen wurden durch die für das Erstellen der Fuzzy-Logik erlassene Regel reflektiert. Die Anzahl der Regeln und deren Kombinationen muss gut bedacht werden, um eine adäquate Ebene der Verallgemeinerung zu haben, wobei Überanpassung vermieden werden sollte. Bei unserer Methode haben wir 11 wissensbasierte Regeln abgeleitet, um all diese Erfordernisse mit einzubeziehen (dargestellt in Tabelle 2). Bei genauer Betrachtung von Tabelle 2 werden die Wirkungen jedes Merkmals auf die abschließende Entscheidung sichtbar. Der Ausgangspegel (Defuzzifikation) wurde unter Verwendung der 'Schwerpunkts'-Methode errechnet. Die Grundkonfiguration der Fuzzy-Logik ist in 13 dargestellt. Bezüglich 13: Der ResW, ResDA und ResInt (nicht fuzzy an diesem Punkt 102) sind fuzzyfiziert 104. Elf wissensbasierte Regeln 108 (unten in Tabelle 2 dargestellt) werden angewendet, und die Schlussfolgerung 106 werden gezogen. Deren Ergebnisse sind defuzzyfiziert 110 und konvertiert 112 zum Fuzzyfizier-Output 114.

Regel Nummer	ResW	ResDA	ResInt	Ausgangspegel
1	Sehr niedrig	Niedrig	-	Ultrahoch
2	Sehr niedrig	Niedrig	-	Ultrahoch
3	Niedrig	Niedrig	-	Sehr hoch
4	Niedrig	Durchschnittlich	-	Mittelhoch
5	Niedrig	Hoch	-	Mittelhoch
6	Durchschnittlich	Niedrig	Hoch	Mittelhoch
7	Durchschnittlich	Durchschnittlich	Hoch	Mittelniedrig
8	Durchschnittlich	Hoch	-	Sehrniedrig
9	Durchschnittlich	Niedrig	Niedrig	Mittelniedrig
10	Durchschnittlich	Durchschnittlich	Niedrig	Sehrniedrig
11	Hoch	-	-	Ultraniedrig

Tabelle 2: Wenn-Dann-Regeln angewendet in der Fuzzy-Logik-Konfiguration

Der Algorithmus zum Bestimmen der Position des Zentromers auf Grund des Schemas der Fuzzy-Logik ist wie folgt:

1. Aus den zwei Ergebnissätzen des Fuzzy-Output (2 Anwärtersätze je Mittellinienpixel), wird das Maximalergebnis für jeden Satz selektiert.
2. Auch die Verschiebung (weg vom gegenwärtigen Zentromer) wird für diese 2 besten Ergebnisse errechnet.
3. Wir sehen uns dann den Unterschied zwischen diesen zwei besten Anwärterwerten (Fuzz-Output) an und vergleichen ihn mit einem Schwellenwert von 0,1.
4. Falls der Unterschied größer als 0,1 ist, wird das Mittellinienpixel mit dem höchsten Ergebnis als die neue Position des Zentromers selektiert.

Falls der Unterschied niedriger als 0,1 ist, wird das Mittellinienpixel mit der niedrigsten Verschiebung als der neue Ort des Zentromers selektiert. Der Ausgangswert liegt im Bereich von: 0,0–1,0 (und variiert typischerweise auf beste Ergebnisse hin zwischen 0,6–0,9). Daher stellt eine Verbesserung von 0,1 zwischen den zwei besten Ergebnissen eine sehr bedeutende Verbesserung dar, in welcher wir die Verschiebung außer Acht lassen sollten.
14 zeigt einen neuartigen Prozess entsprechend der vorliegenden Erfindung. In Schritt 116 findet die automatisierte Erfassung der DAPA-gefärbten Metaphasenbilder statt. Die Bilder werden eingestuft und eingeordnet, 118, in den vorbereitenden Schritten, und sodann werden die Bilder in 120 als übermäßig ausgebreitet, in Ordnung oder überlagert klassifiziert. Die Chromosomen werden in 122 vorbereitet, wobei die Chromosomen in jeder Zelle segmentiert werden. Die Merkmale werden in 124 extrahiert, und für jedes Chromosom wird die Mittellinie festgestellt. Die Breite und Intensität werden in 126 auf ein Minimum gesenkt. Die Zentromere werden in 128 gezählt. Wenn der ”multiglobal”-Wert in 132 nicht minimal ist, dann ist das Chromosom normal in 130. Wenn der ”multiglobal”-Wert in 132 minimal ist, dann suchen wir die Schwesterchromatidentrennung in 134. Falls wir sie finden, verfeinern wir das Zentromer in 136. Falls wir sie nicht finden, dann wird das zweite Zentromer in 138 nachgewiesen, und wir haben ein dizentrisches Chromosom in 140.
Es wird also auch ein Computerprogrammprodukt, gespeichert in einem Computerspeichermittel veröffentlicht. Das besagte Computerprogrammprodukt, einsetzbar zum Ableiten von Parametern für ein Fuzzy-Logik-System, worin das besagte Fuzzy-Logik-System angepasst wird zur Bestimmung der Position von zumindest einem Zentromer jedes Chromosoms in einer Zelle in zumindest einem Bild eines Metaphasenkerns, wobei das besagte Computerprogrammprodukt umfasst: das Mittel zum Zugriff auf einen Algorithmus zum Erstellen einer Vielzahl von Mittellinien von Anwärterchromosomen, welche die besagten Parameter für besagtes Fuzzy-Logik-System repräsentieren, besagte Parameter einschließlich der eingegebenen Zugehörigkeitsfunktionen und Regeln für besagtes Fuzzy-Logik-System; das Mittel zum Transformieren jeder der besagten Vielzahl der Mittellinie des Anwärterchromosoms in besagte Parameter für das Fuzzy-Logik-System; das Mittel zum Importieren der besagten Parameter in das besagte Fuzzy-Logik-System für jedes der besagten Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms; das Mittel zum Simulieren des besagten Fuzzy-Logik-Systems in Hinsicht auf jedes der besagten Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms, worin das besagte Simuliermittel zum weiteren einschließt: ein Mittel zum Herstellen von Bilddaten besagter Metaphasenkernzelle, welche durch besagtes Fuzzy-Logik-System erkannt werden, ein Mittel zum Eingeben besagter Bilddaten in ein Netzwerk zur ”Learning Vector Quantization” für das Erstellen unveränderlicher Vektoren optimierter Zeitpunkte, welche mit jedem im besagten Fuzzy-Logik-System assoziiert sind, und ein Mittel zum Eingeben besagter unveränderlicher Vektoren optimierter Zeitpunkte in das besagte Fuzzy-Logik-System; ein Mittel zum Bewerten besagter Simulationen in Hinsicht auf einen Schwellenwertparameter; und ein Mittel zum Selektieren eines aus der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms, resultierend aus dem Mittel zum Bewerten, falls das aus der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms dem besagten Schwellenwertparameter genügt.
