DE1052938B

DE1052938B - Process for the artificial production of hereditary changes in the properties of microorganisms

Info

Publication number: DE1052938B
Application number: DEG20681A
Authority: DE
Inventors: Brian Stephen Gossling
Original assignee: General Electric Co PLC
Current assignee: General Electric Co PLC
Priority date: 1955-10-05
Filing date: 1956-10-05
Publication date: 1959-03-19

Description

Verfahren zur künstlichen Erzeugung erblicher Veränderungen der Eigenschaften von Mikroorganismen Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Mikroorganismen uald Im besonderen die Elektroschockbehandlung von Mikroorganismen, um eine Änderung ihrer Eigenschaften herbeizuführen.Process for the artificial creation of hereditary changes in properties of Microorganisms The present invention relates to the treatment of microorganisms uald In particular, the electroshock treatment of microorganisms to make a change bring about their properties.

Die Verwendung von Mikroorganismen verschiedenster Art ist heute in der Industrie weit verbreitet, wobei diese Organismen verwendet werden, um verschiedene und manchmal komplizierte Umwandlungen herbeizuführen. Wohlbekannte Beispiele der Verwendung von Mikroorganismen auf diese Art finden sich z. B. in der Käseherstellung, der Herstellung von Antibiotika, in Brauerei, Bäckerei und auf synthetischchemischem Gebiet. Der Wert solcher Organismen für ihre spezifische industrielle Anwendung hängt jedoch fast immer von einer besonderen Eigenschaft oder von besonderen Eigenschaften ab, die sie aufweisen, und dementsprechend ist man fortwährend bestrebt, ihre Leistung in bezug auf die gewünschten Eigenschaften zu verbessern oder unerwünschte Eigenschaften auszuschalten. Diese Bestrebungen befaßten sich in der Vergangenheit hauptsächlich mit der Ausivahl sowohl aus den kultivierten als auch aus wilden Quellen jener Stämme von Mikroorganismen, die die gewünschten Eigenschaften im höchsten Maße zeigten. In letzter Zeit wurden jedoch künstlich Mutationen in Organismen durch verschiedene Mittel herbeigeführt, und die mutierten Organismen wurden getestet und jene ausgewählt, die eine Verbesserung der Eigenschaften im Vergleich zu dem nicht mutierten Elternstamm aufwiesen.The use of various types of microorganisms is in today Widely used in industry, these organisms being used to create various and sometimes bring about complicated conversions. Well-known examples of the Use of microorganisms in this way can be found, for. B. in cheese production, the production of antibiotics, in breweries, bakery and on synthetic chemicals Area. The value of such organisms for their specific industrial application however, almost always depends on a particular property or properties which they exhibit, and accordingly one continually strives to improve their performance to improve in terms of the desired properties or undesirable properties turn off. These endeavors have primarily been concerned in the past with selection from both the cultivated and wild sources of those tribes of microorganisms that showed the desired properties to the highest degree. Recently, however, mutations have been artificially made in organisms by various Funds were raised and the mutant organisms were tested and those selected which is an improvement in properties compared to the non-mutated parent strain exhibited.

C?nter den Verfahren, die bisher angewandt wurden, um eine künstliche Mutation von Organismen herbeizuführen, befinden sich die Anwendung von chemischen mutationserzeugenden Stoffen, wie z. B. Senfgas, sowie die Verwendung von hochenergetischen Strahlen, wie ultraviolettem Licht und Röntgenstrahlen.C? Nter the procedures that have previously been used to make an artificial one To bring about mutation of organisms are the application of chemical mutation-generating substances, such as. B. mustard gas, as well as the use of high-energy Rays such as ultraviolet light and X-rays.

Es war weiterhin bekannt, zur Erzeugung erheblicher Veränderungen der Eigenschaften von Mikroorganismen hochenergetische Strahlen, Ultraviolett-, Röntgen- oder Radiumstrahlen, zu verwenden.It was still known to produce significant changes the properties of microorganisms high-energy rays, ultraviolet, X-rays or radium rays should be used.

Außerdem wurde bereits diskutiert, Hefe zur Unterdrückung von Infektionen mit elektrischem Strom mit einer Stärke von etwa 5 Ampere zu behandeln. Auch die Behandlung von Mikroorganismen mit elektromagnetischen Wellen, wie Hertzschen Kurzwellen und Ultrakurzwellen, zur Förderung ihres Wachstums wurde bereits erwähnt. Hierbei soll die Behandlung im Durchfluß erfolgen, und es wurde bereits in diesem Zusammenhang auf die Anwendung der unipolaren Funkenentladung von hochfrequenten hochgespannten Strömen niedriger Intensität hingewiesen.In addition, yeast has already been discussed as a means of suppressing infections treat with an electric current of about 5 amps. Also the Treatment of microorganisms with electromagnetic waves such as Hertzian short waves and ultra-short waves, to promote their growth, has already been mentioned. Here the treatment should take place in the flow, and it has already been done in this context on the application of the unipolar spark discharge of high frequency high voltage Low intensity currents noted.

Die erfindungsgemäße Elektroschockbehandlung, die zu einer wahren Mutation der behandelten Mikroorganismen führt, konnte aber aus allen diesen Angaben nicht entnommen werden.The electric shock treatment according to the invention, the true Mutation of the treated microorganisms results, but could from all these indications cannot be removed.

Man nimmt an, daß derartige veränderungserzeugende Stoffe durch einen Angriff auf bestimmte Funktionen innerhalb der Organismen, die behandelt werden, wirken, und man stellte fest, daß wenigstens zum Teil die Art der Mutation, die man durch die Verwendung eines Verfahrens zustande bringt, durch ein anderes nicht hervorgerufen werden kann, und umgekehrt. Die Entdeckung eines neuen Veränderungen erzeugenden Verfahrens öffnet daher die Wege zu weiteren Fortschritten der künstlich herbeigeführten Mutation von Organismen und dem anschließenden Testen und Auswählen nach gewünschten Eigenschaften mit den entsprechenden industriellen Vorteilen.It is assumed that such change-inducing substances are caused by a Attack on certain functions within the organisms that are being treated work, and it was found that at least in part the type of mutation that is accomplished by using one process and not another can be caused, and vice versa. The discovery of a new change generating process therefore opens the way to further advances in artificially induced mutation of organisms and subsequent testing and selection according to the desired properties with the corresponding industrial advantages.

