DE10331879A1

DE10331879A1 - Drug delivery system

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Publication number: DE10331879A1
Application number: DE10331879A
Authority: DE
Inventors: Sabine Dr.-Ing. Wolf; Martina Dr.-Ing. Jäger; Thorsten Dr.-Ing. Bangsow; Bernhard Dr. Pelzer
Original assignee: ESPLORA GmbH
Current assignee: ESPLORA GmbH
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2005-03-03
Also published as: WO2005004924A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Wirkstofftransportsystem sowie die Verwendung wenigstens eines Transportvermittlers und gegebenenfalls eines mit dem Transportvermittler verbundenen und von diesem verschiedenen Trägers zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. Wirkstofftransportsystems, in Wirkstoff enthaltender oder wirkstofffreier Form, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere oder zum Transport von Wirkstoff über eine Stoffbarriere hinweg geeignet ist und wenigstens einen Transportvermittler und gegebenenfalls einen mit dem Transportvermittler verbundenen und von diesem verschiedenen Träger umfasst, wobei der Transportvermittler und/oder der Träger geeignet sind, einen oder mehrere Wirkstoffe aufzunehmen, einzuschließen, zu binden, zu adsorbieten und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler zu koppeln, oder der Transportvermittler und/oder der Träger einen oder mehrere Wirkstoffe aufgenommen, eingeschlossen, gebunden, adsorbiert und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler gekoppelt aufweisen. Um ein neues, verbessertes Wirkstofftransportsystem bereitzustellen, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere, insbesondere der Blut-Hirn-Schranke in Wirbeltieren, und zum Transport von Wirkstoff über eine solche Stoffbarriere hinweg geeignet ist, wird vorgeschlagen, daß der Transportvermittler einen oder mehrere Stoffe umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: filamentöse ...The present invention relates to a drug delivery system and the use of at least one transport mediator and optionally associated with the transport mediator and different from this carrier for producing a drug or drug delivery system, in drug-containing or drug-free form, which for overcoming a material barrier or for the transport of active ingredient a material barrier is suitable and comprises at least one transport mediator and optionally a carrier associated with and different from the transport mediator, wherein the transport mediator and / or the carrier are adapted to receive, enclose, bind, adsorb and / or adsorb one or more active substances otherwise directly or indirectly coupled via the carrier to the transport mediator, or the transport mediator and / or the carrier received one or more active substances, including, bound, adsorbie rt and / or otherwise directly or indirectly coupled via the carrier to the transport mediator. In order to provide a new, improved drug delivery system which is suitable for overcoming a tissue barrier, particularly the blood-brain barrier in vertebrates, and for transporting drug across such a barrier, it is proposed that the transport agent comprise one or more substances which are selected from the following group: filamentous ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Wirkstofftransportsystem, in Wirkstoff enthaltender oder wirkstofffreier Form, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere oder zum Transport von Wirkstoff über eine Stoffbarriere hinweg geeignet ist und wenigstens einen Transportvermittler und gegebenenfalls einen mit dem Transportvermittler verbundenen und von diesem verschiedenen Träger umfasst, wobei der Transportvermittler und/oder der Träger geeignet sind, einen oder mehrere Wirkstoffe aufzunehmen, einzuschließen, zu binden, zu adsorbieren und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler zu koppeln, oder der Transportvermittler und/oder der Träger einen oder mehrere Wirkstoffe aufgenommen, eingeschlossen, gebunden, adsorbiert und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler gekoppelt aufweisen.The The invention relates to a drug delivery system containing active ingredient or drug-free form, which helps to overcome a material barrier or suitable for the transport of active substance across a material barrier and at least one transport intermediary and, where appropriate one associated with the transport agent and different from this carrier wherein the transport mediator and / or the carrier is suitable are to include, include, or include one or more drugs bind, adsorb and / or otherwise directly or indirectly through the carrier to couple to the transport agent, or the transport agent and / or the carrier one or more active substances included, included, bound, adsorbed and / or otherwise directly or indirectly via the carrier have coupled to the transport agent.

Der Transport von Therapeutika ist der limitierende Faktor in der Umsetzung der Erkenntnisse neurologischer Forschung in effektive klinische Neuro-Therapeutika für Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Schwierigkeiten bei der Applikation von Medikamenten werden durch das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke (BHS) verursacht. Sowohl die Versorgung als auch der Schutz des Gehirnes wird bei allen Wirbeltieren durch eine die Blutgefässe auskleidende einlagige Endothelzellschicht aufrechterhalten. Das kapillare Netz ist dabei so dicht, das kein Neuron oder keine Gliazelle weiter als 20 μm von einem versorgenden Gefäß entfernt ist.Of the Transport of therapeutics is the limiting factor in the implementation the findings of neurological research into effective clinical Neuro-therapeutics for Diseases of the central nervous system (CNS). Difficulties in the application of drugs are characterized by the presence caused the blood-brain barrier (BBB). Both the supply as also the protection of the brain becomes in all vertebrates by a the blood vessels sustained lining single layer endothelial cell layer. The capillary network is so dense that no neuron or no glial cell further than 20 μm removed from a serving vessel is.