Es wird auch eine Methode zum Ableiten von Parametern für ein Fuzzy-Logik-System mitgeteilt, das zum Bestimmen eines Ortes adaptiert wurde, zumindest eines Zentromers jedes Chromosoms in einer Zelle in zumindest einem Bild eines Metaphasenkerns. Die besagte Methode enthält die folgenden Schritte:
Erstellen von Bilddaten von Zentromeren, welche mittels der Anwendung des Fuzzy-Logik-Systems erkannt werden sollen; Eingeben der Bilddaten in ein Netzwerk zur ”Learning Vector Quantization” für das Erstellen unveränderlicher Vektoren optimierter Zeitpunkte, welche mit jedem in dem Fuzzy-Logik-System assoziiert sind; Zugreifen auf einen Algorithmus zum Erstellen einer Vielzahl von Mittellinien von Anwärterchromosomen, welche die Parameter für die Fuzzy-Logik-System repräsentieren; Transformieren jeder der Vielzahl der Mittellinie des Anwärterchromosoms in die Parameter für das Fuzzy-Logik-System; Importieren der Parameter in das Fuzzy-Logik-System für jedes der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms; Simulieren des Fuzzy-Logik-Systems in Hinsicht auf jedes der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms; Eingeben der Bilddaten unveränderlicher Vektoren optimierter Zeitpunkte in das Fuzzy-Logik-System in Hinsicht auf jedes der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms: Bestimmen, wie viele der Zentromere durch das Fuzzy-Logik-System korrekt erkannt werden; Selektieren eines aus der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms, falls der aus der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms alle Zentromere korrekt erkennt; jedem aus der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms einen Punktstand Zentromere durch jedes us der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms erkannt wurden;
Selektieren eines Prozentsatzes aus der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms mit besseren Ergebnissen; Anwenden eines Überführungsprozesses zwischen selektiertem Prozentsatz der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms, um einen oder mehrere Nachkommen hervorzubringen; Ersetzen eines oder mehrerer aus der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms mit den schlechtesten Ergebnissen mit den ein oder mehreren Nachkommen, was eine neue Population von Mittellinien von Anwärterchromosomen zur Folge hat; Transformieren der neuen Population in Fuzzy-Logik-Parameter; Importieren der Fuzzy-Logik-Parameter der neuen Population in das Fuzzy-Logik-System; Simulieren des Fuzzy-Logik-Systems hinsichtlich der neuen Population; Eingeben der unveränderlichen Vektoren optimierter Zeitpunkte in das Fuzzy-Logik-System; hinsichtlich jedes der Vielzahl in der Mittellinie des Anwärterchromosoms in der neuen Population; Bestimmen, wie viele der Zentromere durch das Fuzzy-Logik-System korrekt erkannt wurden; und eine aus der Vielzahl auf der Mittellinie des Anwärterchromosoms in der neuen Population selektieren, falls diejenige aus der Vielzahl auf der Mittellinie des Anwärterchromosoms in der neuen Population alle der Zentromere korrekt erkennt.
Auch wird ein Satz Anweisungen mitgeteilt, gespeichert zumindest auf einem langlebigen computerlesbaren Medium zum Betrieb in einem Computersystem. Dieser Satz besteht aus: Anweisungen zum Erhalten von einer oder mehr elektronischen Bilddateien in einem oder mehr Speichern; Anweisungen zum Identifizieren von Bildinhalt mit Ähnlichkeit zu einem Metaphasenkern mit getrennten, aneinander anschließenden Chromosomen; Anweisungen zum Identifizieren von Metaphasenchromosomen und Teilen davon im Bildinhalt; Anweisungen zum Identifizieren lokaler Klassifikationsparameter von Metaphasenchromosomen und Chromosomen, die mit Chromosomen der Umgebung verbunden sind; Anweisungen zum Extrahieren von Chromosomenmerkmalen aus dem Bildinhalt; Anweisungen zum Anwenden eines Klassifikationssystems auf Grund extrahierter Chromosomenkennzeichen des Bildinhalts zum Trennen einer Vielzahl verschiedener Bildkategorien. Diese Kategorien enthalten die Klassifikation von ”in Ordnung”, ”überlagert” und ”übermäßig ausgebreitet”, wobei die Klassifikation ”in Ordnung” ein Bild mit mindestens einem Chromosom meint, das in dem Bild gänzlich enthalten ist und substantiell keine Überlagerung mit einem anderen Chromosomen aufweist. Die Klassifikation einer Überlagerung bezieht sich auf ein Bild mit mindestens zwei Chromosomen, die sich übereinander befinden, und die Klassifikation einer übermäßigen Ausbreitung bezieht sich auf ein Bild mit mindestens einem Chromosom, das nur teilweise im Bildausschnitt enthalten ist; Anweisungen zum Anwenden eines Rangfolgesystems für die Bilder auf Grund einer Vielfalt globaler Parameter; Anweisungen zum Selektieren einer Teilmenge von Bildern auf Grund von Rangfolge; Anweisungen zum Bestimmen von Chromosomenkonturen; Anweisungen zum Bestimmen des Ortes der Mittellinie des Chromosoms; Anweisungen zum Lokalisieren der wahrscheinlichsten Position zumindest eines Zentromers im Chromosom, wodurch eine Vielzahl von Chromosomen in derselben Zelle auf Grund ihrer Position klassifiziert werden; Anweisungen zum Messen des Konfidenzwertes eines Zentromers, um die wahrscheinliche Position im automatisierten Nachweisprozess für das Zentromer zu messen; Anweisungen zum Maskieren der wahrscheinlichsten Position für das erste Zentromer und zum Wiedererrechnen des Zentromerkonfidenzwertes, um zu bestimmen, ob im selben Chromosom Zentromere vorhanden sind; Anweisungen zum Ermitteln der Anzahl der Zentromere im Chromosom; Anweisungen zum Errechnen der Häufigkeit von dizentrischen Chromosomen in zumindest einer Zelle; und Anweisungen zum Bestimmen einer Strahlungsdosis durch Vergleichen der errechneten Häufigkeit jedes dizentrischen Chromosoms bei einer zuvor festgelegten Dosiswirkungskurve aus einer kalibrierten Quelle.
Unter einem Aspekt sind die Anweisungen a.–p. so bearbeitet worden, dass sie ohne manuelle Intervention ausgeführt werden sollen. Im Allgemeinen erfolgt zumindest eine Anweisung zum Speichern von Informationen, die auf den Inhalt hinweisen, der einem Metaphasenchromosom ähnelt. Unter einem weiteren Aspekt erfolgt zumindest eine Anweisung zum Speichern von Informationen zum Bestimmen lokaler Klassifikationsparameter von Metaphasenchromosomen sowie Chromosomen, die mit Chromosomen der Umgebung verbunden sind. In einem weiteren Aspekt gibt es wenigstens eine Anweisung zum Speichern allgemeiner Klassifizierungsparameter für Metaphasenchromosome sowie Chromosome, die mit Chromosomen der Umgebung verbunden sind. Unter einem weiteren Aspekt erfolgt wenigstens eine Anweisung zum Speichern der eingestuften Bilder. Unter einem weiteren Aspekt erfolgt wenigstens eine Anweisung zum Speichern von Chromosomenkonturen. Unter einem weiteren Aspekt erfolgt wenigstens eine Anweisung zum Speichern des Ortes der Mittellinie von Metaphasenchromosomen. Unter einem weiteren Aspekt erfolgt wenigstens eine Anweisung zum Speichern der Anzahl von Zentromeren in einem Metaphasenchromosom. Unter einem weiteren Aspekt erfolgt wenigstens eine Anweisung zum Speichern des Ortes von Zentromeren in einem Metaphasenchromosom. Unter einem weiteren Aspekt erfolgt wenigstens eine Anweisung zum Speichern einer Bestimmung eines abnormalen Chromosoms. Die Anweisungen sind so bearbeitet, dass sie die Häufigkeit von dizentrischen Chromosomen in einem Satz Bildern von Metaphasenkernen bestimmen. Die Anweisungen sind so bearbeitet, dass sie den Konfidenzwert des Zentromers bestimmen, um wiederum die wahrscheinlichsten Positionen von einem oder mehreren Zentromeren in einem Chromosom zu bestimmen. Die Anweisungen sind so bearbeitet, dass sie eine Strahlungsdosis bestimmen, indem die errechnete Häufigkeit jedes dizentrischen Chromosoms mit einer zuvor bestimmten Dosis-Wirkungskurve aus einer kalibrierten Quelle verglichen wird.