Wir haben festgestellt, daß in Mikroorganismen verschiedener Art, besonders in einzelligen Organismen, durch die Anwendung einer starken Elektroschockbehandlung in einem flüssigen Medium erbliche Veränderungen in der Natur der Mutation künstlich herbeigeführt werden können. Derartige Behandlungen erwiesen sich als äußerst wirksam, um Variationen in den Eigenschaften verschiedener Organismen zustande zu bringen, sie sind leicht auszuführen und besitzen außerdem den Vorteil, daß die Intensität der dem Organismus aufgelegten Behandlung leicht zu kontrollieren ist; außerdem wird die Wirksamkeit der Behandlung von der Zusammensetzung des Mediums, in dem der Mikroorganismus suspendiert ist, kaum beeinträchtigt.We have found that in various types of microorganisms, especially in unicellular organisms, through the application of a strong electric shock treatment in a liquid medium, hereditary changes in the nature of the mutation are artificial can be brought about. Such treatments have been found to be extremely effective, to bring about variations in the properties of different organisms, they are easy to carry out and also have the advantage that the intensity the The treatment applied to the organism is easy to control is; in addition, the effectiveness of the treatment depends on the composition of the medium, in which the microorganism is suspended, hardly affected.

Gemäß der Erfindung ist ein Verfahren vorgesehen, um erbliche Veränderungen der Eigenschaften von Mikroorganismen künstlich herbeizuführen, welches darin besteht, daß der Organismus in einem geeigneten flüssigen Medium einer starken Elektroschockbehandlung ausgesetzt wird.According to the invention a method is provided for hereditary changes to artificially bring about the properties of microorganisms, which consists in that the organism is subjected to a strong electric shock treatment in a suitable liquid medium is exposed.

Die Ausdrücke »erbliche Veränderungen« oder »Mutation« betreffen in der vorliegenden Beschreibung eine einem Organismus zugefügte Veränderung, die wenigstens einige Generationen hindurch erblich ist. Sie bedeuten nicht unbedingt, daß die Veränderungen permanent für alle Generationen erblich werden oder daß ein besonderer Mechanismus, z. B. eine Veränderung im Chromosömenmaterial, damit verbunden ist.The terms "hereditary changes" or "mutation" refer to in of the present description a change added to an organism, the at least is hereditary for several generations. They don't necessarily mean that Changes are permanently hereditary for all generations or that a special one Mechanism, e.g. B. a change in the chromosome material is associated with it.

Die Stärke der Schockbehändlung ist unter anderem die Funktion von zwei Faktoren, nämlich der Intensität des Schocks und der gesamten Energie, die bei der Behandlung aufgewendet wird. Die Intensität des Schocks hängt vom Leistungsverbrauch in dem Medium ab, und während die untere wirksame Grenze je nach den zu behandelnden Organismen verschieden ist, kann man allgemein sagen, .daß die erforderliche Intensität des Elektroschocks dem Organismus zugeführt wird, wenn der Leistungsverbrauch in dem unter Behandlung stehenden Medium eine untere Grenze von ungefähr 100 kW/cm3 überschreitet. Bei vielen Organismen ist es zweckmäßig, diese untere Grenze weit zu überschreiten; wir fanden z. B., daß für viele Mikroorganismen ein Leistungsverbrauch in der Größenordnung von 1000 kW/cm3 sehr zufriedenstellende Ergebnisse liefert.The strength of shock treatment is, among other things, the function of two factors namely the intensity of the shock and the total energy that is expended in the treatment. The intensity of the shock depends on the power consumption in the medium, and while the lower effective limit depends on the treatment to be treated Organisms is different, one can generally say that the required intensity of the electric shock is delivered to the organism when the power consumption in the medium under treatment has a lower limit of approximately 100 kW / cm3 exceeds. With many organisms it is advisable to keep this lower limit wide To exceed; we found z. B. that for many microorganisms a power consumption on the order of 1000 kW / cm3 gives very satisfactory results.

Das im Verfahren nach der-vorliegenden Erfindung verwendete flüssige Medium muß natürlich mit den zu behandelnden Mikroörgaiiismen verträglich sein; außerdem rnuß es fähig sein,.-die elektrische Energie zu übertragen, die notwendig ist, um den harten Schock hervorzurufen, also eine entsprechende Leitfähigkeit aufweisen. Es können alsoverschizdeneNährmedien oder Halbnährmedien, die für Mikroorganismen geeignet sind, verwendet werden, obgleich es nicht wesentlich ist, daß die verwendeten Medien irgendwelche Nähreigenschaften haben. -Die Wirksamkeit des Mutationsverfahrens nach der vorliegenden Erfindung läß.t -sich an einem weiten Bereich von -Mikroorganismen zeigen, und zwar, nicht nur an solchen, die eine besondere industrielle Anwen= dung finden, sondern auch -an anderen, so- daß man sagen kann, daß das Verfahren allgemein anwendbar ist. Die Erfindung kann mit Erfolg auf einen weiten Bereich von einzelligen -lrIikroorganisrnen angewendet @verden, -z.-B. aerobe, anaerobe, fakultative und mikro= aerophile Bakterien und Hefen und Schimmelpilze im allgemeinen. Wenn auch »Mutation« .ein Terminus ist, der auf Viren vielleicht nicht ganz streng anwendbar ist, so kann gesagt werden, daß die Anwendung- dieses hllutationsverfahrens - ihre-._Inaktivierung um- einen Faktor von bis zu 10s bewi-rkt. -- --Die Dauer- der Schockbehandlung im Sinne der Zeit zwischen Beginn -und Abschluß ist nicht kritisch; es ist jedoch klar; daß die gesamte in dem Medium verbrauchte Energie eine Funktion der -Intensität des Schocks und der Zeit,- während welcher er verabfolgt wird, ist. Die gesamte- Zeit; während -welcher ein Schock-von gegebener und geeigneter Intensität verabreicht werden muß, wenn ein Schock der nötigen Härte vermittelt werden soll, sollte daher so bemessen sein, daß die Gesamtenergie, die in dem Medium verteilt ist, eine untere Grenze von ungefähr 10 Kalorien, d. h. 42 Joules pro cm3, übersteigt. Auch hier stellten wir wieder fest, daß es für viele Organismen vorteilhaft ist, diese untere Grenze beträchtlich zu überschreiten, und wir fanden, daß ein Bereich von 20 bis 60 Kalorien oder 84 bis 350 Joules pro cm3 häufig wünschenswert ist.The liquid used in the process of the present invention The medium must of course be compatible with the microorganisms to be treated; in addition, it must be able to - transmit the electrical energy necessary is to cause the hard shock, so have a corresponding conductivity. It can also be used as nutrient media or semi-nutrient media for microorganisms are suitable, although it is not essential that those used Media have any nutritional properties. -The effectiveness of the mutation process According to the present invention, it can be applied to a wide range of microorganisms show, and not only on those that have a special industrial application find, but also -on others, so- that one can say that the procedure is general is applicable. The invention can be used with success on a wide range of unicellular -lrIikroorganisrnen applied @verden, -z.-B. aerobic, anaerobic, facultative and micro = aerophilic bacteria and yeasts and molds in general. If also "Mutation" is a term that may not be strictly applicable to viruses is, it can be said that the application of this mutation process is its inactivation by a factor of up to 10s. - --The duration of the shock treatment im The meaning of the time between start and finish is not critical; it is clear, however; that the total energy consumed in the medium is a function of the intensity of shock and the time during which it is administered. The whole- Time; during -which a shock-of given and appropriate intensity is administered must be given if a shock of the necessary severity is to be conveyed, should therefore be dimensioned so that the total energy that is distributed in the medium, a lower Limit of about 10 calories, i.e. H. 42 joules per cm3. Here too we found again that it is beneficial for many organisms, this lower one Limit considerably and we found that a range from 20 to 60 calories or 84 to 350 joules per cubic centimeter is often desirable.

