DE1037069B

DE1037069B - Manufacture of the antibiotic E-129

Info

Publication number: DE1037069B
Application number: DEG21290A
Authority: DE
Inventors: Kenneth Arthur Lees; Salt Hill; Jean Whitfield; Stanley Ball; Betty Margaret Dyer; Wooburn Moor; Aileen Marion Mortimer; Winston Kennay Anslow; George Desmond Wilkin
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1956-01-13
Filing date: 1957-01-14
Publication date: 1958-08-21
Also published as: DK91561C; SE171554C1

Description

Herstellung des Antibiotikums E-129 Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibiotikums, insbesondere einer neuen antibiotischen Verbindung oder eines Gemisches von Verbindungen, die bzw. das vorläufig als E-129 bezeichnet wird. E-129 kann unter anderem durch submerse aerobe Gärung eines geeigneten Organismus hergestellt werden.Preparation of Antibiotic E-129 The invention described herein relates to the manufacture of a new antibiotic, especially a new antibiotic Compound or mixture of compounds provisionally designated as E-129 referred to as. E-129 can, among other things, by submerged aerobic fermentation of a suitable Organism.

Das neue Antibiotikum E-129 wurde durch aerobe Züchtung eines neuerdings entdeckten Organismus erhalten, der als zum Genus Streptomyces gehörig identifiziert wurde. Dieser Organismus, der aus einer nahe bei Jericho in Transjordanien gefundenen Bodenprobe isoliert wurde, wird vorläufig als Streptomyces E-129 bezeichnet. Kulturen des Organismus Streptomyces E-129 wurden bei der National of Collection of Industrial Bacteria (N.C.I.B.) beim Department of Scientific and Industrial Research, Teddington, England, zur Aufnahme in diese Sammlung hinterlegt, und der Organismus erhielt die Nr. N.C.I.B. 8792. Der Organismus wurde ferner unter dem Namen Streptomyces ostreogriseus in der Culture Collection der Northern Regional Research Laboratories (N.R.R.L.) in Peoria, I11., USA., hinterlegt und erhielt die Nr. N.R.R.L. 2558.The new antibiotic E-129 was made by aerobic cultivation recently discovered organism that is identified as belonging to the genus Streptomyces became. This organism that was found near Jericho in Transjordan Soil sample isolated is tentatively designated Streptomyces E-129. Cultures of the organism Streptomyces E-129 were registered with the National of Collection of Industrial Bacteria (N.C.I.B.) at the Department of Scientific and Industrial Research, Teddington, England, deposited for inclusion in this collection, and the organism received the No. N.C.I.B. 8792. The organism was also named Streptomyces ostreogriseus in the Culture Collection of Northern Regional Research Laboratories (N.R.R.L.) in Peoria, I11., USA., and received the No. N.R.R.L. 2558.

Die Erfindung soll nun an Hand der folgenden vier Hauptmerkmale beschrieben werden 1. Die Eigenschaften des neuen Antibiotikums E-129, 2. die Eigenschaften des Organismus Streptomyces E-129, 3. Züchtung von Streptomyces E-129 zur Erzeugung von rohem E-129, 4. Isolierung und Reinigung von E-129.The invention will now be described with reference to the following four main features 1. The properties of the new antibiotic E-129, 2. the properties of the organism Streptomyces E-129, 3. Cultivation of Streptomyces E-129 for production of crude E-129, 4. Isolation and purification of E-129.

Es sei besonders darauf hingewiesen, daß zwar die im folgenden angegebenen Daten die neuesten und zuverlässigsten der zur Zeit zur Verfügung stehenden darstellen, daß sie jedoch im Verlaufe weiterer Entwicklungen Abweichungen erfahren können.It should be particularly noted that although the following specified Data represent the latest and most reliable of those currently available, that they may, however, experience deviations in the course of further developments.

1. Die Eigenschaften von E-129 Das neue Antibiotikum E-129 ist eine neutrale Substanz, die unter normalen Temperaturen und in Abwesenheit von hellem Licht innerhalb eines weiten pg-Wertbereichs vergleichsweise stabil ist. Sie ist in vielen organischen Lösungsmitteln ziemlich löslich, in Wasser und Kohlenwasserstofflösungsmitteln jedoch weniger löslich. E-129 weist im ultravioletten Bereich keine bedeutenden Absorptionen auf und zeigt nur eine Endabsorption, besitzt jedoch ein wohldefiniertes und eindeutiges Absorptionsspektrum im Ultrarot. E-129 weist ein weites Spektrum antibakterieller Aktivität auf. Es wirkt hauptsächlich gegen grampositive Organismen, zeigt jedoch auch eine gewisse Wirksamkeit gegen einige gramnegative Organismen. Es besitzt eine sehr geringe Toxizität, und seine Aktivität in vivo stimmt mit seiner Aktivität in vitro gut überein. Beim Vergleich des neuen Antibiotikums mit bekannten Antibiotika wurde eine gewisse allgemeine Ähnlichkeit mit Erythromycin festgestellt, von dem es jedoch leicht, hauptsächlich durch seine neutrale Reaktion und durch sein Infrarotspektrum, unterschieden werden kann.1. The properties of E-129 The new antibiotic E-129 is one neutral substance that under normal temperatures and in the absence of bright Light is comparatively stable within a wide pg value range. she is Quite soluble in many organic solvents, in water and hydrocarbon solvents but less soluble. E-129 has no significant in the ultraviolet range Absorptions and shows only one end absorption, but has a well-defined one and clear absorption spectrum in the ultrared. E-129 has a wide spectrum antibacterial activity. It works mainly against gram-positive organisms, however, it also shows some effectiveness against some gram-negative organisms. It has very low toxicity and its in vivo activity is consistent with it Activity in vitro well matched. When comparing the new antibiotic with known ones Some general resemblance to erythromycin has been found for antibiotics, of which it is easy, however, mainly by its neutral reaction and by its infrared spectrum, can be distinguished.

E-129 besitzt jedoch eine deutliche Ähnlichkeit mit dem Antibiotikum Streptogramin, das von Charney und Mitarbeitern in Antibiotics Annual,1953/54, S. 171 bis 173, und in der südafrikanischen Patentanmeldung Nr. 3927/54 beschrieben ist. Es erscheint möglich, daß E-129 ein komplexes Gemisch von Substanzen darstellt, von denen einige, jedoch nicht alle und nicht in den gleichen Mengenverhältnissen, auch im Streptogramin vorliegen. Insbesondere wird angenommen, daß E-129 einen Faktor enthält, der im Streptogramin, wie es von Charney und Mitarbeitern beschrieben wurde, nicht vorhanden ist und dem wesentliche Eigenschaften zuzuschreiben sind.However, E-129 has a clear similarity to the antibiotic Streptogramin, published by Charney and coworkers in Antibiotics Annual, 1953/54, p. 171-173, and described in South African Patent Application No. 3927/54 is. It seems possible that E-129 is a complex mixture of substances of which some, but not all and not in the same proportions, are also present in streptogramin. In particular, it is believed that E-129 a Contains factor that is found in streptogramin as described by Charney and coworkers does not exist and to which essential properties can be attributed.

E-129 kann von Streptogramin durch eine Reihe physikalischer Kennzahlen, einschließlich und besonders durch sein Infrarotspektrum und seine Wasserlöslichkeit unterschieden «erden. E-129 ist als Antibiotikum wirksamer als Streptogramin, was durch physiologische Teste, z. B. durch Versuche an Mäusen gezeigt wird.E-129 can be derived from streptogramin through a number of physical indicators, including and especially by its infrared spectrum and its water solubility differentiated «earth. E-129 is more effective than streptogramin as an antibiotic, what by physiological tests, e.g. B. is shown by experiments on mice.

Im folgenden soll auf die obenerwähnten Eigenschaften näher eingegangen werden: a) Eines der am stärksten charakteristischen Merkmale von E-129 ist seine chemische Neutralität, die überdies nicht darauf zurückzuführen ist, daß es amphoterer Natur ist. Soweit bisher bekannt, bildet E-129 weder mit Säuren noch mit Alkalien Salze, wodurch sich auch gewisse Schwierigkeiten bei der Extraktion und Reinigung des Antibiotikums aus Lösungen, die es in roher Form enthalten, ergeben. Streptogramin ist jedoch ebenfalls ein neutrales Material.The above-mentioned properties will be discussed in more detail below be: a) One of the most distinctive features of E-129 is its chemical neutrality which, moreover, is not due to the fact that it is amphoteric Nature is. As far as is known, E-129 does not form either with acids or with alkalis Salts, which also creates certain difficulties in extraction and purification of the antibiotic from solutions containing it in raw form. Streptogramin however, it is also a neutral material.

b) E-129 erwies sich als bei Zimmertemperatur innerhalb eines pH-Bereichs von 2 bis 10 vergleichsweise stabil; im Verlauf von 45 Minuten verliert es bei Zimmertemperatur nicht mehr als die Hälfte seiner Aktivität bei extremen pH-Werten. Seine Stabilität nimmt mit steigender Temperatur ab, und im allgemeinen ist es wohl bei p$ 7 am stabilsten. Es ist gewöhnlich unter alkalischen Bedingungen am wenigsten stabil. Diese Eigenschaften werden durch die in der folgendenTabelle wiedergegebenen Ergebnisse erläutert, die dadurch erhalten wurden, daß man Anteile filtrierter, E-129 enthaltender Nährflüssigkeit mit einem Gehalt von 100 Einh./ml verschieden lange Zeitspannen bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen hielt. Die »Einheit.. von E-129 ist auf die Aktivität einer willkürlich ausgewählten Zubereitung bezogen. Die Ergebnisse werden in den gleichen willkürlichen Einheiten/ml angegeben. Tabelle I Temperatur Zeit PH ° C Minuten 2 7 10 20 45 95 88 52 60 30 74 105 Spur Es sei darauf hingewiesen, daß Streptogramin bekanntlich bei der Behandlung mit Alkali bei einem pH-Wert von etwa 9,5 in Lösung geht und danach rasch inaktiviert wird.b) E-129 was found to be relatively stable at room temperature within a pH range of 2 to 10; in 45 minutes at room temperature it loses no more than half of its activity at extreme pH values. Its stability decreases with increasing temperature, and in general it is probably most stable at p $ 7. It is usually the least stable under alkaline conditions. These properties are illustrated by the results given in the following table, which were obtained by maintaining portions of filtered nutrient liquid containing E-129 with a content of 100 units / ml for different periods of time at different pH values and temperatures. The "unit .." of E-129 is related to the activity of an arbitrarily selected preparation. The results are reported in the same arbitrary units / ml. Table I. Temperature time PH ° C Minutes 2 7 10 20th 45 95 88 52 60 30 74 105 track It should be noted that streptogramin is known to go into solution on treatment with alkali at a pH of about 9.5 and is then rapidly inactivated.

c) Das Antibiotikum E-129 ist in Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton, Methylisobutylketon, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester, Essigsäureamylester, Chloroform und Benzol stark löslich. Es ist weniger löslich in Äther und Wasser und unlöslich in Petroläther. Außerdem ist es in Wasser wenigstens doppelt so löslich wie Streptogramin (d. h., es hat eine Löslichkeit in Wasser von wenigstens 0,2 mg/ml bei 20° C). Bisher isolierte Festsubstanzen zeigen variierende Schmelzpunkte zwischen 121 und 134'C und ergeben bei der Elementaranalyse etwa folgende Werte: C 640/0, H 71)/0, Stickstoff 80/,. Streptogramin hat einen Schmelzpunkt von etwa 155°C und liefert bei der Elementaranalyse folgende Werte: Kohlenstoff 62,250/(), Wasserstoff 6,620/0, Stickstoff 8,42 d) Lösungen von E-129 in Äthanol zeigen kein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum, sondern 1ediglich eine Ultraviolettendabsorption. E-129 besitzt jedoch ein charakteristisches Infrarotspektrum, wie dies aus den Zeichnungen ersichtlich ist.c) The antibiotic E-129 is in methanol, ethanol, butanol, acetone, Methyl isobutyl ketone, ethyl acetate, butyl acetate, amyl acetate, Chloroform and benzene highly soluble. It is less soluble in ether and water and insoluble in petroleum ether. In addition, it is at least twice as soluble in water such as streptogramin (i.e. it has a solubility in water of at least 0.2 mg / ml at 20 ° C). So far isolated solid substances show varying melting points between 121 and 134'C and result in the following values in the elemental analysis: C 640/0, H 71) / 0, nitrogen 80 / ,. Streptogramin has a melting point of about 155 ° C and provides the following values in elemental analysis: carbon 62.250 / (), hydrogen 6.620 / 0, nitrogen 8.42 d) Solutions of E-129 in ethanol show no characteristic Ultraviolet absorption spectrum, but only one ultraviolet absorption. However, E-129 has a characteristic infrared spectrum as shown in the drawings can be seen.

Wie der Fig. 1 entnommen werden kann, besitzt eine 1,0°/jge Chloroformlösung von E-129 charakteristische Absorptionsbanden bei 1728 cm-' (2,99#L), 1670 cm-' (5,99 #t), 1623 cm -1 (6,16 #t), 1595 cm -1 (6,27 u,), 1420 cm-' (7,04 u.), 1360 cm-' (7,35 u.), 1340 cm-1 (7,46 u), 1306 cm-' (7,66 u.), 1148 cm-' (8,71 u.), 1104 cm-' (9,06u,) und 958 cm-' (10,44u.). Außerdem zeigt es charakteristische Banden bei 3350 cm-' (2,99 u.), 996 cm-1 (10,04 u,) und 880 cm-' (11,36 u,). Nach der Beschreibung in Antibiotics Annual (a. a. O.) und in der genannten südafrikanischen Patentanmeldung weist Streptogramin Absorptionsbanden bei folgenden Werten auf: 3,05, 3,43, 3,54, 5,80, 6,02, 6,17, 6,23, 6,35, 6,46, 6,58, 6,94, 7,03, 7,32, 7,46, 7,64, 7,72, 7,96, 8,09, 8,20, 8,44, 8,61, 8,94, 9,45, 9,65, 9,78,10,15,10,26,10,60,10,80,10,98,11,29,11,50, 11,78, 12,28, 12,68, 13,0, 13,23, 13,40 und 14,35 #t. Eine Überprüfung des der genannten südafrikanischen Patentanmeldung beigefügten Absorptionsdiagramms ergibt jedoch, daß die obige Aufzählung zu ausführlich ist, da viele dieser Banden tatsächlich kaum erkennbar sind. In der Praxis scheinen die charakteristischen Absorptionsbanden für Streptogramin bei folgenden Werten zu liegen 3,05, 3,43, 3,54, 5,80, 6,02, 6,17 6,23, 6,35, 6,46, 6,58, 6,94, 7,03, 7,32, 7,46, 7,64, 7,72, 7,96, 8,20, 8,44, 8,61, 8,91, 9,45, 9,65, 9,78, 10,15, 10,26, 11,29, 13,25, 13,40 und 14,35 u..As can be seen from FIG. 1, it has a 1.0% chloroform solution absorption bands characteristic of E-129 at 1728 cm- '(2.99 # L), 1670 cm-' (5.99 #t), 1623 cm -1 (6.16 #t), 1595 cm -1 (6.27 u,), 1420 cm- '(7.04 u), 1360 cm- '(7.35 u.), 1340 cm-1 (7.46 u), 1306 cm-' (7.66 u.), 1148 cm- '(8.71 u.), 1104 cm- '(9.06u,) and 958 cm-' (10.44u.). It also shows characteristic bands at 3350 cm- '(2.99 u.), 996 cm-1 (10.04 u,) and 880 cm-' (11.36 u,). According to the description in Antibiotics Annual (op. cit.) and in said South African patent application shows streptogramin absorption bands at the following values: 3.05, 3.43, 3.54, 5.80, 6.02, 6.17, 6.23, 6.35, 6.46, 6.58, 6.94, 7.03, 7.32, 7.46, 7.64, 7, 72, 7.96, 8.09, 8.20, 8.44, 8.61, 8.94, 9.45, 9.65, 9.78,10,15,10,26,10,60,10,80,10, 98,11,29,11.50, 11.78, 12.28, 12.68, 13.0, 13.23, 13.40 and 14.35 #t. A review of the said South African patent application attached absorption diagram shows, however, that the above list is too extensive, as many of these gangs are in fact are hardly recognizable. In practice the characteristic absorption bands appear for streptogramin the following values are 3.05, 3.43, 3.54, 5.80, 6.02, 6.17 6.23, 6.35, 6.46, 6.58, 6.94, 7.03, 7.32, 7.46, 7.64, 7.72, 7.96, 8.20, 8, 44, 8.61, 8.91, 9.45, 9.65, 9.78, 10.15, 10.26, 11.29, 13.25, 13.40 and 14.35 and ...