Beispiel 1
Automatischer Nachweis einzelner Zentromere in normalen Chromosomen.

Zellen von drei verschiedenen normalen Individuen wurden mit Fluoreszenzmikroskopie abgebildet nach Hitzedenaturierung, Fixierung der Metaphasenchromosome in 2XSSC, 50%-igem Formamid, 10%-iger Dextransulfatlösung und Färben mit DAPI (wie in J. Knoll und P. Lichter, Abschnitt 4.3, Current Protocols in Human Genetics, Wiley NY, 1994, revidiert 2006 beschrieben). Wir erhielten Graustufenbilder, mit einem DAPI-Filterset unter Verwendung eines Olympus BX61 Mikroskops und von Cytovision-Software (Genetix Inc., San Jose, CA) erstellt und invertiert. Denaturierung verstärkt die Einfärbung von zentromeren und heterochromatischen Sequenzen (im Gegensatz zu euchromatischen Domänen mit einer Einzelkopie), wegen der Präferenz dieses Färbemittels an doppelsträngige, A/T-reiche DANN zu binden, welches sich infolge der Selbst-Renaturierung von Tandem-Alphoid-Monomeren in diesen Regionen wieder bildet. Digital aufgenommene Bilder wurden dann invertiert, und Regionen mit partieller Metaphase, die gut getrennte Chromosomen enthielten, wurden segmentiert, um ihre wesentlichen Eigenschaften zu erhalten, die für das Lokalisieren der Zentromere erforderlich waren. Die Koordinaten der Zentromere, die aus den segmentierten Chromosomenmerkmalen segmentiert worden waren, sind in der folgenden Tabelle angegeben. Diese gefolgerten Positionen der Zentromere wurden von zwei Zytogenetikern bewertet, um die Genauigkeit der aktuell verwendeten Methode zu bestimmen:

Mikroskop Objektträger Nr.	Zelle Nr.	Zentromer X	Koordinaten (Pixel) Y	Partielle Metaphase X	Koordinaten Y	korrekte Position ?
1974	1	112	91	374.45	306.52	Ja
1974	2	101	99	348.00	364.72	Ja
1974	3	99	97	400.91	479.37	Ja
1974	4	94	99	377.98	551.68	Ja
1974	5	100	99	429.13	631.05	Ja
1974	6	108	97	547.30	599.30	Ja
1974	7	100	98	609.04	572.85	Ja
1974	8	100	101	496.15	595.78	Ja
1974	9	110	110	669.00	477.60	Ja
1974	10	99	98	580.81	392.94	Nein
1974	11	102	106	536.72	366.48	Ja
1974	12	94	96	577.29	350.61	Ja
1974	13	99	100	531.43	322.39	Ja
1974	14	109	91	402.67	362.96	Ja
1974	15	107	98	388.56	433.51	Ja
1974	16	93	106	515.56	463.49	Ja
1974	17	110	97	485.57	502.30	Ja
1974	18	86	102	566.70	551.68	Ja
1974	19	101	91	630.20	479.37	Ja
1974	20	103	100	446.77	461.73	Ja
1974	21	93	104	480.28	467.02	Ja
1974	22	98	89	582.58	294.17	Ja
1974	23	97	93	499.68	535.81	Ja
1973	1	108	91	436.19	308.28	Ja
1973	2	88	105	506.74	306.52	Ja
1973	3	115	99	434.42	345.32	Ja
1973	4	113	89	339.18	472.31	Ja
1973	5	95	105	386.80	549.92	Ja
1973	6	104	104	381.51	608.12	Ja
1973	7	107	102	473.22	548.15	Ja
1973	8	95	104	598.45	611.65	Ja
1973	9	86	93	639.02	620.47	Ja
1973	10	112	87	658.42	534.04	Ja
1973	11	99	105	557.89	519.93	Ja
1973	12	96	94	593.16	366.48	Ja
1973	13	94	100	494.39	361.19	Ja
1973	14	101	106	459.11	407.05	Ja
1973	15	102	102	561.41	396.47	Ja
1973	16	102	99	407.96	451.15	Ja
1973	17	99	104	674.30	602.83	Ja
1973	18	109	101	531.43	572.85	Ja
1973	19	103	105	594.93	528.75	Ja
1972	1	95	102	485.57	299.46	Ja
1972	2	92	103	356.81	362.96	Ja
1972	3	101	107	360.34	384.12	Ja
1972	4	110	94	409.73	359.43	Ja
1972	5	103	95	441.48	355.90	Ja
1972	6	103	105	418.55	431.74	Ja
1972	7	99	94	383.27	461.73	Ja
1972	8	109	91	340.94	484.66	Ja
1972	9	97	103	353.29	447.62	Ja
1972	10	105	98	363.87	539.33	Ja
1972	11	125	103	473.22	442.33	Nein
1972	12	99	103	450.30	498.77	Ja
1972	13	93	100	474.99	606.36	Ja
1972	14	107	93	568.47	602.83	Ja
1972	15	100	100	573.76	514.64	Ja
1972	16	108	94	630.20	518.17	Ja
1972	17	106	102	480.28	401.76	Ja
1972	18	91	110	531.43	382.36	Ja
1972	19	119	107	630.20	359.43	Ja
1972	20	95	102	582.58	315.33	Ja
1972	21	100	103	575.52	340.03	Ja
1972	22	102	97	647.84	544.63	Ja
1972	23	108	110	494.39	362.96	Ja
1972	24	99	108	575.52	405.29	Ja
1972	25	98	116	651.37	412.34	Ja
1970	1	88	103	446.77	311.81	Ja
1970	2	88	102	392.09	341.79	Nein
1970	3	94	110	392.09	370.01	Ja
1970	4	92	96	415.02	408.81	Ja
1970	5	100	99	437.95	398.23	Ja
1970	6	91	110	355.05	458.20	Ja
1970	7	90	92	415.02	507.59	Ja
1970	8	98	107	407.96	548.15	Ja
1970	9	97	108	430.89	576.37	Ja
1970	10	89	100	473.22	528.75	Ja
1970	11	99	91	460.88	461.73	Ja
1970	12	103	109	499.68	398.23	Ja
1970	13	97	102	631.96	375.30	Ja
1970	14	94	93	513.79	486.42	Ja
1970	15	97	98	557.89	500.53	Ja
1970	16	92	97	605.51	475.84	Ja
1970	17	100	104	534.96	315.33	Ja

Beispiel 2
Ergebnisse des Algorithmus für den Zentromernachweis zwecks dizentrischen Nachweises. Der Algorithmus wurde entwickelt für und getestet an DAPI-gefärbten bestrahlten Metaphasenchromosomenbildern und sodann für FPG-gefärbte Bilder adaptiert. Metaphasenspreads von Zellen wurden mit 5 Gy ionisierender Bestrahlung von Dr. Ruth Wilkins (Health Canada; HC) bestrahlt, dann unter Hitze denaturiert und mit DAPI an der Universität von Western Ontario (UWO) eingefärbt. Wir haben DCC dann manuell identifiziert und eine modifizierte Form unseres veröffentlichten Algorithmus angewendet, um Zentromere nachzuweisen (Subasinghe, A. u. a. in Canadian Conf. on Computer & Robot Vision, Seiten 223–230, DOI: 10.1109/CRV.2010.36, 2010). Nach dem Segmentieren des Chromosoms und dem Errechnen der Mittellinie, der Methode folgend, die wir weiter unten beschrieben haben, bestimmt die Software das Zentromer und die assoziierten CCF-Werte. Das erste Zentromer wird dann maskiert, und der Prozess wird wiederholt, um das zweite zu finden. Typische Beispiele der zwei Zentromere, die durch den Algorithmus gefunden wurden, sind in den 3 und 4 gekennzeichnet. Bei 17 (85%) von 20 DCCs waren beide Zentromere richtig platziert. Zum Maskieren müssen die Einträge zum Breitenprofil des Objekts, das maskiert wird (in diesem Falle das erste Zentromer), aus den folgenden Berechnungen entfernt werden, um die nächste beste Position für ein Zentromer zu finden.