Es ist nicht wesentlich, daß die erforderliche Gesamtenergie in dem Medium durch einen einzigen ununterbrochenen Schock ganz verbraucht werden soll. Es ist im Gegenteil ein bedeutendes Merkmal der Erfindung, daß ein Schock der erforderlichen Stärke den Mikroorganismen als die Summe einer Reihe von Schocks vermittelt wird, die alle die erforderliche Intensität, aber geringere Stärke aufweisen. Dies läßt sich durch pulsierende Ströme leicht bewerkstelligen.It is not essential that the total energy required in the Medium is intended to be completely consumed by a single continuous shock. On the contrary, it is an important feature of the invention that a shock is required Strength imparted to the microorganisms as the sum of a series of shocks, all of which have the required intensity but lesser strength. This leaves easily accomplished by pulsating currents.

Wenn pulsierende elektrische Ströme verwendet werden, hängt die Stärke der Behandlung natürlich unter anderem von der Intensität eines jeden Stromstoßes ab, von seiner Dauer und der jedem Mediumvolumen vermittelten Anzahl von Stößen. Die Intensität eines jeden Pulses muß auf die oben erklärte Art gewählt werden. Die Dauer eines Pulses ist augenscheinlich nicht sehr kritisch und kann 50 Mikrosekunden und mehr oder 5 Mikrosekunden oder weniger betragen. Es ist jedoch ein bevorzugtes Merkmal dieser Erfindung, daß die Pulsdauer zwischen diesen Grenzen liegen soll und wir fanden, daß eine Pulsdauer von ungefähr 10 Mikrosekunden für die meisten Mikroorganismen sehr günstig ist.When pulsating electrical currents are used, the strength depends the treatment, of course, on the intensity of each electric shock, among other things from its duration and the number of shocks imparted to each volume of medium. The intensity of each pulse must be chosen in the manner explained above. The duration of a pulse is apparently not very critical and can be 50 microseconds and be more or 5 microseconds or less. However, it is a preferred one Feature of this invention that the pulse duration should lie between these limits and we found that a pulse duration of about 10 microseconds for most Microorganisms is very beneficial.

Das Intervall zwischen den Pulsen ist ebenfalls nicht kritisch, vorausgesetzt natürlich, daß es nicht so lange ist, daß sich der Organismus inzwischen von der Wirkung des vorausgegangenen Pulses erholen kann. Da jedoch der Anteil jeden Pulses zur gesamten Energiezufuhr normalerweise so beträchtlich ist, können gewöhnlich nur ein paar Stöße in direkter Folge gegeben werden, und da die ganze Zeit der An-%vendung in der Regel nicht weniger als ein paar Hundertstelsekunden sein kann, ist das Intervall zwischen den Stößen notwendigerweise viel größer als die Dauer der Stöße selbst. Intervalle von einer Fünfhundertstel- und einer Tausendstelsekunde erwiesen sich als für viele Organismen geeignet. Die Anzahl von Stößen einer gegebenen Intensität und Dauer, die dem Organismus zugeführt werden müssen, werden durch die Gesamtenergie bestimmt, die in dem Medium verbraucht werden soll.The interval between pulses is also not critical, provided of course, that it has not been so long that the organism has moved away from the Effect of the previous pulse can recover. However, there is the proportion of each pulse to the total energy input is usually so considerable, usually can only a few shocks are given in direct succession, and there the whole time of use As a rule, the interval cannot be less than a few hundredths of a second necessarily much greater than the duration of the shocks themselves between shocks. Intervals of five hundredths and one thousandths of a second turned out to be as suitable for many organisms. The number of bursts of a given intensity and duration, which must be supplied to the organism, are determined by the total energy determined to be consumed in the medium.