Zusätzlich zur BHS existieren im Gehirn zwei weitere Barrieresysteme, die Spinnenhaut, welche die Oberfläche des Hirngewebes bedeckt, und der Plexus chorioideus, der eine Schranke zwischen Blut und Gehirnflüssigkeit bildet. Beim Menschen ergibt sich daraus eine Kapillarlänge von ungefähr 650 km und eine Austauschfläche des Gehirnendothels von schätzungsweise 20 m². Diese Fläche übersteigt die der beiden anderen Systeme um das Tausendfache, wodurch die Überwindung der BHS als für den quantitativen Transport relevant angesehen werden muss.In addition to the BBB, there are two other barrier systems in the brain, the spider skin, which covers the surface of the brain tissue, and the choroid plexus, which forms a barrier between blood and cerebral fluid. In humans this results in a capillary length of approximately 650 km and an exchange surface of the brain endothelium of approximately 20 m ² . This area exceeds that of the other two systems by a factor of a thousand, making the overcoming of the BHS relevant for quantitative transport.

Die Endothelzellschicht ist mit 200–300 nm sehr dünn, woraus sich im Vergleich zur großen Fläche ein nur geringes Volumen von 5 ml für das gesamte menschliche Gehirn ergibt. Aber diese dünne Zellschicht stellt eine der striktesten Barrieren im Körper dar.The Endothelial cell layer is 200-300 very thin, which results in only a small volume compared to the large area of 5 ml for the entire human brain results. But this thin cell layer represents one of the strictest barriers in the body.

Der Transport von Medikamenten vom Blut ins Gehirn ist durch das Vorhandensein verschiedener Mechanismen limitiert. Dazu gehören eine physikalische Grenze, die durch die Endothelzellen selbst gebildet wird, eine enzymatisch vermittelte und eine Efflux-Transportbarriere. Diese Multifunktionalität der BHS begründet sich im Zusammenspiel verschiedener Zellen in den mikrovaskulären Gefäßen. Die Endothelzellen stehen hier in engem Kontakt mit kapillären Perizyten und Astrozyten. Das Endothel und die Perizyten teilen sich dabei eine gemeinsame Basalmembran, und 99 % der kapillären Oberfläche ist in Kontakt mit den Endfüßchen der Astrozyten.Of the Transport of drugs from the blood to the brain is due to the presence limited to various mechanisms. These include a physical limit, which is formed by the endothelial cells themselves, an enzymatic mediated and an efflux transport barrier. This multifunctionality of the BHS justified in the interaction of different cells in the microvascular vessels. The Endothelial cells are in close contact with capillary pericytes and astrocytes. The endothelium and the pericytes share one common basement membrane, and 99% of the capillary surface is in contact with the End of the astrocytes.

Kapillaren, die andere Organe versorgen, haben poröse Zellwände und Zwischenräume zwischen den Zellen. Zusammen mit einer aktiven Pinozytose wird sowohl eine freie para- und als auch transzelluläre Diffusion im Blut gelöster Substanzen ermöglicht. Im Gegensatz dazu zeigen Hirnkapillarendothelzellen epithel-ähnliche undurchlässige Zell-Zell-Kontakte (tight junctions), so dass der parazelluläre Austausch bzw. Transport verhindert wird. Dazu kommt eine stark verringerte pinozytotische Aktivität, die einem unspezifischen transzellulären Transport entgegenwirkt. Diese Kombination des sehr hohen Widerstandes der endothelialen Tight Junctions und der geringen pinozytotischen Aktivität bildet die physikalische Schrankenfunktion.capillaries, the other organs provide, have porous cell walls and spaces between the cells. Together with an active pinocytosis is both a free para- and transcellular diffusion in the blood of dissolved substances allows. In contrast, brain capillary endothelial cells show epithelial-like features impermeable Cell-cell contacts (tight junctions), allowing the paracellular exchange or transport is prevented. In addition a strongly reduced one comes pinocytotic activity, which counteracts an unspecific transcellular transport. This combination of very high endothelial resistance Tight junctions and the low pinocytotic activity forms the physical barrier function.

In der Literatur ist auch das Vorhandensein einer sogenannten enzymatischen Blut-Hirn-Schranke zusätzlich zur physikalischen beschrieben. Die Hirnkapillarendothelzellen, ebenso wie Perizyten und Astrozytenendfüsschen, exprimieren eine Reihe von auf der Oberfläche lokalisierten Enzymen, die eine Vielzahl von aktiven Substanzen durch Modifikation in ihrer Wirkung blockieren können. Dazu gehören unter anderem Aminopeptidasen, Carboxypeptidasen und Endopeptidasen. Zirkulierendes Adenosin gelangt z.B. über den Nukleosidtransporter Typ2 (CNT2) ins Gehirn, kann aber keine pharmakologische Wirkung entfalten, da es sehr schnell an der BHS durch Enzyme metabolisiert wird. Im Gegensatz dazu wird aus der inaktiven Vorstufe L-DOPA, die in das Gehirn über den Transporter für große neutrale Aminosäuren (LAT1) transportiert wird, an der BHS das aktive Dopamin freigesetzt.In The literature is also the presence of a so-called enzymatic Blood-brain barrier in addition to the physical described. The brain capillary endothelial cells, as well as pericytes and astrocyte pus, express a number from on the surface Localized enzymes containing a variety of active substances can block their effect by modification. These include under other aminopeptidases, carboxypeptidases and endopeptidases. circulating Adenosine is e.g. above the nucleoside transporter type 2 (CNT2) into the brain, but can not Pharmacological effect unfold, as it is very fast on the BBB is metabolized by enzymes. In contrast, from the inactive precursor L-DOPA, which enters the brain via the transporter for large neutral amino acids (LAT1) is released at the BBB the active dopamine.

Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass verschiedene Medikamente die Blut-Hirn-Schranke zwar mittels freier Diffusion überqueren können, dann aber aus dem Hirnkomhartiment sofort wieder aktiv ins Blut zurück transportiert werden. Daher besteht eine Strategie zur besseren Aufnahme der Medikamente ins Gehirn in der zeitgleichen Gabe von Inhibitoren dieser sogenannten Efflux-Transporter, um einen Rücktransport zu verhindern.Another difficulty is that although various drugs can cross the blood-brain barrier by means of free diffusion, they are then immediately actively transported back into the blood from the brain compartment. Therefore, there is a strategy for better absorption of the drugs in Brain in the simultaneous administration of inhibitors of these so-called efflux transporters to prevent a return transport.

Aufgrund dieser obengenannten Besonderheiten der BHS ergeben sich für die Abgabe von Substanzen ins Hirn nur zwei generelle Wege:

a) Lipid-vermittelte freie Diffusion von kleinen hydrophoben Molekülen und
b) der aktive und passive Transport von kleinen und großen Substanzen.

Due to the above-mentioned peculiarities of the BBB, there are only two general ways of delivering substances into the brain:

a) Lipid-mediated free diffusion of small hydrophobic molecules and
b) the active and passive transport of small and large substances.

Der freie Übertritt von Substanzen ist dabei von ihrer Größe (<500 Da) und ihre Lipophilie abhängig. Alle bishengen Medikamente, die bei der Behandlung von ZNS-Erkrankungen zur Zeit eingesetzt werden, weisen die obengenannten Charakteristika auf. Daraus ergeben sich die von Lipinski et al. (Lipinski C.A., Lombardo F., Dominy B.W. and Feeney P.J. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev., 23:3–25) aufgestellten Regeln für einen verminderten Transport und damit eine verringerte pharmakologische Aktivität für folgende Stoffeigenschaften:

a) ein Molekulargewicht >500 Da,
b) die Summe von Hydrogenbindungen Donoren/Akzeptoren >10,
c) Substrat eines metabolisierenden Enzymsystems,
d) Substrat eines aktiven Efflux-Transporters und
e) Plasmaproteine binden das Molekül.

The free transfer of substances depends on their size (<500 Da) and their lipophilicity. All bisphenic drugs currently used in the treatment of CNS disorders have the above characteristics. This results in the Lipinski et al. (Lipinski CA, Lombard F., Dominy BW and Feeney PJ (1997) Adv. Drug Deliv. Rev., 23: 3-25) established rules for decreased transport and thus reduced pharmacological activity for the following material properties:

a) a molecular weight> 500 Da,
b) the sum of hydrogen bonds donors / acceptors> 10,
c) substrate of a metabolizing enzyme system,
d) Substrate of an active efflux transporter and
e) Plasma proteins bind the molecule.

Die Auswahl an Substanzen bzw. Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke überhaupt oder zumindest in ausreichender Menge zu überwinden, um eine pharmakologische Wirkung zu entfalten, ist damit äußerst begrenzt. Es besteht daher ein dringender Bedarf nach Verfahren oder Systemen, mit denen Wirkstoffe effektiv, zielgerichtet und in ausreichender Menge an ihren Wirkort im ZNS gebracht werden können, auch wenn die Wirkstoffe eine, mehrere oder alle der vorgenannten, von Lipinski aufgestellten Stoffeigenschaften a) bis e) besitzen.The Selection of substances or active ingredients that are able to Blood-brain barrier at all or at least in sufficient quantity to overcome a pharmacological To develop an effect is thus extremely limited. There is therefore an urgent need for methods or systems with which active ingredients effectively, purposefully and in sufficient Amount can be brought to their site of action in the CNS, even if the active ingredients one, several or all of the aforementioned, set up by Lipinski Substance properties a) to e) possess.