Wie ersichtlich, entsprechen diese Absorptionsbanden in ihrer Lage etwa denjenigen von E-129, unterscheiden sich jedoch in einigen Fällen ausgeprägt und deutlich in der Intensität. So unterscheidet sich das Spektrum von E-129 in Nujolaufschlämmung (schweres Mineralöl) von dem des Streptogramins dadurch, daß es eine stärkere Absorption bei 810 cm-' (12,35 u.) und 1058 cm-' (9,45 #t) aufweist, während andererseits Streptogramin eine beträchtlich stärkere Absorption bei 1022 cm-' (9,78 u.) und 1575 cm -1 (6,35 u.) zeigt. Diese Unterschiede im Infrarotspektrum sind, obzwar auffallend, verhältnismäßig klein, was eine große Ähnlichkeit in der chemischen Struktur zwischen E-129 und Streptogramin vermuten läßt. Diese Unterschiede weisen jedoch auf einige strukturelle Verschiedenheiten zwischen E-129 und Streptogramin hin, die sich auch in den anderen zwischen diesen beiden Substanzen festgestellten physikalischen und physiologischen Unterschieden wiederspiegeln. Es ist beispielsweise auffallend, daß die relativen Intensitäten der verschiedenen Banden im Infrarotspektrum von E-129 von den relativen Intensitäten der Banden im Infrarotspektrum des Streptogramins verschieden sind.As can be seen, these absorption bands correspond in their position such as those of E-129, but differ markedly in some cases and clear in intensity. So the spectrum of E-129 differs in Nujol slurry (heavy mineral oil) of that of streptogramins in that it has a stronger absorption at 810 cm- '(12.35 u.) and 1058 cm-' (9.45 #t), while on the other hand streptogramin had a considerably stronger absorption at 1022 cm- '(9.78 u.) and 1575 cm -1 (6.35 u.). These differences in the infrared spectrum are, although striking, relatively small, which shows a great resemblance in the chemical structure between E-129 and streptogramin suggests. Those differences however, point to some structural differences between E-129 and streptogramin which were also found in the other between these two substances reflect physical and physiological differences. It is for example it is striking that the relative intensities of the various bands in the infrared spectrum of E-129 on the relative intensities of the bands in the infrared spectrum of the streptogramin are different.

Das in der genannten südafrikanischen Patentanmeldung beschriebene Infrarotspektrum des Streptogramins wurde mit einer Nujolaufschlämmung des Materials ausgemessen. Diese Methode ist zwar nicht so gut wie mit echten Lösungen durchgeführte Messungen, da es jedoch von Bedeutung ist, E-129 und Streptogramin voneinander zu unterscheiden, wurde das Infrarotspektrum von E-129 ebenfalls unter Verwendung einer NujolaufschIämmung des Antibiotikums ermittelt. Dieses Spektrum ist in Fig. 2 wiedergegeben. Wie oben erwähnt, liegen die hauptsächlichen Unterscheidungsmerkmale zwischen dem Infrarotspektrum von E-129 und dem von Streptogramin in den relativen Intensitäten der verschiedenen Absorptionsbanden; diese Unterschiede werden am besten an Hand der folgenden Tabelle erläutert, in der die angegebenen Zahlen diejenigen eines Spektrums sind, das mit einer Nujolaufschlämmung des jeweiligen Materials erhalten wurde. Relative Intensitäten E-129 Strepto- gramin 1 810/1 1022 . . . . . . . . . . . . . . . . > 0,5 etwa 0,4 I 8101 1575 . . . . . . . . . . . . . . . . > 0,4 etwa 0,3 1 1058!I 1022 . . . . . . . . . . . . . . . > 0,95 etwa 0,9 I 1058/I 1575 . . . . . . . . . . . . . . . > 0,7 etwa 0,6 e) E-129 zeigt eine in gewisser Hinsicht enge Verwandtschaft in der antibiotischen Wirkung mit Erythromycin. Es kann jedoch auf verschiedenen Wegen leicht von Erythromycin unterschieden werden. Erstens, Erythromycin ist in chemischer Hinsicht eine basische Substanz, während E-129 neutral ist. Zweitens, sein Infrarotspektrum, wie es beschrieben wurde, unterscheidet sich grundsätzlich von dem des Erythromycins. Drittens, das antibakterielle Spektrum von E-129 unterscheidet sich deutlich von dem des Erythromycins. Ferner ist bekannt, daß beim Vermischen von Erythromycin in wäßriger Lösung mit 2 n-Schwefelsäure und 30minütigem Stehenlassen die erhaltene Lösung ein scharfes Absorptionsmaximum bei 485 m#t aufweist (vgl. Ford und Mitarbeiter, Analytical Chemistry, 1953, Bd.25 (8), S. 1195). Unter diesen Bedingungen tritt bei E-129 bei 485 m#t kein scharfes Absorptionsmaximum auf.The infrared spectrum of the streptogramin described in the above-mentioned South African patent application was measured with a Nujol slurry of the material. While this method is not as good as measurements made with real solutions, since it is important to distinguish E-129 and streptogramin from one another, the infrared spectrum of E-129 was also determined using a Nujol slurry of the antibiotic. This spectrum is shown in FIG. As mentioned above, the main distinguishing features between the infrared spectrum of E-129 and that of streptogramin lie in the relative intensities of the various absorption bands; these differences are best illustrated with reference to the following table in which the numbers given are those of a spectrum obtained with a Nujol slurry of the particular material. Relative intensities E-129 Strepto- grim 1 810/1 1022. . . . . . . . . . . . . . . . > 0.5 about 0.4 I 8101 1575. . . . . . . . . . . . . . . . > 0.4 about 0.3 1 1058! I 1022. . . . . . . . . . . . . . . > 0.95 about 0.9 I 1058 / I 1575. . . . . . . . . . . . . . . > 0.7 about 0.6 e) E-129 shows a close relationship in some respects to erythromycin in its antibiotic effect. However, it can be easily distinguished from erythromycin in a number of ways. First, erythromycin is chemically basic while E-129 is neutral. Second, its infrared spectrum, as described, is fundamentally different from that of erythromycin. Third, the antibacterial spectrum of E-129 is very different from that of erythromycin. It is also known that when erythromycin is mixed in aqueous solution with 2N sulfuric acid and left to stand for 30 minutes, the resulting solution has a sharp absorption maximum at 485 m # t (cf. Ford and coworkers, Analytical Chemistry, 1953, Vol. 25 (8)) , P. 1195). Under these conditions, there is no sharp absorption maximum for E-129 at 485 m # t.

Die qualitativen Unterschiede in den mikrobiologischen Spektren sind zum Teil auffallend, jedoch weniger aufschlußreich als der quantitative Vergleich. Die quantitative Unterscheidung kann an Hand der Schwankung zwischen den relativen antibakteriellen Aktivitäten von E-129 und Erythromycin gegenüber mehreren verschiedenen Organismen gezeigt werden. Diese Schwankung in der relativen Aktivität wird unten erläutert, wobei die Ergebnisse folgendermaßen erhalten wurden: Nähragarplatten wurden mit drei verschiedenen Organismen beimpft, und Lösungen von E-129 und Erythromycin wurden im gleichen Konzentrationsverhältnis auf jede Platte aufgebracht (im Fall eines der Testorganismen, nämlich Sarcina lutea, wurden jedoch die absoluten Konzentrationen auf Grund seiner größeren Empfindlichkeit herabgesetzt). Die Aktivität der Lösungen jedes der beiden Antibiotika gegenüber dem Testorganismus wird als Durchmesser der entstandenen Inhibitionszone angegeben. Aus diesen Ergebnissen werden angenäherte Werte für die Aktivität von E-129 gegenüber dem jeweiligen Testorganismus als Aktivität von Erythromycin gegenüber diesem Organismus berechnet und als p,g/ml Erythromycin angegeben. Tabelle II Durchmesser der Inhibitionszone Aktivität von Testorganismus in mm E-129 (angege- ben als #tg/ml Erythro- E-129 Erythromycin) mycin Sarcina Lutea. . (a) 19,0 15,9 20 (b) 16,7 12,8 Staphylococcus.. (a) 20,5 20,2 40 aureus .........(b) 18,6 17,7 Micrococcus .... (a) 21,6 25,9 150 flavus . . . . . . . . . . (b) 18,9 23,1 Es ist offensichtlich, daß die in der obigen Tabelle für die E-129-Aktivität als Erythromycin angegebenen absoluten Werte nicht von Bedeutung sind. Das aus der Tabelle zu entnehmende auffallende Ergebnis ist die 7fache Steigerung der Aktivität von E-129 im Verhältnis zu Erythromycin zwischen Sarcina lutea und Mikrococcus flavus, die eine Unterscheidung zwischen den beiden Antibiotika ergibt.Some of the qualitative differences in the microbiological spectra are striking, but less informative than the quantitative comparison. The quantitative distinction can be demonstrated by the variation between the relative antibacterial activities of E-129 and erythromycin against several different organisms. This variation in relative activity is explained below, the results being obtained as follows: Nutrient agar plates were inoculated with three different organisms, and solutions of E-129 and erythromycin were applied to each plate in the same concentration ratio (in the case of one of the test organisms, namely Sarcina lutea, but the absolute concentrations have been reduced due to its greater sensitivity). The activity of the solutions of each of the two antibiotics against the test organism is given as the diameter of the resulting zone of inhibition. From these results, approximate values for the activity of E-129 against the respective test organism are calculated as the activity of erythromycin against this organism and given as p, g / ml erythromycin. Table II Diameter of Zone of inhibition activity of Test organism in mm E-129 (indicated ben as # tg / ml Erythro- E-129 erythromycin) my cin Sarcina Lutea. . (a) 19.0 15.9 20 (b) 16.7 12.8 Staphylococcus .. (a) 20.5 20.2 40 aureus ......... (b) 18.6 17.7 Micrococcus .... (a) 21.6 25.9 150 flavus. . . . . . . . . . (b) 18.9 23.1 It is evident that the absolute values given in the above table for the E-129 activity as erythromycin are not important. The striking result that can be seen in the table is the 7-fold increase in the activity of E-129 in relation to erythromycin between Sarcina lutea and Mikrococcus flavus, which differentiates between the two antibiotics.

f) In der folgenden Tabelle wird das mikrobiologische Spektrum des Antibiotikums E-129 wiedergegeben: Tabelle III Mikrobiologisches Spektrum des Antibiotikums E-129 Minimum der In- hibitionskonzen- tration einer teil- weise gereinigten Festsubstanz in #tg/ml Corynebacterium diphtheriae gravis . . 0,01 a. d. Sarcina lutea ..................... 0,01 aal. Mikrococcus flavus ................ 0,03 aal. Staphylococcus aureus (C. 186) ...... 0,3 a. d. " " (663) . . . . . . . . 0,5 b. d. Staphylococcus pyogenes (3010) ..... 0,2 a. d. " (3030) ..... 0,2 a. d. " (3102) ..... 0,2 a. d. " (3035) ..... 0,2 a. d. " (3099) ..... 0,4 a. d. " (3106) ..... 0,4 a. d. Staphylococcus aureus (Terramycin-re- sistent) ......................... 0,4 aal. Staphylococcus aureus (Streptomycin- resistent) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3 a. 1. Staphylococcus aureus27144 (Penicillin- resistent) ..... ................. 0,5 b. d. Staphylococcus aureus27156 (Penicillin- resistent) ....................... 0,25 b. d. Staphylococcusaureus27024 (Penicillin- resistent) ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 b. d. Staphylococcus aureus20424 (Penicillin- resistent)........................ 1,0 b. d. Staphylococcus aureus 18232 (Penicillin- resistent) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 b. d. Staphylococcus aureus 18233 (Penicillin- resistent) ............. ......... 0,5 b. d. Staphylococcusaureus17512(Penicillin- resistent) ....................... 0,5 b. d. Staphylococcus aureus20413 (Penicillin- resistent) ....................... 0,25 b. d. Staphylococcus aureus 3010 (Erythro- mycin-resistent) . . . . . . . . . . . . . . 185,0 a. d. Streptococcus haemolyticus (GruppeA) 0,4 a. d. " (GruppeD) 4,0 2. d. Staphylococcus albus............... 0,9 aal. Streptococcus Faecalis ............. 0,9 aal. Shigella dysenteriae (Flexner) ....... 110 a. d. Escherichia coli ................... 320 aal. Salmonella typi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 a. d. Salmonella typhimurium . . . . . . . . . . . . > 30,0 a. d. Pseudomonas pyocyanea . . . . . . . . . . . > 30,0 a. d. Proteus vulgaris................... > 30,0 aal. Clostridium welchii................. > 30,0 a. d. In der obigen Tabelle bedeuten: a. d. Agarverdünnungsteste, die in 10 °/o Blut enthaltendem Nähragar, der 24 Stunden bei 37° C bebrütet wurde, durchgeführt wurden.f) The following table shows the microbiological spectrum of the antibiotic E-129: Table III Microbiological spectrum of the antibiotic E-129 Minimum of in- hibitionsconzen- tration of a partial wisely cleaned Solids in #t g / ml Corynebacterium diphtheriae gravis. . 0.01 ad Sarcina lutea ..................... 0.01 eel. Micrococcus flavus ................ 0.03 eel. Staphylococcus aureus (C. 186) ...... 0.3 ad "" (663). . . . . . . . 0.5 bd Staphylococcus pyogenes (3010) ..... 0.2 ad "(3030) ..... 0.2 ad "(3102) ..... 0.2 ad "(3035) ..... 0.2 ad "(3099) ..... 0.4 ad "(3106) ..... 0.4 ad Staphylococcus aureus (Terramycin-re- persistent) ......................... 0.4 eel. Staphylococcus aureus (streptomycin resistant). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.3 a. 1. Staphylococcus aureus27144 (penicillin resistant) ..... ................. 0.5 bd Staphylococcus aureus27156 (penicillin resistant) ....................... 0.25 bd Staphylococcus aureus27024 (penicillin resistant) ...... . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.25 bd Staphylococcus aureus20424 (penicillin resistant) ........................ 1.0 bd Staphylococcus aureus 18232 (penicillin resistant). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.25 bd Staphylococcus aureus 18233 (penicillin resistant) ............. ......... 0.5 bd Staphylococcus aureus 17512 (penicillin resistant) ....................... 0.5 bd Staphylococcus aureus20413 (penicillin resistant) ....................... 0.25 bd Staphylococcus aureus 3010 (erythro- mycin-resistant). . . . . . . . . . . . . . 185.0 ad Streptococcus haemolyticus (group A) 0.4 ad "(GroupD) 4.0 2. d. Staphylococcus albus ............... 0.9 eel. Streptococcus faecalis ............. 0.9 eel. Shigella dysenteriae (Flexner) ....... 110 ad Escherichia coli ................... 320 eel. Salmonella typi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 ad Salmonella typhimurium. . . . . . . . . . . . > 30.0 ad Pseudomonas pyocyanea. . . . . . . . . . . > 30.0 ad Proteus vulgaris ...................> 30.0 eel. Clostridium welchii ................. > 30.0 ad In the table above: ad agar dilution tests which were carried out in nutrient agar containing 10% blood and incubated at 37 ° C. for 24 hours.