Obwohl die Härte des dem unter Behandlung stehenden Organismus vermittelten Schocks unter anderem eine Funktion der Gesamtenergie ist, die in dem Medium verbraucht wird, glaubt man, daß die Wirkung auf dem Organismus fast ausschließlich elektrischer und nicht thermischer Natur ist. Es ist in der Tat zweckmäßig, Schritte zu unternehmen, um eventuelle thermische Veränderungen, die in Begleitung der elektrischen Behandlung auftreten können, möglichst gering zu halten. So kann das Medium vorteilhafterweise z. B. sowohl während als auch nach der Behandlung auf irgendeine übliche Art gekühlt werden. Wenn man außerdem bedenkt, daß die Stärke des Schocks nur dann eine Funktion des Gesamtenergieverbrauchs ist, wenn ein Schock entsprechender Intensität erfolgt, wogegen etwaige auftretende thermische Veränderungen auch die Energie aufnehmen, die durch Pulse öder Teile von Pulsen verbraucht wird, die unter der erforderlichen Intensität liegen, dann wird man feststellen, daß die Verwendung von Pulsen der sogenannten Rechteckform der Verwendung von z. B. sinusförmigen Pulsen im allgemeinen vorzuziehen ist, es sei denn, das Energiemaximum liege weit über der Schwelle, in diesem Fall ist die Form des Pulses weniger bedeutend.Although conveyed the hardness of the organism under treatment Shocks are, among other things, a function of the total energy consumed in the medium it is believed that the effect on the organism is almost exclusively electrical and is not thermal in nature. It is indeed appropriate to take steps to any thermal changes that accompany the electrical treatment can occur, to be kept as low as possible. So the medium can be advantageous z. B. chilled in any conventional manner both during and after treatment will. If you also consider that the strength of the shock is only a function of the total energy consumption is when a shock of the corresponding intensity occurs, whereas any thermal changes that occur also absorb the energy, which is consumed by pulses or parts of pulses that are below the required Intensity, then you will find that use of pulses of the so-called rectangular shape using z. B. sinusoidal pulses is generally preferable unless the energy maximum is well above the threshold, in which case the shape of the pulse is less important.

Es stellte sich heraus, daß die Temperatur des 'Jediums, in dem die Mikroorganismen suspendiert sind, in vielen Fällen die Wirksamkeit der Behandlung stark beeinflußt. Die optimale Temperatur für die Behandlung irgendwelcher besonderen Organismen wird am besten durch einen einfachen vorausgehenden Test bestimmt. Während man für einen weiten Bereich von Mikroorganismen zufriedenstellende Ergebnisse bei der und um die Zimmertemperatur herum erhält, kann man im allgemeinen sagen, daß innerhalb gewisser Grenzen die Wirksamkeit der Behandlung um so größer ist, je tiefer die Temperatur ist. So glaubte man z. B. bei bestimmten Organismen nach einem Versuch bei Zimmertemperatur, d. h. bei 18° C, daß sie auf die Behandlung nicht ansprechen; bei niedrigeren Temperaturen, z. B. 3° C, zeigte sich, daß sie bedeutend stärker und sogar vollständig reagierten.It turned out that the temperature of the 'Jedium in which the Microorganisms are suspended, in many cases the effectiveness of the treatment strongly influenced. The optimal temperature for treatment of any special Organisms are best determined by a simple preliminary test. While gives satisfactory results for a wide range of microorganisms who receives and around room temperature can generally be said to be within certain limits the effectiveness of the treatment is greater, the deeper it is the temperature is. So one believed z. B. in certain organisms after an experiment at room temperature, d. H. at 18 ° C that they do not respond to the treatment; at lower temperatures, e.g. B. 3 ° C, it was found to be significantly stronger and even fully responded.

Man muß sich immer vor Augen halten, daß irgendwelche besonderen Mikroorganismen, die dem Mutationsverfahren nach der vorliegenden Erfindung unterzogen werden sollen, eventuell besondere, ihnen gemäße Bedingungen erfordern, die beachtet werden müssen, ehe die Behandlung wirksam werden kann. Solche speziellen Bedingungen können verschiedenster Art sein, z. B. Anpassung der Temperatur, des p$ Wertes, der Konzentration usw. Das Ansprechen z. B. von E. coli auf die Behandlung wie das vieler anderer cvtochromtragender Organismen hängt, wie man feststellen konnte, wenigstens zu einem Teil davon ab, daß die Luft- oder Sauerstoffmenge, die in dem Suspensionsmedium gelöst ist, weder zu groß noch zu klein ist, so daß bei solchen Organismen eine zusätzliche Bedingung für eine wirksame Behandlung darin besteht, daß das Einwirken der Luft zwischen den Behandlungsstufen beschränkt, jedoch nicht gänzlich ausgeschaltet werden soll.One must always keep in mind that any special microorganisms which are to be subjected to the mutation process according to the present invention, possibly require special, appropriate conditions that must be observed, before treatment can take effect. Such special conditions can be very diverse Be kind, e.g. B. Adjustment of temperature, p $ value, concentration, etc. The response z. B. E. coli to the treatment like that of many other cvtochrome-carrying As has been shown, organisms depend at least in part on that the amount of air or oxygen dissolved in the suspending medium is neither is too big nor too small, so that an additional condition in such organisms for an effective treatment consists in the action of the air between the treatment stages should be limited, but not completely switched off.

Um festzustellen, ob eine besondere Behandlung zum Herbeiführen einer Mutation von Mikroorganismen, auf die sie angewendet wurde, wirksam war, halten wir es für geeignet, als Maßstab den Prozentsatz von Organismen zu nehmen, die durch die Behandlung getötet oder nicht lebensfähig gemacht wurden. Wir fanden im allgemeinen, da-ß eine zufriedenstellende Elektroschockbehandlung zu dem in dieser Erfindung verfolgten Zweck dann vorliegt, wenn wenigstens 101/o und weniger als 100% der Mikroorganismen getötet oder nicht lebensfähig gemacht werden. Gewöhnlich sollte der Schock derart sein, daß er nicht weniger als 20% und vorzugsweise wenigstens 50% nicht lebensfähig macht. Die besten Ergebnisse erzielte man im allgemeinen durch Behaindlungen, in welchen 90 bis 95% getötet oder nicht lebensfähig gemacht wurden. Durch die Anwendung dieser Kriterien auf den behandelten Organismus ist es möglich, festzustellen, ob ein Elektroschock. der erforderlichen Härte vermittelt worden ist. Wenn nicht, kann man einige oder alle einen Einfluß ausübenden Falttoren einschließlich der Behandlungstemperatur entsprechend abändern, um das Ergebnis zu verbessern.To determine if a specific treatment is used to induce a Mutation of microorganisms to which it was applied was effective we find it appropriate to take as a benchmark the percentage of organisms that pass through the treatment has been killed or rendered non-viable. We generally found that a satisfactory electric shock treatment to that in this invention The purpose pursued is present when at least 101 / o and less than 100% of the microorganisms killed or rendered non-viable. Usually the shock should be like this be that it is not less than 20% and preferably at least 50% non-viable power. The best results were generally obtained by treating in which 90 to 95% have been killed or rendered non-viable. Through the application Based on these criteria on the treated organism, it is possible to determine whether an electric shock. the required severity has been imparted. If not, can some or all of the influencing folding doors including the treatment temperature modify accordingly to improve the result.