Die DE-OS 197 45 950 schlägt für den Transport von Arzneimißteln über die Blut-Hirn-Schranke hinweg Arzneistoffträgerpartikel vor, bei denen an der Partikeloberfläche ein Erkennungsprotein oder zumindest ein Molekülteil davon, welcher einen Rezeptor erkennt, gebunden ist. Das Erkennungsprotein, welches den Transport über die BHS vermittelt, ist Apolipoprotein, speziell Apolipoprotein E. Das Trägerpartikel kann der Arzneistoff selbst sein. In der Regel wird der Arzneistoff jedoch in ein Trägermaterial eingearbeitet oder daran gebunden. Die Beispiele der DE-OS 197 45 950 beschreiben Polybutylcyanoacrylat (PBCA)-Nanopartikel als Träger, an denen Apolipoprotein E gebunden ist und die mit Wirkstoff beladen sind.The DE-OS 197 45 950 proposes drug carrier particles for the transport of drugs across the blood-brain barrier in which a recognition protein or at least a portion of it which recognizes a receptor is bound to the particle surface. The recognition protein that mediates transport across the BBB is apolipoprotein, specifically apolipoprotein E. The carrier particle may be the drug itself. In general, however, the drug is incorporated into or bound to a carrier material. The examples of DE-OS 197 45 950 describe polybutyl cyanoacrylate (PBCA) nanoparticles as carriers to which apolipoprotein E is bound and which are loaded with drug.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues, verbessertes Wirkstofftransportsystem bereitzustellen, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere, insbesondere der Blut-Hirn-Schranke in Wirbeltieren, und zum Transport von Wirkstoff über eine solche Stoffbarriere hinweg geeignet ist.The Object of the present invention was to provide a new, improved To provide drug delivery system, which overcomes a substance barrier, in particular the blood-brain barrier in vertebrates, and for transport of active ingredient over such a material barrier is suitable.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Wirkstofftransportsystem, in Wirkstoff enthaltender oder wirkstofffreier Form, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere oder zum Transport von Wirkstoff über eine Stoffbarriere hinweg geeignet ist und wenigstens einen Transportvermittler und gegebenenfalls einen mit dem Transportvermittler verbundenen und von diesem verschiedenen Träger umfasst, wobei der Transportvermittler und/oder der Träger geeignet sind, einen oder mehrere Wirkstoffe aufzunehmen, einzuschließen, zu binden, zu adsorbieren und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler zu koppeln, oder der Transportvermittler und/oder der Träger einen oder mehrere Wirkstoffe aufgenommen, eingeschlossen, gebunden, adsorbiert und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler gekoppelt aufweisen, wobei der Transportvermittler einen oder mehrere Stoffe umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
filamentöse Phagen; Teile, Bruchstücke, Partikel und Fragmente von Partikeln von filamentösen Phagen; Proteine, Teile oder Bereiche von Proteinen und Peptide von filamentösen Phagen; Kombinationen, Fusionen, Derivate und Homologe der vorgenannten Stoffe, wobei filamentöse Phagen intakte natürliche filamentöse Phagen und genetisch manipulierte Formen oder Analoge davon umfassen.According to the invention, this object is achieved by a drug delivery system, in drug-containing or drug-free form, which is suitable for overcoming a substance barrier or for transporting drug across a material barrier and at least one transport mediator and optionally includes a connected to the transport agent and different from this carrier, wherein the transport mediator and / or the carrier are adapted to receive, enclose, bind, adsorb and / or otherwise directly or indirectly couple one or more active agents to the transport mediator via the carrier, or the transport mediator and / or the carrier one or more a plurality of active ingredients have been included, enclosed, bound, adsorbed and / or otherwise directly or indirectly coupled via the carrier to the transport mediator, wherein the transport mediator comprises one or more substances selected from the following group are:
filamentous phages; Parts, fragments, particles and fragments of filamentous phage particles; Proteins, parts or regions of proteins and peptides of filamentous phages; Combinations, fusions, derivatives and homologs of the aforementioned substances, wherein filamentous phages comprise intact natural filamentous phages and genetically engineered forms or analogues thereof.

Bei der Stoffbarriere, die mittels des erfindungsgemäßen Wirkstofftransportsystem überwunden werden kann, handelt es sich vorzugsweise um eine biologische Membran oder eine Zellmembran und ganz besonders bevorzugt um die Blut-Hirn-Schranke (BHS) eines Wirbeltiers, insbesondere die Blut-Hirn-Schranke des Menschen.at the substance barrier, which overcome by means of the drug delivery system according to the invention can be, it is preferably a biological membrane or a cell membrane, and most preferably around the blood-brain barrier (BBB) of a vertebrate, especially the blood-brain barrier of the People.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Transportvermittler einen oder mehrere Stoffe, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
M13-Bakteriophagen; Teile, Bruchstücke, Partikel und Fragmente von Partikeln von M13-Bakteriophagen; Proteine, Teile oder Bereiche von Proteinen und Peptide von M13-Bakteriophagen; Kombinationen, Fusionen, Derivate und Homologe der vorgenannten Stoffe, wobei M13-Bakteriophagen intakte natürliche M13-Bakteriophagen und genetisch manipulierte Formen oder Analoge davon umfassen.In a very particularly preferred embodiment of the invention, the transport mediator comprises one or more substances selected from the following group:
M13 bacteriophage; Parts, fragments, particles and fragments of particles of M13 bacteriophages; Proteins, parts or regions of proteins and peptides of M13 bacteriophages; Combinations, fusions, derivatives and homologs of the aforementioned substances, wherein M13 bacteriophages comprise intact natural M13 bacteriophages and genetically engineered forms or analogs thereof.

