DE1168015B

DE1168015B - Method for purifying virus antigen

Info

Publication number: DE1168015B
Application number: DENDAT1168015D
Authority: DE
Inventors: Frank B Brandon; Alton R Taylor
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Publication date: 1964-04-16

Description

Verfahren zur Reinigung von Virusantigen Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Reinigung von Virusantigenen.Methods for Purification of Virus Antigen The invention relates to on methods for purifying virus antigens.

Zur Verfügung stehende Verfahren für die Herstellung von Virusantigenen betreffen die Isolierung des Virus aus natürlichen Quellen oder aus einer Züchtung des Virus in einem geeigneten Wachstumsmedium, z. B. Geflügelembryo, Zellgewebekulturen u. ä. Infolge des hohen Gehaltes dieser Medien an Protein enthalten die anfallenden Virusflüssigkeiten, selbst wenn sie partiell, z. B. durch Bakterienfiltration, gereingt sind, unerwünscht große Mengen Nichtviruseiweiß, Nichtviruseiweißbruchstücke, wasserlösliche anorganische Salze und andere Verunreinigungen, die für diagnostische oder immunogenische Zwecke eine unspezifische Antikörperreaktion oder andere komplizierende Reaktionen hervorrufen können. Dabei begrenzen diese Nichtvirusverunreinigungen die Brauchbarkeit des antigenen Produktes.Processes available for the production of virus antigens concern the isolation of the virus from natural sources or from a culture of the virus in a suitable growth medium, e.g. B. poultry embryo, cell tissue cultures u. Ä. As a result of the high protein content of these media contain the resulting Virus fluids, even if they are partially, e.g. B. cleaned by bacterial filtration are undesirably large amounts of non-viral protein, non-viral protein fragments, water-soluble inorganic salts and other impurities useful for diagnostic or immunogenic Purposes a non-specific antibody reaction or other complicating reactions can evoke. These non-viral contaminants limit the usefulness of the antigenic product.

Es ist daher ein Ziel der Erfindung, Verfahren zur Herstellung hochgereingter Virusantigene zu schaffen. Gemäß der Erfindung wird eine wäßrige Lösung, die nicht gereinigte oder partiell gereinigte Virusantigene enthält, einer Filtration durch ein hydrophiles wasserunlösliches Dextranpolymergel, das ein dreidimensionales makroskopisches Netzwerk von vernetzten Dextranstoffen aufweist, unter solchen Bedingungen unterworfen, daß die Nichtviruseiweißstoffe und andere Verunreinigungen in der Gehnasse zurückgehalten werden, während das Virusantigen das Filter passiert. Das anfallende filtrierte Produkt zeichnet sich dadurch aus, daß es eine praktisch unverminderte Viruswirksamkeit aufweist, wie durch Titrierung oder andere Arbeitsweisen festgestellt wird, und doch praktisch frei ist von Nichtviruseiweißstoffen und anderen Nichtvirusverunreinigungen. Die Filtration wird zweckmäßig vorgenommen, indem man eine Säule, wie sie für die Chromatographie verwendet wird, herstellt, die als Filter hydrophiles wasserunlösliches Dextranpolymergel in Form von Körpern enthält, wobei jedes Korn ein dreidimensionales makroskopisches Netzwerk von vernetzten Dextranstoffen aufweist, ferner die Säule mit einem wäßrigen Medium, z. B. einer verdünnten Salzlösung equilibriert, die wäßrige Lösung mit dem Virusantigen auf die Säule aufgibt in Berührung mit der Filterschicht und das Virusantigen aus der Säule durch Eluieren oder Auswaschen mit physiologischer Salzlösung gewinnt. Um eine Einführung von verunreinigenden Stoffen zu vermeiden, wird die Filtrierung vorzugsweise unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Im Gegensatz zu üblichen Konzentrationsmethoden, bei denen eine feste Phase zurückgehalten wird, während die flüssige Phase durch das Filtrat passiert, erreicht das vorliegende Verfahren eine Trennung durch Zurückhaltung oder Herausnahme von niedrigen, molekularen, gelösten Stoffen in der Filterschicht und durch Überführung der relativ großen Moleküle in das Eluat. Das vorstehende Verfahren zur Filtrierung ist ferner von üblichen Abtrennungsverfahren wie Dialyse u. ä. verschieden. Ein unerwartetes Merkmal der Erfindung besteht darin, daß eine extrem selektive Abtrennung von Virusantigenen von den Verunreinigungen, die normalerweise solche Antigene begleiten, mit Hilfe einer Filtration durch ein Gel leicht erzielt werden kann.It is therefore an object of the invention to provide methods for producing highly purified Create viral antigens. According to the invention, an aqueous solution does not contains purified or partially purified virus antigens, a filtration through a hydrophilic water-insoluble dextran polymer gel that is a three-dimensional macroscopic Network of crosslinked dextran substances, subjected under such conditions, that the non-viral proteins and other impurities are retained in the water while the virus antigen passes through the filter. The resulting filtered Product is characterized by the fact that it has practically undiminished virus effectiveness as determined by titration or other working methods, and yet is virtually free of non-viral proteins and other non-viral contaminants. The filtration is conveniently carried out by using a column as it is for the Chromatography is used, which produces hydrophilic water-insoluble as a filter Containing dextran polymer gel in the form of bodies, each grain being a three-dimensional having a macroscopic network of crosslinked dextran substances, furthermore the column with an aqueous medium, e.g. B. equilibrated a dilute saline solution, the aqueous Solution with the virus antigen on the column gives up in contact with the filter layer and the virus antigen from the column by eluting or washing out with physiological Saline wins. To avoid the introduction of contaminants, the filtration is preferably carried out under sterile conditions. In contrast to usual concentration methods in which a solid phase is retained, as the liquid phase passes through the filtrate, the present one reaches Process a separation by retention or removal of low, molecular, dissolved substances in the filter layer and by transferring the relatively large molecules into the eluate. The above method of filtration is also common Separation methods such as dialysis and the like are different. An unexpected feature of the Invention is that an extremely selective separation of virus antigens with the help of the impurities that normally accompany such antigens filtration through a gel can be easily achieved.

