DE1091706B

DE1091706B - Methods for cleaning up and concentrating viruses

Info

Publication number: DE1091706B
Application number: DEY328A
Authority: DE
Inventors: Julius Stuart Youngner; Hans Noll
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1956-03-12
Filing date: 1959-03-11
Publication date: 1960-10-27

Description

Verfahren zur Reinigung und Konzentration von Viren Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Konzentration von Viren und ähnlichen infektiösen Stoffen durch Behandlung mit Lipoiden oder lipoidähnlichen Stoffen.Methods for Purifying and Concentrating Viruses The invention relates to a method for purifying and concentrating viruses and similar infectious Substances through treatment with lipoids or lipoid-like substances.

Seit langem fehlt ein brauchbares Verfahren zur Reinigung und Konzentration von Viren, z. B. Viren der Grippe-, Kuhpocken- und der Newcastlekrankheit sowie ähnlicher infektiöser Krankheiten.A useful method of cleaning and concentration has long been lacking of viruses, e.g. B. Flu, cowpox and Newcastle disease viruses as well similar infectious diseases.

Die Reinigung und Konzentration von Viren wird nachfolgend an Hand des bei der Reinigung und Konzentration der Grippeviren angewandten Verfahrens dargestellt. Die Reinigung und Konzentration der Grippeviren ist besonders schwierig und große Mengen von nach gewöhnlichen Verfahren hergestellten Vaccinen und Impfstoffen zeigen eine derart geringe Wirksamkeit, daß sie praktisch als unwirksam anzusehen waren. Hierdurch entstehen beträchtliche Verluste an Zeit, Arbeit und Geld, und es erhöhen sich die Herstellungskosten der Vaccine.The purification and concentration of viruses is shown below on hand of the process used to cleanse and concentrate the flu viruses. The cleaning and concentration of the flu virus is particularly difficult and large Show amounts of vaccines and vaccines produced by common methods so poor in effectiveness that they were practically ineffective. This creates significant losses in time, labor, and money, and increases it the manufacturing costs of the vaccine.

Für die Herstellung von Grippevaccinen werden Hühnereier mit Virusmengen in Höhe von jeweils etwa 20 000 Einheiten geimpft. Die Viren entwickeln sich in der allantoischen Flüssigkeit der infizierten Eier. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Eier geöffnet und die Eiflüssigkeit in einer schnell laufenden Zentrifuge zentrifugiert. Die Viren werden zusammen mit größeren Mengen Protein und ähnlichen Stoffen aus der Flüssigkeit abgezogen. Die Viren werden erneut suspendiert und der Virusgehalt der Suspension festgestellt. Auf Grund dieses Verfahrens werden nur etwa 50 °/ o der ursprünglich vorhandenen Viren gewonnen; das Verfahren bringt also große Verluste mit sich. Außerdem enthalten die auf die übliche Weise hergestellten Grippeimpfstoffe Protein in solchen Mengen, daß hierdurch bei bestimmten Menschen schwere toxische oder allergische Wirkungen hervorgerufen werden. In solchen Fällen lassen die unerwünschten Nebenwirkungen des Grippeimpfstoffes die Vorteile des durch den Impfstoff erzielten Schutzes in den Hintergrund treten.For the production of flu vaccines, chicken eggs with amounts of virus are used vaccinated in the amount of about 20,000 units each. The viruses develop in the allantoic fluid of the infected eggs. After the incubation period has expired the eggs are opened and the egg fluid in a high-speed centrifuge centrifuged. The viruses get along with larger amounts of protein and the like Substances removed from the liquid. The viruses are resuspended and the Virus content of the suspension was determined. Due to this procedure only recovered about 50 per cent of the viruses originally present; so the procedure brings great losses with it. Also contain those made in the usual way Influenza vaccines protein in such amounts that it will affect certain people cause severe toxic or allergic effects. In such cases The unwanted side effects of the flu vaccine let the benefits of the flu through the protection achieved by the vaccine takes a back seat.

Zur Herstellung von Vaccinen und Impfstoffen und für andere bakteriologische und biologische Verwendungszwecke wurde ein Verfahren zur Reinigung und Konzentration von Viren und von ähnlichen nicht über den Magen-Darm-Kanal wirkenden infektiösen Stoffen entwickelt, bei dem die bisher bei der technischen Herstellung dieser Stoffe auftretenden Schwierigkeiten fortfallen. Die Konzentration dieser Viren und ähnlicher Stoffe wird vorzugsweise so durchgeführt, daß das zu reinigende Virus zusammen mit den es verunreinigenden biologischen Stoffen mit einem Lipoid oder lipoidähnlichen Stoff in Berührung gebracht wird. Dann wird das Lipoid von den übrigen biologischen Stoffen getrennt, wobei das Virus im Lipoid zurückgehalten wird.For the production of vaccines and vaccines and for other bacteriological and biological uses became a method of purification and concentration viruses and similar infectious ones that do not act via the gastrointestinal tract Substances developed, in which the so far in the technical production of these substances any difficulties that arise. The concentration of these viruses and the like Substances is preferably carried out so that the virus to be cleaned together with the biological substances contaminating it with a lipoid or a lipoid-like one Substance is brought into contact. Then the lipoid is separated from the remaining biological Substances separated, whereby the virus is retained in the lipoid.

