DE1042179B

DE1042179B - Process for the preparation of antigen-containing vaccines

Info

Publication number: DE1042179B
Application number: DEI13699A
Authority: DE
Inventors: Pierre Raphael Lepine
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1957-07-11
Filing date: 1957-09-10
Publication date: 1958-10-30

Description

Verfahren zur Herstellung antigenhaltiger Impfstoffe Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer hochwirksamer Impfstoffe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Impfstoffe, die dadurch gewonnen werden, daß Stämme ansteckender Viren durch getrennte Behandlung der Viren mit Formaldehyd und ß-Propiolakton entaktiviert werden.Process for the production of antigen-containing vaccines is the subject of Invention is a method for producing new, highly effective vaccines. In particular The present invention relates to vaccines which are obtained by Strains of contagious viruses by treating the viruses separately with formaldehyde and ß-propiolactone are deactivated.

Impfstoffe sind bereits aus einer großen Anzahl ansteckender Viren hergestellt worden. Hierzu gehören nicht nur solche Viren, die auf Menschen ansteckend wirken, sondern auch solche, die bei verschiedenen Arten von Tieren Krankheiten hervorrufen. Im allgeineinen werden die Impfstoffe dadurch hergestellt, daß das Virus entweder in einem lebenden Tier, in befruchteten Eiern oder in verschiedenen Arten von GewebepräparaL-en gezüchtet wird. Darauf wird das Virus abgeschwächt oder abgetötet durch bestimmte Reaktionsmittel oder physikalische Kräfte, die fähig sind, die Wirksamkeit des Organismus zu unterdrücken oder auszuschalten, ohne dabei seine Fähigkeit, bei Verabreichung an ein Tier Schutzstoffe zu bilden. zu verringern. Zu dieser Behandlung der gezüchteten Viren werden Formaldehyd, Ultraviolettbestrahlung, Methanol, Äthylenoxyd, ß-Propiolakton usw. angewendet.Vaccines are already made from a large number of contagious viruses has been manufactured. This includes not only those viruses that are contagious to humans act, but also those that cause diseases in different types of animals cause. In general, the vaccines are made by the Virus either in a live animal, in fertilized eggs, or in various Types of tissue preparations being grown. Then the virus is weakened or killed by certain reactants or physical forces that are capable of suppressing or switching off the effectiveness of the organism without thereby affecting its own Ability to form protective agents when administered to an animal. to reduce. For this treatment of the cultured viruses formaldehyde, ultraviolet radiation, Methanol, ethylene oxide, ß-propiolactone, etc. applied.

In den letzten Jahren sind nach diesen allgemeinen Methoden Impfstoffe unter Anwendung von einem oder mehreren Stämmen des menschlichen Poliomyelitis-Virus hergestellt worden. Zur Inaktivierung des Virus ist Formaldehyd verwendet worden.In recent years these general methods have been used to produce vaccines using one or more strains of the human poliomyelitis virus has been manufactured. Formaldehyde has been used to inactivate the virus.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung verbesserter Poliomyelitis-Impfstoffe durch Behandlung von einem oder mehreren Stämmen des Virus der menschlichen Poliomyelitis mit Formaldehyd während einer Zeitspanne oder unter solchen Bedingungen, daß das Virus nicht vollständig inaktiviert wird, worauf sich eine Behandlung mit ß-Propiolakton unter Anwendung von Bedingungen anschließt, die. für sich keine Inaktivierung des Poliomyelitis-Virus hervorrufen. Der so hergestellte Impfstoff besitzt erhöhte Antigenwirkung gegenüber Impfstoffen, die in der Weise hergestellt worden sind, daß derselbe Stamm oder andere Stämme des Poliomyelitis-Virus mit Formaldehyd allein unterBedingungen behandelt wurden, die die vollständigeAbtötung des Virus zurFolge haben. Die Antigenwirkung des erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffes ist auch der Antigenwirkung eines Impfstoffes, der unter sonst gleichen Bedingungen, aber unter Ausnutzung der entaktivierenden Wirl:ungen des ß-Propiolaktons allein hergestellt wird, deutlich überlegen.The invention relates to a method for producing improved Poliomyelitis vaccines by treating one or more strains of the virus of human polio with formaldehyde for a period of time or under conditions such that the virus is not completely inactivated, which is what followed by treatment with β-propiolactone using conditions which. do not by themselves cause inactivation of the poliomyelitis virus. The one made in this way Vaccine possesses increased antigenic activity over vaccines made in that way that same strain or different strains of poliomyelitis virus have been produced treated with formaldehyde alone under conditions that would kill the whole body of the virus. The antigenic action of the vaccine produced according to the invention is also the antigenic effect of a vaccine, which under otherwise identical conditions, but using the deactivating effects of ß-propiolactone alone is clearly superior.