Nachdem die Mikroorganismen der Behandlung unterzogen worden sind, ist es üblich, wenn auch nicht immer notwendig, die Organismen zu isolieren und jeden zu testen, ob er lebensfähig geblieben ist, um festzustellen, ob er eine Mutation erlitten hat, und, wenn dies der Fall ist, um weiter festzustellen, ob die Veränderung, die er erfahren hat, für die industrielle Funktion, die er erfüllen soll, von Vorteil ist. Die besonderen Verfahren des Isoliereis und Testens variieren natürlich je nach der Natur des Organismus. Ganz allgemein ist ein geeignetes Verfahren, das Medium zu verdünnen und die Suspension von Organismen so auszubreiten, daß man sicher ist, daß jeder lebensfähige Organismus eine abgesonderte und deutlich unterschiedene Kolonie entstehen lassen wird. Gewöhnlich ist es angebracht, in diesem Stadium eine erste Sichtung dieser Kolonien vorzunehmen, indem man einen einfachen Test anwendet, entsprechend dem Organismus und der Eigenschaft, auf Grund welcher er von Wert ist, um somit a11 die Kolonien auszuschalten, die keine Verbesserung gegenüber dem parentalen unbehandelten Stamm des Organismus versprechen. - Die Kolonien, die eine Verbesserung versprechen, werden dann ausgelesen und in üblicher Weise weiterkultiviert unter Bedingungen, die denen, unter welchen der industrielle Prozeß abläuft, nahekommen, und unter einem genauen quantitativen Vergleich der neuen mutierten Stämme mit dem Elternstamm. Schließlich werden natürlich die durch die Behandlung hervorgerufenen mutierten Stämme, die bei Abwägen' aller ihrer Eigenschaften die größte Verbesserung gegenüber dem Elternstamm zeigen, substituiert und icn dem industriellen Verfahren verwendet. In der industriellen Anwendung verhalten sich die neuen Stämme im allgemeinen ganz ähnlich wie der Elternstamm, mit Ausnahme der Eigenschaft oder Eigenschaften, derentwegen sie ausgewählt wurden. Natürlich bestehen jedoch geringe Differenzen in ihren Eigenschaften, und optimale Ergebnisse lassen sich nur durch weitere Versuche erreichen.After the microorganisms have been subjected to the treatment, it is common, though not always necessary, to isolate the organisms and test everyone to see if they have remained viable to see if they have a mutation and, if so, to further determine whether the change, which it has experienced is advantageous for the industrial function which it is supposed to fulfill is. The special procedures for insulating ice and testing vary, of course according to the nature of the organism. In general, one suitable method is that Dilute medium and spread the suspension of organisms in such a way that one is safe is that every viable organism is a separate and distinct one Will give rise to a colony. It is usually appropriate to have one at this stage make an initial sighting of these colonies using a simple test according to the organism and the property on the basis of which it is of value, in order to eliminate a11 the colonies which do not show any improvement over the parental promise untreated strain of the organism. - The colonies that are an improvement promise, are then selected and further cultivated under in the usual way Conditions which come close to those under which the industrial process takes place, and under a precise quantitative comparison of the new mutant strains with the Parent line. Eventually, of course, those evoked by the treatment will be mutant strains which, when weighing all of their properties, produce the greatest improvement compared to the parent strain show substituted and icn the industrial process used. In industrial use, the new strains behave in general very similar to the parent strain, except for the trait or traits, for which they were chosen. Of course, there are minor differences in their properties, and optimal results can only be obtained through further experimentation reach.

Es gibt viele verschiedene Methoden der Anwendung der Elektroschockbehandlung auf das Medium; die einfachste ist vielleicht die, bei der man die in dem Medium suspendierten Mikroorganismen in eine Zelle mit zwei Elektroden bringt, die so lange mit der Stromquelle verbunden sind, wie nötig ist, um die gewünschte Anzahl von Stößen auszusenden. Zweckmäßig ist es jedoch, das die Mikroorganismen tragende Medium durch eine Behandlungszone zwischen den Elektroden fließen zu lassen, wobei seine Fließgeschwindigkeit und, wenn nötig, die Frequenz der elektrischen Stöße so gewählt werden, daß jeder Teil des Mediums in der Zeit, während welcher er in die, durch die oder aus der Behandlungszone fließt, -einen Schock von entsprechender Härte empfängt.There are many different methods of applying electric shock treatment on the medium; Perhaps the simplest is the one in which one is in the medium puts suspended microorganisms in a cell with two electrodes that last for so long connected to the power source as necessary to the desired number of To send out bumps. However, it is expedient to use the medium carrying the microorganisms to flow through a treatment zone between the electrodes, its The flow rate and, if necessary, the frequency of the electrical surges are selected in this way be that every part of the medium in the time during which it enters the, through flowing or out of the treatment area, -a shock of appropriate severity receives.

Fachleuten ist es klar, daß - wenn die Grundzüge der oben beschriebenen elektrischen Behandlung einmal richtig erkannt sind - viele verschiedene elektrische Anlagen verwendet werden können, um Schocks einer entsprechenden Art und Härte zu erzeugen. Wir geben im folgenden die Beschreibung einer Anlage, die sich allgemein als zufriedenstellend erwies.It is clear to those skilled in the art that - if the general principles of the above electrical treatment once properly identified - many different electrical ones Attachments can be used to deliver shocks of an appropriate type and severity produce. In the following we give a description of a system that is general proved satisfactory.