In zahlreichen Versuchen der Anmelderin konnte gezeigt werden, dass M13-Bakteriophagen sowie vorgenannten Teile, Proteine usw. davon die Fähigkeit besitzen, die Stoffbarriere in einem etablierten Modellsystem für die Blut-Hirn-Schranke von Wirbeltieren sehr effektiv zu überwinden und den Durchtritt von anderen Substanzen durch diese Barriere zu vermitteln bzw. solche Substanzen durch die Barriere hindurch zu transportieren. Die Verwendung von filamentösen Bakteriophagen, insbesondere M13-Bakteriophagen als Transportvermittler eröffnet damit ein weites Anwendungsgebiet für die medikamentöse Behandlung von Störungen und Erkrankungen im zentralen Nervensystem, das bislang aufgrund der begrenzten Auswahl an Stoffen, welche selbst die BHS überwinden können, sehr eng war.In numerous attempts by the Applicant could be shown that M13 bacteriophages and the aforesaid parts, proteins, etc. thereof the ability possess the substance barrier in an established model system for the blood-brain barrier of vertebrates very effectively overcome and the passage to mediate by other substances through this barrier or such Transport substances through the barrier. The usage of filamentous Bacteriophages, in particular M13 bacteriophages as transport mediators open thus a wide field of application for drug treatment of disorders and Diseases in the central nervous system, previously due to the Limited choice of fabrics that even overcome the BBB can, was very tight.

Bevorzugt ist der erfindungsgemäß eingesetzte Transportvermittler unter Oberflächenproteinen, Teilen oder Bereichen von Oberflächenproteinen und/oder Peptiden mit Aminosäuresequenzen von Oberflächenproteinen des M13-Bakteriophagen oder Kombinationen, Fusionen, Derivaten und/oder Homologen davon ausgewählt.Prefers is the inventively used Transport mediator among surface proteins, Parts or regions of surface proteins and / or peptides with amino acid sequences of surface proteins of the M13 bacteriophage or combinations, fusions, derivatives and / or Homologs selected from them.

Ganz besonders bevorzugt ist der erfindungsgemäße Transportvermittler unter den Oberflächenproteinen P3, P6, P7, P9 des M13-Bakteriophagen, Teilen oder Bereichen davon und/oder Peptiden mit Aminosäuresequenzen von diesen Oberflächenproteinen oder Kombinationen, Fusionen, Derivaten und/oder Homologen davon ausgewählt.All the transport mediator according to the invention is particularly preferred the surface proteins P3, P6, P7, P9 of the M13 bacteriophage, parts or regions thereof and / or peptides with amino acid sequences from these surface proteins or combinations, fusions, derivatives and / or homologs thereof selected.

Versuche haben gezeigt, dass das Oberflächenprotein P3 des M13-Bakteriophagen eine wichtige Rolle bei der Überwindung der Stoffbarriere spielt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Wirkstofftransportsystems ist daher der Transportvermittler unter dem Oberflächenprotein P3, Teilen oder Bereichen davon und/oder Peptiden mit Aminosäuresequenzen dieses Oberflächenproteins des M13-Bakteriophagen oder Kombinationen, Fusionen, Derivaten und/oder Homologen davon ausgewählt.tries have shown that the surface protein P3 of the M13 bacteriophage plays an important role in overcoming the fabric barrier plays. In a further preferred embodiment of the active substance transport system according to the invention is therefore the transport mediator under the surface protein P3, parts or regions thereof and / or peptides having amino acid sequences this surface protein of the M13 bacteriophage or combinations, fusions, derivatives and / or Homologs selected from them.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der Transportvermittler eine Anzahl von unmittelbar aufeinanderfolgenden Histidinresten, vorzugsweise 3 bis 10 Histidinreste, besonders bevorzugt 6 Histidinreste (His₆; 6-His-Tag) auf. Besonders bevorzugt sind die Histidinreste am aminoterminalen Ende des Transportvermittlers gebunden. Es hat sich überraschend gezeigt, dass mit Histidinresten versehene Proteine bzw. Peptide eine erhöhte Transportrate durch die BHS zeigen.According to a further preferred embodiment of the invention, the transport mediator comprises a number of immediately consecutive histidine residues, preferably 3 to 10 histidine residues, more preferably 6 histidine residues (His ₆ ; 6-His-tag). Particularly preferably, the histidine residues are bound to the amino-terminal end of the transport mediator. It has surprisingly been found that proteins or peptides provided with histidine residues show an increased transport rate through the BBB.

Das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem umfasst verschiedene Ausführungsvarianten bezüglich der Kombination von Wirkstoff bzw. Wirkstoffen, Transportvermittler und, soweit vorhanden, Träger. In einer unter verschiedenen möglichen Ausführungsformen ist der Wirkstoff oder sind mehrere gleiche oder verschiedene Wirkstoffe direkt mit dem Transportvermittler verbunden: [Wirkstoff]-[Transportvermittler].The Active substance transport system according to the invention includes various embodiments in terms of the combination of active substance or agents, transport mediator and, if present, carrier. In one of several possible embodiments is the active substance or are several identical or different active ingredients directly connected to the transport intermediary: [active ingredient] - [transport intermediary].

In einer alternativen Ausführungsform, die einen Träger umfasst, ist der Wirkstoff einerseits und der Transportvermittler andererseits mit dem Träger verbunden, ohne dass Wirkstoff und Transportvermittler direkt miteinander verbunden sind: [Wirkstoff]-[Träger]-[Transportvermittler].In an alternative embodiment, the one carrier includes, is the active ingredient on the one hand and the transport mediator on the other hand with the carrier connected without drug and transport agent directly with each other are connected: [active ingredient] - [carrier] - [transport mediator].

Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem auch Kombinationen der vorgenannten Ausführungsvarianten, die z. B. verschiedene Wirkstoffe am Träger und/oder am Transportvermittler, mehrere gleiche oder verschiedene Trägersubstanzen, mehrere gleiche oder verschiedene Transportvermittler etc. miteinander verbunden enthalten: ([Wirkstoff1][Wirkstoff2])-[Träger]-[Transportvermittler]; [Wirkstoff1]-[Träger]-[Transportvermittler]-[Wirkstoff2], [Wirkstoff]-[Träger]-([Transportvermittler1][Transportvermittler2]) usw.Farther includes the drug delivery system of the invention also combinations of the aforementioned embodiments, the z. B. various active ingredients on the carrier and / or at the transport intermediary, several same or different Excipients several identical or different transport agents etc. with each other Contains: ([active ingredient1] [active ingredient2]) - [carrier] - [transport mediator]; [Wirkstoff1] - [support] - [transportation broker] - [Wirkstoff2] [Drug] - [support] - ([Transportvermittler1] [Transportvermittler2]) etc.

Als Träger eignen sich alle auf dem Gebiet bekannten Trägersubstanzen und Trägersysteme, insoweit sie sich mit dem erfindungsgemäßen Wirkstofftransportsystem kombinieren lassen und eine Bindung von Wirkstoff und/oder Transportvermittler erlauben. Insbesondere eignen sich die in der DE 197 45 950 A1 beschriebenen Trägersubstanzen, die durch die Bezugnahme zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören sollen. Ganz besonders bevorzugt werden als Träger Polymere, feste Lipide, flüssige Lipide, Phospholipidvesikel, Nanopartikel oder Mikropartikel eingesetzt.Suitable carriers are all carrier substances and carrier systems known in the art, insofar as they can be combined with the active compound transport system according to the invention and permit binding of active ingredient and / or transport mediator. In particular, those are in the DE 197 45 950 A1 described carrier substances which are to be included by the reference to the subject of the present application. Very particular preference is given to using as carrier polymers, solid lipids, liquid lipids, phospholipid vesicles, nanoparticles or microparticles.

Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem weiterhin pharmazeutisch verträgliche Zusatz- und/oder Hilfsstoffe enthalten. Die Auswahl der geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffe liegt im Ermessen des Fachmanns auf dem Gebiet.Furthermore can the drug delivery system of the invention furthermore pharmaceutically acceptable Contain additives and / or auxiliaries. The selection of suitable Additives and / or auxiliaries are at the discretion of the person skilled in the art that area.

Neben dem Wirkstofftransportsystem als solches umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung wenigstens eines Transportvermittlers und gegebenenfalls eines mit dem Transportvermittler verbundenen und von diesem verschiedenen Trägers zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. Wirkstofftransportsystems, in Wirkstoff enthaltender oder wirkstofffreier Form, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere oder zum Transport von Wirkstoff über eine Stoffbarriere hinweg geeignet ist, wobei der Transportvermittler und/oder der Träger geeignet sind, einen oder mehrere Wirkstoffe aufzunehmen, einzuschließen, zu binden, zu adsorbieren und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler zu koppeln, oder der Transportvermittler und/oder der Träger einen oder mehrere Wirkstoffe aufgenommen, eingeschlossen, gebunden, adsorbiert und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler gekoppelt aufweisen, wobei der Transportvermittler einen oder mehrere Stoffe umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
filamentöse Phagen; Teile, Bruchstücke, Partikel und Fragmente von Partikeln von filamentösen Phagen; Proteine, Teile oder Bereiche von Proteinen und Peptide von filamentösen Phagen; Kombinationen, Fusionen, Derivate und Homologe der vorgenannten Stoffe, wobei filamentöse Phagen intakte natürliche filamentöse Phagen und genetisch manipulierte Formen oder Analoge davon umfassen.In addition to the active substance transport system as such, the present invention also encompasses the use of at least one transport mediator and, if appropriate, a carrier which is connected to the transport mediator and different from it for the production of a drug or active substance transport system, in active ingredient-containing or active ingredient-free form, which is used to overcome a substance barrier or for transport of drug across a tissue barrier, the delivery agent and / or carrier being capable of receiving, entrapping, binding, adsorbing and / or otherwise directly or indirectly coupling the carrier to the transport mediator via the carrier, or the transport mediator and / or the carrier has one or more active substances incorporated, enclosed, bound, adsorbed and / or otherwise directly or indirectly coupled via the carrier to the transport mediator, wherein the transportability one or more substances selected from the following group:
filamentous phages; Parts, fragments, particles and fragments of filamentous phage particles; Proteins, parts or regions of proteins and peptides of filamentous phages; Combinations, fusions, derivatives and homologs of the aforementioned substances, wherein filamentous phages comprise intact natural filamentous phages and genetically engineered forms or analogues thereof.

Begriffsdefinitionen:Definition of terms:

"Filamentöser Phage" bezeichnet alle Bakteriophagen mit fadenförmig gestreckter Form bzw. Stäbchenform des Viruspartikels, einschließlich M13-Bakieriophagen, fd-Bakteriophagen, f1-Bakteriophagen, in der Wildtyp-Form sowie in natürlich vorkommenden oder gentechnisch veränderten mutanten Formen."Filamentous phage" refers to all Bacteriophages with filiform shape elongated shape or rod shape of the virus, including M13 Bakieriophages, fd bacteriophages, f1 bacteriophages, in the wild-type form as well as in course occurring or genetically modified mutant forms.