Die kombinierte Behandlung von Organismen mit Formaldehyd und ß-Propylakton ist auch für die Behandlung anderer Viren, Rickettsien und Bakterien zwecks Antigenbildung zum Gebrauch für Immunisierung oder Diagnose geeignet, z. B. für die Herstellung von Impfstoffen gegen Mumps, Mandelentzündung beim Menschen, Masern, westliche Pferdeencephalomyelitis, östliche Pferdeencephalomyelitis, Grippe, Tollwut, Pocken, Keuchhusten usw. Das hier beschriebene, sich besonders auf die Herstellung des Poliomyelitis-Impfstoffes beziehende Verfahren muß naturgemäß, falls es zur Herstellung anderer Impfstoffe oder diagnostisch wirksamer Präparate aus Mikroorganismen angewendet werden soll, verschiedene Abänderungen erfahren. Da jedoch die Methoden zur Anwesenheitsbestimmung von lebenden Organismen in diesen Präparaten und die Bestimmung der Wirksamkeit der Präparate bekannt sind, ist es möglich, die Kombination von Formaldehyd- und ß-Propiolaktonbehandlung mit einemMindestmaß an durchzuführenden Experimenten auf die Besonderheiten des jeweiligen Mikroorganismusstammes abzustellen. Die Behandlung kann auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden, d. h., die Viren können zuerst mit Lakton und dann mit Formaldehyd behandelt werden. Wie oben erwähnt, wird im folgenden in erster Linie die Herstellung von Poliomyelitis-Impfstoff beschrieben, wobei jedoch beträchtliche Abänderungen dieser Bedingungen zulässig sind. So werden günstigste Ergebnisse dann erzielt, wenn die Dauer der Formaldehyd- und der Propiolaktonbehandlung auf die jeweils angewendete Temperatur abgestellt wird. Bei Anwendung niedrigerer Temperatur ist es gewöhnlich erforderlich, die Behandlungsdauer zu verlängern. Bei Anwendung höherer Temperatur kann dieBehandlungsdauer abgekürzt werden. Natürlich ist es erforderlich, daß die Temperatur 37° G nicht wesentlich übersteigt, damit die wertvollen wirksamen Antigeneigenschaften des Impf- oder Diagnosestoffes nicht durch ungünstige Reaktionen Schaden erleiden. Wird ein Viruspräparat zur Erzielung günstiger Bedingungen für die Behandlung mit ß-Propiolakton 2 Tage bei 37° C mit Formaldehyd behandelt, dann kann bei Anwendung einer Temperatur von 23° C zur Erzielung desselben Gütegrades eine Behandlungsdauer von 3 Tagen erforderlich sein.The combined treatment of organisms with formaldehyde and ß-propylactone is also used to treat other viruses, rickettsiae and bacteria for antigen production suitable for use for immunization or diagnosis, e.g. B. for manufacturing of vaccines against mumps, tonsillitis in humans, measles, western equine encephalomyelitis, Eastern equine encephalomyelitis, flu, rabies, smallpox, whooping cough, etc. That described here, focuses particularly on the manufacture of the poliomyelitis vaccine Obtaining process must, of course, if it is used to manufacture other vaccines or diagnostically effective preparations made from microorganisms are to be used, experience various changes. However, since the methods of presence determination of living organisms in these preparations and the determination of the effectiveness Of the preparations known, it is possible to use the combination of formaldehyde and β-propiolactone treatment with a minimum of experimentation to be performed to adjust the peculiarities of the respective microorganism strain. The treatment can also be carried out in reverse order, i.e. i.e., the viruses can treated first with lactone and then with formaldehyde. As mentioned above, will in the following primarily the manufacture of poliomyelitis vaccine is described, however, substantial changes to these terms and conditions are permitted. Be like that the most favorable results are achieved when the duration of the formaldehyde and propiolactone treatment is set to the temperature used in each case. When using lower Temperature it is usually necessary to extend the treatment time. at The duration of the treatment can be shortened if the temperature is higher. Naturally it is necessary that the temperature is not 37 ° G significantly exceeds thus the valuable effective antigenic properties of the vaccine or diagnostic substance not be harmed by adverse reactions. Will a virus preparation to achieve favorable conditions for treatment with ß-propiolactone 2 days at 37 ° C with Treated formaldehyde, then using a temperature of 23 ° C to achieve of the same quality level, a treatment period of 3 days may be required.