Eine einfache Anordnung für die Elektroschockbehandlung von Mikroorganismen im Labor umfaßt eine Behandlungszelle aus Glas oder einem anderen chemisch inerten Isoliermaterial, durch welche das flüssige Medium derart fließt, daß es ganz zwischen Planelektroden von der Größenordnung 1 cm2, die in einer Entfernung von 1 mm angeordnet sind, hindurchgeht. Es können auch andere Zellenformen verwendet werden, vor allem eine Zelle, bei der, um die Belastung der Elektroden zu mindern, größere Elektroden durch eine vielfach perforierte isolierende Trennwand von gleicher Dicke wie die vorgenannte Entfernung voneinander getrennt sind, deren gesamte Ouerschnittsfläche von der gleichen Größenordnung wie die obengenannte Elektrodenfläche ist. Damit ist gewährleistet, daß die Energiedichte in den Perforationen den erforderlichen Wert aufweist.A simple arrangement for electroshocking microorganisms in the laboratory includes a treatment cell made of glass or some other chemically inert Insulating material through which the liquid medium flows in such a way that it is entirely between Planar electrodes of the order of 1 cm2, placed at a distance of 1 mm are going through. Other cell shapes can be used, in particular a cell with larger electrodes in order to reduce the stress on the electrodes by a multiple perforated insulating partition wall of the same thickness as the the aforementioned Distance separated from each other, their entire Cross-sectional area of the same order of magnitude as the above-mentioned electrode area is. This ensures that the energy density in the perforations is the required Has value.

Die Flüssigkeit kann vor und/oder unter der Zelle auf beliebige Weise abgekühlt werden.The liquid can be in front of and / or under the cell in any way be cooled down.

Um die notwendigen Betriebsenergiedichten zu erreichen, die am besten bei 1000 kW/cm3 liegen, haben sich elektrische Stöße erzeugende Anordnungen als geeignet erwiesen. Ein geeigneter statischer Generator enthält z. B. eine Vielfach-T-Schaltung von Reiheninduktivitäten (mit stufenweise gesättigten Kernen) und Shuntkapazitäten, die von einem Kondensator aufgeladen werden, der von der normalen Wechselstromquelle entsprechend gespeist wird, und die in der durch die Behandlungszelle dargestellten Belastung endet. Ein geeigneter statischer Pulsgenerator wurde z. B. von W. S. Melv ille (Proc. Inst. Electrical Engineers, Vol. 98, Part. III, p.185, 1951) beschrieben.In order to achieve the necessary operating energy densities, which are best around 1000 kW / cm3, electrical shock-generating arrangements have proven to be suitable. A suitable static generator includes e.g. B. a multiple-T circuit of series inductors (with stepwise saturated cores) and shunt capacitances, which are charged by a capacitor which is fed accordingly by the normal AC power source and which ends in the load represented by the treatment cell. A suitable static pulse generator has been e.g. B. by WS Melville (Proc. Inst. Electrical Engineers, Vol. 98, Part. III, p.185, 1951).

Wenn man z. B. eine einfachere Form des von M e 1 v i 11 e beschriebenen Generators mit zwei Stufen verwendet, kann der Eingang in der Größenordnung von 250 Volt 50 Hertz sein und der Output in der Größenordnung von ein paar Kilovolt in Pulsform. Bei Verwendung eines solchen Generators ist die Dauer eines jeden Pulses weniger als 10 Mikrosekunden.If you z. B. a simpler form of that described by M e 1 v i 11 e Used generator with two stages, the input can be of the order of 250 volts 50 hertz and the output on the order of a few kilovolts in pulse form. When using such a generator, the duration of each pulse is less than 10 microseconds.

Um die Erfindung noohmäls zu erläutern, geben wir im folgenden die Resultate von Experimenten, die wir über die Mutation von Milch-Streptokokken anstellten. Diese Organismen werden in der Käseindustrie verwendet und werden dort »Säurewecker« genannt. Wie bekannt, leiden diese Organismen oft an einer Infektion durch Viren, bekannt als Bakteriophagen, die eine beinahe vollständige Inaktivierung und Lysis der Milchstreptokokken zustande bringen können. Ein solcher bakteriophager Befall ist ein ernsthaftes Problem in der Käseindustrie. Durch die Anwendung des Mutationsverfahrens nach vorliegender Erfindung konnten wir Mutationen in Milch-Streptokokken herbeiführen und feststellen, daß die mutierten Organismen erhöhten Widerstand gegen bakteriophage Infektion zeigten. Experiment I Der verwendete Säurewecker war ein Stamm von Streptococcus lactis, genannt M, Sl. Dieser Starter überlebte eine Infektion mit seinem zugehörigen Bakterophagus m, s. in dem geringen Verhältnis von nur 1:5000. Eine 18-Stunden-Kultur dieses Starters in Hefe-Dextrose-Brühe wurde verwendet, um ein 2%iges Inoculum in 41 Hefe-Dextrose-Brühe herzustellen; die Bevölkerung der entstehenden Suspension war ungefähr 30 Millionen Organismen pro cm3. Diese Suspension ließ man zwischen Plan-Platin-Elektroden von 2,1 cm= Fläche und 0,051 cm Abstand mit solcher Geschwindigkeit fließen, daß jedes Element der Suspension 1/"o Sekunde brauchte, um zwischen den Elektroden hindurchzufließen, und während des Passierens zwei Stöße in jeder Richtung empfing.In order to further explain the invention, we give in the following the results of experiments which we carried out on the mutation of milk streptococci. These organisms are used in the cheese industry and are called "acid starters" there. As is known, these organisms often suffer from infection by viruses known as bacteriophages, which can bring about almost complete inactivation and lysis of the milk streptococci. Such bacteriophage is a serious problem in the cheese industry. By using the mutation method according to the present invention, we were able to induce mutations in milk streptococci and found that the mutated organisms showed increased resistance to bacteriophageous infection. Experiment I The starter used was a strain of Streptococcus lactis, called M, Sl. This starter survived an infection with its associated bacterophagus m, see in the low ratio of only 1: 5000. An 18 hour culture of this starter in yeast-dextrose broth was used to make a 2% inoculum in 41% yeast-dextrose broth; the population of the resulting suspension was approximately 30 million organisms per cm3. This suspension was allowed to flow between plan platinum electrodes 2.1 cm = area and 0.051 cm apart at such a rate that it took each element of the suspension 1/ "o of a second to flow between the electrodes and two shocks while passing received in every direction.

Die wirksame Dauer jedes Stoßes, das ist die Zeit, während welcher die Energieaufnahme die Hälfte ihres maximalen Wertes übersteigt, war 10 Mikrosekunden, und die maximale Aufnahme war ungefähr 1200 k@V/cm3.The effective duration of each shock is the time during which the energy consumption exceeds half of its maximum value, was 10 microseconds, and the maximum uptake was approximately 1200 k @ V / cm3.