In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die aus den Eiern entfernte, das Grippevirus enthaltende allantoische Flüssigkeit so lange durch eine Cholesterin enthaltende Säule geleitet, bis das Cholesterin mit dem Virus gesättigt ist. Darauf wird das Cholesterin aus der Säule entfernt und zur Herstellung der Vaccine verwendet.In one embodiment of the method according to the invention, the removed allantoic fluid containing the flu virus from the eggs for so long passed through a column containing cholesterol until the cholesterol with the virus is saturated. The cholesterol is then removed from the column and used for production the vaccine used.

Beispiel 1 Die das Grippevirus enthaltende allantoische Flüssigkeit wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 0,5 ccm je Minute durch eine Säule geleitet. Bei Verwendung von 2 g Cholesterin je Säule (18 - 17 mm) wurde gefunden, daß zur Sättigung des Cholesterins 22 000 Einheiten des Hämagglutination bewirkenden Grippevirus erforderlich waren. Das entsprach einer Menge von 96 °/o des Virus, der in 18 ccm durch die Säule geleiteter allantoischer Flüssigkeit (Titer: 1280 Einheiten des Hämagglutination bewirkenden Virus je Kubikzentimeter) enthalten war. Das im abfließenden Material enthaltene Virus wurde dadurch gewonnen, daß es durch eine zweite Cholesterin enthaltende Säule geleitet wurde. Ebenso konnten unter Verwendung von allantoischer Flüssigkeit mit geringem Virusgehalt gleich hohe Viruskonzentrationen je Gramm Cholesterin dadurch erhalten werden, daß entsprechend größere Mengen durch die Säule geleitet wurden. Auf Grund von Untersuchungen der ursprünglichen und der abfließenden Flüssigkeit wurde gefunden, daß weniger als 100/, Protein in der Säule zurückgeblieben waren. Diese Werte zeigen, daß die spezifische Wirksamkeit des Virus je Milligramm Protein um mehr als das Zehnfache angewachsen war. Beispiel 2 Im Handel bezogene polyvalente Grippevaccine, in der der Virusgehalt durch das Sharples-Zentrifugierverfahren auf 20fache Stärke konzentriert und mit Formalin unwirksam gemacht worden war, wurde durch eine Säule der gleichen Art wie der im Beispiel 1 geleitet. Das aus der Säule auslaufende Cholesterin zeigte eine Adsorption von 94 °; o des Virus und nur 6 °/0 des ursprünglich in der Vaccine enthaltenden Proteins. Dies stellt eine Erhöhung der Viruseinheiten, d. h. der spezifischen Wirksamkeit des Blutagglutination bewirkenden Virus je Milligramm Protein dar von 2130 in der ursprünglichen Vaccine auf mehr als 29 900 Einheiten in der Cholesterin-Säule.Example 1 The allantoic fluid containing the flu virus was passed through a column at a rate of 0.1 to 0.5 cc per minute. Using 2 g of cholesterol per column (18-17 mm), it was found that 22,000 units of the hemagglutinating influenza virus were required to saturate the cholesterol. This corresponded to an amount of 96% of the virus contained in 18 ccm of allantoic fluid passed through the column (titer: 1280 units of the virus causing the hemagglutination per cubic centimeter). The virus contained in the effluent was recovered by passing it through a second column containing cholesterol. Equally high virus concentrations per gram of cholesterol could also be obtained using allantoic fluid with a low virus content by passing correspondingly larger amounts through the column. Based on studies of the original liquid and the effluent, it was found that less than 100 % protein remained in the column. These values show that the specific effectiveness of the virus per milligram of protein had increased by more than ten-fold. Example 2 Commercially available polyvalent flu vaccines in which the virus content had been concentrated to 20-fold strength by the Sharples centrifugation method and made ineffective with formalin were passed through a column of the same type as that in Example 1. The cholesterol leaking from the column showed an adsorption of 94 °; o of the virus and only 6% of the protein originally contained in the vaccine. This represents an increase in the virus units, ie the specific effectiveness of the virus causing blood agglutination per milligram of protein, from 2130 in the original vaccine to more than 29,900 units in the cholesterol column.