Der Algorithmus wurde dann modifiziert, um Giemsa- oder FPG-gefärbte Chromosomen nachzuweisen, die mit standardisierten Biodosimetrieprotokollen erstellt werden. Diese Prozeduren resultieren in nahezu einheitlicher Färbung am ganzen Chromosom entlang, so dass Pixelintensität kein verlässliches Merkmal mehr ist. Bilder von Metaphasenzellen wurden aus Blutleukozyten erstellt, die einer 5 Gy Gamma Bestrahlung im Chalk River Labor (AECL) ausgesetzt wurden. Das AECL protokolliert Ergebnisse bei einer signifikanten Schwesterchromatidtrennung, ausgenommen in zentromerischen Regionen. Es kann zu Zentromerseparation und Assoziation zwischen kurzen Armen von akrozentrische Chromosomen kommen, was die automatisierte Bildanalyse durcheinanderbringen kann.
Der Bildverarbeitungsalgorithmus wurde modifiziert, um Pixelintensitäten außer Acht zu lassen. Das zweite Zentromer wurde durch Maskieren der Breitenprofilregion ermittelt, welche das erste enthielt, und das Minimum, W_m, wurde in Wp(i) umbenannt. Von 21 vom Zytogenetiker identifizierten DCC wurden beiden Zentromere genau 15 Zellen (71%) zugeordnet, ein Zentromer genau 4, und keins der zwei Zentromere wurde in den 2 Fällen korrekt lokalisiert. Ein zweiter unabhängig erstellter Satz von 12 Giemsa-gefärbten, dizentrischen Chromosomen wurde sodann analysiert, und die Ergebnisse waren mit dem ersten Satz vergleichbar (7, in denen beide Zentromere richtig zugeordnet waren, 4, in denen eins richtig zugeordnet war und 1, in dem keins der beiden Zentromere korrekt war).
Während die Trennung der Schwesterchromatiden das Breitenprofil in DAPI-gefärbten Chromosomen nicht signifikant beeinflusst, ist die Trennung eine beträchtliche Quelle von Irrtümern in Giemsa-gefärbten Chromosomen, die man durch ausgedehnte Behandlung mit Colcemid erhält. Kurze, kondensierte Chromosomen, welche eine Ausbreitung der Schwesterchromatiden an ihren Enden aufweisen, sind fehleranfällig, weil die diskrete Kurvenentwicklung (”DCE”) das einzelne Chromatid in dieser Region als das gesamte Chromosom beim Skelettieren der Mittellinie falsch interpretiert. Diese Art Chromosomenstruktur kann durch das einzigartige konkave Muster ihres Aufbaus unterschieden werden. Wenn Konkavität nachgewiesen wird, kann die Chromosomenkontur bis zu dem Punkt erodiert werden, an dem diese Konkavität eliminiert wird (die Chromatiden schmelzen). Das ist die Position eines Zentromers.
Hitzedenaturierung chromosomaler DNA mit nachfolgender DAPI-Färbung gibt bei der Verwendung des Algorithmus eine größere Genauigkeit. Man erhielt Ergebnisse, welche die Genauigkeit des Algorithmus für Chromosomen direkt mit denen vergleichen, die hitzedenaturiert und mit DAPI gefärbt wurden gegenüber normalen Chromosomen, die nicht hitzedenaturiert wurden. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Dizentrische Analyseergebnisse – Scoring 26. Oktober 2010
Gewerbliche Anwendbarkeit
Der neue Prozess umgeht einen pseudopositiven (falsches positives) Nachweis durch Vorselektieren optimaler Metaphasenausbreitung zur Analyse. Das Lokalisieren von Zentromeren wird mit DAPI- und Giemsa-Färbemethoden verbessert, welche zentromerische Regionen hervorheben, die eine bessere Unterscheidung von DCCs mittels Bildverarbeitung ermöglichen, was die Automatisieren der zuvor arbeitsintensiven und langsamen Prozesse ermöglicht. Insbesondere kann Hitzedenaturierung DAPI-gefärbter Chromosomen die Genauigkeit des Erkennens von Zentromeren im Vergleich zum Färben mit Giemsa erhöhen. Die Verarbeitungsmenge und die Möglichkeiten des Systems können erweitert werden, um die Häufigkeiten von DCCs zu bestimmen und die Strahlenexposition in einem Cluster-Computerrahmen zu berechnen, der imstande ist, die Datenverarbeitung bei einer Großschadenslage zu bewältigen. Die Methode zur Bestimmung der Mittellinie erbringt bei kurzen, langen oder stark gebogenen Chromosomen gute Leistung.
Im Verbund mit Zentromernachweis verbessert dieses neue Verfahren den Nachweis von Zentromeren. Das ist nicht offensichtlich, weil die Zwecke des Zentromernachweises im Allgemeinen ohne Bezug zum Einstufen einer Sammlung von Metaphasenchromosomen in derselben Zelle sind.
Das neue Verfahren kann bestrahlte Chromosomen mit signifikanter Schwesterchromatidentrennung nachweisen. Bei dem neuen Verfahren sind keine geraden Chromosomen erforderlich, um das Zentromer genau zu identifizieren. Das Verfahren hat eine niedrigere Rate pseudopositiven Nachweises, weil die am höchsten eingestuften Chromosomen zwecks Analyse nachgewiesen werden. Es hat auch eine höhere Empfindlichkeit als im Handel erhältliche automatisierte Verfahren und Software, wie jene, welche/s von einem anderen handelsüblichen Mikroskopiebildsystem der Zytogenetik entwickelt wurde, welches nur etwa 50% der dizentrischen Chromosomen nachweist. Im Gegensatz dazu weist das vorliegende Verfahren 70–85% der dizentrischen Chromosomen nach.