b. d. Nährflüssigkeitsverdünnungsteste, 24 Stunden bei 37° C bebrütet.b. d. Nutrient dilution test, incubated for 24 hours at 37 ° C.

g) Die Aktivität von E-129 gegenüber verschiedenen Organismen, insbesondere S. aureus, in vitro wird durch die Gegenwart von Gesamtblut in dem Testmedium nicht merkbar beeinträchtigt; eine etwas geringere Aktivität kann möglicherweise durch das kräftigere Wachstum des Testorganismus in dem bluthaltigen, in höherem Maße nährenden Medium erklärt werden, obzwar E-129 in Gegenwart von Gesamtblut etwas weniger stabil ist als in einfachen bakteriologischen Medien.g) The activity of E-129 against various organisms, in particular S. aureus, in vitro, is produced by the Presence of whole blood in the Test medium not noticeably impaired; a little less activity may be possible by the more vigorous growth of the test organism in the blood-containing, in higher one Degree of nourishing medium can be explained, although E-129 is somewhat in the presence of whole blood is less stable than in simple bacteriological media.

Die Wirksamkeit von E-129 in vivo wird aus mit Mäusen durchgeführten Versuchen ersichtlich, bei denen folgende Ergebnisse erhalten wurden: Tabelle IVa Behandlung mit E-129 Zahl der nach der Testorganismus Infektion bis zum Art Dosis 7. Tag überleben- der An- (Ein- den Mäuse Wendung heiten) 4 I Staphylococcus Isubcutan 4 200 4/4 aureus (Stamm 663) 2100 4/4 Infektionsdosis 1050 3/4 1000.106 525 0/4 Organismen 260 0/4 oral 8400 4/4 " 4200 14 " I 2100 0/4 " 1050 0/4 " 525 0/4 unbehandelte Kontrollen 0/4 Streptococcus subcutan; 4200 4/4 haemolyticus 2100 414 (Stamm 618) 1050 4/4 Infektionsdosis 525 4;'4 25. 10s Organismen 260 1/4 oral 8400 6/6 " 4200 5/6 " 2100 4/6 " 1050 3/6 " 525 06 260 0/6 unbehandelte Kontrollen 0!4 Pneumococcus Typ 1 subcutan; 3 000 4/4 (Stamm 245 E) 1500 4/4 Infektionsdosis 750 3/4 10.10s Organismen 375 0/4 " 180 0/4 unbehandelte Kontrollen 0/4 MitE-129behandelte, subcutan! 4 200 4/4 nicht infizierte " . j 2 100 4/4 Kontrollen oral 4 200 4/4 " 2100 4/4 Bt r den vorstehend beschriebenen Versuchen wurde die Lifektionsdosis durch intraperitoneale Injektion verabreicht, und die Behandlung erfolgte mit einer wäßrigen Suspension des Antibiotikums, wobei jede Dosis 0,2 ml betrug. Die erste Dosis wurde 30 Minuten nach der Infektionsdosis gegeben, woran sich dann drc i weitere Dosen nach 8, 24 und 32 Stunden anschlossen (insgesamt vier Dosen). Feste Präparate mit gleicher Wirkungsstärke (3000 Einheiten; mg) wie das oben verwendete wiesen folgende Toxizität auf: Tabelle IVb Mäuse (Stamm A 2G, Geschlecht - männlich, Körpergewicht 16 bis 22 g) Art der Anwendung Beobachtungs- LD;o zeit in mg/kg Intravenös ........... 48 Stunden 83 Intraperitoneal . . . . . . . 7 Tage 460 Subcutan ............ 7 Tage 3500 Oral................. 7 Tage 5000 Es sei erwähnt, da die durchgeführten Versuche gezeigt haben, daß E-129 vom Darm absorbiert wird und daß es unter Erzielung eines therapeutischen Spiegels in dem Versuchstier oral verabreicht werden kann.The effectiveness of E-129 in vivo can be seen from experiments carried out with mice, in which the following results were obtained: Table IVa Treatment with E-129 number of after the Test organism infection up to Type of dose 7th day survival- the to (one to the mice Phrase) 4 I. Staphylococcus isubcutane 4 200 4/4 aureus (strain 663) 2100 4/4 Infection dose 1050 3/4 1000.10 6 525 0/4 Organisms 260 0/4 oral 8400 4/4 "4200 14 "I 2100 0/4 "1050 0/4 "525 0/4 untreated Controls 0/4 Streptococcus subcutaneous; 4200 4/4 haemolyticus 2100 414 (Strain 618) 1050 4/4 Infection dose 525 4; '4 25. 10s organisms 260 1/4 oral 8400 6/6 "4200 5/6 "2100 4/6 "1050 3/6 "525 06 260 0/6 untreated Controls 0! 4 Pneumococcus type 1 subcutaneous; 3,000 4/4 (Strain 245 E) 1500 4/4 Infection dose 750 3/4 10.10s organisms 375 0/4 "180 0/4 untreated Controls 0/4 Treated with E-129, subcutaneously! 4 200 4/4 not infected ". j 2 100 4/4 Oral controls 4 200 4/4 "2100 4/4 In the experiments described above, the vital dose was administered by intraperitoneal injection and treatment was carried out with an aqueous suspension of the antibiotic, each dose being 0.2 ml. The first dose was given 30 minutes after the infectious dose, followed by three further doses after 8, 24 and 32 hours (a total of four doses). Solid preparations with the same potency (3000 units; mg) as the one used above showed the following toxicity: Table IVb Mice (strain A 2G, sex - male, Body weight 16 to 22 g) Type of application observation LD; o time in mg / kg Intravenous ........... 48 hours 83 Intraperitoneally. . . . . . . 7 days 460 Subcutaneous ............ 7 days 3500 Oral ................. 7 days 5000 It should be noted that the experiments carried out have shown that E-129 is absorbed from the intestine and that it can be administered orally to the test animal with a therapeutic level being achieved.

h) Bei der Anwendung chromatographischer Arbeitsweisen auf E-129 wurden folgende Ergebnisse erhalten Eine papierchromatographische Trennung wurde mit filtrierter Nährflüssigkeit und teilweise gereinigten Konzentraten von E-129 unter Anwendung absteigender Entwicklung mit Whatman-Papier Nr. 1 bei 28° C durchgeführt. Dabei wurden folgende Rf-Werte beobachtet: mit 1 °/oigem Eisessig als Entwicklungslösungsmittel R j, = 0,64 mit 3 °!siger Ammoniumchloridlösung als Entwicklungslösungsmittel Rf = 0,65 mit Methanol: Aceton: Wasser (19: 6 : 75 Volumen/ Volumen) als Entwicklungslösungsmittel R f = 0,78 2. Die Eigenschaften von Streptomyces E-129 Streptomyces E-129 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in etwa 120 m Höhe über dem Meer in der Nähe von Jericho (Transjordanien) genommen wurde. Eine gewisse Bodenmenge wurde mit sterilem Wasser beträchtlich verdünnt und aliquote Anteile wurden in Petrischalen mit Bennets-Agar vermischt. Nach 5tägiger Bebrütung bei 28°C wurden die Aktinomyceten-Kolonien entnommen, und ihre antibiotische Aktivität wurde durch weitere 5tägige Züchtung auf der Oberfläche eines Kartoffel-Pepton-Agars und Ausschneiden von Agarscheiben aus der Kolonie, die dann auf ihre Aktivität gegen Staphylococcus aureus geprüft wurden, nachgewiesen.h) Applying chromatographic procedures to E-129, the following results were obtained. Paper chromatographic separation was performed on filtered nutrient fluid and partially purified concentrates of E-129 using descending development with Whatman # 1 paper at 28 ° C. The following Rf values were observed: with 1% glacial acetic acid as developing solvent R j = 0.64 with 3% ammonium chloride solution as developing solvent Rf = 0.65 with methanol: acetone: water (19: 6: 75 volume / Volume) as developing solvent R f = 0.78 2. The properties of Streptomyces E-129 Streptomyces E-129 was isolated from a soil sample which was taken at a height of about 120 m above sea level near Jericho (Transjordan). A certain amount of soil was diluted considerably with sterile water and aliquots were mixed in petri dishes with Bennets agar. After 5 days of incubation at 28 ° C., the actinomycete colonies were removed and their antibiotic activity was determined by culturing them for another 5 days on the surface of a potato-peptone agar and cutting agar slices from the colony, which were then tested for their activity against Staphylococcus aureus , proven.

Bei der submersen Gärung von 50-ml-Volumina verschiedener Medien in konischen Flaschen von 250 ml Fassungsvermögen wurden innerhalb einer Zeitspanne von 1 bis 4 Tagen Antibiotikaausbeuten erzielt, wobei der Spitzentiter sehr rasch in etwa 24 bis 36 Stunden erreicht wurde. Diese verhältnismäßig rasche Entwicklung ist eines der charakteristischen Merkmale des Streptomyces E-1.29.In the submerged fermentation of 50 ml volumes of various media in Conical bottles of 250 ml capacity were made within a period of time antibiotic yields achieved from 1 to 4 days, the peak titer being very rapid was reached in about 24 to 36 hours. This relatively rapid development is one of the characteristic features of Streptomyces E-1.29.