Es wurde gefunden, daß Grippeviren, die in Cholesterin adsorbiert worden waren, ihre Fähigkeit, Blutagglutination und Antikörperbildung zu bewirken und Ansteckungen hervorzurufen, beibehielten. So wurde nach Entfernung de. Cholesterins durch Atherextraktion in Gegenwart einer wäßrigen Phase ein wäßriges Viruskonzentrat, das 40 °; o der ursprüglichen Hämagglutininwirksamkeit enthielt, erhalten. Die mit adsorbierten Virusstoff enthaltender Cholesterinsuspension aus den Säulen durchgeführten Untersuchungen ergaben, daß die Ansteckungsfähigkeit der Zahl der in der Säule adsorbierten Einheiten des infektiösen Stoffes entsprachen.It has been found that influenza viruses are adsorbed in cholesterol their ability to cause blood agglutination and antibody formation and cause contagion. So after removal de. Cholesterol an aqueous virus concentrate by extraction of ether in the presence of an aqueous phase, the 40 °; o the original hemagglutinin efficacy was obtained. With adsorbed virus substance-containing cholesterol suspension carried out from the columns Investigations have shown that the infectivity is the number of adsorbed in the column Units of the infectious substance corresponded.

Die Immunisierung von Versuchstieren mit Cholesterinsuspensionen, in denen Grippeviren adsorbiert worden waren, zeigte, daß die Cholesterinvaccinen einen etwa -!mal höheren Gehalt an Antikörpern hatten als eine gleiche Zahl Virusteilchen enthaltende wäßrige Virussuspensionen. Ferner hielt der erhöhte Antikörpertiter bei Tieren, die mit Cholesterinvaccine geimpft worden waren, während längerer Zeit an, welche Wirkung bei hacdelsmäßiger polyvalenter Grippevaccine, die vor der Adsorption in Cholesterin gewöhnlich geringe Antikörperwirksamkeit zeigte, besonders auffällig zutage trat. Diese Wirkung wird veranschaulicht in Fig.1 bis 4 derZeichnung.The immunization of test animals with cholesterol suspensions, in which influenza viruses had been adsorbed showed that the cholesterol vaccines had about -! times higher levels of antibodies than an equal number of virus particles containing aqueous virus suspensions. Furthermore, the increased antibody titer persisted in animals vaccinated with cholesterol vaccines for a long time to what effect in the case of hacdelsymmetrical polyvalent flu vaccines, which were before adsorption usually showed poor antibody activity in cholesterol, especially noticeable came to light. This effect is illustrated in Figures 1 through 4 of the drawing.

Fig. 1 zeigt die Antikörper-Reaktion von Küken, die mit zwei Dosen des wäßrigen formalinbehandelten, polyvalenten Grippevirus B', dargestellt durch die gestrichelte Linie, und einer gleichen Menge des gleichen in Cholesterin adsorbierten Virus, dargestellt durch die durchgezogene Linie (eine Verdünnung des wäßrigen Impfstoffes im Verhältnis von 1 : 10 wurde als Antikörper verwendet), infiziert worden waren.Fig. 1 shows the antibody response of chicks with two doses of the aqueous formalin-treated polyvalent influenza virus B 'represented by the dashed line, and an equal amount of the same adsorbed in cholesterol Virus represented by the solid line (a dilution of the aqueous vaccine in a ratio of 1:10 was used as antibody), had been infected.

Fig. 2 zeigt die Antikörper-Reaktion von Küken, die mit zwei Dosen eines wäßrigen formalinbehandelten, polvvalenten Influenzavirus A' (in gestrichelter Linie) und einer gleichen Menge des an Cholesterin adsorbierten Virus behandelt worden waren (in durchgezogener Linie) (1 : 10 Verdünnung der als Antigen verwendeten Vaccine).Figure 2 shows the antibody response of chicks to two doses of an aqueous formalin-treated, polyvalent influenza virus A '(in dashed line Line) and an equal amount of the virus adsorbed on cholesterol (in solid line) (1:10 dilution of the antigen used Vaccine).

Fig. 3 zeigt die Antikörper-Reaktion bei Küken, die mit zwei Dosen des wäßrigen formalinbehandelten Virus der Asiatischen Grippe, dargestellt durch die gestrichelte Linie, und einer gleichen Menge des gleichen in Cholesterin adsorbierten Virus, dargestellt durch die durchgezogene Linie (eine Verdünnung des wäßrigen Impfstoffes im Verhältnis von 1 : 10 wurde als Antikörper verwendet), infiziert worden waren.Figure 3 shows the antibody response in chicks that received two doses of the aqueous formalin-treated Asian flu virus, represented by the dashed line, and an equal amount of the same adsorbed in cholesterol Virus represented by the solid line (a dilution of the aqueous vaccine in a ratio of 1:10 was used as antibody), had been infected.