Das Poliomyelitis-Virus wird zur Zeit gewöhnlich auf Zellen von Affennieren gezüchtet. Das vorliegende Verfahren kann aber auch bei Viren oder anderen Organismen angewendet werden, die auf einer großen Anzahl verschiedener Gewebearten oder in lebenden Tieren gezüchtet werden. Diese Verfahren, wie auch Verfahren zur Abtrennung der Organismen von äußeren Gewebe- oder anderen Stoffen, die im fertigen, antigen wirksamen Produkt unerwünscht sind, sind in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. So kann z. B. der Impfstoff gegen die östliche Pferdeencephalomyelitis dadurch gewonnen werden, daß der Organismus in befruchteten Hühnereiern gezüchtet wird. Die infizierten Embryos werden entfernt und in Kochsalzlösung zermahlen. Darauf werden sie mit Formaldehyd und ,B-Propiolakton behandelt, worauf der Impfstoff gewonnen wird. Impfstoff gegen Mumps wird auf die beinah gleiche Weise dadurch hergestellt, da?) die Eier in der Chorioallantoishöhlung mit dem Virus geimpft werden. Nach entsprechender Bebrütungszeit wird das Virus aus der Flüssigkeit abgesondert und dann mit Formaldehyd und Propiolakton behandelt, um den Impfstoff zu erhalten.The poliomyelitis virus is currently commonly found on cells from monkey kidneys bred. The present method can also be used for viruses or other organisms applied to a large number of different types of tissue or in live animals are bred. These methods, as well as methods of separation the organisms of external tissue or other substances that are antigenic in the finished product effective product are undesirable are described in the scientific literature. So z. B. the vaccine against eastern equine encephalomyelitis won thereby that the organism is raised in fertilized hen's eggs. The infected Embryos are removed and ground up in saline. On top of that they will be filled with formaldehyde and, treated B-propiolactone, whereupon the vaccine is obtained. Vaccine against Mumps is made in much the same way by putting the eggs in the Chorioallantoic cavity should be vaccinated with the virus. After the appropriate incubation time the virus is secreted from the fluid and then treated with formaldehyde and propiolactone treated to get the vaccine.

Der Grund der Zusammenwirkung von Formaldehyd und Propiolakton in ihrer Wirkung auf krankheitsbildende Organismen ist nicht bekannt. Es ist möglich, daß die kurze Behandlung mit Formaldehyd im vorliegenden Verfahren in einem Organismus (wie z. B. dem Poliomyelitis-Virus) einige Veränderungen verursacht, ohne dabei das Absterben eines großen Teils der Teilchen zu bewirken und ohne die antigene Wirkung dieser Teilchen stark zu verringern, welche Veränderung das Virus sehr viel empfänglicher gegenüber der abtötenden Wirkungskraft des ß-Propiolaktons, aber weniger stark empfänglich gegenüber dem Verlust an antigener Wirksamkeit werden läßt, die durch die Wirkung des ß-Propiolaktons hervorgerufen wird. Diese Annahme stellt jedoch nur eine Hypothese dar, wobei es noch andere Erklärungen für die ungewöhnliche gemeinsame Einwirkung der beiden Reaktionsträger auf die Organismen geben mag. Auf jeden Fall ist diese ungewöhnliche gemeinsame Einwirkung dadurch sehr vorteilhaft, daß sie die Herstellung von ungewöhnlich wirksamen Impfstoffen gegen die Poliomyelitis sowie von andersartigen Impfstoffen gestattet.The reason for the interaction of formaldehyde and propiolactone in its effect on disease-causing organisms is not known. It is possible, that the brief treatment with formaldehyde in the present process in an organism (such as the poliomyelitis virus) causes some changes without changing causing the death of a large part of the particles and without the antigens Effect of these particles greatly reduce which change the virus very much more susceptible to the killing power of ß-propiolactone, but less makes the caused by the action of ß-propiolactone. This assumption makes however just one hypothesis, there being other explanations for the unusual common May give effect of the two reaction carriers on the organisms. Definitely This unusual joint action is very advantageous in that it the manufacture of unusually effective vaccines against poliomyelitis as well of other types of vaccines.

Ein weiterer Vorteil des vorliegenden Verfahrens besteht darin, daß für die aufeinanderfolgende Behandlung des Virus mit den beiden Reaktionsmitteln insgesamt sehr viel wenigerZeit benötigt, als erforderlich ist, um durch Behandlung eines Stammes desgleichen beim ;Menschen wirksamen Poliomyelitis-Virus mit Formaldehyd allein einen vergleichbaren Grad von Ansteckungsfreiheit zu erreichen.Another advantage of the present method is that for the sequential treatment of the virus with the two reactants overall much less time is required than is required to go through treatment of a strain similar to the poliomyelitis virus with formaldehyde, which is effective in humans to achieve a comparable degree of freedom from contagion alone.

ZwecksHerstellung eines Impfstoffes gegen menschlichePoliomyelitiswerden einer oder mehrereStämme des Virus in einem tierische Zellen als Wirt für den Virus enthaltenden Medium gezüchtet. Zwar können verschiedene Gewebearten für diesen Zweck an,-ewendet werden, neuere Erfahrungen haben jedoch gezeigt. dä.ß die Anwendung von Zellen äug den Nieren bestimmter Affenarten besonders zweckmäßig ist. Hierfür ist es erforderlich, diese Tiere sorgfältig daraufhin zu überwachen, daß sie nicht Träger ansteckender Krankheiten sind, die durch den Impfstoff weiter übertragen werden. Aus Nieren gewonnene Zellenpräparate werden nach in der Literatur bereits beschriebenen Verfahren erhalten.For the purpose of making a vaccine against human poliomyelitis one or more strains of the virus in an animal cell to host the virus containing medium. Although different types of tissue can be used for this purpose can be applied, but recent experience has shown. dä.ß the application of cells to the kidneys of certain species of monkeys is particularly useful. Therefor it is necessary to carefully monitor these animals to see that they are not Carriers of infectious diseases that are passed on through the vaccine will. Cell preparations obtained from kidneys are already used in the literature obtained method described.