Die Erfindung ist im breiten Sinne auf Viren der Antigengruppen anwendbar, die imstande sind, Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier hervorzurufen (vgl. Rhodes et a1., Textbook of Virology, Williams & Wilkins Co, Baltimore, 3. Auflage [1958]). Einige der zahlreichen- Viren dieser Art, die dem vorliegenden Verfahren unterworfen werden können, sind die Tollwutvirus, infektiöse Hepatitis, Mumps, Influenza, Parainfluenza, Kuhpocken, Pferdeencephalomyelitis, Hundestaupe, Poliomyelitis, Encephalomyocarditis, Schweinecholera, St. Louis encephalitis, Gelbes Fieber, Adenovirus, Masern, Coxsackie, ECHO und die gewöhnlichen Erkältungsviren. Die Natur der wäßrigen Lösung, die als Ausgangsstoff verwendete Viren für das Verfahren enthält, ist nicht kritisch. Die Lösung soll natürlich von sichtbaren Feststoffen frei sein. Für diese Zwecke kann die rohe Viruslösung durch übliche Verfahren, z. B. Dekantieren, Filtrieren und Zentrifugieren, geklärt werden. Die Lösung kann aus beliebigen wäßrigen Medien, die die Viren enthalten. bestehen. Zum Beispiel kann sie eine Gewebestrukturflüssigkeit oder einen wäßrigen Extrakt oder eine Suspension vom Zenralnervengewebe, ein Blutzelleluat, einen wäßrigen Extrakt oder eine Suspension von Geflügelembryo oder eine Geflügel-Ei-Extrakt-Flüssigkeit, z. B. Allantoin- oder Amniotinflüssigkeit mit Viren darstellen. Die bevorzugte Virusquelle hängt ab von den einzelnen Umständen und schwankt von Virus zu Virus. Zum Beispiel besteht bei den MM-Stämmen von Mäuse-Encephalomyocarditisvirus die bevorzugte Quelle aus einem Extrakt oder einer Suspension vom zerkleinerten Zentralnervengewebe, das mit dem Virus infiziert ist, und bei dem Tollwutvirus aus einem Extrakt oder einer Suspension von Gehirngewebe oder einem Geflügelembryo, die mit dem Virus infiziert sind. Für Encephalomyelitisvirus ist eine Chorioallantoinflüssigkeit von bebrüteten Geflügeleiern, die mit dem Virus infiziert sind, die bevorzugte Quelle und für den Poliomyelitisvirus eine Gewebekulturflüssigkeit mit dem Virus. Für Influenzavirus besteht eine übliche Quelle aus einer Kückenembryo-Allantoinflüssigkeit mit dem Virus. Für Adenovirus, Masern, Coxsackie, ECHO und gewöhnliche Erkältungsvirusarten ist ein Filtrat einer Kulturflüssigkeit aus Affennierengewebe mit dem Virus ein gutes Ausgangsmaterial. Der Virus kann auch in Form einer Impflösung vorliegen, in der der Virus mit Hilfe von Serienpassagen in Gewebekulturen angereichert ist oder in der der Virus antigenisch, aber durch Inaktivierung mit einem Inaktivierungsmittel wie Wärme, Ultraviolettstrahlen oder anderer energiereicher Strahlen, Ultraschallbehandlung, Formaldehyd, Betapropiolacton, Chlor, Phenol od. ä. oder mit einer Kombination von zwei oder mehreren dieser Mittel abgetötet ist. Die antigene Wirksamkeit der Viruslösungen, die als Ausgangsmaterial verwendet werden, ist nicht kritisch und kann nach Bedarf variiert werden.The invention is broadly applicable to viruses of the antigen groups capable of causing infectious diseases in humans and animals (cf. Rhodes et al., Textbook of Virology, Williams & Wilkins Co, Baltimore, 3rd edition [1958]). Some of the numerous- viruses of this type that make up the present process Can be subjected to are the rabies virus, infectious hepatitis, mumps, influenza, Parainfluenza, cowpox, equine encephalomyelitis, canine distemper, poliomyelitis, encephalomyocarditis, Pig cholera, St. Louis encephalitis, yellow fever, adenovirus, measles, coxsackie, ECHO and the common cold viruses. The nature of the aqueous solution, which as Raw material contains viruses used for the procedure is not critical. The solution should of course be free of visible solids. For this Purposes can the raw virus solution by usual methods, e.g. B. decanting, filtering and centrifugation. The solution can be obtained from any aqueous media, that contain the viruses. exist. For example, it can be a tissue structure fluid or an aqueous extract or a suspension of central nerve tissue, a blood cell eluate, an aqueous extract or a suspension of poultry embryo or a poultry egg extract liquid, z. B. represent allantoin or amniotin fluid with viruses. The preferred source of virus depends on the individual circumstances and varies from virus to virus. For example is the preferred source in the MM strains of mouse encephalomyocarditis virus from an extract or suspension of the minced central nervous tissue that is infected with the virus, and in the case of the rabies virus from an extract or a Suspension of brain tissue or a poultry embryo infected with the virus are. For encephalomyelitis virus, a chorioallantoin fluid is incubated Poultry eggs infected with the virus are the preferred source and for the Poliomyelitis virus is a tissue culture fluid containing the virus. For influenza virus A common source consists of a chick embryo allantoin fluid with the Virus. For adenovirus, measles, coxsackie, ECHO and common cold virus types is a filtrate of a culture fluid from monkey kidney tissue containing the virus good starting material. The virus can also be in the form of a vaccine solution, in which the virus is enriched with the help of serial passages in tissue cultures or in which the virus is antigenic, but by inactivation with an inactivating agent such as heat, ultraviolet rays or other high-energy rays, ultrasound treatment, Formaldehyde, beta propiolactone, chlorine, phenol od. Ä. Or with a combination of two or more of these agents are killed. The antigenic effectiveness of the virus solutions, which are used as the starting material is not critical and can be used as required can be varied.

Wie angegeben, ist die Gelfiltermasse, wie sie gemäß der Erfindung verwendet wird, ein hydrophiles wasserunlösliches vernetztes Dextranpolymergel. Dieses Material und das Verfahren seiner Herstellung sind in der britischen Patentschrift 854 715 beschrieben. Das Gelmaterial enthält ein dreidimensionales makroskopisches Netzwerk von Dextranstoffen, die miteinander verbunden oder vernetzt sind, das Wasser unter Quellen absorbieren kann. Diese Fähigkeit der Gelmasse, Wasser aufzunehmen, ist umgekehrt proportional dem Ausmaß der Vernetzung der Dextranstoffe in der Gelmasse. Mit anderen Worten, je größer die Vernetzung ist, um so kleiner ist die Porosität und die Wiederaufnahme von Wasser durch das Material. Für Filtrierzwecke wird, wenn die Gelmasse in körniger Form mit der selektiven Porosität mit einem Filtrat aus einer Gewebestruktur oder einem anderen wäßrigen Medium, das den Virus sowie assoziierte Eiweißbruchstücke oder sonstige Verunreinigungen enthält, in Berührung gebracht wird, können die Verunreinigungen in die Gelmasse diffundieren, während die Virusmoleküle, da sie größer sind, daran gehindert werden, daß sie in die Gelkörnen eintreten und gezwungen werden, zwischen den Körnern hindurchzugehen. Hierdurch erreicht man eine Abtrennung des Virus von den übrigen in der Lösung gelösten Stoffen. Das Gelmaterial steht in mehreren Gradlinierungen zur Verfügung, die sieh hinsichtlich der Porosität unterscheiden, z. B. bis zu 8 g/g Wasseraufnahme und mehr. So kann man durch die Verwendung einer Gelmasse mit einer Porosität, die durch relativ kleine, niedrigmolekulare, gelöste Stoffe durchdringbar ist, aber undurchlässig ist hinsichtlich einer Diffusion, durch das ausgewählte Virusmolekül, eine Reinigung einer wäßrigen Lösung, die den Virus enthält, erzielen.As indicated, the gel filter mass is as it is according to the invention is used, a hydrophilic water-insoluble crosslinked dextran polymer gel. This material and the method of its manufacture are set out in British Patent Specification 854 715. The gel material contains a three-dimensional macroscopic Network of dextran substances that are connected or networked with one another, the water can absorb under sources. This ability of the gel mass to absorb water, is inversely proportional to the extent of crosslinking of the dextran substances in the gel mass. In other words, the greater the crosslinking, the smaller the porosity and the re-uptake of water by the material. For filtering purposes, if the gel mass in granular form with the selective porosity with a filtrate a tissue structure or other aqueous medium that associated the virus as well Contains protein fragments or other impurities the impurities can diffuse into the gel mass, while the virus molecules, since they are larger, they are prevented from entering the gel granules and forced to pass between the grains. This achieves a Separation of the virus from the remaining substances dissolved in the solution. The gel material is available in several gradations, which you can see with regard to the porosity differentiate, e.g. B. up to 8 g / g water absorption and more. So you can go through the Use of a gel mass with a porosity that is determined by relatively small, low-molecular, dissolved substances can be penetrated, but is impermeable to diffusion, by the selected virus molecule, a purification of an aqueous solution containing the Virus contains, achieve.

Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Viruslösung vor der Gelfiltration einer an sich bekannten (vgl. zum Beispiel I. Immunolopy, 85, S. 309 bis 313, 1960) Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Fluorkohlenwasserstoff unterworfen. Diese Ausführungsform der Erfindung ist auf die Reinigung von Virusarten der Art anwendbar, die gegenüber Fluorkohlenwasserstoff hinsichtlich der Beibehaltung ihrer antigenen Wirksamkeit inert sind. Eine solche Extraktion wird zweckmäßig durchgeführt, indem man die wäßrige Lösung mit dem Virus, z. B. infektiösem Hepatitisvirus, mit dem Fluorkohlenwasserstoff vermischt, vorzugsweise gleiche Volumina, die Mischung sich in zwei Phasen trennen läßt, die Fluorkohlenwasserstoffphase durch frischen Fluorkohlenwasserstoff ersetzt und nacheinander die Extraktion der wäßrigen Phase hinreichend oft wiederholt, daß praktisch alle Nichtvirusstoffe, die in Fluorkohlenwasserstoffen löslich sind, aus der wäßrigen Phase entfernt werden. Gewöhnlich sind hierfür drei bis acht solche Extraktionen ausreichend. Für beste Ergebnisse werden etwa fünf bis sechs Extraktionen angewendet. Obgleich die Zahl der angewendeten Extraktionen nicht kritisch ist, ist es im Interesse der Erhaltung der Integrität des spezifischen Antigeneiweißes wünschenswert, eine unnötig lange Behandlung in dem Extraktionslösungsmittel zu vermeiden, und auch nicht eine unnötig große Anzahl von Extraktionen anzuwenden. Das Verhältnis von Fluorkohlenwasserstoff zur wäßrigen Lösung mit dem Virus kann je nach den Umständen variiert werden. Zum Beispiel wird bei Lösungen mit abnormen Eiweißgehalt vorgezogen, eine große Menge von Kohlenwasserstoff zu verwenden, z. B. etwa 2 Volumina auf 1 Volumen wäßrige Lösung. Das Vermischen erfolgt zweckmäßig mit Hilfe üblicher schnellaufender mechanischer Homogenisiereinrichtungen. Die Extraktion der wäßrigen Viruslösung kann auch durchgeführt werden, indem man diese zunächst zentrifugiert und die anfallenden zentrifugierten Feststoffe in einer einzigen Stufe in einem wäßrigen Medium mit dem Fluorkohlenwasserstoff vermischt und die sich abscheidende wäßrige Phase gewinnt. Dieses Verfahren ist dadurch vorteilhaft, daß es nicht nur weniger Zeit erfordert, sondern auch eine hohe Konzentration der wäßrigen Phase am Virusantigen gibt. Die Wahl der Fluorkohlenwasserstoffe ist nicht kritisch, und es können beliebige inerte flüssige Fluorkohlenwasserstoffe verwendet werden, die mit Wasser nicht mischbar sind und sich beim Stehen in Gegenwart von Wasser in einer gesonderten Phase abscheiden. Von den zahlreichen geeigneten Fluorkohlenwasserstoffen seien erwähnt Äthylidenfluorid, 1,1,1-Difluorchloräthan, 1,1,2,2-Tetrachlor-1,2-difluoräthan, 1,2,2-Trichlor-1,1,2-trifluoräthan und ähnliche Fluorkohlenwasserstoffe. Wenn es erwünscht ist, eine Extraktionsphase mit verminderter Dichte zu verwenden, kann der Fluorkohlenwasserstoff im Gemisch mit einem inerten hydrophilen flüssigen Kohlenwasserstofflösungsmittel mit einer relativ niedrigen Dichte, z. B. n-Heptan, verwendet werden. Für die Zwecke der Erfindung wird der Begriff Fluorkohlenwasserstoff verwendet, um nicht nur Fluorkohlenwasserstoffe der erwähnten Art zu beschreiben, sondern auch deren Gemische mit anderen mit Wasser nicht mischbaren flüssigen Lösungsmitteln, z. B. flüssigen Kohlenwasserstoffen.According to another preferred embodiment of the invention the virus solution before the gel filtration of a known per se (cf. for example I. Immunolopy, 85, pp. 309 to 313, 1960) extraction with a water immiscible Subject to fluorocarbon. This embodiment of the invention is based on the purification of virus species of the kind applicable to the fluorocarbon are inert in terms of maintaining their antigenic activity. Such Extraction is expediently carried out by the aqueous solution with the virus, z. B. infectious hepatitis virus, mixed with the fluorocarbon, preferably equal volumes, the mixture can be separated into two phases, the fluorocarbon phase replaced by fresh fluorocarbon and successively the extraction of the aqueous phase is repeated sufficiently often that practically all non-viral substances, which are soluble in fluorocarbons are removed from the aqueous phase. Usually three to eight such extractions are sufficient for this. For best Results are applied approximately five to six extractions. Although the number of the extractions used is not critical, it is in the interest of conservation the integrity of the specific antigenic protein is desirable, for an unnecessarily long time Avoid treatment in the extraction solvent, and neither does one unnecessarily apply large numbers of extractions. The ratio of fluorocarbon to the aqueous solution with the virus can vary depending on the circumstances. To the Example is preferred for solutions with abnormal protein content, a large amount to use of hydrocarbon, e.g. B. about 2 volumes to 1 volume of aqueous Solution. Mixing is expediently carried out with the aid of conventional high-speed mechanical devices Homogenizing devices. The extraction of the aqueous virus solution can also be carried out by first centrifuging them and centrifuging the resulting ones Solids in a single stage in an aqueous medium with the fluorocarbon mixed and the separating aqueous phase wins. This procedure is advantageous in that it not only takes less time, but also takes one there is a high concentration of the aqueous phase in the virus antigen. The choice of fluorocarbons is not critical and any inert liquid fluorocarbons can be used are used that are immiscible with water and that can be used when standing in the presence separate from water in a separate phase. Of the numerous suitable Fluorocarbons are ethylidene fluoride, 1,1,1-difluorochloroethane, 1,1,2,2-tetrachloro-1,2-difluoroethane, 1,2,2-trichloro-1,1,2-trifluoroethane and like fluorocarbons. If desired, an extraction phase To use with reduced density, the fluorocarbon can be mixed with an inert hydrophilic liquid hydrocarbon solvent with a relatively low density, e.g. B. n-heptane can be used. For the purposes of the invention the term fluorocarbon is used to include not just fluorocarbons of the kind mentioned, but also their mixtures with others with water immiscible liquid solvents, e.g. B. liquid hydrocarbons.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, die aus Viruslösungen allgemein anwendbar ist, aber zwecks Erläuterung hernach unter spezieller Bezugnahme auf Lösungen mit Influenzavirus beschrieben wird, kann eine weitere Reinigung erreicht werden, indem man die durch Gel filtrierte Viruslösung einer Ätherextraktion unterwirft. Bei dieser Arbeitsweise wird die Viruslösung mit Äther vermischt, vorzugsweise in etwa gleichen Volumen, und die besten Ergebnisse erhält man in der Kälte bei ausreichender Behandlungszeit, um praktisch eine völlige Trennung der Viruspartikelchen voneinander und eine Extraktion von ätherlöslichen Stoffen zu erreichen. Eine Ätherextraktion dient dazu, die charakteristischen Influenzavirusteilchen durch Auflösen des Lipids, das als Bindemittel für das Virusteilchen wirkt, um die Viruskomponenten zusammenzuhalten, durch Auflösen zu zerlegen. Die bevorzugte Mischzeit beträgt für den Influenzavirus etwa 5 Stunden. Nach der Vermischung läßt man die wäßrige und die Ätherphasen sich voneinander trennen, vorzugsweise in der Kälte, und die wäßrige Phase mit dem gewünschten gereinigten Virusantigen wird gewonnen. Wenn bemerkenswerte Mengen von Stoffen vorhanden sind, die eine Zwischenphase bilden, soll die Zwischenphase aus der wäßrigen Phase gewonnen werden und erneut mit Wasser und Äther extrahiert werden. Der wäßrige Extrakt wird dann, wenn erwünscht, zusammen mit einem etwaigen wäßrigen Zwischenphasenextrakt von allen Spuren gelöstem Äther befreit, z. B. indem man ein inertes Gas, wie Stickstoff, durch die wäßrige Phase hindurchperlen läßt oder indem man die wäßrige Phase eine ausreichende Zeit von etwa einer Stunde bei Raumtemperatur unter Vakuum hält. Eine Extraktion der wäßrigen Phase mit Äther wird erleichtert, indem man der wäßrigen Phase ein Netzmittel zusetzt. Nichtionische Netzmittel sind hierfür besonders geeignet. Bevorzugte Netzmittel sind Partialester von Polyoxyäthylensorbitan höherer Fettsäuren, wie Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat und -monooleat. Die anfallenden Extrakte, die nichtinfektiös sind und von nichtantigenen Virusfaktoren, wie den Lipiden, befreit sind, können für die Herstellung von Impflösungen oder diagnostischen Mitteln dienen oder können zur Injektion an Tiere für die Herstellung von spezifischen Antiseren u. ä. verwendet werden. Bei der Herstellung von Impflösungen z. B. wird eine geeignete Influenzavirus-Impflösung gewonnen, indem man einen Schutzstoff, wie Thimerosal (1:10 000), und einen Stabilisator, wie Formalin, hinzugibt. Die optimale Formalinkonzentration für die Stabilisierung beträgt etwa 0,111/o. Es wurde gefunden, daß die Schutzwirkung, die erfolgende Reaktion zwischen Formalin und dem Ätherextraktantigen, das Antigen bei der Lagerung gegenüber Wärme stabiler macht als das intakte Virusteilchen.According to a further embodiment of the invention that consists of virus solutions is generally applicable, but with specific reference hereinafter for explanation on solutions containing influenza virus is described, further purification can be achieved by subjecting the virus solution filtered through gel to ether extraction. In this way of working, the virus solution is mixed with ether, preferably in about the same volume, and the best results are obtained in the cold with sufficient Treatment time in order to practically complete separation of the virus particles from one another and to achieve extraction of ether-soluble substances. An ether extraction serves to remove the characteristic influenza virus particles by dissolving the lipid, which acts as a binder for the virus particle to hold the virus components together, decompose by dissolving. The preferred mixing time is for the influenza virus about 5 hours. After mixing, the aqueous and ether phases are allowed to stand separate from each other, preferably in the cold, and the aqueous phase with the desired purified virus antigen is obtained. When significant amounts of substances are present which form an intermediate phase, the intermediate phase is said to be from the aqueous phase and extracted again with water and ether. The aqueous extract is then, if desired, together with any aqueous interphase extract freed from all traces of dissolved ether, e.g. B. by using an inert gas such as nitrogen, bubbling through the aqueous phase or by the aqueous phase holds a sufficient time of about an hour at room temperature under vacuum. One Extraction of the aqueous phase with ether is facilitated by removing the aqueous Phase adds a wetting agent. Nonionic wetting agents are particularly suitable for this. Preferred wetting agents are partial esters of polyoxyethylene sorbitan of higher fatty acids, such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate and monooleate. The resulting extracts that are non-infectious and free of non-antigenic viral factors such as lipids can be used for the preparation of vaccination solutions or diagnostic agents or can be injected into animals for the production of specific antisera and the like can be used. In the production of vaccination solutions z. B. becomes a suitable one Influenza virus vaccine solution obtained by adding a protective agent, such as thimerosal (1:10 000), and a stabilizer such as formalin is added. The optimal concentration of formalin for stabilization is about 0.111 / o. It has been found that the protective effect, the reaction that takes place between formalin and the ether extract antigen, the antigen makes more stable to heat on storage than the intact virus particle.