Streptomyces E-129 kann durch Untersuchung des Wachstums auf verschiedenen organischen Medien und seiner Fähigkeit verschiedenartige Kohlenstoffverbindungen, unter den von Pridham, T. G., und Gottlieb, D. (J. Bact. 1948, Bd. 56 [l], S.107 bis l14), beschriebenen Bedingungen, zu verwerten, charakterisiert werden. Diese Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen wiedergegeben. - Tabelle V a - - - Wg;@hstumseigenschaften,xön-Streptomyces E-129 Vegetativ-Luftmycel Lösliches Medium - - Wachstum und Sporen - Pigment Bemerkungen Hafermehlagar - gut White bis Pale Mouse Gray Strontian Oberfläche faltig Sporu- (Weiß bis Mattmausgrau) Yellow Tation gut nach 3 Tagen (Strontian- gelb) Czapek-Dox mäßig Vegetatives Mycel (gelblich- blaßbräun- Sporulation mäßig nach cremefarben) Luftmycel lichgelb 3 Tagen Pale Mouse Gray (Mattmaus- grau) Glucose-Nähragar mäßig Pale Mouse Gray (Mattmaus- blaßbraun Oberfläche faltig, Sporu- bis gut (grau) Tation mäßig Stärkenitrat ausgezeichnet White bis Pallid Mouse Gray blaß- Oberfläche glatt, Unter- (Weiß bis Blaßmausgrau) grünlichgelb seitenfärbung. Pale Ochraceous Buff to Pin kish - Buff (Mattockerartigleder- farben bis Rosalederfarben) Synthetischer Agar schlecht rehfarbenes Mucoid keins Asparaginglucose mäßig Myceldurchsichtiges Mucoid keins Sporulation geringfügig, bis gut Unterseite cremefarben Kartoffelschnitzel mäßig Pale bis Pallid Mouse Gray schwach- Sporulation dürftig bis gut (Matt- bis Blaßmausgrau) braun - Gelatine schlecht bis schmutzig weiß (Dirty ausgeprägtes starke Verflüssigung mäßig, nur auf white) Maßbraunes - .der Oberfläche - Pigment Nähragar gut Mucoidrehfarben tiefbraun Oberfläche faltig Nitratbrühe mäßig Pallid Mouse Gray (Blaß- Old Gold Sporulation gut, Nitrat- ' mausgrau) - (Altgold) reduktion vernachlässigbar Lakmusmilch schlecht - schwach- geringe Peptonisafion oder dunkel pA-Veränderung werdend Natriumsuccinatagar gut Pallid Mouse Gray (Blaß- keines Oberfläche glatt, Unterseite mausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt- - ockerartiglederfarben) Natriumcitratagar mäßig Pallid Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite (Blaßmausgrau) Pale Ochraceous-Buff (Matt- -- ockerartiglederfarben) Calciummalatagar kein Wachs- Pallid Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite tnm nach (Blaßmausgrau) weiß 3 Tagen, . - Wachstum gut bis mäßig ' ' -nach 6 Tagen. - Maltoseagar ausgezeichnet Pallid bis Pale 14louse Gray keines Oberfläche faltig, Unterseite oder Pale Smoke Gray (Blaß- Pale Ochraceoüs Buff (Matt- bis Mattmausgrau oder Matt- ockerartiglederfarben) rauchgrau Arabinoseagar ausgezeichnet Pallid Mouse Gray bis Pale keines Oberfläche glatt, Unterseite Olive Gray (Blaßmausgrau Pale Ochraceous Buff (Matt- bis Mattolivengrau) ockerartiglederfarben) Lactoseagar sehr schlecht Pallid Mouse Gray keines nahezu kein Wachstum in (Blaßmausgrau) 6 Tagen Rhamnoseagar mäßig nach Pale Mouse Gray - keines Oberfläche glatt, Unterseite 3 Tagen; (Mattmausgrau) Pale Ochraceous Buff ausgezeichnet (Mattockerartiglederfarben) nach 6 Tagen. Saccharoseagar gut bis Mucoid nach 3 Tagen Pallid keines Oberfläche glatt, Unterseite mäßig- bis Pale-Mouse Gray (Blaß- Pale Ochraceous Buff (Matt- bis Mattmausgrau) nach ockerartiglederfarben) 6 Tagen Laevuloseagar mäßig Pallid Olive bis Pallid Mouse keines Oberfläche glatt. Unterseite Grat' (Blaßoliven- bis Blaß- Pale Ochraceous Buff (Matt- - mausgrau) ockerartiglederfarben) ß09 548/519 Medium Wachstum Vegetativ-Luftmycel Lösliches Bemerkungen und Sporen Pigment Inulinagar mäßig Pallid bis Pale Mouse Gray keines Oberfläche faltig, Unterseite (Blaß- bis Mattmausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt- ockerartiglederfarben) Mannitagar keines Galactoseagar ausgezeichnet Smoke Gray bis Pale Mouse keines Oberfläche glatt, Unterseite Gray (Rauchgrau bis Matt- Pale Ochraceous Buff (Matt- mausgrau) ockerartiglederfarben) Nyloseagar gut Pallid Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite (Blaßmausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt- ockerartiglederfarben) Sorbitagar sehr schlecht keines sehr dürftiges Wachstum Raffinoseagar ausgezeichnet Pallid bis Pale Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite (Blaß- bis Mattmausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt- ockerartiglederfarben) Dulcitagar keines Salicinagar sehr schlecht Pallid Mouse Gray keines nach (Blaßmausgrau) 6 Tagen Inositagar sehr schlecht Pallid Mouse Giay keines nach (Blaßmausgrau) 6 Tagen Stärke ausgeprägte Hydrolyse Alle Farbangaben unter Verwendung großer Anfangsbuchstaben entsprechen denen von Rigdeway, Colour Standards z Nomen- klature, Washington, 1912. Alle Angaben wurden nach 3tägiger Bebrütung bei 28°C gemacht, außer in den besonders bezeichneten Fällen. Es sei darauf hingewiesen, daß die vorstehenden Versuche bezüglich der Verwertung von Energiequellen unter besonderen Wachstumsbedingungen durchgeführt wurden und daß die Tatsache, daß der Aktinomycet bestimmte Energiequellen unter den Versuchsbedingungen nicht verwertet, nicht ausschließt, daß unter anderen Bedingungen eine Verwertung beobachtet werden kann.Streptomyces E-129 can be determined by studying the growth on various organic media and its ability of various carbon compounds, among those of Pridham, TG, and Gottlieb, D. (J. Bact. 1948, Vol. 56 [l], p.107 to l14 ), described conditions, to be exploited, characterized. These results are presented in the following tables. - Table V a - - - Wg; @ hstumselösungen, xön-Streptomyces E-129 Vegetative aerial mycelium soluble Medium - growth and spores - pigment remarks Oatmeal Agar - Good White to Pale Mouse Gray Strontian Surface Wrinkled Sporu- (White to matt mouse gray) Yellow Tation good after 3 days (Strontian yellow) Czapek-Dox moderately vegetative mycelium (yellowish pale brown sporulation moderately after cream-colored) aerial mycelium light yellow 3 days Pale Mouse Gray (matt mouse Gray) Glucose nutrient agar moderately Pale Mouse Gray (matt mouse pale brown surface wrinkled, sporu- to good (gray) Tation moderate Starch nitrate excellent White to Pallid Mouse Gray pale surface smooth, under- (White to pale mouse gray) greenish-yellow side coloration. Pale Ochraceous Buff to Pin kish - Buff (matt ocher-like leather colors to rose leather colors) Synthetic agar bad deer-colored mucoid none Asparagine glucose moderate mycelium clear mucoid no sporulation slight, until well underside cream-colored Potato schnitzel moderately Pale to Pallid Mouse Gray weak - sporulation poor to good (matt to pale mouse gray) brown - Gelatine bad to dirty white (dirty pronounced strong liquefaction moderate, only on white) Dimly brown -. the surface - pigment Nutrient agar good mucoid turning color deep brown surface wrinkled Nitrate broth moderate Pallid Mouse Gray (pale old gold sporulation good, nitrate 'mouse gray) - (old gold) reduction negligible Lakmus milk bad - weak - low peptonization or dark pA change becoming Sodium succinate agar good Pallid Mouse Gray (pale- none surface smooth, underside mouse gray) Pale Ochraceous Buff (matt - ocher-like leather color) Sodium Citrate Agar Moderately Pallid Mouse Gray None Surface smooth, underside (Pale Mouse Gray) Pale Ochraceous-Buff (Matt- - ocher-like leather color) Calcium malate agar no wax- Pallid Mouse Gray none surface smooth, underside tnm after (pale mouse gray) white 3 days,. - growth good to moderate ' ' -after 6 days. - Maltose agar excellent Pallid to Pale 14louse Gray none Wrinkled surface, underside or Pale Smoke Gray (Pale Pale Ochraceoüs Buff (Matt- to matt mouse gray or matt ocher-like leather colors) smoke gray Arabinose agar excellent Pallid Mouse Gray to Pale none Surface smooth, underside Olive Gray (Pale Mouse Gray Pale Ochraceous Buff (Matt- to matte olive gray) ocher-like leather-colored) Lactose agar very poor Pallid Mouse Gray none almost no growth in (Pale mouse gray) 6 days Rhamnose agar moderately after Pale Mouse Gray - none surface smooth, underside 3 days; (Matt mouse gray) Pale Ochraceous Buff excellent (matt ocher-like leather color) after 6 days. Sucrose agar good to mucoid after 3 days Pallid none Surface smooth, underside Moderately to Pale-Mouse Gray (Pale Pale Ochraceous Buff (Matt- to matt mouse gray) to ocher-like leather colors) 6 days Laevulose agar moderate Pallid Olive to Pallid Mouse none Surface smooth. bottom Grat '(Pale Olive to Pale Pale Ochraceous Buff (Matt- - mouse gray) ocher-like leather-colored) ß09 548/519 Medium Growth Vegetative aerial mycelium Soluble Remarks and spore pigment Inulin agar moderately Pallid to Pale Mouse Gray none Surface wrinkled, underside (Pale to matt mouse gray) Pale Ochraceous Buff (matt ocher-like leather-colored) Mannitagar none Galactose agar excellent Smoke Gray to Pale Mouse none Surface smooth, underside Gray (Smoke Gray to Matt- Pale Ochraceous Buff (Matt- mouse gray) ocher-like leather-colored) Nylose agar good Pallid Mouse Gray none Surface smooth, underside (Pale Mouse Gray) Pale Ochraceous Buff (Matt- ocher-like leather-colored) Sorbitol agar very bad none very poor growth Raffino agar excellent Pallid to Pale Mouse Gray none Surface smooth, underside (Pale to matt mouse gray) Pale Ochraceous Buff (matt ocher-like leather-colored) Dulcitagar none Salicin agar very bad Pallid Mouse Gray none to (pale mouse gray) 6 days Inositol agar very bad Pallid Mouse Giay none to (pale mouse gray) 6 days Starch pronounced hydrolysis All color specifications using capital letters correspond to those of Rigdeway, Color Standards z noun klature, Washington, 1912. All information was given after 3 days of incubation at 28 ° C, except in the specially designated cases. It should be pointed out that the above experiments with regard to the utilization of energy sources were carried out under special growth conditions and that the fact that the actinomycete does not utilize certain energy sources under the experimental conditions does not exclude that utilization can be observed under other conditions.

Die mikroskopische Untersuchung von auf Gelatinefilm gewachsenem Streptomyces E-129 läßt folgende Eigenschaften erkennen: Das primäre Mycel zeigt sehr feine monopodische verzweigte Hyphen ; es besteht ein beträchtlicher Größenunterschied in den Ausmaßen der Hyphen im primären und im sekundären Mycel. Die Conidien werden in langen geraden und hauptsächlich unverzweigten Ketten erzeugt, sind gewöhnlich ellipsoid und haben eine Größe von etwa 0,7 mal 0,5 #t. Der Durchmesser des primären Mycels von Streptomyces E-129 liegt beträchtlich unter 0,5 #t ,während der des sekundären Mycels etwa 0,5 #t beträgt.The microscopic examination of Streptomyces E-129 grown on gelatine film reveals the following properties: The primary mycelium shows very fine monopodic branched hyphae; there is a considerable difference in size in the dimensions of the hyphae in the primary and secondary mycelium. The conidia are created in long straight and mostly unbranched chains, are usually ellipsoidal and about 0.7 by 0.5 #t in size. The diameter of the primary mycelium of Streptomyces E-129 is well below 0.5 #t, while that of the secondary mycelium is about 0.5 #t.

Nach der in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 6th Edition, angegebenen Determination ähnelt Streptomyces E-129 in gewisser Weise dem Streptomycesgriseolus, kann von dieser Species jedoch durch einen Vergleich der Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen unterschieden werden, wie in der folgenden Tabelle gezeigt wird.According to Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 6th Edition, specified determination is similar to Streptomyces E-129 in a certain way to Streptomycesgriseolus, can, however, by comparing the utilization of different of this species Carbon sources can be distinguished as shown in the following table.

Unter Zugrundelegung des Schemas für die Erkennung von Species von Antibiotika erzeugenden Isolaten auf der Basis der Verwertung von Kohlenstoffverbindungen in einem chemisch definierten Medium nach Pridham, T. G., und Gottlieb, D. (a. a. O.), S. 113, ergibt sich für Streptomyces E-129, daß er eine Species des Nocardia ist, was offensichtlich nicht logisch ist, da die Wachstumseigenschaften zeigen, daß der Aktinomycet dem Genus Streptomyces der Ordo Aktinomycetales gemäß der Klassifizierung in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (6th Edition), S.938, angehört. Streptomyces E-129 stellt demnach eine neue Species dar. Tabelle Vb S.griseolus*) Verbindung NRRL S. E-129 B-1062 Saccharose ................ - ++ Raffinose ................. - Inulin ........ . ........... - - Calciumsuccinat ........... - ++ ....+ ausgezeichnetes Wachstum, -+--+- gutes Wachstum, mäßiges Wachstum, - kein Wachstum. *j Benedict, R. G., Lindenfelser, L. A., Stodola, F. H., und Traufler, D. H. (J. Bact., 1951, Bd. 62 [4], S. 487 bis 497). 3. Züchtung von Streptomyces E-129 unter Bildung von rohem E-129 Das Antibiotikum E-129 wird durch aerobe Züchtung geeigneter Stämme des Organismus Streptomyces E-129 auf oder in sein Wachstum fördernden Medien erzeugt. Diese Medien sind gewöhnlich von der Art, wie sie für die Züchtung von Pilzen des Genus Streptomyces geeignet sind, und sollten eine oder mehrere Quellen assimilierbaren Stickstoffs, eine Kohlenstoff- und Energiequelle und Nährsalze enthalten. Die Züchtung wird vorzugsweise unter aeroben submersen Bedingungen geführt.On the basis of the scheme for the recognition of species of antibiotic-producing isolates on the basis of the utilization of carbon compounds in a chemically defined medium according to Pridham, TG and Gottlieb, D. (loc. Cit.), P. 113, for Streptomyces E -129 that it is a species of Nocardia, which is obviously not logical, since the growth characteristics show that the actinomycete belongs to the genus Streptomyces of the Ordo Aktinomycetales according to the classification in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (6th Edition), p.938 . Streptomyces E-129 is therefore a new species. Table Vb S.griseolus *) Compound NRRL S. E-129 B-1062 Sucrose ................ - ++ Raffinose ................. - Inulin ......... ........... - - Calcium succinate ........... - ++ .... + excellent growth, - + - + - good growth, moderate growth, - no growth. * j Benedict, RG, Lindenfelser, LA, Stodola, FH, and Traufler, DH (J. Bact., 1951, Vol. 62 [4], pp. 487 bis 497). 3. Cultivation of Streptomyces E-129 with Production of Crude E-129 The antibiotic E-129 is produced by aerobic cultivation of suitable strains of the organism Streptomyces E-129 on or in its growth-promoting media. These media are usually of the type suitable for growing fungi of the genus Streptomyces and should contain one or more sources of assimilable nitrogen, a source of carbon and energy, and nutrient salts. The cultivation is preferably carried out under aerobic submerged conditions.

Vorzugsweise werden Medien verwendet, in denen die Stickstoffquelle in Form eines komplexen organischen Materials vorliegt. Das Mehl von Bohnen, z. B. Sojabohnen, ist zufriedenstellend, doch hat sich Hafermehl im besonderen als für diesen Zweck, besonders wenn es durch Fischmehl oder Maisquellwasser vervollständigt wird, als hervorragend geeignet erwiesen. Die Kohlenstoff- und Energiequelle kann ein Zucker wie Dextrose, Maltose, Saccharose (z. B. brauner Zucker) oder vorzugsweise Glucose oder in einigen Fällen vorteilhaft Stärke sein, die entweder in der als Stickstoffquelle dienenden organischen Substanz bereits vorliegt oder dieser zugesetzt wird. Nährsalze sollen in dem Maße, wie sie erforderlich sind, zugegeben werden, und die Verwendung der folgenden Stoffe entweder allein oder in Kombination hat sich als vorteilhaft erwiesen: Natrium- und Magnesiumchlorid, Kaliumhydrogenphosphat (K2 H P O4 und K H2 P 04), Calciumcarbonat und Magnesium-, Zink-, Ammonium- und Ferrosulfat.Media are preferably used in which the nitrogen source is in the form of a complex organic material. The flour of beans, e.g. B. Soybeans, is satisfactory, but oatmeal in particular has proven to be for this purpose, especially when completed by fish meal or corn steeple is proven to be extremely suitable. The carbon and energy source can a sugar like dextrose, maltose, Sucrose (e.g. brown sugar) or preferably glucose or, in some cases, advantageously starch, either is already present in the organic substance serving as the nitrogen source or this is added. Nutritional salts should, to the extent that they are required, may be added, and the use of the following substances either alone or in Combination has proven beneficial: sodium and magnesium chloride, potassium hydrogen phosphate (K2 H P O4 and K H2 P 04), calcium carbonate and magnesium, zinc, ammonium and Ferrous sulfate.