Während eines Durchgangs zwischen den Elektroden stieg die Temperatur der Suspension um 6' C, so daß diie Energitezwfuhr 6 Kaloriein pro. om3 betrug. Unmittelbar nach dem Durchgang zwischen den Elektroden wurde die Suspension auf ihre ursprüngliche Temperatur von 20' C abgekühlt. Nach jedem der sieben aufeinanderfolgenden Durchgänge wurde eine Probe der Suspension entnommen, ebenso wie eine unbehandelte Kontrollprobe vor dem ersten Durchgang.During a pass between the electrodes, the temperature of the suspension rose by 6 ° C, so that the energy supply was 6 calories per. om3 scam. Immediately after the passage between the electrodes, the suspension was cooled to its original temperature of 20 ° C. A sample of the suspension was taken after each of the seven consecutive runs, as was an untreated control sample before the first run.

Nicht infizierte und infizierte Anteile einer jeden Probe wurden mittels Trübetest in bezug auf Veränderungen in der Bevölkerung während mehrerer Stunden bei 50' C verglichen. Die gegebene Infektion war die übliche Testinfektion, nämlich 1% einer völlig lysierten Kultur des Wirtes. Die Bevölkerung der unbehandelten infizierten Versuchszelle fiel nach 4 Stunden Inkubationszeit aus, was zeigt, daß die Bakteriophagen zur Lysierwng der Organilsmen aktiv waren. Die Proben, die nach dem dritten und späteren Durchgängen entnommen wurden, zeigten den gleichen Bevölkerungsanstieg, und zwar bei infizierten und nicht infizierten, was zeigt, daß nach der dritten Behandlungsstufe die Lysis unterdrückt ist. Dieser Bevölkerungsanstieg wurde über sechs Generationen aufrechterhalten,v-as zeigt, das die Resistens gegen Lysis erblich war.Uninfected and infected portions of each sample were compared by turbidity test for changes in the population over several hours at 50 ° C. The infection given was the usual test infection, namely 1% of a fully lysed culture of the host. The population of the untreated infected test cell failed after an incubation time of 4 hours, which shows that the bacteriophages were active in lysing the organisms. The samples taken after the third and later rounds showed the same increase in population, both infected and uninfected, indicating that after the third stage of treatment the lysis is suppressed. This population increase was sustained for six generations, v-as shows that resistance to lysis was hereditary.

Andere Teile, sowohl der infizierten als auch der nicht infizierten Proben, wurden über Nacht rekultiviert, und zwar in sterilisierter Milch bei 22' C, und die durch sie produzierte Säure in 1% Impfstoff in sterilisierter Milch nach einer - Inkubationszeit von 6 Stunden bei 30' C wurde durch Titration bestimmt. Das Ergebnis in Prozent Milchsäure zeigt Tabelle I Probe kontrolliert , 2. I 3. , 4. I 5. I 6. Stufe nicht infiziert . .. .. . . . 0,51 0,38 0.37 0,35 0,35 I 0,34 infiziert ... .. .. ...... 0,24 0,32 0,36 0,35 0,35 I 0,34 Es zeigt sich, daß die Säureproduktion der behandelten Proben erheblich vermindert war; die Infektionsanfälligkeit wurde nach der 3. Behandlungsstufe herabgesetzt und nach der 5. Stufe ausgeschaltet.Other parts of both the infected and uninfected samples were re-cultured overnight in sterilized milk at 22 ° C, and the acid produced by them in 1% vaccine in sterilized milk after an incubation period of 6 hours at 30 ° C ' C was determined by titration. The result in percent shows lactic acid Table I. sample controlled, 2nd I 3rd, 4th I 5th I 6th step not infected. .. ... . . 0.51 0.38 0.37 0.35 0.35 I 0.34 infected ... .. .. ...... 0.24 0.32 0.36 0.35 0.35 I 0.34 It can be seen that the acid production of the treated samples was considerably reduced; the susceptibility to infection was reduced after the 3rd stage of treatment and switched off after the 5th stage.

Die sich am Behandlungstage durch Trübemessungen gezeigte erbliche Resistenz gegen Infektion konnte wie gezeigt während der über Nacht erfolgten Rekultivierung aufrechterhalten werden, wie die Messungen der praktisch wichtigen Eigenschaften der Säureproduktion zeigen.The hereditary one shown by turbidity measurements on the day of treatment Resistance to infection could as shown during the overnight recultivation are maintained as are the measurements of the practically important properties show the acid production.

Experiment II Der gleiche Starterstamm wie im Experiment I -wurde in 2% Suspension in Milch ähnlich behandelt unter Verwendung eines anderen Pulsgenerators 'und anderer Elektroden. Die Pulse erstreckten sich über 2 Mikrosekunden und wiesen rechtwinklige Form auf. Die Elektroden bestanden aus Platindrahtgeflecht mit 1 cm2 Fläche und hatten einen Abstand von 0,3 cm. Die Durchbangszext betrug etwa 1/5o Sekunde, und da die Intervalle zwischen den Pulsen 1/sooo Sekunde etwa betrugen, erfolgten beim Durchgang 10 Pulse, jeder mit einer maximalen Aufnahme von 2000 kW/cm3. Die Temperaturerhöhung pro Durchgang betrug 9,5° C.Experiment II The same starter strain as in Experiment I -was treated similarly in 2% suspension in milk using a other pulse generator 'and other electrodes. The pulses extended over 2 microseconds and were rectangular in shape. The electrodes passed Platinum wire mesh with an area of 1 cm2 and a distance of 0.3 cm. The passage text was about 1/50 of a second, and there the intervals between the pulses 1 / sooo of a second were approximately 10 pulses were received during passage, each with a maximum uptake of 2000 kW / cm3. The temperature increase per pass was 9.5 ° C.

Die Anteile nicht lebensfähiger Organismen nach den aufeinanderfolgenden Stufen betrugen: 1. Stufe 25%, 2. Stufe 49%, 4. Stufte 93%, 5. Stufe 95%, 6. Stufe 98,711/o. Nach der 4. und den folgenden Stufen wurden Infektionen vollständig unterdrückt.The proportions of non-viable organisms according to the successive Levels were: 1st level 25%, 2nd level 49%, 4th level 93%, 5th level 95%, 6th level 98.711 / o. After the 4th and subsequent stages, infections were completely suppressed.