Die Nieren werden, nachdem sie vom Fremdgewebe getrennt wurden, fein zerteilt und die Zellen von Blutzellen und verschiedenerlei Geweben durch Waschen der feinzerteilten Präparate mit Salzlösung getrennt, welche Salzlösungen dafür bekannt sind, daß sie die Nierenzellen in gesunder Verfassung erhalten. Die Trennung der Zellen von anderem Gewebe wird oft durch die Anwendung einer verdünnten Lösung des Enzyms Trypsin erleichtert, das in den physiologischen Salzlösungen verwendet wird. Natürlich müssen alle Verfahrensgänge unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, um eine Ansteckung durch fremde Mikroorganismen zu verhindern. Hierbei können verschiedene Antibiotika, wie Penicillin und Streptomycin, in geeigneten Konzentrationen den physiologischen Salzlösungen zugesetzt, dazu beitragen, die Präparate frei von fremden ansteckenden Mikroorganismen zu halten. Die Suspensionen von Zellen von Affennieren können durch Zentrifugieren konzentriert werden, wobei jedoch dafür Sorge zu tragen ist, daß die Zellen nicht durch zu kräftige Behandlung beschädigt werden. Darauf werden die Zellen in geeigneten Konzentrationen in Zuchtflaschen, wie z. B. Roux-Flaschen, in eine physiologische Salzlösung, wie z. B. in Hanks-Medium, gelegt, worauf die Zellen in den Flaschen, deren Inhalt leicht umgerührt wird, unter aseptischen Bedingungen bei etwa 37° C mehrere Tage, vorzugsweise 5 bis 8 Tage, gezüchtet werden. Während dieser Zeit bilden die Zellen eine wachsende Schicht auf der Oberfläche des Flascheninhalts. Darauf wird das Medium sorgfältig aus der durch die Zellen gebildeten Schicht entfernt, die Zellen werden mit einer geeigneten physiologischen Salzlösung gespült, und frische Lösung wird zugesetzt. Darauf werden die Zellen der Affennieren mit einer Kultur des ausgewählten Stammes des Virus der menschlichen Poliomyelitis behandelt.The kidneys become fine after being separated from the foreign tissue and the cells of blood cells and various tissues by washing of the finely divided preparations separated with saline solution, which saline solutions for it are known to keep the kidney cells in healthy condition. The separation The cells of other tissues are often removed by the application of a dilute solution facilitated by the enzyme trypsin, which is used in physiological saline solutions will. Of course, all operations must be carried out under aseptic conditions to prevent infection by foreign microorganisms. Here you can various antibiotics, such as penicillin and streptomycin, in appropriate concentrations Added to the physiological saline solutions help keep the preparations free from to keep foreign infectious microorganisms. The suspensions of cells from Monkey kidneys can be concentrated by centrifugation, however, for this Care must be taken that the cells are not damaged by excessive treatment will. The cells are then placed in appropriate concentrations in cultivation bottles, such as B. Roux bottles, in a physiological saline solution, such as. B. in Hanks medium, placed, whereupon the cells in the flasks, the contents of which are gently stirred, underneath aseptic conditions at about 37 ° C for several days, preferably 5 to 8 days, be bred. During this time the cells form a growing layer the surface of the contents of the bottle. The medium is then carefully selected from the through the cells formed layer removed, the cells are treated with a suitable physiological Saline is flushed and fresh solution is added. Thereupon the cells of the monkey kidneys with a culture of the selected strain of the human virus Poliomyelitis Treated.

Verschiedene Stämme von Poliomyelitis-Viren können für die Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe verwendet werden. Im allgemeinen ist es erwünscht, Stämme der drei verschiedenen Arten der Poliomyelitis einzeln derart zu züchten, daß die so hergestellten einwertigen Impfstoffe in einem dreiwertigen Impfstoff zur Verabreichung an menschliche Patienten vereinigt werden können. Hierzu können die verschiedenen seither hierfür verwendeten Stämme oder frisch isolierte Stämme einer geeigneten Art dienen. Darauf werden die angesteckten Zellen mehrere Tage bei einer Temperatur von etwa 37° C gezüchtet. Um zu bestimmen, ob der Virus genügend Wachstum entwickelt hat, können mit üblichen Verdünnungen des Präparats Versuche hinsichtlich der Ansteckungsfähigkeit desselben durchgeführt werden. Im allgemeinen genügen 3 bis etwa 5 Tage, um ein gutes Wachstum zu gewährleisten. Während der Gesamtdauer der Kultur des Organismus werden die Flaschen in leichter Schwingung gehalten, worauf alle Nierenzellen durch den Virus zerstört sein dürften. Die in den Flaschen enthaltenen Viren können dann artenweise vereinigt werden.Different strains of polio virus can be used for the manufacture of the vaccines according to the invention can be used. In general it is desirable To cultivate strains of the three different types of poliomyelitis individually in such a way that that the monovalent vaccines so produced in a trivalent vaccine can be combined for administration to human patients. You can do this the various strains used since then or freshly isolated strains serve in an appropriate manner. The infected cells are there for several days grown at a temperature of about 37 ° C. To determine if the virus is sufficient As growth has developed, experiments can be carried out with the usual dilutions of the preparation with regard to the contagiousness of the same. In general 3 to about 5 days are sufficient to ensure good growth. During the entire duration the culture of the organism, the bottles are kept vibrating gently, whereupon all kidney cells are likely to have been destroyed by the virus. The ones contained in the bottles Viruses can then be combined in species.