Das neue Verfahren kann zur Bestimmung des Grades ionisierender Strahlenbelastung eingesetzt werden. Bestrahlungsdosen, die aus dizentrischen Häufigkeiten geschätzt werden, werden verwendet, um bei Massenunfällen und industrieller Exposition mit ionisierenden Strahlungen Behandlungsentscheidungen zu fällen. Das neue Verfahren kann auch zur genauen Bestimmung der Dosis der ionisierenden Bestrahlung des gesamten Körpers über die Analyse dizentrischer Chromosomen im Blut angewendet werden. Das neue Verfahren liefert eine genaue, wirksame automatisierte Methode, die Häufigkeit dizentrischer Chromosomen im Blut zu bestimmen.

Claims

Methode zum Nachweis von Strahlungsbelastung aus in einer Probe vorhandenen Chromosomenanomalien, bestehend aus den folgenden Schritten: (a) Bestimmen einer Position zumindest eines Zentromers jedes Chromosoms in einer Zelle in einem Bild eines Metaphasenkerns durch: (i) Segmentieren einer akkurat gezogenen Chromosomenmittellinie jedes der Chromosomen in der Zelle, (ii) Selektieren eines Längsquerschnitts eines Chromosomenbildes mit minimaler Breite, Intensität oder einer Kombination von Merkmalen, die aus Breite und Intensität abgeleitet sind, worin in einem dizentrischen Chromosom, der Ort eines ersten Zentromers abgedeckt wird, um einen folgenden Längsquerschnitt mit einem zweitniedrigsten Minimum kombinierter Breite zu identifizieren; (b) Ermitteln der Anzahl der Zentromere in jedem Chromosom in jeder Zelle; (c) Zusammenzählen einer errechneten Häufigkeit dizentrischer Chromosomen in einer Zellpopulation; und d) Bestimmen einer Strahlungsdosis durch Vergleichen der errechneten Häufigkeit dizentrischer Chromosome mit einer zuvor bestimmten Dosis-Wirkungskurve aus einer kalibrierten Quelle ionisierender Strahlung.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Ort eines ersten Zentromeres maskiert wird, um einen nachfolgenden Längsquerschnitt eines zweiten Zentromers mit einem zweitniedrigsten Minimum kombinierter Breite zu identifizieren.
Methode nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Bild des Metaphasenkerns selektiert wird, welches zumindest eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (i) komplette Chromosomenanzahl, (ii) Minimierung des Überlappungsgrades und der Chromosomenüberschneidung, sowie (iii) Chromosomen weisen festgelegte Grenzen auf.
Methode nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Ort des Zentromers durch die Querschnittsintensität und/oder die Breitenprofile des Chromosoms senkrecht zur Chromosomenmittellinie bestimmt wird.
Methode nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Chromosomenmittellinie durch diskrete Kurvenevolution durch Ausästen des Skeletts abgeleitet wird.
Methode zum Nachweisen zumindest eines abnormalen Chromosoms, bestehend aus den folgenden Schritten: Scannen einer Vielzahl von Sektoren in einem vorbestimmten Bereich eines Objektträgers nach zumindest einem Sektor mit Bildinhalt der einem Metaphasenkern ähnelt, der diskrete, benachbarte Chromosomen enthält, wodurch ein Bildsektor geschaffen wird; Identifizieren von Metaphasenchromosomen und Teilen davon im Bildinhalt des Bildsektors; Bestimmen lokaler Klassifikationsparameter von Metaphasenchromosomen und von Chromosomen, die mit benachbarten Chromosomen verbunden sind; Extrahieren von Merkmalen aus dem Bildsektor von Metaphasenchromosomen und von Chromosomen, die mit benachbarten Chromosomen verbunden sind; Anwenden eines Klassifikationssystems, basierend auf den extrahierten Chromosomenmerkmale, um eine Vielzahl verschiedener Kategorien von Bildsektoren zu trennen, wobei die Kategorien aus einer ”in Ordnung”-Klassifikation, einer ”überlagert”-Klassifikation und einer ”übermäßig ausgebreitet”-Klassifikation besteht, wobei eine ”in Ordnung”-Klassifikation ein Bildsektor ist, der zumindest ein Chromosom aufweist, das vollkommen in dem Bildsektor enthalten ist und im Wesentlichen keine Überlagerung mit einem anderen Chromosom aufweist, eine ”überlagert”-Klassifikation ein Bildsektor ist, der zumindest zwei Chromosome aufweist, die übereinander gelagert sind und eine ”übermäßig ausgebreitet”-Klassifikation ein Bildsektor ist, der zumindest ein Chromosom aufweist, das nur teilweise in dem Bildsektor enthalten ist; Bestimmen zumindest eines lokalen Parameters für jeden Bildsektor; Anwenden eines Bewertungssystems, basierend auf einer Vielzahl von Gesamtparametern; Selektieren des Bildsektors mit zumindest einem Chromosom basierend auf dem Bewertungssystems, in welchem der selektierte Bildsektor einen hohen Rang aufweist; Bestimmen zumindest einer Kontur des zumindest einen Chromosoms; Bestimmen einer Mittellinie des zumindest einen Chromosoms; Lokalisieren der wahrscheinlichsten Position zumindest eines Zentromers in dem zumindest einen Chromosom, wodurch eine Vielzahl von Chromosomen in einer Zelle basierend auf der Position klassifiziert werden; Messen des Konfidenzwertes eines Zentromers, um eine wahrscheinliche Position des zumindest einen Zentromers zu messen; Maskieren der wahrscheinlichsten Position für ein erstes Zentromer und erneutes Ermitteln des Konfidenzwertes eines Zentromers, um zu bestimmen, ob die folgenden Zentromere auf dem Chromosom vorhanden sind; Ermitteln der Anzahl der Zentromere im Chromosom; Zusammenzählen einer errechneten Häufigkeit dizentrischer Chromosomen in zumindest einer Zelle; und Bestimmen einer Strahlungsdosis durch Vergleichen der errechneten Häufigkeit jedes dizentrischen Chromosoms mit einer zuvor bestimmten Dosis-Wirkungskurve aus einer kalibrierten Quelle.
Methode nach Anspruch 6, worin die Gesamt-Klassifikationsparameter zumindest einen Parameter enthalten, der aus einer Gruppe, bestehend aus einem Durchschnittsbereich, einer Standardabweichung des Bereichs, Länge, Umfang, Querschnittsverhältnis, paarweisem Abstand zwischen jedem Chromosom und Kombinationen davon ausgewählt wurde.
Methode nach Anspruch 6, worin die lokalen Rangparameter zumindest einen Parameter enthalten, der aus einer Gruppe ausgewählt wurde, die aus Gesamtbereich, Verhältnis erheblicher Überlagerungen, mittlerem, paarweisem Abstand, Helligkeit, Kontrast und Kombinationen daraus besteht.