Lediglich zur Erläuterung werden weiter unten Beispiele für eine Anzahl von Medien angegeben, die sich als das Wachstum von Streptomyces E-129 unter Bildung des Antibiotikums E-129 fördernd erwiesen haben. Wie für den Fachmann offensichtlich, eignen sich viele Medien für die Züchtung vonIE-129, und geeignete Medien können durch Versuchsfermentationen leicht ermittelt werden. Medium I Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 30/0 Distillers Solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,750/0 Natriumchlorid p$ 7,6 ± 0,1 . . . . . . . . 0,250/0 Medium II Maltose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/0 Bacto-pepton ..................... 0,5% Distillers Solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,50/0 Natriumchlorid pH 6,4 :E 0,1 . . . . . . . . 0,50/0 Medium III Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 20/0 Distillers Solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/0 Säurehydrolysiertes Kasein . . . . . . . . . . 0,070/0 Bengers enzymatisches Casein ....... 0,070/0 Marmite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,070/, Hafermehl ........................ 0,5 0/0 Malzextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 0,250/0 Natriumchlorid .................... 1,125% Kaliumhydrogenphosphat . . . . . . . . . . . 0,1250/0 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/0 Dextrose ......................... 0,5 0/0 Maltose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,250/0 Brauner Zucker (40 Stück) p$ bis 7,3 i 0,1.......................... 0,25o/0 1stündiges Rühren und erneute pH-Einstellung auf 7,3 -j- 0,1. Medium IV Hafermehl ........................ 2,5 0/0 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 0/0 Dextrose pH 6,8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0 Medium V Gelbes Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 0/0 Tyrosin........................... 0,2 0/0 Ammoniumphosphat ............... 0,4 0/0 Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0 Kaliumhydrogenphosphat . . . . . . . . . . . 0,2 0/0 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,350/0 Magnesiumsulfat (Mg S04 # 7H20) .... 0,1 0/0 Ferrosulfat (Fe S 04 . 7 H20) ...... . . 0,0020/0 Zinksulfat (Zn S 04 . 7 H2 0) . . . . . . . . . . 0,0010/0 Manganchlorid (MnC12) p. 6,8 ....... 0,0002% Medium VI Maismehl ......................... 4,0 0/0 Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 4,0 0/0 Ammoniumsulfat .................. 0,1 0/0 Calciumcarbonat p$ 7,0 . . . . . . . . . . . . 1,0 0/0 Medium VII Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 4,0 0/0 Stärke............................ 0,5 0/0 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0 Calciumlactat p. 7,6. . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0 Medium VIII Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 1,5 0/0 Maisquellwasserfeststoffe . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0 Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,251)/, Kalk (leicht gefällt) . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/0 lösliche Stärke pH 6,5 . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 0/0 Unter Verwendung der oben angegebenen Medien IV und VIII wurden gute Ausbeuten an E-129 sowohl bei kleinen Ansätzen als auch bei Ansätzen im technischen Maßstab erhalten. Vorzugsweise wird das Medium IV verwendet, das, wie sich gezeigt hat, ausgezeichnete Ergebnisse bei 150-1-Gärtanks liefert, obwohl dieses Medium wahrscheinlich unzureichend (vermutlich bezüglich des Stickstoffs) ist, da ein Zusatz von Maisquellwasser und Fischmehl Steigerungen der Ausbeute in der E-129-Aktivität in Schüttelkolbenfermentationen ergeben hat.For illustration purposes only, examples are given below of a number of media which have been found to promote the growth of Streptomyces E-129 with the formation of the antibiotic E-129. As will be apparent to those skilled in the art, many media are suitable for growing IE-129 and suitable media can be readily determined by trial fermentations. Medium I. Rolled soybean meal. . . . . . . . . 30/0 Distillers Solubles. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.750 / 0 Sodium chloride p $ 7.6 ± 0.1. . . . . . . . 0.250 / 0 Medium II Maltose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/0 Bacto-peptone ..................... 0.5% Distillers Solubles. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.50 / 0 Sodium chloride pH 6.4 : E 0.1. . . . . . . . 0.50 / 0 Medium III Rolled soybean meal. . . . . . . . . 20/0 Distillers Solubles. . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/0 Acid hydrolyzed casein. . . . . . . . . . 0.070 / 0 Bengers enzymatic casein ....... 0.070 / 0 Marmite. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.070 /, Oatmeal ........................ 0.5 0/0 Malt extract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 0.250 / 0 Sodium Chloride .................... 1.125% Potassium hydrogen phosphate. . . . . . . . . . . 0.1250 / 0 Calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1 0/0 Dextrose ......................... 0.5 0/0 Maltose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.250 / 0 Brown sugar (40 pieces) p $ to 7.3 i 0.1 .......................... 0.25o / 0 Stir for 1 hour and adjust the pH again 7.3 -j- 0.1. Medium IV Oatmeal ........................ 2.5 0/0 Calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.0 0/0 Dextrose pH 6.8. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 0/0 Medium V Yellow dextrin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.0 0/0 Tyrosine ........................... 0.2 0/0 Ammonium phosphate ............... 0.4 0/0 Sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 0/0 Potassium hydrogen phosphate. . . . . . . . . . . 0.2 0/0 Calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.350 / 0 Magnesium Sulphate (Mg SO4 # 7H20) .... 0.1 0/0 Ferrous sulfate (Fe S 04th 7 H20) ....... . 0.0020 / 0 Zinc sulfate (Zn S 04.7 H2 0). . . . . . . . . . 0.0010 / 0 Manganese chloride (MnC12) p. 6.8 ....... 0.0002% Medium VI Cornmeal ......................... 4.0 0/0 Rolled soybean meal. . . . . . . . . 4.0 0/0 Ammonium sulfate .................. 0.1 0/0 Calcium carbonate p $ 7.0. . . . . . . . . . . . 1.0 0/0 Medium VII Rolled soybean meal. . . . . . . . . 4.0 0/0 Strength ............................ 0.5 0/0 Calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 0/0 Calcium lactate p. 7.6. . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 0/0 Medium VIII Rolled soybean meal. . . . . . . . . 1.5 0/0 Corn steep liquor solids. . . . . . . . . . . . 0.5 0/0 Sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.251) /, Lime (easily felled). . . . . . . . . . . . . . . . 0.1 0/0 soluble starch pH 6.5. . . . . . . . . . . . . . . 1.5 0/0 Using the media IV and VIII given above, good yields of E-129 were obtained both in small batches and in batches on an industrial scale. Medium IV is preferably used, which has been shown to give excellent results in 150-1 fermentation tanks, although this medium is likely to be inadequate (presumably in terms of nitrogen) as the addition of corn steep liquor and fish meal increases the yield in the E. -129 activity in shake flask fermentations.

Ferner wurde gefunden, daß bei der Erzeugung von E-129 durch Züchtung eines E-129 erzeugenden Organismus, insbesondere von Streptomyces E-129, auf oder in einem geeigneten Medium verbesserte Ergebnisse, insbesondere erhöhte Titer erzielt werden, wenn das Medium verfügbares Eisen in einer Konzentration im Bereich von 30 bis 135 Teile/Million und zweckmäßigerweise von 35 bis 55 Teile/Million enthält. Bei einer Eisenkonzentration von über 135 Teile/Million beginnt sich ein beträchtlicher Inhibierungseffekt auf den Organismus einzustellen.Further, it was found that in the production of E-129 by breeding of an E-129 producing organism, in particular Streptomyces E-129, on or in a suitable medium, improved results, in particular increased titers, are achieved if the medium is available iron in a concentration in the range of Contains from 30 to 135 parts / million and more conveniently from 35 to 55 parts / million. At an iron concentration of over 135 parts / million, a considerable one begins To adjust the inhibiting effect on the organism.

E-129 wird, wie bereits erwähnt, vorzugsweise durch submerse Gärung eines E-129 erzeugenden Organismus in einem Nährmedium gebildet, das eine komplexe organische Stickstoffquelle, wie Hafermehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser u. dgl., ein Kohlenhydrat und Mineralsalze enthält. Bekanntlich enthalten organische Materialien, wie die obengenannten Stickstoffquellen, häufig Spurenmengen von Eisen, und diese sollen bei der Berechnung der dem Medium für die erfindungsgemäßen Zwecke zuzusetzenden Eisenmengen berücksichtigt werden. Viele der wichtigeren komplexen organischen Stickstoffquellen, die zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden, enthalten praktisch die gleiche Eisenmenge, d. h. 10 bis 20 Teile/Million, so daß eine zusätzliche Eisenmenge von wenigstens 20 Teilen/Million und nicht mehr als 115 Teilen/Million gewöhnlich zufriedenstellend ist. Bei Verwendung eines organischen Materials mit einem davon stark verschiedenen Eisengehalt muß selbstverständlich die Menge zugesetzten Eisens entsprechend berichtigt werden.As already mentioned, E-129 is preferably made by submerged fermentation of an E-129 producing organism in a nutrient medium that contains a complex organic nitrogen source such as oatmeal, soybean meal, corn steep liquor and the like, contains a carbohydrate and mineral salts. It is well known that organic materials contain like the nitrogen sources mentioned above, often trace amounts of iron, and these should be added when calculating the amount to be added to the medium for the purposes according to the invention Iron quantities are taken into account. Many of the more important complex organic nitrogen sources, that are used to grow microorganisms contain practically the same Amount of iron, d. H. 10 to 20 parts / million, so an additional amount of iron of at least 20 parts / million and no more than 115 parts / million usually satisfactory is. When using an organic material with one of them very different The iron content must of course be adjusted accordingly to the amount of iron added will.

Die Art der das zugesetzte Eisen liefernden Substanz scheint nicht von Bedeutung zu sein, solange sie in dem Gärmedium löslich und für den Organismus praktisch nicht toxisch sowie mit dem gebildeten Antibiotikum verträglich ist. Eisen sowohl im Ferro- als auch im Ferrizustand kann verwendet werden.The nature of the substance supplying the added iron does not appear to be of importance as long as they are soluble in the fermentation medium and for the organism is practically non-toxic and compatible with the antibiotic formed. iron both ferrous and ferrous states can be used.

Als geeignete Eisenquellen haben sich Ferricitrat, Ferrichlorid und Ferroammoniumsulfat erwiesen.Ferricitrate, ferric chloride and have proven to be suitable iron sources Ferroammonium sulfate proved.

Bekanntlich bildet Kalk mit Eisen Chelate. Bei manchen der für die Erzeugung von E-129 eingesetzten Medien wurde Kalk als Bestandteil neben Eisen verwendet, und trotz der bekannten chelatbildenden Eigenschaften des Kalks mit Eisen wurde eine Zunahme im Titer erzielt.It is well known that lime forms chelates with iron. For some of the For the production of E-129 media, lime was used as a component in addition to iron, and despite the well-known chelating properties of lime with iron achieved an increase in titer.

Ferner wurde gefunden, daß bei Verwendung von Maisquellwasser in einem eine Kohlenhydratquelle enthaltenden Medium ein verbesserter Titer erhalten wird. Eine Maisquellwassermenge von 0,4 bis 0,9 °./s (bezogen auf das Gewicht der Feststoffe) des Gewichts des Mediums, vorzugsweise eine Menge von 0,7 Gewichtsprozent Feststoffe, ist besonders geeignet. Das Maisquellwasser wird vorzugsweise gemeinsam mit einer anderen Stickstoffquelle, insbesondere Hafermehl, verwendet, wobei die bevorzugten Mengen von Hafermehl im Bereich zwischen 1 und 5 °!°, vorteilhafterweise bei 2,5 °/°, liegen.It has also been found that when using corn steep liquor in one containing a source of carbohydrates Medium an improved titer is obtained. An amount of corn steep water of 0.4 to 0.9 ° / s (based on the weight of solids) by weight of the medium, preferably an amount of 0.7 percent by weight Solids, is particularly suitable. The corn steep liquor is preferably common used with another nitrogen source, particularly oatmeal, the preferred amounts of oatmeal in the range between 1 and 5 °! °, advantageously at 2.5 ° / °.

Das Verhältnis von Maisquellwasser zu löslichen Kohlenhydraten ist zur Erzielung guter Titer ebenfalls von Bedeutung. Bei Verwendung zweier Medien, die unter anderem 0,5 bzw. 1,5 Gewichtsprozent Glucose enthalten, wird zwar in Abwesenheit von Maisquellwasser kein merklicher Titerunterschied erhalten; wenn jedoch Maisquellwasser, beispielsweise 0,7 Gewichtsprozent Feststoffe, jedem Medium zugesetzt wird, wird nicht nur eine Titersteigerung in jedem Medium erzielt, sondern es wird auch bei einem Medium, das 1,5 °/° Glucose enthält, gegenüber einem nur 0,50/, Glucose enthaltenden Medium ein erhöhter Titer erreicht. Die Wirkung des Maisquellwassers und der Kohlenhydratquelle sind- daher offensichtlich synergistisch.The ratio of corn steep water to soluble carbohydrates is also of importance to achieve good titers. When using two media, which contain, inter alia, 0.5 or 1.5 percent by weight of glucose, is in fact absent no noticeable difference in titre obtained from corn steep liquor; but if corn steep water, e.g. 0.7 weight percent solids is added to each medium not only does a titer increase in each medium, but it is also achieved in a medium containing 1.5% glucose compared to one containing only 0.50% glucose Medium reaches an increased titer. The effect of the corn steep water and the source of carbohydrates are therefore obviously synergistic.

Bei Verwendung von Maisquellwasser hat es sich als vorteilhäft erwiesen, wenn 1,50/, lösliches Kohlenhydrat, insbesondere Glucose, vorhanden sind.When using corn steep liquor, it has proven to be advantageous if 1.50% soluble carbohydrate, in particular glucose, is present.

Ein Medium, das, wie sich gezeigt hat, zur Verwendung bei, der Erzeugung von E-129 sehr geeignet ist, enthält vorzugsweise 2,5 °/° Hafermehl, vorzugsweise 2,0 °° Kalk und vorzugsweise 1,50/, Glucose und wird mit beispielsweise Salzsäure auf ein pH von 6,8 bis 7,0 eingestellt. Außerdem wird diesem Medium Maisquellwasser in den wie oben angegebenen Mengen zugesetzt, und es enthält ferner vorzugsweise von außen zugeführtes Eisen in der oben angegebenen Menge (vorzugsweise 30 Teile/Million).A medium which has been found to be very suitable for use in the production of E-129 preferably contains 2.5% oatmeal, preferably 2.0 °° lime and preferably 1.50% glucose and is adjusted to a pH of 6.8 to 7.0 with, for example, hydrochloric acid. In addition, corn steep liquor is added to this medium in the amounts specified above, and it also preferably contains externally supplied iron in the amount specified above (preferably 30 parts per million).

Die Gärung wird zweckmäßigerweise als Vielstufenverfahren in der üblichen Weise durchgeführt. So kann zweckmäßig eine Abschabung von Sporen oder Mycelfilz von Streptomyces E-129, die man aus einem geeigneten Schrägnähragar erhalten hat, zur Einleitung einer Impfstufe im kleinen Maßstab verwendet werden. Eine aus dieser Impfungsstufe erhaltene Submerssporensuspension kann, falls erwünscht, direkt zum Beimpfen des Produktionsmediums im großen Maßstab verwendet werden, doch wird statt dessen vorzugsweise das Produkt der Impfstufe zur- Beimpfung einer Entwicklungsstufe verwendet. Als Entwicklungsmedium kann das gleiche Medium, wie in der nachfolgenden Großerzeugungsstufe verwendet werden, öder es kann beispielsweise durch Erhöhung seiner Nährkraft modifiziert werden. Die in der Entwicklungsstufe gebildete frei wachsende und sporenbildende Vegetativkultur kann dann als Impfstoff für das Großerzeugungsmedium verwendet werden. Es hat sich gezeigt, daß durch Verwendung einer vergleichsweise geringen Menge dieses vegetativen Impfstoffs, beispielsweise 2 °; `°, bezogen auf das gesamte Erzeugungsmedium, zufriedenstellende Ergebnisse erreichbar sind.The fermentation is expediently as a multi-stage process in the usual Way done. A scraping of spores or mycelial felt can be useful from Streptomyces E-129 obtained from a suitable nutrient slant, can be used to initiate a small-scale vaccination step. One of this Submerged spore suspension obtained in the vaccination stage can, if desired, be sent directly to the Inoculation of the production medium can be used on a large scale, yet is taking place which is preferably the product of the inoculation stage for inoculation of a development stage used. As the developing medium, the same medium as in the following can be used Large-scale generation stage can be used, or it can be increased, for example its nutritional power can be modified. The freely educated in the development stage growing and spore-forming vegetative culture can then be used as a vaccine for the large-scale production medium be used. It has been shown that by using a comparatively small amount of this vegetative vaccine, for example 2 °; `°, based on the entire production medium, satisfactory results can be achieved.