Nach Vereinigung der Inhalte der den Virus enthaltenden Flaschen wird der pg Wert des Gemisches so eingestellt, daß er etwa neutral ist, d. h. auf etwa 6,5 bis etwa 7,0. Zur Entfernung von Bakterien, Zellanhäufungen und anderen großen Teilchen wird das Praparat dann vorzugsweise filtriert. Die Filtration kann dadurch erfolgen, daß der Stoff durch feine Glasfilter, Seitzfilter, Zellulosefilter oder andere geeignete Filter geleitet wird. Diese Verfahrensgänge sind natürlich unter aseptischen Bedingungen durchzuführen.After combining the contents of the bottles containing the virus the pg of the mixture is adjusted to be about neutral; d. H. on about 6.5 to about 7.0. For removing bacteria, cell clusters and other large particles the preparation is then preferably filtered. The filtration can be done by that the substance through fine glass filters, Seitz filters, cellulose filters or other suitable Filter is passed. These operations are of course under aseptic conditions perform.

Darauf ist die filtrierte Lösung zur Behandlung mit Formaldehyd in der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens fertig. Im allgemeinen wird etwa 0,1 bis 0,5 ccm 40o/oiges Formaldehyd (0,04 g je Liter bis 0,2 g je Liter reines Formaldehyd) je Liter Viruslösung verwendet, wobei die Menge in gewissem Maße von der Konzentration des Virus abhängt. Im allgemeinen sollten die Präparate des Poliomyelitis-Virus eine Viruskonzentration von etwa 104 bis 108 Virusteilchen je ccm aufweisen, wie durch Reihenverdünnungen des Präparats bei Züchtung in Rohren oder Flaschen auf Geweben wie z. B. Affennieren bestimmt wurde. Der Ausdruck »Formaldehydlösung« bezieht sich auf den handelsüblichen Stoff, der eine Konzentration von etwa 40 Gewichtsprozent aufweist. Vor Zugabe dieses Stoffes zum Virus kann es empfehlenswert sein, das Formaldehyd mit Wasser zu verdünnen, wobei die Viruslösung während der Zugabe der verdünnten Formaldehydlösung stark zu rühren ist. Für die Entaktivierung des Virus kann eine stärkere Konzentration des Formaldehyds verwendet werden, es ist dies aber nicht unbedingt erforderlich und in der Tat nicht ratsam, da hierdurch die antigene Wirkung stärker als erwünscht herabgesetzt werden kann. Es ist verhältnismäßig leicht, die Konzentration so einzustellen, daß die anfänglich erfolgende Entaktivierung bei begrenztem Verlust an antigener Wirksamkeit und bei größtmöglicher Beibehaltung der wertvollen Eigenschaften des Impfstoffes erreicht wird. Dieser erste Verfahrensschritt bewirkt keine Ansteckungsunfähigkeit des Impfstoffes, wie dies bei den gegenwärtig gewöhnlich zur Herstellung von Impfstoff gegen Poliomyelitis angewendeten Verfahren der Fall ist. Die Formaldehydbehandlung wird bei einer Temperatur von etwa 25 bis zu etwa 40° C, vorzugsweise bei etwa 37° C, durchgeführt. Die Behandlung wird etwa 40 bis 55 Stunden fortgesetzt. Bei industriell angewendeten Verfahren, bei denen Formaldehyd allein für die Behandlung des Poliomyelitis-Virus angewendet wird, wird die Behandlung im allgemeinen wenigstens etwa 5 Tage fortgesetzt, wodurch vollkommene Entaktivierung des Virus gewährleistet wird. Während dieser Zeit erleiden die Präparate starken Verlust an antigener Wirksamkeit.The filtered solution is then ready for treatment with formaldehyde in the first stage of the process according to the invention. In general, about 0.1 to 0.5 cc of 40% formaldehyde (0.04 g per liter to 0.2 g per liter of pure formaldehyde) per liter of virus solution is used, the amount depending to a certain extent on the concentration of the virus . In general, the preparations of the poliomyelitis virus should have a virus concentration of about 104 to 108 virus particles per cc, as determined by serial dilutions of the preparation when grown in tubes or bottles on tissues such. B. monkey kidneys was determined. The term "formaldehyde solution" refers to the commercially available substance, which has a concentration of around 40 percent by weight. Before adding this substance to the virus, it may be advisable to dilute the formaldehyde with water, stirring the virus solution vigorously while adding the diluted formaldehyde solution. A higher concentration of formaldehyde can be used to deactivate the virus, but this is not absolutely necessary and in fact not advisable, since this can reduce the antigenic effect more than is desired. It is relatively easy to adjust the concentration so that the initial deactivation is achieved with limited loss of antigenic activity and with the greatest possible retention of the valuable properties of the vaccine. This first step in the process does not cause the vaccine to become infectious, as is the case with the processes currently commonly used to manufacture vaccine against poliomyelitis. The formaldehyde treatment is carried out at a temperature of about 25 up to about 40 ° C, preferably at about 37 ° C. Treatment continues for about 40 to 55 hours. In industrial processes in which formaldehyde alone is used to treat the poliomyelitis virus, treatment is generally continued for at least about 5 days, thereby ensuring complete inactivation of the virus. During this time the preparations suffer a great loss of antigenic effectiveness.