Fig. 4 zeigt die Antikörper-Reaktion bei Küken, die mit zwei Dosen des wäßrigen formalinbehandelten, polyvalenten Grippevirus A, dargestellt durch die gestrichelte Linie, und einer gleichen Menge des gleichen in Cholesterin adsorbierten Virus, dargestellt durch die durchgezogenen Linien (eine Verdünnung des wäßrigen Impfstoffes im Verhältnis von 1 :10 wurde als Antikörper verwendet), infiziert worden waren.Figure 4 shows the antibody response in chicks given two doses of the aqueous formalin-treated polyvalent influenza virus A represented by the dashed line, and an equal amount of the same adsorbed in cholesterol Virus, represented by the solid lines (a dilution of the aqueous Vaccine in the ratio of 1:10 was used as antibody) was.

Ein Vergleich der in diesen Zeichnungen durch die gestrichelten und die durchgezogenen Linien dargestellten Kurven zeigt, daß mit dem in Cholesterin adsorbierten Virus eine weit wirksamere Antikörper-Reaktion erzielbar ist als mit dem bisher technisch hergestellten Virus. Die Adsorption der Virus-Antikörper in Cholesterin erhöht die Antikörper-Reaktion beträchtlich.A comparison of those in these drawings by the dashed and the curves shown in solid lines shows that with that in cholesterol adsorbed virus a far more effective antibody reaction can be achieved than with the virus that has been engineered to date. The adsorption of the virus antibodies in Cholesterol increases the antibody response considerably.

Das auf einer Adsorption des Virus in Cholesterin beruhende Verfahren ist besonders brauchbar für die Herstellung hochwirksamer Impfstoffe aus biologischen Flüssigkeiten mit niedrigem Virusgehalt, da dieses Verfahren eine wirksame Konzentration mit der zusätzlichen Wirkung des Cholesterins, die in Fig. 5 der Zeichnung veranschaulicht ist, vereinigt.The process based on adsorption of the virus in cholesterol is particularly useful for making highly effective vaccines from biologicals Low virus fluids as this procedure is an effective concentration with the added effect of cholesterol illustrated in Figure 5 of the drawing is united.

Fig. 5 zeigt die Antikörper-Reaktion bei Küken, die mit zwei Dosen der ursprünglichen allantoischen Flüssigkeit (gestrichelte Linie) und einer zehnfachen Viruskonzentration in Cholesterinsuspension (durchgezogene Linie) infiziert worden waren.Figure 5 shows the antibody response in chicks given two doses the original allantoic fluid (dashed line) and a tenfold Virus concentration in cholesterol suspension (solid line) infected was.

In dem in Fig. 5 dargestellten Fall wurde das Virus des Michigan-Stammes der Asiatischen Grippe verwendet. Ein Vergleich der Kurven der Fig. 5 zeigt die besondere Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Herstellung hochwirksamer Impfstoffe aus biologischen Flüssigkeiten mit niedrigem Virusgehalt. Beispiel 3 Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung wurde mit kristallinem Hexadecvlamin zu einer homogenen Paste vermahlen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Konzentration von 1 g je 10 ccm Kochsalzlösung suspendiert. Eine Reihe von Röhrchen, die jeweils 5 ccm infizierte allantoische Flüssigkeit (1280 Einheiten des Hämagglutination bewirkenden Virus je Kubikzentimeter enthielten), wurden zu. 5 ccm phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die geringer werdende Mengen Hexadecylamin enthielten, gegeben. Die Röhrchen wurden geschüttelt und zentrifugiert, wodurch der Stoff in eine klare, wäßrige untere Phase und eine darüber schwimmende Lipoide Schicht getrennt wurde. Die untere wäßrige Schicht wurde darauf auf ihren Gehalt an restlichem Virus untersucht. Gesamtgehalt Im Lipoid Hexadecylamin der wäBrigen Phase adsorbierte Einheiten an Blutagglutination des Blutagglutination bewirkendem Virus bewirkenden Virus mg/Röhrchen Anzahl der Einheiten °/o 250 0 100 100 0 100 50 300 91 25 600 82 10 1200 62 - 3200 - (Kontroll- versuch) Aus dieser Tabelle geht hervor, daß Hexadecylamin bei einer Endkonzentration von nur 0,10/0 62 °/o der vorhandenen Einheiten des Hämagglutination bewirkenden Virus adsorbierte, d. h., in 200 Einheiten des Hämagglutination bewirkenden Virus wurden in 1,0 mg Hexadecylamin-Adsorptionsmittel adsorbiert.In the case shown in Fig. 5, the Michigan strain of Asian flu virus was used. A comparison of the curves of FIG. 5 shows the particular effectiveness of the method according to the invention in the production of highly effective vaccines from biological fluids with a low virus content. Example 3 Phosphate-buffered physiological saline solution was ground to a homogeneous paste with crystalline hexadecylamine and suspended in phosphate-buffered saline solution in a concentration of 1 g per 10 cc saline solution. A series of tubes each containing 5 cc of infected allantoic fluid (1280 units of the hemagglutinating virus per cubic centimeter) closed. 5 cc of phosphate buffered saline (PBS) containing decreasing amounts of hexadecylamine was given. The tubes were shaken and centrifuged, separating the material into a clear, aqueous lower phase and a floating lipoid layer. The lower aqueous layer was then examined for residual virus content. Total content in the lipoid Hexadecylamine units adsorbed in the aqueous phase of blood agglutination of blood agglutination causing virus causing virus mg / tube Number of units ° / o 250 0 100 100 0 100 50 300 91 25 600 82 10 1200 62 - 3200 - (Control attempt) This table shows that hexadecylamine adsorbed at a final concentration of only 0.10 / 0.62% of the units of the hemagglutinating virus present, ie, in 200 units of the hemagglutinating virus, 1.0 mg of hexadecylamine adsorbent was adsorbed .