Die Ergebnisse der Titration nach einer Rekultivierung über Nacht zeigt die folgende Tabelle II Probe kontrolliert I 1. I 2. I 4. I 5. I 6. Stufe nicht infiziert ....... . 0,43 0,36 0,35 0,36 0.34 0,34 infiziert ............. 0,21 0,23 0,25 0,35 0,34 0,34 Die Behandlung in Milch anstatt Brühe und unter verschiedenen elektrischen Bedingungen war für die Säureproduktion vergleichbar wirksam. Nach drei weiteren Rekultivierungen waren die Titrationsergebni,s.se noch unverändert.The results of the titration after overnight recultivation are shown as follows Table II sample controlled I 1. I 2. I 4. I 5. I 6. step not infected ........ 0.43 0.36 0.35 0.36 0.34 0.34 infected ............. 0.21 0.23 0.25 0.35 0.34 0.34 Treatment in milk instead of broth and under various electrical conditions was similarly effective for acid production. After three further recultivations, the titration results, see below, were still unchanged.

Es kann aus den Experimenten I und II ersehen werden, daß es das Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, eine Mutation zu schaffen und nicht aus einer nichthomogenen Kultur die Glieder auszuwählen, die von Natur aus gegen den Virus resistent sind. Der Starter war ein sehr reiner Stamm, und der Anteil, der die Infektion überlebte, war sehr gering, unter 1 von 1000.It can be seen from Experiments I and II that it is the result of the method according to the invention is to create a mutation and not from one Inhomogeneous culture select the limbs that are inherently resistant to the virus are resistant. The starter was a very pure strain, and the portion that caused the infection survived was very low, below 1 in 1000.

Nach der Behandlung betrugen die noch lebensfähigen Überleber, welche nun gegen die Infektion resistent waren, etwa 10 %., d. h. etwa 1 von 10 der ursprünglichen Bevölkerung. Sie überschreiten wesentlich die Anzahl der ursprünglich natürlich resistenten Organismen, auch wenn keiner der letzteren durch die Behandlung lebensunfähig gemacht wurde. Nach der Behandlung ruft eine Infektion keine unterschiedliche Lebensfähigkeit hervor, was zeigt, daß alle lebensfähigen Überleber mutierten.After treatment, the survivors still viable were, which were now resistant to the infection, about 10%., d. H. about 1 in 10 of the original Population. They significantly exceed the number originally natural resistant organisms, even if none of the latter are rendered viable by treatment have been done. After treatment, infection does not produce a difference in viability showing that all viable survivors mutated.

Experiment III Die im Experiment II beschriebenen Pulse von 2 Mikrosekunden wurden zur Behandlung einer Suspension in Hefe-Dextrose-Brühe verwendet. Die Ergebnisse waren denen in den Experimenten I und II fast gleich.Experiment III The 2 microsecond pulses described in Experiment II were used to treat a suspension in yeast-dextrose broth. The results were almost the same as those in Experiments I and II.

Experiment IV Dauerhaftigkeit des Widerstandes gegen baktenophagen Befall nach Behandlung mit elektrischen Pulsen Ein Säurewecker, der ähnlich wie im Experiment II mit elektrischen Pulsen behandelt wurde, wurde nach 35 Rekultivierungen und wieder nach 69 Rekultivierungen getestet, und es fand sich bei beiden Malen keine Anfälligkeit gegen Infektion. Es ist zu bemerken, daß eine einzelne Rekultur einer Vielzahl Generationen des Säureweckers gleichzusetzen ist. Experiment V Dauer der Widerstandsfähigkeit nach kombinierter thermischer und elektrischer Behandlung Ein Teil des im Experiment IV erwähnten Starters wurde nach der 42. Rekultivierung, nach der er keine Infektionsanfälligkeit zeigte, ein zweites Mal mit Pulsen behandelt, und nach weiteren 26 Rekultivierungen zeigte er noch keine Infektionsanfälligkeit.Experiment IV Persistence of resistance to bacterial phages Infestation after treatment with electrical pulses An acid alarm similar to was treated with electrical pulses in Experiment II, after 35 recultivations and tested again after 69 recultivations, and found both times no susceptibility to infection. It should be noted that a single reculture is to be equated with a multitude of generations of the acid alarm clock. Experiment V duration the resistance after combined thermal and electrical treatment A part of the starter mentioned in Experiment IV was after the 42nd recultivation, after which he showed no susceptibility to infection, treated a second time with pulses, and after a further 26 recultivations he was not yet susceptible to infection.

Obwohl in den vorstehenden Experimenten nur Streptococcus lactis beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, daß viele andere Mikroorganismen unterschiedlichster Art durch das erfindungsgemäße Verfahren mutiert werden können.Although only Streptococcus lactis was described in the previous experiments it goes without saying that there are many other microorganisms of the most varied Kind can be mutated by the method according to the invention.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Method for artificial augmentation hereditary Changes in the properties of microorganisms, characterized in that subjected the organisms to a strong electric shock in a liquid medium are, preferably such that. the entire energy absorption in the medium by the Shock treatment 10 calories per cm3 and the power consumption in the medium 1001-, W per cm3 of medium.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the total energy absorption in the medium by the shock treatment between 20 and 60 calories per cm3.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that that the series of shocks is applied by means of high-voltage current pulses.

4. Procedure according to claim 3, characterized in that the duration of each pulse is between 5 and 50 microseconds and the intervals are preferably between successive ones Pulses between five hundredths and hundredths of a second and preferably the pulses are rectangular.

5. Vetrfahren according to claims = 1 to 4, characterized in that that the strength of the shock is such that at least 10 0 / a, but less than 100%, preferably 90 to 95%, of the organisms are killed.

6. The method according to claims 1 to 5; characterized in that bacteria, fungi imperfecti, yeasts or viruses are used as microorganisms. -7.- device for performing the method according to claims 1 to 6; characterized by a cell through which a liquid medium containing microorganisms can flow and which has a pair of electrodes between which the liquid medium can flow and which is provided with means for supplying high-voltage electrical pulses, preferably with at least 1000 kW per em3 of the medium to be treated. Considered publications: German Patent Nos. 81228, 648 347, 669133, 909 324; "Results of Enzyme Research" by R. Weidenhagen, Leipzig (1950), Vol. 11, pp-458, and Vol. 12, pp. 182 and 183; "Archive for Hygiene and Bacteriology", 1953, B. 137, Issue 2, p. 85.