Ein mögliches Merkmal der Erfindung, das vorteilhaft angewendet werden kann bei wäßrigen Lösungen, die aus der Gelfiltration oder der Ätherextraktion erhalten werden, insbesondere wenn diese Produkte bei diesem Verfahren unerwünscht verdünnt werden, besteht darin, daß man aus den Lösungen mit dem Virusantigen Wasser entfernt. Die Entfernung von Wasser kann je nach Wunsch vollständig oder teilweise sein. Dieses wird durch Dialyse des wäßrigen Produktes gegen ein hygroskopisches Material erreicht, das durch eine wasserdurchlässige Dialysemembran davon getrennt ist. Bemerkenswerterweise findet auf diese Weise die Entfernung von Wasser ohne merklichen Verlust oder Beeinträchtigung des Virusantigen statt. Gemäß einer bevorzugten Arbeitsweise wird die wäßrige Viruslösung mit dem Virusantigen in einer Dialysierhülle oder einer Membran eingebracht, die ihrerseits in einem geeigneten hygroskopischen Material suspendiert ist, so daß Wasser aus der Lösung durch die Membran in das hygroskopische Material hineindiffundieren kann. Man läßt die Dialyse vor sich gehen, bis die gewünschte Konzentration der wäßrigen Lösung erreicht ist. Die Wahl der Dialysemembranen ist nicht kritisch, da beliebige der zahlreichen wasserdurchlässigen Membranen verwendet werden können. Eine bevorzugte Membran ist ein regenerierter Celluloseschlauch. In gleicher Weise können beliebige Arten von inerten hygroskopischen Stoffen für die Dialyse verwendet werden, von denen feste Polyäthylenglykole der allgemeinen Formel HOCH2 (CH20CH2), CH20H erwähnt seien. Ferner Polyvinylpyrrolidon, konzentrierte Gelatine, synthetische Polysaccharidpolymere, wie Dextran, Dextranderivate, z. B. das Material, das bekannt ist unter der Handelsmarke »Ficoll«, erhältlich von AB Pharmacia, Uppsala, Schweden, und ähnliche Massen. Das hygroskopische Material kann in trockener Form oder als wäßriges Konzentrat verwendet werden. Die Antigenprodukte, die durch die erwähnten Dialyseverfahren entweder in trockener oder wäßriger Form konzentriert sind, sind hoch antigen und für diagnostische Zwecke besonders gut geeignet.One possible feature of the invention that can be advantageously used can be obtained from the gel filtration or the ether extraction in the case of aqueous solutions especially if these products are undesirably diluted in this process consists in removing water from the solutions containing the virus antigen. The removal of water can be total or partial as desired. This is achieved by dialysis of the aqueous product against a hygroscopic material, which is separated from it by a water-permeable dialysis membrane. Remarkably in this way finds the removal of water without noticeable loss or impairment of the virus antigen. According to a preferred procedure, the aqueous virus solution placed with the virus antigen in a dialysis sheath or membrane, which is in turn suspended in a suitable hygroscopic material, so that Diffuse water from the solution through the membrane into the hygroscopic material can. Dialysis is allowed to proceed until the desired concentration of aqueous solution is reached. The choice of dialysis membranes is not critical, since any of the numerous water permeable membranes can be used. A preferred membrane is a regenerated cellulose tube. In the same way Any type of inert hygroscopic material can be used for dialysis of which solid polyethylene glycols of the general formula HOCH2 (CH20CH2), CH20H should be mentioned. Also polyvinylpyrrolidone, concentrated gelatin, synthetic Polysaccharide polymers such as dextran, dextran derivatives, e.g. B. the material that is known is available under the trademark "Ficoll" from AB Pharmacia, Uppsala, Sweden, and similar masses. The hygroscopic material can be in dry form or as aqueous concentrate can be used. The antigen products produced by the mentioned Dialysis procedures are concentrated in either dry or aqueous form highly antigenic and particularly suitable for diagnostic purposes.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Beispiel 1 a) 10 ccm Gewebekulturfiltrat mit lebenden, abgeschwächten, infektiösen Hepatitisvirus (Infektionstiter, 10-7e) werden mit 10 ccm 1,2,2-Trichlor-1,1,2-trifluoräthan in einer Mischvorrichtung (15 000 bis 16 000 Umdrehungen je Minute) 30 Sekunden vermischt, worauf das Mischen 1 Minute unterbrochen und dann 30 Sekunden wiederholt wird. Das anfallende Gemisch wird durch ein Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit (2500 Umdrehungen je Minute international abgekühlt Nr. 1 und 2) in Schichten zerlegt, die organische Schicht wird verworfen, die wäßrige Phase mit dem Virus wird mit Hilfe einer Pipette aufgenommen und mit einem gleichen Volumen frischem Fluorkohlenwasserstoff 1 Minute in zwei aufeinanderfolgenden Perioden von 30 Sekunden in der beschriebenen Arbeitsweise vermischt. Das anfallende Gemisch wird durch Zentrifugieren in Schichten zerlegt, die organische Schicht wird verworfen, und die w'äßrige Phase mit dem Virus wird gewonnen. Die wäßrige Phase wird weiter viermal mit frischem Fluorkohlenwasserstoff bei der gleichen Extraktionsweise für insgesamt sechs Extraktionen extrahiert. Die anfallende, sich als wäßrige Schicht abscheidende Phase mit dem gereinigten infektiösen Hepatitisvirus ist praktisch frei von Nichtviruseiweiß und wird durch das hernach unter I, c) beschriebene Verfahren weiter gereinigt.The invention is illustrated by the following examples. Example 1 a) 10 cc Gewebekulturfiltrat with live, attenuated, infectious hepatitis virus (infectious titer, 10-7e) are mixed with 10 cc of 1,2,2-trichloro-1,1,2-trifluoroethane in a mixing device (15,000 to 16,000 revolutions per minute) mixed for 30 seconds, after which the mixing is interrupted for 1 minute and then repeated for 30 seconds. The resulting mixture is separated into layers by centrifugation at low speed (2500 revolutions per minute internationally cooled No. 1 and 2), the organic layer is discarded, the aqueous phase with the virus is taken up with the aid of a pipette and made in an equal volume fresh fluorocarbon for 1 minute in two consecutive periods of 30 seconds in the procedure described. The resulting mixture is separated into layers by centrifugation, the organic layer is discarded and the aqueous phase with the virus is recovered. The aqueous phase is further extracted four times with fresh fluorocarbon in the same extraction mode for a total of six extractions. The resulting phase with the purified infectious hepatitis virus, which is deposited as an aqueous layer, is practically free of non-virus protein and is further purified by the method described below under I, c).