Ein Charakteristikum von Streptomyces-E-129-Gärungen ist das frühe Auftreten des Spitzentiters. Bei 5-1- und 150-1-Fermentationen unter Verwendung der oben angegebenen Medien IV und VIII tritt diese Spitze zwischen 16 it;id 28 Stunden auf.A characteristic of Streptomyces E-129 fermentations is that they are early Occurrence of the top titer. Using in 5-1 and 150-1 fermentations of the media IV and VIII given above, this peak occurs between 16 it; id 28 Hours on.

B(i diesen 150-1-Gärungen war, obgleich nur 2 °/° vegetatiN-` s Inokulum verwendet wurde, das Wachstum ausgezeichnet, wobei der Spitzentiter innerhalb von 16- bis 20stündiger Gärzeit erreicht wurde. Ein guter Titer ist z. B. der einer Gesamtbrühe, die bei einer Verdünnung von 1:135 bis 1:250 im Nährbrüheverdünnungsversuch nach 18 Stunden Bebrüten bei 37°C Staphylococcus aureus zu inhibieren vermag. Während der 16- bis 24stündigen Gärung in den 150-1-Gefäßen tritt keine bemerkenswerte Veränderung in dem pH-Wert-des Gärmediums ein; in 5-1-Gärungen unter Verwendung des obengenannten Mediums VIII erfolgt jedoch ein schwacher Anstieg des pH-Werts der Maische nach etwa 40 bis 48 Stunden, d. h., der pH-Wert steigt auf etwa 7,7 an.In these 150-1 fermentations, although only 2% vegetative inoculum was used, growth was excellent, the peak titer being reached within 16 to 20 hours of fermentation. A good titer is, for example, that of a total broth which, at a dilution of 1: 135 to 1: 250 in the nutrient broth dilution test, is able to inhibit Staphylococcus aureus after 18 hours of incubation at 37 ° C. There is no noticeable change during fermentation in the 150-1 vessels for 16 to 24 hours in the pH value of the fermentation medium; in 5-1 fermentations using the above-mentioned medium VIII, however, there is a slight increase in the pH value of the mash after about 40 to 48 hours, i.e. the pH value rises to about 7 , 7 at.

Die Fermentation in dem Hafermehlmedium zeichnet sich durch die Bildung eines ausgeprägten gelben Pigments aus.The fermentation in the oatmeal medium is characterized by the formation a pronounced yellow pigment.

Das Antibiotikum E-129 kann in zufriedenstellender Weise durch die üblichen Plattenversuche unter Verwendung eines geeigneten grampositiven Testorganismus bestimmt werden. Sarcina lutea ist sehr geeignet, da er äußerst empfindlich und nicht pathogen ist. Verdünnungen des Antibiotikums E-129 und der Bezugsstandard (eine teilweise gereinigte Zubereitung von E-129 mit einem willkürlich festgesetzten Einheitenwert) werden mit einem m/20 Phosphatpuffer von pH 7,5 vor der Aufbringung auf die Versuchsplatte verdünnt, da bei einigen Organismen die Aktivität des Antibiotikums mit der Abnahme des BH-Werts innerhalb des für den Testorganismus verträglichen Bereichs zunimmt.The antibiotic E-129 can be used in a satisfactory manner by the conventional plate tests using a suitable gram-positive test organism to be determined. Sarcina lutea is very suitable as it is extremely sensitive and is not pathogenic. Dilutions of the antibiotic E-129 and the reference standard (a partially purified preparation of E-129 with an arbitrarily set Unit value) are mixed with a m / 20 phosphate buffer of pH 7.5 before application diluted on the test plate, since the activity of the antibiotic is in some organisms with the decrease of the BH value within the tolerable for the test organism Range increases.

4. Die Isolierung und Reinigung von E-129 Die bei vier submersen Gärung erzeugte antibiotische Aktivität von E-129 scheint hauptsächlich in der Lösung und nicht sb sehr im Mycel enthalten zu sein. Bei mit den Medien IV und VIII erhaltenen Nährflüssigkeiten wurden folgende Ergebnisse erzielt Tabelle VI Probe Aktivität Aktivität Medium IV Medium VIII Gesamtnährflüssigkeit ...... 100 100 Filtrierte Nährflüssigkeit und Waschwässer ............ 95,1 <71,5 Vereinigte Äthyl- und Butyl- acetatextrakte des Mycels . 1,0 <2,0 Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß diese Beobachtungen durch Verwendung anderer Fermentationsmedien Abweichungen erfahren können.4. The isolation and purification of E-129 The antibiotic activity of E-129 produced in four submerged fermentations appears to be contained mainly in the solution and not very much in the mycelium. The following results were obtained with the nutrient liquids obtained with the media IV and VIII Table VI Sample activity activity Medium IV Medium VIII Total nutrient liquid ...... 100 100 Filtered nutrient liquid and Washing water ............ 95.1 <71.5 United ethyl and butyl acetate extracts of the mycelium. 1.0 <2.0 It should be noted, however, that these observations may vary due to the use of other fermentation media.

Im Hinblick auf diese Gegebenheiten wurde eine Anzahl von Extraktionsarbeitsweisen entwickelt, die zur Gewinnung der antibiotischen Aktivität aus filtrierter Flüssigkeit bestimmt sind, wodurch das Antibiotikum von verunreinigenden Stoffen, vom Mycel und von den hauptsächlichen wasserunlöslichen Produkten der Gärung befreit wird.With this in mind, a number of extraction procedures have been developed designed to extract antibiotic activity from filtered liquid are determined, eliminating the antibiotic from contaminants, from the mycelium and freed from the main water-insoluble products of fermentation.

Bei einer Gewinnungsmethode, die sich als zufriedenstellend erwiesen hat, wird die filtrierte Flüssigkeit bei pH-Werten zwischen 7 und 9,5 mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für E-129, z. B. Benzol, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester, Chloroform oder n-Butanol, extrahiert. Das Antibiotikum E-129 geht in die organische Lösungsmittelphase, die dann in beliebiger zweckmäßiger Weise von der wäßrigen Phase abgetrennt wird, über. Das für eine wirksame Extraktion erforderliche Lösungsmittelvolumen hängt von dem jeweils verwendeten Lösungsmittel ab, doch reicht gewöhnlich eine Extraktion mit einem Lösungsmittelvolunien, das dem der filtrierten Nährflüssigkeit gleich ist, aus, um nahezu die gesamte antibiotische Aktivität aus der wäßrigen Phase zu entfernen.With a method of extraction that has been found to be satisfactory has the filtered liquid at pH values between 7 and 9.5 with a water-immiscible solvents for E-129, e.g. B. benzene, ethyl acetate, Butyl acetate, chloroform or n-butanol, extracted. The antibiotic E-129 goes into the organic solvent phase, which then in any convenient manner is separated from the aqueous phase over. That is necessary for an effective extraction Solvent volume depends on the particular solvent used, but is sufficient usually an extraction with a volume of solvent similar to that of the filtered Nutrient fluid is the same, off to almost all of the antibiotic activity to remove the aqueous phase.

Nach einem anderen Verfahren wird das Antibiotikum E-129 an säuregewaschener Aktivkohle adsorbiert, dass Aktivkohleadsorbat von der verbrauchten Flüssigkeit abgetrennt und die Aktivität mit Hilfe von Lösungsmitteln, z. B. von 80 %igem Aceton., saurem wäßrigem Aceton, n-Butanol u. dgl., eluiert.Another method is to acid-wash the antibiotic E-129 Activated carbon adsorbs that Activated carbon adsorbate from the consumed Separated liquid and the activity with the help of solvents, e.g. B. from 80% acetone, acidic aqueous acetone, n-butanol and the like, eluted.

Die E-129-Aktivität kann aber auch an Magnesiumtrisilikat adsorbiert werden, wonach dann das Adsorbat aus der verbrauchten wäßrigen Nährflüssigkeit abgetrennt und mit 80 bis 100 %igem Aceton eluiert wird.The E-129 activity can also be adsorbed on magnesium trisilicate are then separated from the adsorbate from the consumed aqueous nutrient fluid and eluting with 80 to 100% acetone.

Es hat sich gezeigt, daß rohe Festsubstanzen zweckmäßigerweise aus den so erhaltenen Rohlösungen durch einfaches Abdampfen der Lösungsmittel bis zur Trockne; vorzugsweise im Vakuum, hergestellt werden können. Es ist jedoch wünschenswert, das Lösungsmittel vor der Durchführung dieser Maßnahme über einem Entwässerungsmittel, beispielsweise Natriumsulfat, zu trocknen. Die auf diese Weise erhaltene feste Substanz ist gewöhnlich braungelbgefärbt und in Äthanol oder Aceton ziemlich löslich, nicht jedoch in merklichem Ausmaß in Wasser. Eine stärker gereinigte feste Substanz kann durch Waschen dieser trockenen Feststoffe mit einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, in dem E-129 selbst praktisch unlöslich ist, z. B. Petroläther, das einige der nicht aktiven Verunreinigungen entfernt, erhalten werden.It has been shown that raw solids are expediently made the crude solutions thus obtained by simply evaporating the solvent to Dryness; preferably in a vacuum. However, it is desirable the solvent over a dehydrating agent before performing this measure, for example sodium sulfate, to dry. The solid substance thus obtained is usually brownish yellow in color and quite soluble in ethanol or acetone, not but to a significant extent in water. A more purified solid substance can by washing these dry solids with a hydrocarbon solvent, in which E-129 itself is practically insoluble, e.g. B. petroleum ether, which some of the do not active impurities removed, are obtained.

Wenn das Antibiotikum in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Essigsäureäthylester, vorliegt, kann entweder vor oder nach der Abtrennung der rohen Feststoffe eine weitere Reinigungsstufe eingeschaltet werden. Diese Stufe besteht im Waschen des Lösungsmittels mit n/10-Natriumbicarbonat und n/100-Salzsäure und Wasser entweder einzeln oder in dieser Reihenfolge. Die aus in dieser Weise gewaschenen Lösungen erhaltenen Feststoffe sind heller gefärbt und wirksamer als ohne derartige Waschungen erhaltene entsprechende Festsubstanzen.When the antibiotic is in a water-immiscible organic Solvents, e.g. B. ethyl acetate is present, can either before or after A further purification stage can be switched on to separate the raw solids. This step consists in washing the solvent with n / 10 sodium bicarbonate and n / 100 hydrochloric acid and water either individually or in this order. From Solids obtained in this way washed solutions are lighter in color and more effective than corresponding solids obtained without such washes.

In den folgenden, lediglich der Erläuterung der Erfindung dienenden Beispielen wird die Erzeugung und Isolierung von E-129 in wenigstens teilweise gereinigter Form beschrieben.In the following, only serve to explain the invention Examples are the production and isolation of E-129 in at least partially purified Shape described.

Beispiel 1 Züchtung von Streptomy ces E-129 zur Bildung von E-129 im Laboratoriumsmaßstab 50-ml-Anteile des oben beschriebenen Mediums III wurden in 250-ml-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurden die Kolben mit 2 ml eines 24stündigen vegetativen Wachstums von Streptomyces E-129 beimpft.Example 1 Cultivation of Streptomyces E-129 to produce E-129 50 ml portions of Medium III described above were used on a laboratory scale Sterilized in 250 ml Erlenmeyer flasks at 120 ° C for 20 minutes. After cooling down the flasks were filled with 2 ml of a 24 hour vegetative growth of Streptomyces E-129 inoculated.

Dieser Impfstoff war vorher in 50-ml-Anteilen des unten angegebenen sterilen Mediums auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung (170 Schwingungen/Minute, Ausschlag 6,5 cm) bei 28° C gezüchtet worden. Impfstoffmedium Glycerin .......................... 5,00,1o Lab-Lemco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 0/0 Peptön (Evans) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/, Natrnumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0(o Destilliertes Wasser auf p$ 7,2 ......................... 100 0/0 Dieses Impfstoffmedium wurde mit- Sporen von Streptornyces E-129 beimpft, die von der Oberfläche von Hafermehl/ Kalk/Dextrose-Schrägagar erhalten wurden.This vaccine had previously been grown in 50 ml portions of the sterile medium indicated below on a shaker with a reciprocating motion (170 cycles / minute, deflection 6.5 cm) at 28 ° C. Vaccine medium Glycerin .......................... 5,00,1o Lab Lemco. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.0 0/0 Pepton (Evans). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.00 /, Sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 0 (not included) Distilled water on p $ 7.2 ......................... 100 0/0 This vaccine medium was inoculated with Streptornyces E-129 spores obtained from the surface of oatmeal / lime / dextrose agar slants.

Die das Fermentationsmedium enthaltenden Kolben wurden durch Schütteln bei 28° C 48 Stunden bebrütet, wonach die Flüssigkeit einen Titer von 135 Einheiten/ml aufwies. Beispiel 2 Züchtung von. Streptomyces E-129 zur Erzeugung von F_-129 in kleinem Maßstab Sporen von Streptomyces E-129 wurden aus einem Hafermehl/Kalk/Dextrose-Schrägagar in 50-ml-Anteile eines sterilen Impfstoffentwicklungsmediums der folgenden Zusammensetzung übergeführt: Medium IX Glycerin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0010 Lab-Lemco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/0 Pepton (Evans) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00j, Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5% Destilliertes Wasser auf pH 7,2 ......................... 100 0/0 Die Sporen wurden dann durch submerse Gärung durch 48stündiges Bebrüten bei 28° C auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 6,5 cm und 175 Schwingungen/Minute gezüchtet.The flasks containing the fermentation medium were incubated by shaking at 28 ° C for 48 hours, after which the liquid had a titer of 135 units / ml. Example 2 Breeding of. Streptomyces E-129 for small-scale production of F_-129 Streptomyces E-129 spores were transferred from an oatmeal / lime / dextrose agar slant to 50 ml portions of sterile vaccine development medium of the following composition: Medium IX Glycerin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0010 Lab Lemco. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.00 / 0 Peptone (Evans). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.00j, Sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5% Distilled water on pH 7.2 ......................... 100 0/0 The spores were then grown by submerged fermentation by incubating for 48 hours at 28 ° C on a shaker with a deflection of 6.5 cm and 175 cycles / minute.