Die mit Formaldehyd behandelte Viruslösung wird mit einem Bisulfit, wie z. B. der des Natriumbisulfits, behandelt, um auf diese Weise restliches Formaldehyd auszuscheiden, was jedoch, wenn eine niedrigere Konzentration des Formaldehyds innerhalb der oben angegebenen Bedingungen angewendet wird, nicht erforderlich ist. DieMenge des zu verwendenden Bisulfits hängt ab von der Menge des ursprünglich zur Behandlung des Virus eingeführten Formaldehyds. So werden z. B. bei Anwendung von 0,35 ccm 40°/oigem Formaldehyd etwa 0,6 g Natriumbisulfit benötigt. Im allgemeinen ist es ratsam, das Bisulfit in Form einer verdünnten wäßrigen Lösung zu der behandelten Viruslösung zuzugeben und dabei stark zu rühren, um eine gute Berührung zu gewährleisten.The virus solution treated with formaldehyde is treated with a bisulfite, such as B. that of sodium bisulfite, treated to remove residual formaldehyde in this way excrete what, however, if a lower concentration of formaldehyde within of the conditions given above is not required. The amount the bisulfite to be used depends on the amount of the original to be treated formaldehyde introduced by the virus. So z. B. when using 0.35 ccm 40% formaldehyde requires about 0.6 g of sodium bisulfite. In general it is advisable to add the bisulfite in the form of a dilute aqueous solution to the treated Add virus solution, stirring vigorously to ensure good touch.