Das bei der vorstehenden Arbeitsweise verwendete Gewebekulturfiltrat wird erhalten, indem man den lebenden Virus unter Verwendung des Serums eines Patienten, der unter infektiöser Hepatitis leidet, als Impfmittel in Gewebekulturzellen des Detroit-6-Stammes von Epithelzellen in einer Reihe von Kulturen entwickelt, um eine Abschwächung des Virus durch das nachstehende einzeln wiedergegebene Verfahren zu erzielen. Kulturen von Detroit-6-Zellen (B e r m a n et a1., Blood, B. 10, S. 896 bis 911, 1955) werden in ortsfesten Rohren unter Verwendung von 4 ccm Gemisch einer 60%igen Hankschen Lösung und 40% menschlichen Serums für jedes Rohr als Nutzmedium entwickelt. Die Kulturen werden nach 2 oder 3 Tagen dreimal mit einem Gemisch aus 60% Hankscher Lösung und 40% Serum gewaschen. Alle Kulturen werden dann mit 0,5 ccm einer 1:5-Verdünnung von infektiösem Serum [Infektionstiter (TCID58) 10-65] eines Patienten (IHAR-17), der an infektiöser Hepatitis leidet, beimpft, und es wird 1,5 ccm Erhaltungsmedium (90°/o Gemisch Nr. 199 und 10°/0 Pferdeserum) zu jedem Serum der Kultur gegeben. Der Virus wird bei 37,5° C unter Rotieren einen oder mehrere Tage entwickelt (während welcher Zeit eine cytopathogene Degenerierung auftritt), wobei man die Kultur durch periodische Einstellung alkalisch hält (PH 7,2 bis 7,6). Die Flüssigkeit mit dem lebenden Virus wird frei von Zellen gesammelt, und 0,5 ccm davon werden auf eine frische Reihe von stationären Kulturrohren von Detroit-6-Zellen für eine weitere Entwicklung des Virus unter Verwendung des gleichen Volumens je Rohr des Erhaltungsmediums und den gleichen Entwicklungsbedingungen, wie sie bei den Ursprungskulturen verwendet wurden, überimpft. Die Entwicklung wird fortgeführt bis zu einer maximalen Vermehrung des frischen Virus und wie sie durch cytopathogene Degenerierung der Zellen ersichtlich wird. Die Virusflüssigkeit wird dann gesammelt, und das Verfahren wird dann serienmäßig wiederholt in einem Satz von Kulturrohren auf einen anderen unter Verwendung von verdünnter oder unverdünnter gesammelter Flüssigkeit über eine Gesamtheit von elf Passagen. Die anfallende Gewebekulturflüssigkeit wird einer Bakterienfiltration unterworfen. Die Einzelheiten der Passagen einschließlich der speziellen Medien, wie sie für die Entwicklung und die Unterhaltung der Zellen für die verwendeten Impfstoffe verwendet wurden, der Entwicklungszeit, des geernteten Volumens und der Erntebezeichnung und des Infektionstiters bei der Sammlung sind in der Tabelle wiedergegeben. Volumen Kenn- Verwendetes Ent- (Kubik- zeichnung Infektions- Bezugs- Erhaltungs- Impfmedium wicklun zeit zentimeter) titer nummer Nährmedium medium der Besam- der Besam- bei der melten melten Sammlung (0,5 ccm) (Tage) Flüssigkeit Flüssigkeit 0 Originalserum 1 38 TCl > 10-E 1 TCl 4 8 TCE > 10-1 2 60% Hanks' * 90% 199 ** TCE verdünnt IO 16 TC3 10-1#s3 3 }40 0% Hu. S.*** 10 % Ho. S. + 1: 1 TC3 verdünnt 9 32 TC4 > 10-3 10:I 4 TC4 10 40 TC5 > 10-e 5 TC5 verdünnt 5 40 TCe > 10-1 10:1 6 TCe 7 50 TC; 10-8.5 7 , 85 % Eagle's ++ 90 % 199 TC7 9 24 TC8 - 8 15 % F. C. S.+++ 10 % F. C. S. TC8 14 26 TC@A 10-85 9 TC8 verdünnt 13 60 TC9B - 10 TC9B 8 72 TCle - 11 TCl9 9 120 *+ TCll 10-7,5 Hank's = Hanks' ausgeglichene Salzlösung. + Ho. S. = Pferde Serum. @`* 199 = Synthetic Gemisch Nr. 199. ++ Eagle's = Eagle's Grundmedium. *** Hu. S. = Menschen Serum. +++ F. C. S. = Kalb-Foetal-Serum. *+ Zwei 28 = oz. Flaschen an Stelle von Rohren (Erhaltungsmedium, 50 ccm Impfung 10 ccm je Flasche). b) Ein weiteres Verfahren zur Fluorkohlenwasserstoffextraktion ist das nachstehende: 150 ccm Gewebekulturfiltrat mit dem lebenden abgeschwächten infektiösen Hepatitisvirus (Infektionstiter 10-7#5) wird in eine Ultrazentrifuge (12,5 ccm in alle zwölf Zentrifugenbehälter; Spinco-Nr. 40-Rotor) eingebracht und bei einer Geschwindigkeit von 40 000 Umdrehungen je Minute 3 Stunden zentrifugiert. Die Flüssigkeit wird dann aus jedem Zentrifugenbehälter dekantiert, und die zurückbleibende feste Pastille in jedem Behälter wird aufgenommen, indem man 10 ccm sterilisierte gepufferte isotonische Salzlösung in einen Behälter und der Reihe nach das anfallende Gemisch auf alle übrigen Behälter überträgt. Die Behälter werden durch Einführung von 5 ccm frischer Salzlösung in einen Behälter und dessen übertragung nacheinander durch die Reihe der restlichen Behälter gewaschen. Die anfallende Lösung wird mit der Waschlösung kombiniert (insgesamt 15 ccm) und mit einem gleichen Volumen 1,2,2-Trichlor-1,2,2-trifluoräthan in einer Mischmaschine (15 000 bis 16 000 Umdrehungen je Minute) während 30 Sekunden vermischt. Das Gemisch wird dann durch Zentrifugieren in Schichten abgetrennt, und die anfallende wäßrige Phase mit dem gereinigten infektionösen Hepatitisvirus wird gewonnen und nach dem Verfahren, wie nachstehend in 1, c) beschrieben ist, verarbeitet.The tissue culture filtrate used in the above procedure is obtained by developing the live virus in tissue culture cells of the Detroit-6 strain of epithelial cells in a series of cultures to attenuate using the serum of a patient suffering from infectious hepatitis as an inoculant of the virus by the procedure detailed below. Cultures of Detroit-6 cells (Berman et al., Blood, B. 10, pp. 896 to 911, 1955) are placed in stationary tubes using a 4 cc mixture of 60% Hank's solution and 40% human serum for every pipe developed as a useful medium. The cultures are washed three times after 2 or 3 days with a mixture of 60% Hank's solution and 40% serum. All cultures are then inoculated with 0.5 cc of a 1: 5 dilution of infectious serum [infection titer (TCID58) 10-65] from a patient (IHAR-17) suffering from infectious hepatitis and it becomes 1.5 cc Maintenance medium (90% mixture No. 199 and 10% horse serum) was added to each serum of the culture. The virus is developed for one or more days at 37.5 ° C. with rotation (during which time cytopathogenic degeneration occurs), the culture being kept alkaline (pH 7.2 to 7.6) by periodic adjustment. The fluid with the live virus is collected free of cells, and 0.5 cc of it is transferred to a fresh set of stationary culture tubes of Detroit-6 cells for further development of the virus using the same volume per tube of maintenance medium and the same Development conditions as they were used in the original cultures, inoculated. The development is continued up to a maximum replication of the fresh virus and as it is evident from the cytopathogenic degeneration of the cells. The viral fluid is then collected and the process is then serially repeated in one set of culture tubes on another using diluted or undiluted collected fluid for a total of eleven passages. The tissue culture fluid obtained is subjected to bacterial filtration. The details of the passages including the specific media used to develop and maintain the cells for the vaccines used, the development time, the volume harvested and the harvest designation and infection titre when collected are given in the table. Volume characteristic Used de- (cubic drawing of infection Reference maintenance inoculation medium winding time centimeter) titer number culture medium medium of the inseminator melten melten collection (0.5 cc) (days) liquid liquid 0 original serum 1 38 TCl> 10-U 1 TCl 4 8 TCE> 10-1 2 60% Hanks' * 90% 199 ** TCE diluted IO 16 TC3 10-1 # s3 3} 40 0% Hu. S. *** 10% Ho.S. + 1: 1 TC3 diluted 9 32 TC4> 10-3 10: I. 4 TC4 10 40 TC5> 10-e 5 TC5 diluted 5 40 TCe> 10-1 10: 1 6 TCe 7 50 TC; 10-8. 5 7, 85% Eagle's ++ 90% 199 TC 7 9 24 TC8 - 8 15% FCS +++ 10% FCS TC8 14 26 TC @ A 10-85 9 TC8 diluted 13 60 TC9B - 10 TC9B 8 72 TCle - 11 TCl9 9 120 * + TCII 10-7.5 Hank's = Hanks' balanced salt solution. + Ho. S. = horse serum. @ `* 199 = Synthetic mixture No. 199. ++ Eagle's = Eagle's basic medium. *** Hu. S. = human serum. +++ FCS = calf fetal serum. * + Two 28 = oz. Bottles instead of tubes (Maintenance medium, 50 ccm vaccination 10 ccm per bottle). b) Another method of fluorocarbon extraction is as follows: 150 cc tissue culture filtrate containing the live attenuated infectious hepatitis virus (infection titre 10-7 # 5) is placed in an ultracentrifuge (12.5 cc in all twelve centrifuge containers; Spinco # 40 rotor) introduced and centrifuged at a speed of 40,000 revolutions per minute for 3 hours. The liquid is then decanted from each centrifuge container and the remaining solid lozenge in each container is collected by transferring 10 cc of sterilized buffered isotonic saline to one container and sequentially transferring the resulting mixture to the remaining containers. The containers are washed by introducing 5 cc of fresh saline into a container and transferring it successively through the series of remaining containers. The resulting solution is combined with the washing solution (15 cc in total) and mixed with an equal volume of 1,2,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane in a mixer (15,000 to 16,000 revolutions per minute) for 30 seconds . The mixture is then separated into layers by centrifugation, and the resulting aqueous phase with the purified infectious hepatitis virus is collected and processed according to the method as described below in 1, c).