Methode nach Anspruch 6, worin der Schritt des Auswählens eines Bildsektors aus dem Bereitstellen eines Algorithmus' unter Verwendung eines Fuzzy-Logik-Systems zum Nachweis eines abnormalen dizentrischen Chromosoms besteht.
Methode nach Anspruch 6, worin das Bestimmen der Kontur aus den folgenden Stufen besteht: a) Vorverarbeiten eines fluoreszenten Metaphasenbildes eines DAPI-gefärbten Chromosoms zur Chromosomensegmentierung; b) Beobachten einer Intensitätsschwankung des Chromosoms; c) Durchführen einer Grauskalaumwandlung; d) Extrahieren eines rechteckigen Fensters, welches das Chromosom und einen sich anschließenden Hintergrund enthält, wodurch Schwankungen der Lichtbedingungen überall auf dem Bild ausgeglichen wurden; e) Normalisieren von Intensitäten durch Anpassung der Fenstermitte und Ausarbeiten eines komplettes Spektrums möglicher Pixelwerte; f) Anwenden eines Schwellenwertes, basierend auf Otsu's Methode, wodurch eine Binärdarstellung generiert wird; g) Unterwerfen des Binärabbilds dem inhalts- und klassifikationsbasierten Rangalgorithmus; h) Anwenden eines Skalierungsfaktors für das Binärabbild; i) Extrahieren des Chromosoms aus dem Bild durch Markieren miteinander verbundener Komponenten eines Graphen mit 4 Verbindungen, wodurch Diskontinuitäten innerhalb und an der Grenze des Chromosoms entfernt wurden; j) Ausfindigmachen der ursprünglichen Chromosomkontur unter Verwendung einer 3 × 3 Nachbarschaft; und k) Anwenden einer aktiven Kontur zur Bestimmung des Chromosomenumrisses, wodurch die aktive Kontur iterativ auf ein nächstgelegenes lokales Minimum von Bildgradienten aus einer anfänglichen Menge von Kontrollpunkten zuläuft.
Methode nach Anspruch 10, welche des Weiteren eine iterative GVF aktive Kontur zum Glätten einer Begrenzungskarte des Binärabbildes einschließt.
Methode nach Anspruch 6, worin das Definieren der Kontur das Erhalten eines Dickenprofils und eines Breitenprofils des Chromosoms unter Verwendung einer intensitätsintegrierten Laplace'schen Dickenmessung einschließt, wodurch ein Laplace'scher Operator (Δ) die Ableitung des zweiten Grades des Bildes erzielt, wodurch die Informationen zur Chromosomenkontur hervorgehoben wird.
Methode nach Anspruch 6, worin die Festlegung der Kontur die Verwendung einer Methode zur Bildintensitätsintegration einschließt, wodurch das Bild in eine Vielzahl von Regionen segmentiert wird oder zumindest ein Randfragment durch Verwendung eines Konzepts von Lichtstrom je Flächeneinheit nachgewiesen wird.
Methode nach Anspruch 6, worin das Bestimmen der Mittellinie des Chromosoms ein Verfahren des Beschneiden des Skeletts einschließt, basierend auf einer Berechnung der diskreten Kurvenevolution zum Erstellen eines beschnittenen Skeletts, bestehend aus den folgenden Schritten: a) Modellieren des Skeletts als Vieleck mit einer vorbestimmten Anzahl von Scheitelpunkten, b) Unterteilen zumindest einer diskreten Kurvenevolutions-kontur in vieleckige Sektionen, c) Entfernen einer Vielzahl Skelettpunkte, welche zumindest einen Punkt auf der vieleckigen Sektion generieren, wodurch das resultierende Skelett einen einzelnen Fehlzweig aufweisen wird, d) Liefern eines Kurvenanpassungsverfahrens und e) Sammeln von Probenkontrollpunkten aus dem beschnittenen Skelett.
Methode nach Anspruch 6, worin der Schritt der Lokalisierung einer wahrscheinlichsten Position jedes Zentromers die folgenden Schritte umfasst: a) Verwenden einer am Ende beschnittenen Mittelline als Referenz, wobei die am Ende beschnittene Mittelline zumindest ein maximales Ende des Chromosoms ausschließt, b) Zeichnen zumindest eines Gitterliniensegments senkrecht zum beschnittenen Mittellinensegment in gleichen Längenintervallen, wobei ein vorbestimmter Querschnitt eine Länge des Gitterliniensegments ist, c) Gewichten zumindest einer Probenintensität des Gitterliniensegments mit einer Gauß'schen Funktion, wodurch eine Vielheit von Bildrauschen und ein Vielzahl unerwünschter Wirkungen aufgehoben werden, die durch das Biegen des Chromosoms herbeigeführt wurden, d) Bestimmen der Längen der Gitterliniensegmente aus zumindest einem binären Ergebnis durch ein GVF Binärabbild, worin das GVF Binärabbild eine Gauß'sche kernaktive Kontur darstellt, wodurch die Verwendung des GVF Binärabbildes verbesserte Randeigenschaften des Zentromers liefert und e) Lokalisieren des Zentromers, durch Verwendung von Wp, wobei Wp ein Breitenprofil des Chromosoms darstellt, entlang dem Gitterliniensegment auf einer Mittelachse des GVF Binärabbildes und Ip, wobei Ip ein Intensitätsprofil aus den gewichteten durchschnittlichen Intensitätswerten eines DAPI-gefärbten Chromosomabbilds darstellt, basierend auf einer Gauß'schen Funktion entlang dem durch das GVF Binärabbild begrenzte Gitterliniensegment.
Methode nach Anspruch 6, worin der Schritt des Lokalisierens einer wahrscheinlichsten Position jedes Zentromers, die folgenden Schritte umfasst: a) Kombinieren einer Chromosomenbreite mit einer Mittellinienpixelintensität und b) Verwenden nur einer auf Dicke basierenden Messung, wodurch ein Zentromer genau nachgewiesen wird.
Methode nach Anspruch 6, worin ein ein Fuzzy-Logik-System verwendender Algorithmus eine optimale Position für jedes Zentromer berechnet, wobei der Algorithmus die folgenden Schritte umfasst: a) Erhalten eines Satzes von Liniensegmenten, welche mehrere Winkel abdecken mit einem Winkel-Offset von 2,5° für jedes Mittellinienpixel in der Nähe des nachgewiesenen Zentromerortes; b) Selektieren der zwei kürzesten Liniensegmente aus dem Satz der Liniensegmente, wodurch zwei Anwärtersätze geschaffen werden, worin ein erster Anwärtersatz der zwei Anwärtersätze die Liniensegmente mit dem kürzesten Wert umfasst, und ein zweiter Anwärtersatz der zwei Anwärtersätze die zweitkürzesten Liniensegmente umfasst; c) Bestimmen von ResDA, wobei ResDA einen Winkelunterschied zwischen einer Richtung eines Liniensegments und einer erwarteten Richtung vom Zentromer für die zwei Anwärtersätze darstellt; d) Berechnen eines Offset-Wertes für eine Vielzahl von Anwärterpunkten, worin der Offset-Wert ein Pixelintervall zwischen dem nachgewiesenen Zentromerort und dem Pixelort auf der Mittellinie darstellt; e) Erhalten eines Fuzzy-Ausgabeergebnisses für die zwei Anwärtersätze; f) Selektieren eines Maximalergebnisses aus den zwei Anwärteroffsetsätzen; g) Selektieren des Anwärterortes mit der höchsten Fuzzy-Logik-Ausgabe für jeden Anwärterdatensatze; h) Berechnen eines Unterschiedes zwischen den 2 höchsten Fuzzy-Logik-Ausgabewerten; und i) Selektieren eines neuen Zentromerortes, worin, falls die Differenz größer als 0,1 ist, das Mittellinienpixel mit der höchsten Fuzzy-Logik-Ausgabe als der neue Zentromerort selektiert wird, und falls der Unterschied niedriger als 0,1 ist, das Mittellinienpixel mit dem niedrigsten Offset vom ursprünglichen Ort als der neue Zentromerort selektiert wird.