Beispiel 4 Ein weiteres Virus, das in starkem Maß von Cholesterin adsorbiert wird, ist der Herpes-B-Virus. Viele Affenarten sind in latenter Form Träger dieses Virus, das gelegentlich auch auf den Menschen übertragen wird, wobei die Infektion durch diesen Virus für den Menschen in allen Fällen tödlich verläuft. 10 ccm einer aus Kaninchennierengewebe bestehenden flüssigen Kultur, die 6,4 # 10' infektiöse Dosen des Herpes-B-Virus enthielt, wurden durch eine 2 g Cholesterin enthaltende Säule geleitet. Die Untersuchung de-, abfließenden Stoffes und der Waschflüssigkeit zeigte, daß nur 2,4 # 10-5 infektiöse Dosen vom Cholesterin nicht aufgenommen wurden, was einer Virusadsorption in Cholesterin von 99,7 °/o entspricht.Example 4 Another virus that is highly adsorbed by cholesterol is herpes B virus. Many species of monkeys are latent carriers of this virus, which is occasionally transmitted to humans, the infection by this virus being fatal for humans in all cases. Ten cc of a liquid culture of rabbit kidney tissue containing 6.4 # 10 'infectious doses of herpes B virus was passed through a column containing 2 g of cholesterol. The investigation of the runoff and the washing liquid showed that only 2.4 # 10-5 infectious doses of cholesterol were not absorbed, which corresponds to a virus adsorption in cholesterol of 99.7%.

Die Bestimmung der Ansteckungsfähigkeit wurde durchgeführt unter Verwendung von aus Kaninchennierengewebe bestehenden Kulturen. Beispiel 5 100 ccm allantoische Flüssigkeit mit einem Gesamtgehalt von 128000 Einheiten des Hämagglutination bewirkenden PR 8-Grippevirus wurden durch 2 g Palmitinsäure geleitet. Im abfließenden Stoff und der Waschflüssigkeit wurden insgesamt 18 000 Einheiten des Hämagglutination bewirkenden Virus gewonnen, was einer Adsorption von 85 °/o des durch die Säule geleiteten Virus entspricht. Entsprechende Untersuchungen zeigten, daß die Viruskonzentration der zuletzt aus der Säule abfließenden Flüssigkeit nur 25 Oi o der Anfangskonzentration betrug, was zeigt, daß die Säule noch nicht gesättigt war.The determination of infectivity was carried out using cultures consisting of rabbit kidney tissue. Example 5 100 cc of allantoic fluid with a total content of 128,000 units of the hemagglutinating PR 8 influenza virus was passed through 2 g of palmitic acid. A total of 18,000 units of the virus causing haemagglutination were obtained in the runoff and the washing liquid, which corresponds to an adsorption of 85% of the virus passed through the column. Corresponding investigations showed that the virus concentration of the liquid last flowing out of the column was only 25% of the initial concentration, which shows that the column was not yet saturated.