Darauf wird das Virus mit ß-Propiolakton behandelt. Zu diesem Zweck werden etwa 0;5 bis etwa 1,5 ccm Lakton je Liter Viruslösung verwendet. Da ß-Propiolakton ein sehr stark reagierendes Chemikal darstellt, ist es mit Sorgfalt anzuwenden. Es ist empfehlenswert, obzwar nicht unbedingt erforderlich, das Lakton durch Zugeben in kaltes Wasser unmittelbar vor der Behandlung des Virus zu verdünnen. Darauf wird das in dem eiskalten Wasser befindliche ß-Propiolakton schnell dem Viruspräparat zugegeben. Jede Verzögerung verstärkt die Hydrolyse des Laktons und setzt die Wirksamkeit der Virusbehandlung herab. Während der Zugabe des Laktons wird das Viruspräparat stark gerührt. Durch die Einwirkung des Laktons auf das Virus wird der Säuregehalt der Lösung erhöht. Dies erfolgt im allgemeinen innerhalb einiger Minuten, nachdem das Lakton zugegeben wurde. Ein zuverlässiger Indikator zum Nachweis dieses Vorgangs ist Phenolrot. Der während dieser Verfahrensstufe entwickelte Säuregrad wird vorzugsweise kontinuierlich oder diskontinuierlich neutralisiert, so daß die Lösung etwa neutral gehalten wird. Wird die Reaktion bei der bevorzugten Temperatur von etwa 37° C durchgeführt, dann hört die Säureentwicklung gewöhnlich nach etwa 4 bis 6 Stunden auf. Die Neutralisierung wird mit Alkali, vorzugsweise mit verdünntem Natriumhydroxyd erreicht. Hierauf ist die das entaktivierte Virus enthaltende Lösung gewöhnlich verwendungsbereit. Vorzugsweise läßt man jedoch das Gemisch weitere etwa 10 bis 14 Stunden stehen. Während dieser Zeit wird die Temperatur bei etwa 37° C gehalten. Darauf wird der pH-Wert erneut geprüft und, falls erforderlich, auf etwa Neutralität eingestellt. Der Stoff wird bei einer niedrigen Temperatur, vorzugsweise bei etwa 4° C, gelagert, und verschiedene Versuche werden mit Proben des entaktiv ierten Virus durchgeführt. Insbesondere wird der Stoff daraufhin geprüft, ob die gesamte Virussubstanz abgetötet wurde und ob die gewöhnliche hohe antigene Wirksamkeit beibehalten wurde. Es ist im allgemeinen ratsam, entaktivierte Viren der Typen 1, 2 und 3 jeweils in einem Präparat zu vereinigen, wobei je nach ihrer Wirksamkeit die einzelnen Präparate mengenmäßig etwas schwanken werden. Die verschiedenen Arten werden erst dann vereinigt, wenn die Sicherheits- und Wirksamkeitsprüfungen der einzelnen behandelten Viren abgeschlossen worden sind. Es erweist sich als ratsam, die Lagerung bei niedriger Temperatur vorzunehmen, um die Wirksamkeit des Präparats auf jeden Fall zu gewährleisten. Zum gleichen Zweck können den Präparaten verschiedene Konservierungsmittel zugegeben werden, wie z. B. Phenol, Thiomersal, Benzethonchlorid usw. Diese Stoffe werden, wie in den seitherigen Veröffentlichungen angegeben, in niedriger Konzentration angewendet. Beispiel 1 21 einer Suspension des wirksamen Virus Typ 1 der menschlichen Poliomyelitis, der auf Zellen von Affennieren gezüchtet wurde, wurden durch ein Zellulosefilter, das zuerst mit Hanks-Lösung gewaschen worden war, filtriert. Das Viruspräparat besaß eine Wirksamkeit von etwa 107 virulenten Teilchen je ccm, wie durch Versuch mittels einer Gewebekultur bestimmt wurde. Die Filtration und die anderen folgenden Verfahrensgänge wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt; vor dem Filtrieren wurde das Gemisch auf einen pH-Wert von 6,7 eingestellt. Das filtrierte Gemisch wurde bei 37° C gehalten, und unter Rühren wurden 0,35 ccm handelsübliche 40°/oige Formaldehydlösung, verdünnt in 20 ccm sterilisiertem destilliertem Wasser, zugegeben. Das Gemisch wurde 48 Stunden bei 37° C gehalten. Darauf wurde das Formaldehyd durch Zugabe von 0,61 g Natriumsulfit, gelöst in 10 ccm sterilem destilliertem Wasser, entfernt. Das Gemisch wurde während der Zugabe des Bisulfits gerührt. 1,5 ccm in der Kälte gelagertes f-Propiolakton wurde durch Zugabe zu 10 ccm eiskaltem sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Während der Zugabe wurde das Gemisch gerührt und in einem Eisbad gekühlt. Die Verdünnung wurde sehr schnell durchgeführt und die kalte, verdünnte Lösung >ofort zu der gerührten Virussuspension gegeben. Zwischen dem Beginn der Verdünnung und der Zugabe zu dem Virus sollten weniger als 5 Minuten vert-ehen. Durch Einverleibung einer geringen Menge Phenolrotindikator in das Viruspräparat ließ sich die Entwicklung der Sauerstellung verfolgen. In regelmäßigen Zwischenräumen wird verdünnte Natriumhydroxy dlösung zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes <: an etwa 6,8 bis 7,0 zugegeben. Im allgemeinen werden etwa 5 Stunden zur vollständigen Durchführung der Hydrolyse des Laktons und zur Entwicklung der Sauerstellung benötigt. Abschließend wird die Viruslösung bei 37° C über Nacht gelagert. Darauf ist sie verwendungsfertig für die Immunisierung von Patienten gegen Ansteckung durch Poliomyelitis Typ 1. Bei üblichen Tierversuchen zeigte sie hohe antigene Wirksamkeit (verglichen mit einem der üblichen Impfstoffpräparate), und zwar eine viel stärkere Wirksamkeit als Impfstoffe, die mit Formaldehyd oder ß-Propiolakton allein hergestellt worden waren.The virus is then treated with ß-propiolactone. For this purpose, about 0.5 to about 1.5 cc of lactone per liter of virus solution are used. Since ß-propiolactone is a very strongly reactive chemical, it should be used with care. It is recommended, although not essential, to dilute the lactone by adding it to cold water immediately prior to treating the virus. The ß-propiolactone in the ice-cold water is then quickly added to the virus preparation. Any delay increases the hydrolysis of the lactone and reduces the effectiveness of the virus treatment. The virus preparation is stirred vigorously while the lactone is added. The effect of the lactone on the virus increases the acidity of the solution. This is generally done within a few minutes after the lactone has been added. A reliable indicator to detect this process is phenol red. The degree of acidity developed during this process stage is preferably neutralized continuously or discontinuously so that the solution is kept approximately neutral. When the reaction is carried out at the preferred temperature of about 37 ° C, acid evolution usually ceases in about 4 to 6 hours. Neutralization is achieved with alkali, preferably with dilute sodium hydroxide. The solution containing the deactivated virus is then usually ready for use. Preferably, however, the mixture is allowed to stand for a further 10 to 14 hours. During this time the temperature is maintained at about 37 ° C. The pH is then checked again and, if necessary, adjusted to approximately neutrality. The substance is stored at a low temperature, preferably around 4 ° C, and various tests are carried out on samples of the deactivated virus. In particular, the substance is checked to see whether all of the virus substance has been killed and whether the usual high antigenic activity has been retained. It is generally advisable to combine inactivated viruses of types 1, 2 and 3 in one preparation, although the individual preparations will vary somewhat in terms of quantity depending on their effectiveness. The different types are not combined until the safety and effectiveness tests of the individual treated viruses have been completed. It is advisable to store it at a low temperature in order to guarantee the effectiveness of the preparation. Various preservatives can be added to the preparations for the same purpose, e.g. B. phenol, thiomersal, benzethone chloride, etc. These substances are, as indicated in previous publications, used in low concentrations. Example 1 21 of a suspension of active human poliomyelitis virus type 1 cultured on cells of monkey kidneys was filtered through a cellulose filter which was first washed with Hanks' solution. The virus preparation had a potency of about 107 virulent particles per ccm, as determined by tissue culture experiment. The filtration and the other subsequent operations were carried out under aseptic conditions; the mixture was adjusted to pH 6.7 before filtering. The filtered mixture was kept at 37 ° C., and 0.35 cc of commercially available 40% formaldehyde solution, diluted in 20 cc of sterilized distilled water, was added with stirring. The mixture was held at 37 ° C for 48 hours. The formaldehyde was then removed by adding 0.61 g of sodium sulfite dissolved in 10 cc of sterile distilled water. The mixture was stirred while the bisulfite was added. 1.5 cc of cold stored f-propiolactone was diluted by adding it to 10 cc of ice-cold sterile distilled water. During the addition, the mixture was stirred and cooled in an ice bath. The dilution was carried out very quickly and the cold, diluted solution was added> immediately to the stirred virus suspension. There should be less than 5 minutes between starting the dilution and adding it to the virus. The development of acidity could be followed by incorporating a small amount of phenol red indicator into the virus preparation. Dilute sodium hydroxide solution is added at regular intervals to maintain a pH value of <: around 6.8 to 7.0. In general, it takes about 5 hours for lactone hydrolysis to complete and acidification to develop. Finally, the virus solution is stored at 37 ° C. overnight. It is then ready for use in immunizing patients against poliomyelitis type 1 infection. In conventional animal studies, it has shown high antigenic activity (compared to a common vaccine preparation), much more potent than vaccines made with formaldehyde or ß-propiolactone alone had been made.