Methode nach Anspruch 9 worin der ein Fuzzy-Logik-System verwendende Algorithmus eine optimale Position für das Zentromer berechnet, umfassend die folgenden Schritte: (a) Definieren eines Suchraums des Bildes, welches nur einen gewünschten Zentromerort einschließt, (b) Selektieren eines Satzes von Mittellinienpunkten für den Suchraum, basierend auf dem gewünschten Zentromerort, (c) Zeichnen eines Liniensegments etwa alle 2,5 Grad durch jeden der selektierten Mittellinienpunkte, (d) Bestimmen der Endpunkte der Mittellinienpunkte unter Verwendung der Kontur eines Binärobjekts, (e) Bestimmen von ResW für jedes Liniensegment, worin ResW ein Verhältnis der Breite eines Liniensegments zur Durchschnittsbreite eines Breitenprofils darstellt, (f) Identifizieren zweier Liniensegmente mit dem niedrigsten ResW-Wert und (g) Anwenden eines auf einem Fuzzy-Logik-System basierenden Algorithmus zum Berechnen einer optimalen Position für das Zentromer aus den zwei Liniensegmenten mit dem niedrigsten ResW-Wert.
Methode zum Nachweis zumindest eines abnormalen Chromosoms nach Anspruch 6, welche des Weiteren die folgenden Schritte umfasst: a) Erhalten eines Dickenprofils jedes Chromosoms, b) Erhalten eines Breitenprofils jedes Chromosoms, c) Vorsehen einer intensitätsintegrierten Laplace'schen Dickenmessung und d) Vorsehen eines Laplace'schen Operators (Δ) zum Erzielen einer Ableitung eines zweiter Ordnung eines Abbildes einer Chromosomenmetaphase zum Hervorheben einer Chromosomenkontur und e) Nachweisen einer Schwesterchromatidentrennung unter Verwendung Orthogonalfunktionsrepräsentation, welche unterteilte Konturformen an einem Telomer analysiert.
Computerimplementiertes Verfahren zum Nachweis von zumindest einem dizentrischen Chromosom, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Nachweis eines Chromosomes, das nicht mit einem anderen Chromosom überlappt, um ein nicht-überlagerndes Chromosom zu erhalten, b) Segmentieren des sich nicht-überlagernden Chromosoms, c) Bestimmen einer Mittellinie für das Chromosom, d) Minimieren einer Breite und einer Intensität des Chromosoms, e) Nachweis eines Zentromers, f) Nachweis eines zweiten Zentromerortes durch Maskieren der nachbarschaft des Ortes des ersten Zentromers und danach Auffinden der Gesamtminima von Breite und Intensität, g) Nachweisen einer Schwesterchromatidentrennung, wodurch eine Zentromerverfeinerungsmethode angewendet wird, falls die Schwesterchromatidentrennung nachgewiesen wird und h) Nachweisen eines zweiten Zentromers.
Computerimplementiertes Verfahren nach Anspruch 20, worin die Zentromerverfeinerungsmethode angewendet wird, um Bilder der Metaphasenchromosomen zu verarbeiten, die durch das Kultivieren von Zellen entweder mit hohen Konzentrationen oder dadurch, dass sie über längere Zeit hemmenden Mikrotubuli ausgesetzt wurden, vorbereitet worden waren.
Computerimplementiertes Verfahren zu Anspruch 20, worin die Zentromerverfeinerungsmethode angewendet wird, um Bilder der Metaphasenchromosomen zu verarbeiten, die durch das Kultivieren von Zellen entweder mit niedrigen Konzentrationen oder dadurch, dass sie über kürzere Zeit hemmenden Mikrotubuli ausgesetzt wurden, vorbereitet worden waren.
Verfahren zum Nachweis von zumindest einem abnormalen Chromosom nach Anspruch 6 oder Anspruch 19, welches des Weiteren die folgenden Schritte umfasst: Erstellen von Bilddaten von Zentromeren, die durch das Anwenden des Fuzzy-Logic-Systems erkannt werden sollen; Eingeben der Bilddaten in ein Lernvektorquantisierungsnetzwerk zum Erstellen invarianter Vektoren optimierter Momente, welche mit jedem in dem Fuzzy-Logik-System assoziiert sind; Zugreifen auf einen Algorithmus zum Erstellen einer Vielzahl von Mittellinien von Anwärterchromosomen, welche die Parameter für das Fuzzy-Logik-System repräsentieren; Transformieren jede der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen in die Parameter für das Fuzzy-Logik-System; Importieren der Parameter in das Fuzzy-Logik-System für jede der Vielzahl der besagten Mittellinien von Anwärterchromosomen; Simulieren des Fuzzy-Logik-Systems in Bezug auf jede der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen; Eingeben der invarianten Vektoren optimierter Momente in das Fuzzy-Logik-System; bezüglich jeder der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen, festlegen wie viele der Zentromere durch das Fuzzy-Logik-System richtig erkannt werden; Selektieren einer der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen, falls die eine der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen alle Zentromere richtig erkennt; Assoziieren eines Punktes bei jeder der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen, wobei der Punkt anzeigt, wie viele der Zentromere von jeder der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen erkannt werden; Selektieren eines Prozentsatzes der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen, die bessere Ergebnisse haben; Anwenden eines Crossover-Prozesses zwischen dem selektierten Prozentsatz der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen zum Hervorbringen eines oder mehrerer Nachkommen; Austauschen eines oder mehrerer der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen, welche die schlechtesten Ergebnisse haben gegen die ein oder mehr Nachkommen, was zu einer neuen Population der Mittellinien von Anwärterchromosomen führt; Transformieren der besagten neuen Population in Fuzzy Logik Parameter; Importieren der Fuzzy-Logik-Parameter der neuen Population in das Fuzzy-Logik-System; Simulieren des Fuzzy-Logik-Systems bezüglich der neuen Population; Eingeben der invarianten Vektoren optimierter Momente in das Fuzzy-Logik-System; bezüglich jeder der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen in der neuen Population, bestimmen wie viele der Zentromere durch das Fuzzy-Logik-System richtig erkannt werden; und Selektieren eine aus der Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen in der neuen Population, falls die Vielzahl der Mittellinien von Anwärterchromosomen in der neuen Population alle Zentromere richtig erkennt.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Regeln umfassen: Falls ResW sehr niedrig und ResDA niedrig ist, dann ist der Ausgangspegel extrem hoch, Falls ResW sehr niedrig ist und ResDA in der Mitte liegt, dann ist der Ausgangspegel extrem hoch, Falls ResW sehr niedrig und ResDA niedrig ist, dann ist der Ausgangspegel sehr hoch, Falls ResW niedrig ist und ResDA in der Mitte liegt, dann ist der Ausgangspegel mittelhoch, Falls ResW niedrig und ResDA hoch ist, dann ist der Ausgangspegel mittel niedrig, Falls ResW mittel und ResDA niedrig ist und ResInt hoch ist, dann ist der Ausgangspegel mittelhoch, Falls ResW mittel, ResDA in der Mitte liegt und ResInt hoch ist, dann ist der Ausgangspegel mittel niedrig, Falls ResW mittel und ResDA hoch ist, dann ist der Ausgangspegel sehr niedrig, Falls ResW mittel ist, ResDA und ResInt niedrig sind, dann ist der Ausgangspegel mittelniedrig, Falls ResW und ResDA in der Mitte liegen und ResInt niedrig ist, dann ist der Ausgangspegel sehr niedrig, und Falls ResW hoch ist, dann ist der Ausgangspegel extrem niedrig; worin ResW ein Verhältnis der Breite eines Liniensegments zu einer Durchschnittsbreite eines Breitenprofils ist, ResDA eine Winkeldifferenz zwischen einer Richtung eines Liniensegments und einer erwarteten Richtung ist, die durch eine Linie senkrecht zu P1–P3 durch P2 gegeben ist, worin P1, P2 und P3 jegliche 3 aufeinander folgende Punkte auf einer beschnittenen Chromosomemittellinie sind und ResInt eine durchschnittliche Pixelintensität in einer 5-Pixel-Region ist, welche ein Pixel einer Anwärtermittellinie umgibt, worin der durchschnittliche Pixelintensitätswert durch ein Verhältnis durchschnittlicher Pixelintensität von lokaler Umgebung zu maximaler Durchschnittsintensität in einem Suchraum normalisiert wird.