Die 2 g Palmitinsäure, die 110000 Einheiten des adsorbierten, Hämagglutination bewirkenden Grippevirus enthielten, wurden in 20 ccm phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert. Im Abstand von 2 Wochen wurden Küken mit jeweils zwei Dosen, die je 0,5 ccm Suspension enthielten, immunisiert. Der Antikörpergehalt wurde 12 Tage nach der zweiten Injektion festgestellt. Gruppen von jeweils vier Küken erhielten Gesamtmengen von jeweils 100, 25, 6,25 und 1,6 mg Palmitinsäure bzw. von 5500, 1375, 363 und 90 Einheiten des Hämagglutination bewirkenden Virus j e Tier. Alle Kükengruppen zeigten mittlere Antikörpertiter, die höher als 1 :300 lagen, wenn sie nach dem Hämagglutination Hemmungstest getestet wurden. Dies zeigt, daß schon 90 Einheiten eines Hämagglutination bewirkenden Virus, das in Palmitinsäure adsorbiert worden war, genügten, um eine bedeutende Antikörper-Reaktion hervorzurufen. Hieraus geht hervor, daß selbst geringere Mengen des in Palmitinsäure adsoraierten Virus eine wirksame Immunisierung erreichen lassen.The 2 g of palmitic acid containing 110,000 units of the adsorbed hemagglutinating influenza virus were suspended in 20 cc of phosphate-buffered saline. At an interval of 2 weeks, chicks were immunized with two doses each containing 0.5 cc of suspension. The antibody level was determined 12 days after the second injection. Groups of four chicks each received total amounts of 100, 25, 6.25 and 1.6 mg of palmitic acid or of 5500, 1375, 363 and 90 units of the hemagglutination-causing virus per animal. All groups of chicks showed mean antibody titers higher than 1: 300 when tested according to the hemagglutination inhibition test. This shows that as little as 90 units of hemagglutinating virus adsorbed in palmitic acid was enough to produce a significant antibody response. From this it can be seen that even small amounts of the virus adsorbed in palmitic acid can achieve effective immunization.

Dieser Versuch zeigt ferner, daß Palmitinsäure ein besonders geeignetes Adsorptionsmittel zur Herstellung von gereinigten Virusvaccinen darstellt, weil diese Säure starke Adsorptionsfähigkeit mit einer besonderen zusätzlichen Wirksamkeit vereinigt, so daß eine wirksame Immunisierung durch Einspritzen geringster Mengen an Lipoiden erreichbar ist.This experiment also shows that palmitic acid is a particularly suitable one Adsorbent for the production of purified virus vaccines is because this acid has a strong adsorptive capacity with a special additional effectiveness combined, so that an effective immunization by injection of the smallest amounts is accessible on lipoids.

Subkutane und intramuskuläre Injektionen von bis zu 20 mg Cholesterin oder Palmitinsäure in Meerschweinchen erzeugten während eines Zeitraums von 4 Wochen keine mit bloßem Auge sichtbaren, pathologischen Schäden oder irgendwelche nachteiligen Wirkungen.Subcutaneous and intramuscular injections of up to 20 mg of cholesterol or palmitic acid in guinea pigs produced over a 4 week period no pathological damage visible to the naked eye or any adverse effects Effects.

Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Viren von Kuhpocken, K ewcastlekrankheit, Bakteriophage (T1 und T,), Grippe (der Stämme A, A' und B' und der Asiatischen Grippe) durch eine Cholesterinsäule geleitet wurden. In jedem Fall zeigte das konzentrierte Virus eine bessere Fähigkeit zur Erzeugung einer größeren Menge an Antikörper-Stoffen als wäßrige Virussuspensionen und behielt auch seine Wirksamkeit hinsichtlich Hämagglutination, Ansteckungsfähigkeit und Bildung von Antigenstoffen.Similar results were obtained when the viruses from cowpox, K ewcastle disease, bacteriophage (T1 and T,), influenza (of strains A, A 'and B' and Asian flu) were passed through a column of cholesterol. In each Case, the concentrated virus showed a better ability to generate a larger one Amount of antibody substances than aqueous virus suspensions and also retained its Efficacy in terms of hemagglutination, infectivity and formation of Antigenic substances.

Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt bei Durchführung des Adsorptionsverfahrens in einzelnen Ansätzen, wobei das Lipoid in virushaltiger Lösung, z. B. der aus Eiern erhaltenen allantoischen Flüssigkeit, suspendiert und dann nach bekannten Verfahren, wie z. B. Filtration, von der Lösung getrennt wurde.Similar results were obtained when the adsorption process was carried out in individual approaches, the lipoid in virus-containing solution, e.g. B. the one made from eggs obtained allantoic liquid, suspended and then by known methods, such as B. Filtration, was separated from the solution.

Die obigen Beispiele,.-, urden unter Verwendung anderer Lipoide oder lipoidähnlicher Stoffe wiederholt, wobei gleich gute Ergebnisse erzielt wurden.The above examples , .-, were repeated using other lipoids or lipoid-like substances, with equally good results being obtained.