c) Sterile wasserunlösliche vernetzte Dextranpolymergelkörner (100 g Maschenverteilung: 0,2 Gewichtsprozent auf Nr. 50 US screen liegenbleibend, 4,9'% durch Nr. 270 hindurchgehend; Wasserwiederaufnahme ungefähr 2 bis 3 g/g), erhältlich nach der britischen Patentschrift 854 715, werden mit Wasser befeuchtet, und die feuchte Aufschlämmung wird dreimal nacheinander mit einem Liter Volumen steriler 0,5 Mol Kochsalzlösung gewaschen. Das gewaschene Dextran wird als Aufschlämmung in 0,05 Mol Kochsalzlösung in eine senkrechte zylinlindrische Chromatographiglaskolonne (Standhöhe 76 ccm; im Durchmesser 4 cm) eingeführt, die am unteren Ende mit einem groben tragenden Glasfilter und einem Abschlußhahn versehen ist. Man läßt das Gel sich setzen, die Kolonne wird mit Kochsalzlösung gefüllt und geschüttelt, um das Gel frei von Luftbläschen zu machen. Die Kolonne :wird dann mit steriler, gepufferter, isotonischer Salzlösung equilibriert. 100 ccm extrahierte wäßrige Lösung mit dem infektiösen Hepatitisvirus [hergestellt nach der Arbeitsweise von 1, a) oder b)] werden dann auf die Kolonne mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1 ccm je Minute aufgegeben, wobei man oben eine Flüssigkeitschicht von etwa 2 ccm aufrechterhält. Anschließend auf die Einführung der Viruslösung gibt man 250 ccm sterile, gepufferte, isotonische Salzlösung auf die Kolonne mit der gleichen Strömungsgeschwindigkeit und mit der gleichen Flüssigkeitskopfschicht auf. Die ersten 100 ccm Ablauf aus der Kolonne verwirft man. Die nachfolgenden 150-ccm-Fraktionen, die den gereinigten, infektiösen Hepatitisvirus enthält, werden unter sterilen Bedingungen aufgefangen.c) Sterile water-insoluble cross-linked dextran polymer gel beads (100 g mesh distribution: 0.2 percent by weight remaining on No. 50 US screen, 4.9% going through no. 270; Water recovery approximately 2 to 3 g / g) are available according to British patent specification 854 715, are moistened with water, and the wet slurry becomes more sterile three times in a row with one liter volume 0.5 mol of saline solution washed. The washed dextran is used as a slurry in 0.05 mol of saline solution in a vertical cylindrical chromatography glass column (Standing height 76 ccm; diameter 4 cm), which at the lower end with a coarse load-bearing glass filter and a stopcock is provided. Leave the gel sit down, the column is filled with saline solution and shaken to remove the To make gel free of air bubbles. The column: is then filled with sterile, buffered, isotonic saline equilibrated. 100 cc of extracted aqueous solution with the infectious hepatitis virus [prepared according to the procedure of 1, a) or b)] are then on the column with a flow rate of about 1 ccm each Minute, while maintaining a layer of liquid of about 2 cc on top. Following the introduction of the virus solution, 250 ccm of sterile, buffered, isotonic saline solution on the column with the same flow rate and with the same liquid head layer. The first 100 cc run out the column is rejected. The subsequent 150 ccm fractions, which contain the purified, containing infectious hepatitis virus are collected under sterile conditions.