Impfstoffe aus mehreren dieser Schüttelkolben wurden aseptisch vereinigt, und 75 ml wurden aseptisch unter Rühren in 5-1-Gärgefäße übergeführt, deren jedes 3 1 des oben beschriebenen Mediums VIII enthielt;, dann wurde auf 1000/0 mit Leitungswasser aufgefüllt, der pH-Wert mit Natronlauge auf 6,4 bis 6,6 eingestellt und das Ganze 75 Minuten bei etwa 1 Atmosphäre sterilisiert.Vaccines of several of these shake flasks were combined aseptically and 75 ml was transferred aseptically with stirring in 5-1-fermentation vessels, each containing 3 1 of the medium described above, VIII ;, then was made up to 1000/0 with tap water, the pH adjusted to 6.4 to 6.6 with sodium hydroxide solution and sterilized for 75 minutes at about 1 atmosphere.

Nach dem Abkühlen und Beimpfen wurden die 5-1-Gärgefäße bei 28° C gehalten, und es wurde mit einer Geschwindigkeit von 550 Umdrehungen/Minute gerührt. Die Belüftung erfolgte bei einer Geschwindigkeit von 3 1 steriler Luft in der Minute. Während der Gärung, insbesondere in den ersten 8 bis 20 Stunden, w=ar es erforderlich, Entschäumer zuzusetzen, um die gewünschte Geschwrindigkeit des Luftstroms aufrechtzuerhalten. Der pH-Wert des Gärmediums war nach der Sterilisation 6,52 und stieg während der Gärung (48 Stunden) allmählich auf 7,75 an.After cooling and inoculation, the 5-1 fermentation vessels were kept at 28 ° C and it was stirred at a speed of 550 revolutions / minute. The ventilation took place at a rate of 3 liters of sterile air per minute. During fermentation, especially in the first 8 to 20 hours, it would be necessary to Add defoamer to maintain the desired airflow speed. The pH of the fermentation medium was 6.52 after sterilization and increased during the Fermentation (48 hours) gradually increased to 7.75.

Die Ausbeute an Antibiotikum E-129 war nach etwa 20 Stunden maximal (etwa 200 bis 300 Einheiten/ml) und fiel nach 48 Stunden auf etwa 20 bis 50 Einheitenlml. Beispiel 3 Halbtechnische Züchtung von Streptomyces E-129 zur-Erzeugung von E-129 Ein vegetativer Impfstoff von Streptomyces E-129 wurde wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben erzeugt. Dieser vegetative Impfstoff wurde aus Schüttelkolben aseptisch in 5-1-Gärgefäße übergeführt, die jeweils 31 des oben beschriebenen Mediums IX enthielten. Dann wurde 25 Stunden bei 28° C, einer Rührgeschwindigkeit von 550 Umdrehungen/Minute und einem Luftstrom von 31/Minute fermentiert.The yield of antibiotic E-129 was at its maximum after about 20 hours (about 200 to 300 units / ml) and dropped to about 20 to 50 units / ml after 48 hours. Example 3 Semi-industrial cultivation of Streptomyces E-129 to produce E-129 A vegetative vaccine of Streptomyces E-129 was prepared as in Examples 1 and 2 generated. This vegetative vaccine was aseptically prepared from shake flasks transferred into 5-1 fermentation vessels, each containing 31 of the above-described medium IX. This was followed by 25 hours at 28 ° C., a stirring speed of 550 revolutions / minute fermented and an air flow of 31 / minute.

1501 des folgenden Mediums Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/0 Kalk (roher Kalkstein) pH 6,80 .................. - ... 2,0% enthaltende Gefäße wurden 45 Minuten bei 120` C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde dem Fermentationsgefäß eine sterile Dextroselösung in der Weise zugesetzt, daß die Endkonzentration an Dextrose 0,5 % betrug (obenerwähntes Medium IV).1501 of the following medium Oatmeal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.50 / 0 Lime (raw limestone) pH 6.80 .................. - ... 2.0% Containers were sterilized at 120 ° C for 45 minutes. After cooling, a sterile dextrose solution was added to the fermentation vessel so that the final concentration of dextrose was 0.5% (medium IV mentioned above).

Diese Gefäße wurden dann mit 3 1 des in den oben beschriebenen 5-1-Gefäßen erzeugten Impfstoffs beimpft. Die Fermentationen in diesen Gefäßen wurden bei 28c C, einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdrehungen/Minute und einem Luftstrom von etwa 113 1/Minute während der ersten 8 Stunden und von 226 1/Minute danach geführt. Die Fermentation zeichnete sich durch die Bildung eines ausgeprägten gelben Pigments aus.These vessels were then mixed with 3 liters of the 5-1 vessels described above produced vaccine. The fermentations in these vessels were at 28c C, a stirring speed of 350 revolutions / minute and an air flow of about 113 1 / minute during the first 8 hours and from 226 1 / minute thereafter guided. The fermentation was characterized by the formation of a pronounced yellow Pigments off.

Der Spitzentiter wurde nach 16- bis 24-stündiger Gärung erhalten, was von dem Wachstum in dem jeweiligen Gefäß abhing; die Titer in den einzelnen vier Gefäßen betrug 252, 192, 270 bzw. 258 Einheiten/ml.The top titer was obtained after fermentation for 16 to 24 hours, what depended on the growth in the respective vessel; the titers in each four vials was 252, 192, 270 and 258 units / ml, respectively.

Beispiel 4 Lösungsmittelextraktion von E-129 aus der Maische 550 ml E-129-Gärmaische wurden mit Kieselgur als Filterhilfe filtriert, und das erhaltene Filtrat wurde nach Einstellung des p11-Werts auf 7,1 3mal mit je I/5 Volumen n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde im Vakuum azeotrop unter Zugabe von Wasser bis zur Entfernung des Butanols auf ein kleines Volumen eingeengt. Die erhaltene wäßrige Suspension enthielt 73 °/o der Aktivität der Ausgangsmaische, und die verbrauchte Maische war von E-129-Aktivität frei.Example 4 Solvent extraction of E-129 from the mash 550 ml E-129 fermentation mash was filtered with kieselguhr as a filter aid, and the resulting After setting the p11 value to 7.1, the filtrate was poured 3 times with 1/5 volume of n-butanol each time extracted. The butanol extract was azeotroped in vacuo with the addition of water concentrated to a small volume until the butanol is removed. The received The aqueous suspension contained 73% of the activity of the starting mash and that of the spent mash Mash was free of E-129 activity.

Beispiel 5 Lösungsmittelextraktion und Isolierung von E-129 aus der Maische 10 1 einer filtrierten E-129-Maische wurden mit der Hälfte des Volumens an Essigsäureäthylester extrahiert. Der Essigsäureäthylesterextrakt wurde im Vakuum auf etwa 200 ml eingeengt und 5mal mit je 25 ml n/10-Natriumbicarbonat, 2mal mit je 25 ml n/100-Salzsäure und 2mal mit je 25 ml Wasser gewaschen. Der Extrakt wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhielt 350 mg orangebraungefärbter fester Substanz, die 92 % der Aktivität der ursprünglichen filtrierten Maische enthielt. An Hand der folgenden in °/o angegebenen Ausbeuten wird das Extraktionsschema erläutert. Untersuchte Fraktionen "/o Aktivität Filtrierte Maische (als Bezug) ......... 100 Verbrauchte Maische ................. keine n/10-Natriumbicarbonatwaschflüssigkeit 3,5 n/100-Salzsäurewaschflüssigkeit ........ 1,2 Waschwasser ........................ 0,4 Äthanollösung der schließlich erhaltenen Festsubstanz....................... 92,0 Beispiel 6 Extraktion von E-129 aus der Maische durch Adsorption an Aktivkohle 2,45 1 filtrierter E-129-Gärmaische wurden mit 12,5 g säuregewaschener Aktivkohle (Sorte Sutcliffe Speakman 127 W) und 6 g Kieselgur 1 Stunde lang aufgeschlämmt. Die Aktivkohle wurde abgetrennt und nacheinander mit 250 ml und 200 ml 80°/jgem wäßrigem Aceton eluiert. Bei der Gehaltsprüfung der Proben gegenüber der filtrier- ten Ausgangsmaische wurden folgende Ergebnisse er- halten. Untersuchte Fraktion 0/,-Aktivität_ Filtrierte Maische (als Bezug) ......... 100 Verbrauchte Maische ................. keine Aktivkohleeluat 1 ... .. . . . ... ... . ... . . 31 Aktivkohleeluat 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Konzentrat aus den vereinigten Aktiv- kohleeluaten ....................... 27 Beispiel ? Extraktion von E-129 durch Adsorption an Magnesium-- trisilikat 10 1 filtrierte Maische wurden lj2 Stunde mit 100 g Magnesiumtrisilikat aufgeschlämmt. Das erhaltene Gemisch wurde durch ein Kieselgurbett filtriert und die feste Substanz mit Wasser gewaschen. Die Aktivität wurde dann nacheinander mit 1,5 1 reinem Aceton und 11 80°/jgem wäßrigem Aceton aus dem Adsorbat eluiert. Die vereinigten Eluate wurden im Vakuum zu einer feinen wäßrigen Suspension des Antibiotikums eingeengt. Untersuchte Fraktion 1 °/o-Aktivität Filtrierte Maische (als Bezug) ......... 100 Verbrauchte Maische ................. keine Waschwasser ........................ keine 1. Acetoneluat ....................... 48,8 2. Acetoneluat ....................... 13,8 Wäßrige Suspension .................. 58,3 A. Beispiele für die Wirkung des Eisens Beispiel 8 Zwei Reihen von je vier 5-1-Fermentationen wurden mit dem Hafermehlgrundmedium mit 1,5 °/o Glucose und 0,70/, Maisquellwasser zubereitet. Hafermehl ....... **********'** .... 2,50/, Kalkstein . . . . . . . . . ****'***** ...... 2,00/0 Maisquellwasserfeststoffe . . . . . . . . . . . 0,70/0 Glucose (getrennt sterilisiert) ....... 1,50/0 (der p11-Wert wurde mit Natriumhydroxyd auf 6,8 bis 7,0 eingestellt).Example 5 Solvent extraction and isolation of E-129 from the mash 10 1 of a filtered E-129 mash were extracted with half the volume of ethyl acetate. The ethyl acetate extract was concentrated in vacuo to about 200 ml and washed 5 times with 25 ml of n / 10 sodium bicarbonate each time, twice with 25 ml of n / 100 hydrochloric acid each time and twice with 25 ml of water each time. The extract was then dried over anhydrous sodium sulfate and the solution was evaporated to dryness in vacuo. 350 mg of orange-brown solid substance were obtained, which contained 92% of the activity of the original filtered mash. The extraction scheme is explained using the yields given in% below. Fractions examined "/ o activity Filtered mash (for reference) ......... 100 Used mash ................. none n / 10 sodium bicarbonate wash 3.5 n / 100 hydrochloric acid wash liquid ........ 1,2 Wash water ........................ 0.4 Ethanol solution of the finally obtained Solid matter ....................... 92.0 Example 6 Extraction of E-129 from the mash by adsorption of activated carbon 2.45 l of filtered E-129 fermentation mash was 12.5 g acid-washed activated carbon (variety Sutcliffe Speakman 127 W) and 6 g of diatomite slurried for 1 hour. The activated carbon was separated and successively with 250 ml and 200 ml of 80% aqueous acetone eluted. When checking the content of the samples against the filter The following results were obtained from the initial mash keep. Investigated fraction 0 /, - activity_ Filtered mash (for reference) ......... 100 Used mash ................. none Activated carbon eluate 1 ... ... . . ... .... ... . 31 Activated charcoal eluate 2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Concentrate from the combined active coal eluates ....................... 27 Example ? Extraction of E-129 by adsorption on magnesium trisilicate 10 l of filtered mash was slurried with 100 g of magnesium trisilicate for lj2 hours. The resulting mixture was filtered through a kieselguhr bed and the solid substance was washed with water. The activity was then eluted successively with 1.5 1 of pure acetone, and 11 80 ° / Jgem aqueous acetone from the adsorbate. The combined eluates were concentrated in vacuo to give a fine aqueous suspension of the antibiotic. Fraction 1% activity examined Filtered mash (for reference) ......... 100 Used mash ................. none Washing water ........................ none 1. Acetone eluate ....................... 48.8 2. Acetone eluate ....................... 13.8 Aqueous suspension .................. 58.3 A. Examples of the Effect of Iron Example 8 Two series of four 5-1 fermentations each were prepared with the oatmeal base medium containing 1.5% glucose and 0.70 % corn steep liquor. Oatmeal ....... ********** '** .... 2.50 /, Limestone. . . . . . . . . **** '***** ...... 2.00 / 0 Corn steep liquor solids. . . . . . . . . . . 0.70 / 0 Glucose (sterilized separately) ....... 1.50 / 0 (the p11 value was adjusted to 6.8 to 7.0 with sodium hydroxide).