Die folgende Tabelle zeigt die unter Verwendung anderer Lipoide erzielte prozentuale Höhe der Viruskonzentration. Lipoid Virus Erzielte Verfahren Herkunft Konzentration 0/" Cholesterin Grippe Formosa I 80 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Cholesterin Grippe Formosa 80 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Cholesterin Grippe Formosa 80 bis 100 Säule Affennierengewebe Cholesterin Grippe Formosa 80 bis 100 Ansatz Affennierengewebe Cholesterin Grippe 301 80 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Cholesterin Grippe 301 80 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Cholesterin Grippe 301 80 bis 100 Ansatz Affennierengewebe Cholesterin Grippe 301 80 bis 100 Säule Affennierengewebe Cholesterin Grippe GL 1739 50 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Cholesterin Grippe GL 1739 50 Säule Allantoische Flüssigkeit Cholesterin Grippe GL 1739 50 Ansatz Affennierengewebe Cholesterin Grippe GL 1739 50 Säule Affennierengewebe Ergosterin Grippe PR 8 90 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Ergosterin Grippe PR 8 90 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Beta-Sitosterin Grippe PR 8 80 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Beta-Sitosterin Grippe PR 8 80 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Hexadekanol Grippe PR 8 80 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Hexadekanol Grippe PR 8 80 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Oktadekanol Grippe PR 8 80 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Oktadekanol Grippe PR 8 80 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Palmitinsäure Grippe PR 8 90 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Palmitinsäure Grippe PR 8 90 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Palmitinsäure Grippe Formosa 90 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Palmitinsäure Grippe Formosa 90 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Stearinsäure Grippe PR 8 90 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit (Fortsetzung) Lipoid Virus Erzielte Verfahren Herkunft Konzentration o; , Q Stearinsäure Grippe PR 8 90 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Hexadecylamin Grippe PR 8 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Hexadecylamin Grippe PR 8 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Hexadecylamin Grippe GL 1739 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Hexadecylamin Grippe GL 1739 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Stearinsäureamid Grippe PR 8 90 bis 100 Ansatz Allantoische Flüssigkeit Stearinsäureamid Grippe PR 8 90 bis 100 Säule Allantoische Flüssigkeit Die obige Tabelle zeigt, daß eine große Zahl verschiedener Lipoide oder lipoidähnlicher Stoffe zur Adsorption, Konzentration und Reinigung von nicht über den Magen-Darm-Kanal infizierenden Viren verwendet werden kann, so z. B. außer Palmitin und Stearinsäure Octadecanol, Hexadecanol, Hexadecylamin, Stearinsäureamid, Cholesterin, Ergosterin, Betasitosterin. Ein gemeinsames Merkmal dieser Lipoide ist das Vorhandensein einer polaren, hvdrophilen Gruppe, z. B. einer OH-, N H2-1 C O O H- oder C O N H2 Gruppe, die die Dispersion der Lipoide in Wasser ermöglicht.The following table shows the percent virus concentration achieved using other lipids. Lipoid Virus Achieved Process Origin Concentration 0 / " Cholesterol Influenza Formosa I 80 to 100 column allantoic fluid Cholesterol Flu Formosa 80 to 100 Approach Allantoic Fluid Cholesterol Influenza Formosa 80 to 100 column monkey kidney tissue Cholesterol Influenza Formosa 80 to 100 Approach monkey kidney tissue Cholesterol Flu 301 80 to 100 Approach Allantoic Fluid Cholesterol Influenza 301 80 to 100 column allantoic fluid Cholesterol Influenza 301 80 to 100 Approach monkey kidney tissue Cholesterol Influenza 301 80 to 100 column monkey kidney tissue Cholesterol Flu GL 1739 50 Approach Allantoic Fluid Cholesterol Flu GL 1739 50 Column Allantoic Fluid Cholesterol Flu GL 1739 50 Approach monkey kidney tissue Cholesterol Influenza GL 1739 50 column monkey kidney tissue Ergosterol Flu PR 8 90 to 100 approach Allantoic fluid Ergosterin Flu PR 8 90 to 100 column allantoic fluid Beta-Sitosterol Flu PR 8 80 to 100 Approach Allantoic Fluid Beta-sitosterol flu PR 8 80 to 100 column allantoic fluid Hexadecanol Flu PR 8 80 to 100 Approach Allantoic fluid Hexadecanol Flu PR 8 80 to 100 column allantoic fluid Oktadecanol Flu PR 8 80 to 100 approach Allantoic fluid Octadecanol Flu PR 8 80 to 100 column allantoic fluid Palmitic Acid Flu PR 8 90 to 100 Approach Allantoic Fluid Palmitic Acid Flu PR 8 90 to 100 column allantoic fluid Palmitic Acid Flu Formosa 90 to 100 Approach Allantoic Fluid Palmitic Acid Flu Formosa 90 to 100 column allantoic fluid Stearic Acid Flu PR 8 90 to 100 Approach Allantoic Fluid (Continuation) Lipoid Virus Achieved Process Origin Concentration o; , Q Stearic acid flu PR 8 90 to 100 column allantoic fluid Hexadecylamine Flu PR 8 100 Approach Allantoic Fluid Hexadecylamine Flu PR 8 100 column allantoic fluid Hexadecylamine Flu GL 1739 100 Approach Allantoic fluid Hexadecylamine Flu GL 1739 100 column allantoic fluid Stearic acid amide flu PR 8 90 to 100 approach allantoic fluid Stearic acid amide flu PR 8 90 to 100 column allantoic fluid The above table shows that a large number of different lipoids or lipoid-like substances can be used for the adsorption, concentration and purification of viruses which do not infect via the gastrointestinal tract, e.g. B. in addition to palmitic and stearic acid octadecanol, hexadecanol, hexadecylamine, stearic acid amide, cholesterol, ergosterol, betasitosterol. A common feature of these lipoids is the presence of a polar, hydrophilic group, e.g. B. an OH, N H2-1 COO H or CON H2 group, which enables the dispersion of the lipoids in water.