"M13-Bakteriophage" bezeichnet die Wildtyp-Form des M13-Bakteriophagen sowie natürlich vorkommende oder gentechnisch veränderte mutante Formen davon."M13 bacteriophage" refers to the wild-type form of the M13 bacteriophage as well as of course occurring or genetically engineered mutant forms thereof.

"Apikal" oder "apikale Seite" bedeutet im Kontext dieser Erfindung die Seite (Ausgangsseite) einer Stoffbarriere, wie der Blut-Hirn-Schranke von Wirbeltieren, oder eines Labormodells für eine solche Stoffbarriere, von welcher aus ein Stoff über die Barriere hinweg bzw. durch diese hindurch zur gegenüberliegenden Seite (Zielseite) transportiert werden soll."Apical" or "apical side" means in context this invention the side (exit side) of a fabric barrier, such as the blood-brain barrier of vertebrates, or a laboratory model for one such a material barrier from which a substance passes across the barrier or through them to the opposite side (Destination page) should be transported.

"Basolateral" oder "basolaterale Seite" bedeutet im Kontext dieser Erfindung die Seite (Zielseite) einer Stoffbarriere, wie der Blut-Hirn-Schranke von Wirbeltieren, oder eines Labormodells für eine solche Stoffbarriere, zu welcher ein Stoff von der Ausgangsseite bzw. apikalen Seite über die Barriere hinweg bzw. durch diese hindurch transportiert werden soll."Basolateral" or "basolateral side" means in context of this invention the side (target side) of a fabric barrier, such as the blood-brain barrier of vertebrates, or a laboratory model for one such material barrier to which a substance from the exit side or apical side about the barrier or transported through it should.

"P3-Protein" bezeichnet das 42 kDa Genprodukt des Gens 3 des M13-Bakteriophagen."P3 protein" refers to the 42nd kDa gene product of gene 3 of M13 bacteriophage.

Figuren:Characters:

1 zeigt eine schematische Darstellung des filamentösen M13-Bakteriophagen. 1 shows a schematic representation of the filamentous M13 bacteriophage.

2 zeigt eine schematische Darstellung des P3-Proteins aus einem filamentösen Ff-Phagen (wie M13-Bakteriophage), die Domänenstruktur des P3-Proteins, die unterschiedlichen Funktionen der Domänen bei der Infektion eines Wirtsbakteriums und den Infektionsvorgang (modifiziert nach Holliger P. and Riechmann L. (1997) Current Biology 5:265 – 275). 2 Figure 4 shows a schematic representation of the P3 protein from a filamentous Ff phage (such as M13 bacteriophage), the domain structure of the P3 protein, the different functions of the domains in the infection of a host bacterium and the infection process (modified according to Holliger P. and Riechmann L (1997) Current Biology 5: 265-275).

3 ist eine schematische Darstellung des P3-Proteins mit den Domänen D1, D2 und D3 und der hergestellten Expressionskonstrukte His6-D2 und His6-D1-2. 3 is a schematic representation of the P3 protein with the domains D1, D2 and D3 and the produced expression constructs His6-D2 and His6-D1-2.

4 zeigt eine schematische Darstellung des als Modell für die Blut-Hirn-Schranke oder anderer Stoffbarrieren verwendeten Transwellsystems. 4 shows a schematic representation of the transwell system used as a model for the blood-brain barrier or other material barriers.

5 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs des Transportes von Wildtyp-M13-Phagenpartikel über eine Hirnkapillarendothelzellbarriere bei apikaler und basolateraler Phagenzugabe. 5 Figure 3 shows the results of a comparison of the transport of wild-type M13 phage particles across a cerebral capillary endothelial cell barrier with apical and basolateral phage addition.

6 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs des Transportes von Wildtyp-M13-Phagenpartikel über eine Zellbarriere von Hirnkapillarendothelzellen einerseits und Darmepithelzellen (CaCo-2-Zelllinie) andererseits im Transwellsystem. 6 shows the results of a comparison of the transport of wild-type M13 phage particles a cell barrier of brain capillary endothelial cells on the one hand and intestinal epithelial cells (CaCo-2 cell line) on the other hand in the transwell system.

7 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der maximalen Transportgeschwindigkeiten im Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen gemäß Beispiel 3 in den Richtungen apikal-basolateral und basolateral-apikal. 7 Figure 3 shows the results of determination of maximum transport rates in the brain capillary endothelial cell transwell system of Example 3 in the apical-basolateral and basolateral-apical directions.

8 zeigt die Ergebnisse der Km-Wert-Bestimmung für den Transport von Wildtyp-M13-Phagenpartikel über eine Hirnkapillarendothelzellbarriere im Transwellsystem. 8th shows the results of the Km value determination for the transport of wild-type M13 phage particles via a brain capillary endothelial cell barrier in the transwell system.

9 zeigt eine schematische Darstellung von verschiedenen eingesetzten M13-Phagenpartikeln mit unterschiedlichen Modifikationen, die im Transwelltest eingesetzt wurden. 9 shows a schematic representation of various inserted M13 phage particles with different modifications that were used in the transwell test.