Falls gewünscht, kann die Säule regeneriert werden, indem man sie mit steriler Kochsalzlösung auswäscht, und es können dann weitere Mengen an unfiltrierter Viruslösung durch die Säule verarbeitet werden.If desired, the column can be regenerated by using it Washes out with sterile saline, and there can then be more amounts of unfiltered Virus solution can be processed through the column.

Der sterile Ablauf mit dem gereinigten Virus kann für die Herstellung von Impflösung oder immunen Seren verwendet werden. Wenn das als Ausgangsmaterial verwendete Virusmaterial abgetötet oder hinreichend abgeschwächt ist, kann der anfangende Ablauf direkt als Impflösung für die Verabreichung in üblicher Weise dienen. Der Ablauf kann auch als diagnostisches Mittel verwendet werden. Falls gewünscht, kann der Ablauf durch eine Dialyse auf ein kleines Volumen durch die nachstehende Arbeitsweise konzentriert werden. Ein Anteil von 50 ccm des Ablaufs wird in eine abgeschlossene Hülle aus regenerierter Cellulose eingebracht, und die Hülle wird in 100 g trockenen, festen Polyäthylenglycolschuppen aufgehängt, die sich in einem Becher befinden. Die Hülle wird dann in dieser Stellung gehalten. Man läßt die Dialyse mehrere Stunden ablaufen, bis die gewünschte Wassermenge entfernt ist, worauf die Hülle herausgenommen und das wäßrige Konzentrat gewonnen wird. Um die Dialyse zu erleichtern, kann von Zeit zu Zeit eine gewisse Menge Polyäthylenglykol zugegeben werden. Eine vollständige Entfernung des Wassers aus einer Lösung von 50 ccm erfordert etwa 10 bis 12 Stunden.The sterile process with the purified virus can be used for the manufacture of vaccine solution or immune sera. If that's the starting material The virus material used is killed or sufficiently weakened, the beginning Drain directly serve as an inoculation solution for administration in the usual way. Of the Drain can also be used as a diagnostic tool. If desired, can the process through dialysis to a small volume through the following procedure be concentrated. A 50 cc portion of the drain is completed in one Inserted casing made of regenerated cellulose, and the casing is in 100 g dry, fixed polyethylene glycol scales, which are in a beaker. The sheath is then held in this position. Dialysis is allowed for several hours run until the desired amount of water is removed, whereupon the cover is removed and recovering the aqueous concentrate. To facilitate dialysis, von From time to time a certain amount of polyethylene glycol can be added. A complete Removal of the water from a 50 cc solution takes about 10 to 12 hours.

Die Arbeitsweisen nach Beispiel 1, a), b) und c) können auch für die Herstellung anderer antigener Stoffe verwendet werden, die sich ableiten von anderen Virusausgangsmaterialien. Zum Beispiel kann man an Stelle eines Gewebekulturfiltrats mit dem lebenden, abgeschwächten, infektiösen Hepatitisvirus ein wäßriges Medium mit Kuhpocken; Poliomyelitis, Adeno- oder Coxsackievirusantigen in dem gleichen Volumen verwenden, insbesondere z. B. eines der nachstehenden Ausgangsstoffe: Centrifugat einer Chlorioallantoinflüssigkeit, erhalten aus bebrüteten Hühnereiern, infiziert mit Kuhpockenvirus, Infektionstiter 10-s; Affennierengewebekulturfiltrat mit einem Poliomyelitisvirus 1, 2 oder 3, der partiell abgetötet wurde durch Formaldehyd und partiell durch Aussetzen einer ultravioletten Bestrahlung (vgl. britische Patentschrift 802048); Affennierengewebekulturfiltrat (03 Selasfilter) mit Adenovirus (Type 3, 4 oder 7) mit einem Infektionstiter 10-s; Flüssigkeit, erhalten durch Filtrieren einer Affennierengewebekultur (nacheinander durch grob, mittel, fein und ultrafein gesintertem Gläs= filter) von Coxsackie (Virus Type A oder B), Infektionstiter 10-5. Beispiel 2 a) Zu einer mit Salzlösung equilibrierten Dextranpolymergelkörnersäule, hergestellt wie im Beispiel 1, c) beschrieben, gibt man 100 ccm wäßriges Centrifugat mit Influenzavirus (Hämagglutinationstiter, 4-104 HA Einheiten je Kubikzentimeter, wobei die Zugabe bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 11/E ccm/Minute erfolgt und man eine Flüssigkeitskopfschicht von 2 ccm aufrechterhält. Man gibt dann 250 ccm sterile gepufferte isotonische Salzlösung auf die Säule unter Verwendung der gleichen Strömungsgeschwindigkeit und der gleichen Flüssigkeitskopfschicht auf. 100 ccm Ablauf, die nach dem ersten 100 ccm Ablauf folgen und den Influenzavirus in gereinigter Form enthalten, werden unter sterilen Bedingungen aufgefangen. Das Verfahren ergibt eine zehnfache oder noch höhere Reinigung. Der Virusgehalt und die Antigenwirkung des so erhaltenen Konzentrates sind praktisch die gleichen wie die des Ausgangszentrifugalmaterials.The procedures according to Example 1, a), b) and c) can also be used for Manufacture of other antigenic substances are used that are derived from others Virus source materials. For example, in place of a tissue culture filtrate with the live, attenuated, infectious hepatitis virus, an aqueous medium with cowpox; Poliomyelitis, adeno- or coxsackievirus antigen in the same Use volume, especially e.g. B. one of the following starting materials: Centrifugate a chlorioallantoin liquid obtained from incubated chicken eggs with cowpox virus, infection titer 10-s; Monkey kidney tissue culture filtrate with a Poliomyelitis virus 1, 2 or 3, which has been partially killed by formaldehyde and partially by exposure to ultraviolet radiation (see British patent specification 802048); Monkey kidney tissue culture filtrate (03 Selasfilter) with adenovirus (type 3, 4 or 7) with an infection titer 10-s; Liquid obtained by filtration a monkey kidney tissue culture (successively through coarse, medium, fine and ultrafine sintered glass filter) from Coxsackie (virus type A or B), infection titre 10-5. Example 2 a) To a dextran polymer gel granule column equilibrated with saline solution, prepared as described in Example 1, c), 100 cc of aqueous centrifugate are added with influenza virus (hemagglutination titer, 4-104 HA units per cubic centimeter, the addition taking place at a flow rate of about 11 / E ccm / minute and a liquid head layer of 2 cc is maintained. You then give 250 cc of sterile buffered isotonic saline solution onto the column using the same flow velocity and the same liquid head layer. 100 cc process that follows the first 100 cc process and the influenza virus contained in purified form are collected under sterile conditions. That Procedure gives ten times or more cleaning. The virus content and the antigenic effects of the concentrate thus obtained are practically the same as that of the starting centrifugal material.