Es wurde gefunden, daß eine leichte Dispergierbarkeit des Lipoids im Nährboden erforderlich ist. Lipoide, die im Nährboden nicht dispergierbar sind, sind für das erfindungsgemäße Verfahren unbrauchbar. Die Anwendung bekannter mechanischer und chemischer Dispersionsverfahren gestattet aber auch die Verwendung dieser sonst nicht dispergierbaren Lipoide. So wird z. B. durch die Zugabe von Netzmitteln zu in Wasser nicht dispergierbaren Lipoiden die Wirksamkeit der letzteren erreicht. Durch Zugabe eines Netzmittels, z. B. Glycerin zu Tristearin, das in Wasser nicht dispergierbar und gewöhnlich im vorliegenden Verfahren unbrauchbar ist, gelang es, dasselbe für den Grippevirus PR 8 aus allantoischer Flüssigkeit adsorptionsfähig zu machen.It has been found that the lipoid is easy to disperse is required in the culture medium. Lipoids that are not dispersible in the culture medium, are useless for the process according to the invention. The application of known mechanical and chemical dispersion processes also allow the use of these otherwise non-dispersible lipoids. So z. B. by the addition of wetting agents Lipoids not dispersible in water achieve the effectiveness of the latter. By adding a wetting agent, e.g. B. Glycerin to tristearin, which is not in water dispersible and usually useless in the present process, it was possible to the same for the flu virus PR 8 adsorbable from allantoic fluid close.

Die über den Magen-Darm-Kanal wirkenden Viren, wie die Viren von Poliomyelitis, ECHO (Arten 8 und 12), Coxsackie A 9 aus Affennierengewebe enthaltender Flüssigkeit, werden von keinem der bekannten Lipoide adsorbiert.The viruses that act through the gastrointestinal tract, such as the viruses of poliomyelitis, ECHO (species 8 and 12), Coxsackie A 9 from fluid containing monkey kidney tissue, are not adsorbed by any of the known lipoids.

Die nach dem neuen Verfahren hergestellten Vaccine und Impfstoffe haben eine stärkere Wirksamkeit, und die mit ihnen erzielte Schutzwirkung hält längere Zeit an, was anscheinend auf die besondere Wirksamkeit des Lipoids zurückzuführen ist. Überdies zeigten Versuche, daß die auf Grund des vorliegenden Verfahrens gereinigten und konzentrierten Viren länger lagerfähig sind und eine längere Lebensdauer besitzen.The vaccines and vaccines produced using the new process are more effective and the protective effect achieved with them lasts longer Time on, which seems to be due to the special effectiveness of the lipoid is. In addition, tests showed that the purified on the basis of the present process and concentrated viruses can be stored longer and have a longer lifespan.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Methods for purifying and concentrating Viruses, characterized in that the virus and the accompanying substance contaminating it be brought into contact with a lipoid or lipoid-like substance and then the lipoid and the virus adsorbed on it from the contaminating accompanying substances be separated.

2. The method according to claim 1, characterized in that the virus and the impurities contaminating it through a column containing the lipoid be conducted until the virus concentration contained in the lipoid a desired And that the lipoid is then removed from the column along with the virus will.

3. The method according to claim 1, characterized in that the lipoids are cholesterol, Ergosterol, betasitosterol, hexadecanol, octadecanol, palmitic acid, stearic acid, Hexadecylamine or stearic acid amide can be used.

4. The method according to claim 1, characterized in that the virus with the lipoid in the presence of a wetting agent is brought into contact.