Eine Reihe der Fermentationen wurde mit 60 Teilen/ Million Eisen in Form von Ferricitrat versetzt. jedes Fermentationsgefäß wurde mit 20/0 einer vegetativen Kultur von Streptomyces E-129 beimpft, die auf dem oben beschriebenen Hafermehlmedium, dem kein Maisquellwasser zugesetzt worden war und das nur 0,501, Glucose enthielt, gezüchtet worden war. Dann wurde bei 27° C und einem Luftstrom von 3 1/Mirute fermentiert. Bei der Gehaltsprüfung gegen Sarcina lutea wurden folgende Ergebnisse in Einheiten/ml erhalten. Stunden Kontrollen Mit 60 Teilen/Million (ohne Eisen) Eisen 20 315 495 28 385 510 36 355 395 Beispiel 9 Die Wirkung des Eisens wurde ferner durch Verwendung des gleichen Mediums und unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 8 beschrieben, jedoch mit einem Gehalt von 30, 60 bzw. 120 Teilen/Million Eisen in Form von Ferricitrat untersucht. Es wurden folgende durchschnittliche Titer erhalten, wobei drei Fermentationsgefäße in jeder Reihe verwendet worden waren: Kon- mt 30 Teilen/ Mit 60 Teilen/ Mit120Teilen/ Stunden trollen ohneEisen Million Eisen Million Eisen Million Eisen 20 410 465 445 500 28 480 620 525 455 36 415 465 375 345 Beispiel 10 Die im Beispiel 9 beschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei jedoch geringere Eisenmengen, nämlich 15, 30 bzw. 45 Teile/Million eingesetzt wurden. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten, die den Durchschnitt von drei Fermentationen darstellen Kon- Mit 15 Teilen/ Mit 30 Teilen/ Mit 45 Teilen/ Stunden trollen Million Eisen Million Eisen Million Eisen ohneEisen 20 155 130 110 120 28 400 360 410 405 36 375 545 495 485 Beispiel 11 Zur Erhärtung der Tatsache, daß verschiedenartige Eisenquellen die gleiche günstige Wirkung ausüben, wurden drei Reihen von je vier Fermentationen angesetzt, wie dies in den Beispielen 8 bis 10 beschrieben wurde, wobei jedoch in allen Fällen 30 Teile/Million Eisen zugesetzt wurden. Bei einer Reihe wurde, wie oben beschrieben, Ferricitrat verwendet, bei einer anderen Ferrichlorid und bei der dritten Ferroammoniumsulfat. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt, wobei die angegebenen Zahlen den Durchschnitt jeder Reihe darstellen: 30 Teile/Million 30 Teile/Million 30 Teile/Million Stunden als Ferricitrat als Ferrichlorid als Ferroammo- niumsulfat 28 520 490 510 36 445 485 475 Es ist offensichtlich, daß beliebige dieser Salze verwendet werden können.A number of fermentations were spiked with 60 parts / million iron in the form of ferricitrate. each fermentation vessel was inoculated with 20/0 of a vegetative culture of Streptomyces E-129 which had been grown on the oatmeal medium described above to which no corn steep liquor had been added and which contained only 0.501 glucose. Fermentation was then carried out at 27 ° C. and an air flow of 3 1 / Mirute. In the content test against Sarcina lutea, the following results were obtained in units / ml. Hours of 60 part / million controls (without iron) iron 20 315 495 28 385 510 36 355 395 Example 9 The effect of iron was further investigated by using the same medium and under the same conditions as described in Example 8, but with a content of 30, 60 and 120 parts / million iron in the form of ferricitrate. The following average titers were obtained using three fermentation vessels in each row: Made up of 30 parts / With 60 parts / With 120 parts / Trolling for hours without iron million iron million iron million iron 20 410 465 445 500 28 480 620 525 455 36 415 465 375 345 Example 10 The procedure described in Example 9 was repeated, but using smaller amounts of iron, namely 15, 30 and 45 parts / million, respectively. The following results were obtained, which represent the average of three fermentations Con- With 15 parts / With 30 parts / With 45 parts / Hours trolling a million irons, a million irons, a million irons without iron 20 155 130 110 120 28 400 360 410 405 36 375 545 495 485 Example 11 To substantiate the fact that different iron sources have the same beneficial effect, three series of four fermentations each were set up as described in Examples 8-10, but with 30 parts / million iron added in all cases. One series used ferric citrate as described above, another ferric chloride and the third ferroammonium sulfate. The following results were obtained, with the numbers shown representing the average of each series: 30 parts / million 30 parts / million 30 parts / million Hours as ferricitrate as ferric chloride as ferroammo- sodium sulfate 28 520 490 510 36 445 485 475 Obviously, any of these salts can be used.

B. Beispiele für den Nachweis der Wirkung von Maisquellwasser Beispiel 12 Drei 5-1-Fermentationsgefäße wurden mit jeweils 3 1 des folgenden Mediums beschickt, wobei der Glucoseanteil getrennt sterilisiert wurde: Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/0 Kalkstein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/1 Glucose .......................... 0,50/0 Zusätzlich hierzu enthielt ein Fermentationsgefäß 0,23 % Maisquellwasserfeststoffe, das zweite 0,46 und das dritte 0,70°j1. Der ph-Wert in jedem Fermentationsgefäß wurde mit Natriumhydroxyd auf 6,8 bis 7;0 eingestellt.B. Examples for demonstrating the effect of corn steep water Example 12 Three 5-1 fermentation vessels were each charged with 3 liters of the following medium, the glucose portion being sterilized separately: Oatmeal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.50 / 0 Limestone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.00 / 1 Glucose .......................... 0.50 / 0 In addition, one fermentation vessel contained 0.23% corn steep liquor solids, the second 0.46 and the third 0.70%. The pH in each fermentation vessel was adjusted to 6.8 to 7.0 with sodium hydroxide.

,Jede Fermentation wurde bei 27 bis 28° C geführt, und folgende Ergebnisse wurden erhalten: Stunden Maisquellwasserfeststoffe 0,230/0 I 0,460/, I 0,700/, 30 195 350 375 28 210 390 450 Daraus geht hervor, daß mit dem niedrigsten Gehalt an Maisquellwasser keine Steigerung über den üblichen Titer von 200 bis 300 Einheiten/ml, der erfahrungsgemäß mit dem Grundmedium erzielt wird, hinaus erfolgt, wohingegen 0,461J1 und 0,700/1 Maisquellwasser beträchtliche Steigerungen ergeben., Each fermentation was carried out at 27 to 28 ° C and the following results were obtained: Hours of corn steep liquor solids 0.230 / 0 I 0.460 /, I 0.700 /, 30 195 350 375 28 210 390 450 This shows that the lowest corn steep liquor content does not increase beyond the usual titer of 200 to 300 units / ml, which experience has shown to be achieved with the basic medium, whereas 0.461/1 and 0.700/1 corn steep liquor produce considerable increases.

Beispiel 13 Zur Ermittlung des besten Gehalts an Maisquellwasser wurden vier Reihen von je drei 5-1-Fermentationen angesetzt, wobei das Hafermehlgrundmedium mit 1,50/0 Glucose verwendet wurde. Zu einer Reihe wurden 0,45 % Maisquellwasserfeststoffe, zu der zweiten 0,7 0/1, zu der dritten 0,90/0 und zur vierten 1,10/0 gegeben. Die Fermentationsgefäße wurden, wie oben beschrieben, beimpft und fermentiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben, wobei jede Zahl den Durchschnitt der drei Fermentationsgefäße darstellt. Stunden Maisquellwasserfeststoffe 0,450/. 1 0,701/o i 0,901/o 1 1,10/, 18 486 400 400 165 26 375 410 375 345 36 420 410 415 180 Daraus ist ersichtlich, daß 1,1% Maisquellwasserfeststoffe einen schädlichen Einfluß auf den Titer ausüben und daß 0,9 0/1 etwa die obere Grenze darstellen.Example 13 To determine the best corn steep water content, four series of three 5-1 fermentations each were set up, using the oatmeal base medium with 1.50/0 glucose. One row was added 0.45% corn steep liquor solids, the second 0.7 0/1, the third 0.90 / 0, and the fourth 1.10 / 0. The fermentation vessels were inoculated and fermented as described above. The results are shown in the table below, with each number representing the average of the three fermentation vessels. Hours of corn steep liquor solids 0.450 /. 1 0.701 / oi 0.90 1 / o 1 1.10 /, 18 486 400 400 165 26 375 410 375 345 36 420 410 415 180 From this it can be seen that 1.1% corn steep liquor solids has a deleterious effect on the titre and that 0.9 0/1 is about the upper limit.

C. Beispiel für die Wirkung von Glucose Beispiel 14 Ferner wurde die Wirkung von zugesetzter Glucose bestimmt. 5-1-Fermentationen mit dem Hafermehlgrundmedium und Glucosegehalten von 0,5 und 1,50/0 und Fermentationen mit dem Hafermehlgrundmedium und 0,70/1 Maisquellwasserfeststoffe mit Glucosegehalten von 0,5 und 1,5 0/1 wurden angesetzt, beimpft und fermentiert, wie dies im Beispiel 12 beschrieben wurde. Dabei wurden folgende Ergebnisse in Einheiten/ml erhalten. Hafermehlmedium Hafermehlmedium und 0,7 °/o Maisquellwasserfeststoffe Stunden Glucose 0,5 o/' Glucose 1,5 Glucose 0,5 °/o Glucose 1,5 0% a I b I a I b a I b I c I a I b I c 20 198 304 214 125 374 486 326 368 346 374 28 192 300 210 132 512 456 428 864 448 515 Daraus geht hervor, daß die Verwendung von 1,5% Glucose in dem Hafermehlgrundmedium gegenüber 0,5 0/0 keine günstige Wirkung aufweist, während eine beträchtliche Titererhöhung durch Verwendung von 1,50/0 Glucose erzielt wird, wenn 0,70/0 Maisquellwasserfeststoffe mitverwendet werden. Beispiel 15 Herstellung von E-129 454 1 folgenden Mediums wurden mit 800 ml einer kräftig wachsenden Kultur von Streptomyces E-129, die in Schüttelkolben zubereitet worden war, beimpft. Glycerin .......................... 5 0/0 Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 / 0 Kaseinabbauprodukt . . . . . . . . . . . . . . . 1 0t0 N atriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 °o (das pH wurde auf 7,0 eingestellt; 30minütige Sterilisation bei 120 C).C. Example of the Effect of Glucose Example 14 The effect of added glucose was also determined. 5-1 fermentations with the oatmeal base medium and glucose levels of 0.5 and 1.50 / 0 and fermentations with the oatmeal base medium and 0.70 / 1 corn steep liquor solids with glucose levels of 0.5 and 1.5% were set up, inoculated and fermented as described in Example 12. The following results were obtained in units / ml. Oatmeal medium oatmeal medium and 0.7% corn steep liquor solids Hours glucose 0.5% glucose 1.5 glucose 0.5% glucose 1.5 0% a I b I a I ba I b I c I a I b I c 20 198 304 214 125 374 486 326 368 346 374 28 192 300 210 132 512 456 428 864 448 515 It can be seen that the use of 1.5% glucose in the oatmeal base medium has no beneficial effect compared to 0.5%, while a considerable increase in titer is achieved by using 1.50 / 0 glucose when 0.70 / 0 Corn steeple solids are included. Example 15 Preparation of E-129 454 1 of the following medium was inoculated with 800 ml of a vigorously growing culture of Streptomyces E-129 which had been prepared in shake flasks. Glycerin .......................... 5 0/0 Meat extract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0/0 Casein breakdown product. . . . . . . . . . . . . . . 1 0t0 Sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.5 ° o (the pH was adjusted to 7.0; sterilization at 120 ° C for 30 minutes).

Das Medium wurde gerührt und der Tank 28 Stunden bei 27` C gehalten. Ein Strom steriler Luft wurde während der ersten 8 Stunden mit 170 1/Minute und danach mit 283 l; Minute aufrechterhalten.The medium was stirred and the tank was held at 27 ° C for 28 hours. A flow of sterile air was maintained at 170 l / minute and. For the first 8 hours then with 283 l; Maintain minute.

91 bis 113 1 der Kultur wurden zum Beimpfen eines Tanks verwendet, der 2250 1 des folgenden Mediums enthielt Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5010 Kalk ... . ......................... 2,00;o Glucose (gesondert zugesetzt) ....... 0,501/0 (pH-Einstellung mit Salzsäure auf 7,0; 45minütige Sterilisation bei 120° C).91 to 113 liters of the culture were used to inoculate a tank containing 2250 liters of the following medium Oatmeal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5010 Lime .... ......................... 2.00; o Glucose (added separately) ....... 0.501 / 0 (pH adjustment with hydrochloric acid to 7.0; sterilization for 45 minutes at 120 ° C).

Das Medium wurde gerührt und der Tank 20 Stunden bei 27° C gehalten. Ein Luftstrom wurde während der ersten 8 Stunden mit 1130 1/Minute, während der nächsten 4 Stunden mit 17001 ;Minute und danach mit 19801/ Minute aufrechterhalten.The medium was stirred and the tank was held at 27 ° C for 20 hours. An air stream was during the first 8 hours with 1130 1 / min, while the next 4 hours by 17001; minute, and thereafter with 19801 / min maintained.

910 bis 1130 1 .dieser Kultur wurden zur Beimpfung eines Tanks verwendet, der 22 700 1 des folgenden Mediums enthielt Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/() Kalk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/0 Maisquellwasserfeststoffe ........... 0,70/0 Glucose (gesondert zugesetzt) ....... 1,50,10 (pH-Einstellung mit NaOH auf 6,8; 30minütige Sterilisation bei 120° C).910 to 1130 liters of this culture were used to inoculate a tank containing 22 700 liters of the following medium Oatmeal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.50 / () Lime . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.00 / 0 Corn steeple solids ........... 0.70 / 0 Glucose (added separately) ....... 1.50.10 (pH adjustment with NaOH to 6.8; sterilization for 30 minutes at 120 ° C).

Das Medium wurde gerührt und der Tank 22 Stunden bei 27` C gehalten. Ein Luftstrom wurde während der ersten 8 Stunden mit 5660 1/Minute und danach mit 12 740 ljMinute aufrechterhalten. Die Maische wurde mit. Kieselgur versetzt und das Mycel durch Filtration auf einem vorbedeckten Vakuumfilter entfernt. Das Filtrat wurde dann im Gegenstrom mit Essigsäureäthylester extrahiert, wobei das Verhältnis von :Maische zu Lösungsmittel etwa 10: 1 betrug. Es wurden insgesamt 3314 1 Essigsäureäthylesterextrakt erhalten, die im Vakuum bei etwa 25° C auf 354 1 eingedampft wurden. Das Konzentrat wurde abfiltriert, mit Wasser gesättigt, mit 0,01 n-Salzsäure, dann mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das gewaschene und getrocknete Konzentrat wurde im Vakuum weiter eingeengt, bis ein Volumen von 32 1 erreicht war. Während des Verdampfens schied sich E-129 ab, und beim Filtrieren erhielt man zwei Anteile: Anteil A..... 1000 g, Gehalt 1305 Einheiten mg Anteil B..... 520 g, Gehalt 1815 Einheiten !mg Durch Zugabe von 3 Volumina Petroläther (Siedebereich 100 bis 120° C) zu dem Filtrat erhielt man Anteil C..... 1540 g, Gehalt 2565 Einheiten/mg The medium was stirred and the tank was held at 27 ° C for 22 hours. Air flow was maintained at 5660 1 / minute for the first 8 hours and then at 12,740 1 / minute. The mash was with. Diatomaceous earth was added and the mycelium was removed by filtration on a pre-covered vacuum filter. The filtrate was then extracted in countercurrent with ethyl acetate, the ratio of: mash to solvent being about 10: 1. A total of 3314 l of ethyl acetate extract was obtained, which was evaporated to 354 l in vacuo at about 25 ° C. The concentrate was filtered off, saturated with water, washed with 0.01N hydrochloric acid, then with water and dried over sodium sulfate. The washed and dried concentrate was further concentrated in vacuo until a volume of 32 l was reached. E-129 separated out during evaporation and two parts were obtained on filtration: Part A ..... 1000 g, content 1305 units mg Part B ..... 520 g, content 1815 units! Mg By adding 3 volumes of petroleum ether (boiling range 100 to 120 ° C.) to the filtrate, one obtained Content C ..... 1540 g, content 2565 units / mg

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Use of the Streptomyces strain E-129 or an E-129 producing mutant thereof for the production of the antibiotic E-129 or an antibiotic mixture containing E-129 by submerged cultivation or by surface fermentation in nutrient solutions with the addition of growth-promoting substances and recovering the antibiotic by extraction and / or adsorption and purification in a known way.

2. Use of corn steep liquor as a nitrogen source in nutrient solutions for the biological production of the antibiotic E-129.

3. Use of a two or trivalent iron salt in nutrient solutions for the biological production of the antibiotic E-129.