Beispiel 2 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei statt eines Virus des Typs 1 besser ein Poliomy elitis-Virus Typ 2 (z. B. Lansing) in ähnlicher Konzentration verwendet wurde. Ein drittes Präparat wurde hergestellt, wobei in gleicher Weise ein Virus vom Typ 3 (z. B. Saukett) verwendet wurde. Aus 3 Volumen Impfstoff Typ 1, 3 Volumen Impfstoff Typ 2 und 3 Volumen Impfstoff Typ 3 wurde ein mehrwertiger Impfstoff hergestellt. Als Konservierungsmittel wurde Benzothonchlorid in einer Konzentration von 1 :50000 zugegeben. Dieses Präparat erwies sich als stark wirksam zur Immunisierung von Patienten gegen Poliomyelitis des Menschen. Der Impfstoff besaß eine sehr starke antigene Wirksamkeit, und die sorgfältige Prüfung der Proben zeigte keine anstekkenden Virusteilchen.Example 2 The procedure of Example 1 was repeated, with instead a type 1 virus better a type 2 poliomyelitis virus (e.g. Lansing) in similar concentration was used. A third preparation was made, similarly a type 3 virus (e.g. Saukett) was used. the end 3 volumes of vaccine type 1, 3 volumes of vaccine type 2 and 3 volumes of vaccine type 3 a multivalent vaccine was made. Benzothone chloride was used as a preservative added in a concentration of 1: 50,000. This preparation turned out to be strong effective in immunizing patients against human poliomyelitis. The vaccine possessed a very strong antigenic activity, and careful examination of the samples showed no infectious virus particles.

Beispiel 3 Das im Beispiel 1 beschriebene Entaktivierungsverfahren wurde unter Verwendung eines Stammes des Adeno-Virus wiederholt. Der so hergestellte Impfstoff ist wertvoll für die Immunisierung gegen Ansteckung der Atmungswege durch Viren.Example 3 The deactivation process described in Example 1 was repeated using a strain of adenovirus. The one made in this way Vaccine is valuable for immunization against respiratory infection by Viruses.

Claims

PAT $ NTUSPRÜGHE: 1. Process for the preparation of antigen-containing Vaccines for immunizing and diagnostic purposes, characterized in that that one is an aqueous, infectious microorganisms and antigens containing preparation treated separately with formaldehyde and ß-propiolactone.

2. The method according to claim 1, characterized in that the formaldehyde treatment before the ß-propiolactone treatment undertakes.

3. The method according to claim 1, characterized in that the aqueous Preparation containing the human poliomyelitis virus as an infectious microorganism.

4. The method according to claim 1, characterized in that the aqueous preparation as infectious microorganism containing human adenovirus.

5. Procedure according to one of the preceding claims, characterized in that there are different types inactivated poliomyelitis viruses combined into one vaccine.