Satz von Anweisungen, gespeichert in zumindest einem dauerhaften, computerlesbaren Medium zum Betrieb in einem Computersystem, bestehend aus: a. Anweisungen zum Empfangen einer oder mehrerer elektronischer Dateien oder Bilder in einem oder mehr Speichern; b. Anweisungen zum Identifizieren von Bildinhalten, ähnlich einem Metaphasenkern, der diskrete, beieinander liegende Chromosomen enthält; c. Anweisungen zum Identifizieren von Metaphasenchromosomen und Teilen davon in dem Bildinhalt; d. Anweisungen zum Bestimmen lokaler Klassifikationsparameter von Metaphasenchromosomen sowie Chromosomen, die mit benachbarten Chromosomen verbunden sind; e. Anweisungen zum Extrahieren von Chromosommerkmalen aus dem Bildinhalt; f. Anweisungen zum Anwenden eines auf extrahierten Chromosomenmerkmalen basierenden Klassifikationssystems auf den Bildinhalt, um eine Vielzahl verschiedener Kategorien von Bildern zu trennen, wobei die Kategorien aus der ”in Ordnung”-Klassifikation, der ”überlagert”-Klassifikation und der ”übermäßig ausgebreitet”-Klassifikation bestehen, wobei eine ”in Ordnung”-Klassifikation ein Bild darstellt, das mindestens ein Chromosom aufweist, welches in dem Bild gänzlich enthalten ist und im Wesentlichen keine Überlagerung mit einem anderen Chromosom zeigt, eine ”überlagert”-Klassifikation ein Bild darstellt, das mindestens zwei Chromosomen aufweist, die übereinander gelagert sind und eine ”übermäßig ausgebreitet”-Klassifikation ein Bild darstellt, das mindestens ein Chromosom aufweist, das nur teilweise im Bildsektor enthalten ist; g. Anweisungen zum Anwenden eines Rangsystems für die Bilder, basierend auf einer Vielzahl von Gesamtparametern; h. Anweisungen zum Selektieren einer Teilmenge von Bildern, basierend auf dem Rang; i. Anweisungen zum Bestimmen der Chromosomenkonturen; j. Anweisungen zum Bestimmen des Ortes der Mittellinie des Chromosoms; k. Anweisungen zum Lokalisieren der wahrscheinlichsten Position zumindest eines Zentromers in dem Chromosom, wodurch eine Vielzahl von Chromosomen in der selben Zelle basierend auf der Position klassifiziert werden; l. Anweisungen zum Messen des Konfidenzwertes eines Zentromers zum Messen des wahrscheinlichen Ortes im automatisierten Prozess für den Nachweis eines Zentromers; m. Anweisungen zum Maskieren des wahrscheinlichsten Ortes für das erste Zentromer und zum erneuten Berechnen des Konfidenzwertes des Zentromers zwecks Bestimmung nachfolgender Zentromere, falls welche im selben Chromosom vorhanden sind n. Anweisungen zum Zählen der Anzahl von Zentromeren im Chromosom; o. Anweisungen zum Berechnen einer Häufigkeit dizentrischer Chromosome in zumindest einer Zelle; und p. Anweisungen zum Bestimmen einer Bestrahlungsdosis durch Vergleichen der berechneten Häufigkeit jedes dizentrischen Chromosoms mit einer zuvor festgelegten Dosis-Wirkungskurve aus einer kalibrierten Quelle.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, worin die Anweisungen a.–p. daran angepasst sind, ohne manuelle Intervention ausgeführt zu werden.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern von Informationen enthält, die auf den Inhalt schließen lassen, welcher einem Metaphasenchromosom ähnelt.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern von Informationen zum Nachweisen lokaler Klassifikationsparameter von Metaphasenchromosomen und Chromosomen, die mit benachbarten Chromosomen verbunden sind, enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern globaler Rangparameter von Metaphasenchromosomen und von Chromosomen, die mit Chromosomen in ihrer Nachbarschaft verbunden sind, enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern der rangmäßig eingestuften Bilder enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern von Konturen von Chromosomen enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern des Ortes der Mittellinie von Metaphasenchromosomen enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern der Anzahl der Zentromere in einem Metaphasenchromosom enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern des Ortes eines Zentromers in einem Metaphasenchromosom enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, welcher des Weiteren mindestens eine Anweisung zum Speichern der Bestimmung eines abnormalen Chromosoms enthält.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, wobei die Anweisungen an das Bestimmen der Häufigkeit dizentrischer Chromosomen in einer Menge Bilder von Metaphasenkernen angepasst sind.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, wobei die Anweisungen an das Bestimmen des Konfidenzwertes des Zentromers zum Bestimmen der wahrscheinlichsten Orte eines oder mehrerer Zentromere in einem Chromosom angepasst sind.
Anweisungssatz, der auf mindestens einem dauerhaften, computerlesbaren Medium nach Anspruch 25 gespeichert ist, wobei die Anweisungen an das Bestimmen des Konfidenzwertes des Zentromers zum Bestimmen einer Strahlungsdosis durch Vergleichen der berechneten Häufigkeit jedes dizentrischen Chromosoms mit einer im Voraus festgelegten Dosis-Wirkungskurve aus einer kalibrierten Quelle angepasst sind.