Das Ausgangszentrifugalmaterial wird hergestellt wie folgt: 11 Tage alte bebrütete Hühnereier werden mit dem Influenzavirus (entweder Type A, A-1, A-2 oder B; z. B. dem PR-8, Ann Arbor, asiatischen oder Groß-See-Stamm) geimpft und 48 Stunden bei 35° C entwickelt. Nach der Entwicklung wird die Allantoinflüssigkeit aufgefangen, zentrifugiert, und das anfallende Sediment wird wieder in einer Salzlösung suspendiert und 12 bis 15 Stunden in einer Kugelmühle gemahlen. Die anfallende wäßrige Virussuspension wird dann in einer langsamlaufenden Zentrifuge geklärt. b) Man gibt Polyoxyäthylensorbitanmonooleat zu dem im Beispiel 2, a) erhaltenen Viruskonzentrat in einer Konzentration von 1 mg/ccm. Das anfallende Gemisch wird mit einem gleichen Volumen Äther vermischt, und die anfallende wäßrige Ätherlösung wird in der Kälte bei 0 bis 10° C etwa 5 Stunden mit einer solchen Geschwindigkeit gerührt, so daß kein Schäumen auftritt und auch noch keine Abtrennung der beiden Phasen stattfindet. Die wäßrige Ätherphase läßt man sich dann in der Kälte trennen, die Ätherschicht wird abgetrennt, und die wäßrige Phase wird mit Gefahr zusammen mit einer etwaigen Zwischenphase aufgefangen. Spuren von Äther, die in der wäßrigen Phase verbleiben, werden entfernt, indem man zunächst Stickstoff durch die wäßrige Phase leitet und dann die wäßrige Phase etwa eine Stunde bei Raumtemperatur im Vakuum hält. Das anfallende wäßrige Antigenprodukt ist nichtinfektiös und kann für immunogenische, prophylaktische oder diagnostische Zwecke dienen. Zum Beispiel kann aus dem wäßrigen Produkt eine Impflösung mit guten Lagereigenschaften hergestellt werden, indem man dieses mit einem Schutzstoff, z. B. Thimerosal (zu einer Fertigkonzentration von 1:10 000 Teilen Volumen) und mit Formaldehyd (etwa 1:1000 Volumteilen) vermischt.The starting centrifugal material is prepared as follows: 11 days old incubated chicken eggs are infected with the influenza virus (either type A, A-1, A-2 or B; z. B. the PR-8, Ann Arbor, Asian or Great Sea strain) vaccinated and Developed for 48 hours at 35 ° C. After developing, the allantoin becomes liquid collected, centrifuged, and the resulting sediment is again in a saline solution suspended and ground in a ball mill for 12 to 15 hours. The resulting aqueous The virus suspension is then cleared in a low speed centrifuge. b) Polyoxyethylene sorbitan monooleate is added to the virus concentrate obtained in Example 2, a) at a concentration of 1 mg / ccm. The resulting mixture is with a same Volume of ether mixed, and the resulting aqueous ethereal solution is in the cold stirred at 0 to 10 ° C for about 5 hours at such a rate that no foaming occurs and also no separation of the two phases takes place. The aqueous ether phase can then be separated in the cold, the ether layer is separated, and the aqueous phase is dangerous together with any Intermediate phase caught. Traces of ether remaining in the aqueous phase, are removed by first passing nitrogen through the aqueous phase and then the aqueous phase is kept in vacuo at room temperature for about an hour. The accruing Aqueous antigen product is non-infectious and can be used for immunogenic, prophylactic or serve diagnostic purposes. For example, from the aqueous product a Inoculation solution with good storage properties can be prepared by using this with a protective substance, e.g. B. Thimerosal (to a finished concentration of 1:10 000 parts Volume) and mixed with formaldehyde (about 1: 1000 parts by volume).

Die Arbeitsweisen von 2, a) und b) und das Konzentrationsverfahren vom Beispiel 1, c) können auch für die Herstellung weiterer antigener Stoffe dienen, die sich von anderen Virusausgangsstoffen ableiten. Zum Beispiel kann man an Stelle eines Zentrifugat eines Influenzavirus ein wäßriges Medium im gleichen Volumen, das Parainfluenzavirus oder Mumpsvirus enthält, verwenden. Bei Parainfluenzavirus kann man ein Zentrifugat von Kückenembryo-Allantoinkulturflüssigkeit mit Parainfluenzavirus (Type 1, Sendai), 5.104 HA-Einheiten verwenden, beim Mumpsvirus kann man ein Zentrifugat von Kückenembryo-Amniokulturflüssigkeit mit Mumpsvirus, Infektionstiter (Hemmagglutinationstiter) 10-4 verwenden.The working methods of 2, a) and b) and the concentration method from Example 1, c) can also be used for the production of other antigenic substances, which are derived from other virus precursors. For example you can in place a centrifugate of an influenza virus an aqueous medium in the same volume, that contains parainfluenza virus or mumps virus. With parainfluenza virus one can centrifuge chick embryo allantoin culture fluid with parainfluenza virus (Type 1, Sendai), use 5,104 HA units, with mumps virus you can use a centrifugate of chick embryo amnioculture fluid with mumps virus, infection titer (inhibitory agglutination titer) Use 10-4.

Claims

Claims: 1. A method for purifying virus antigen, thereby characterized in that an aqueous solution with the virus antigen and non-virus impurities, optionally after pre-cleaning with fluorocarbons known per se filtered through a wetted hydrophilic water-insoluble cross-linked dextran polymer gel, which can absorb water under swelling and has a porosity that is smaller is than the molecular size of the virus.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the aqueous filtrate is subjected to dialysis, whereby water from the eluate Will get removed.

3. The method according to claim 1, characterized in that the aqueous filtrate mixed with ether, the mixture is divided into an aqueous and an ether phase lets separate and the aqueous phase wins.