10 zeigt eine schematische Darstellung des Transports von Wildtyp-M13-Phagenpartikel und M13-Phagenpartikel mit modifiziertem P3-Protein auf der Oberfläche. 10 shows a schematic representation of the transport of wild-type M13 phage particles and M13 phage particles with modified P3 protein on the surface.

11 zeigt eine schematische Darstellung des Transports von Proteinfragmenten des P3-Proteins D1-2 und D2 und des Transports der Kontrollproteine Rinderserumalbumin (BSA) und Meerrettich-Peroxidase (HRP). 11 shows a schematic representation of the transport of protein fragments of the P3 protein D1-2 and D2 and the transport of the control proteins bovine serum albumin (BSA) and horseradish peroxidase (HRP).

12 zeigt die Ergebnisse des Transports von mit Lucifer-Yellow beladenen Wildtyp-M13-Phagenpartikeln über eine Hirnkapillarendothelzellbarriere im Transwellsystem. 12 Figure 3 shows the results of transport of Lucifer-Yellow loaded wild-type M13 phage particles via a brain capillary endothelial cell barrier in the transwell system.

13 zeigt die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz des Fragmentes D2. 13 shows the nucleic acid and amino acid sequence of fragment D2.

14 zeigt die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz des Fragmentes D1-2. 14 shows the nucleic acid and amino acid sequence of fragment D1-2.

15 zeigt die Nukleinsäuresequenz des P3-Gens. 15 shows the nucleic acid sequence of the P3 gene.

Figuren, Material und MethodenFigurines, material and methods

Filamentöse BakteriophagenFilamentous bacteriophages

Filamentöse Bakteriophagen sind eine große Familie von einzelsträngigen DNA-Viren, die in der Lage sind gram-negative Bakterien zu infizieren. Die Infektion mit einem filamentösen Phagen verläuft dabei in zwei Abschnitten. Zunächst bindet der Phage an seinen primären Rezeptor, im allgemeinen die Spitze des bakteriellen F-Pilus, die sich zum Teil in größerer Entfernung zur Bakterium selbst befindet. Durch Einzug des Pilus zusammen mit dem gebundenen Phagen kommt dieser in die räumliche Nähe zu einem weiteren Rezeptor (ToIA), welcher die Penetration der bakteriellen Zellwand und -membran vermittelt. Der Infektionsprozess ist vor allem bei der Infektion von Escherichia coli mit filamentösen Phagen, insbesondere Ff-Phagen (M13, fd, f1) sehr gut verstanden. In diesen Ff-Phagen wird die Infektion durch das Minor Capsid Protein 3 (P3, P-III, g3p) vermittelt. Dieses Protein ist an einem Ende des länglichen Phagenpartikels lokalisiert, wo es eng mit einem weiteren Oberflächenprotein, dem Minor Capsid Protein 6 (P6, P-VI, g6p), assoziiert ist. Der größte Teil der Hülle wird durch eine Vielzahl von Kopien des Major Capsid Proteins 8 (P8, P-VIII, g8p) gebildet. Am gegenüberliegenden Ende befinden sich mehrere Moleküle der Minor Capsid Proteine 7 und 9, die für die Freisetzung des Phagen aus der Wirtszelle essentiell sind. 1 zeigt eine schematische Darstellung des M13-Bakteriophagen.Filamentous bacteriophages are a large family of single-stranded DNA viruses capable of infecting Gram-negative bacteria. The infection with a filamentous phage runs in two sections. First, the phage binds to its primary receptor, generally the tip of the bacterial F-pilus, some of which is further away from the bacterium itself. By inserting the pilus together with the bound phage this comes in the proximity to another receptor (ToIA), which mediates the penetration of the bacterial cell wall and membrane. The infection process is very well understood especially in the case of the infection of Escherichia coli with filamentous phages, in particular Ff phages (M13, fd, f1). In these Ff phages the infection is mediated by the minor capsid protein 3 (P3, P-III, g3p). This protein is located at one end of the elongated phage particle, where it is closely associated with another surface protein, minor capsid protein 6 (P6, P-VI, g6p). Most of the envelope is formed by a variety of copies of major capsid protein 8 (P8, P-VIII, g8p). At the opposite end are several molecules of minor capsid proteins 7 and 9, which are essential for the release of the phage from the host cell. 1 shows a schematic representation of the M13 bacteriophage.

Das 42 kDa Protein P3 besitzt eine Struktur mit drei Domänen. Dabei ist jede Domäne von der nächsten durch glycinreiche Tetra- und Pentapeptidwiederholungen getrennt. Durch Deletionsanalysen konnten den einzelnen Domänen verschiedene Funktionen zugewiesen werden. So wird das Protein durch den C-terminalen Membrananker der dritten Domäne (D3) mit der Phagenhülle verbunden. Die beiden N-terminalen Domänen sind dagegen direkt an der Infektion des Bakteriums beteiligt. Die Domäne 2 (D2) bindet an den primären Rezeptor, den F-Pilus des Bakteriums, aber die Adsorption alleine ist nicht ausreichend für eine erfolgreiche Penetration. Experimente weisen dabei auf eine Beteiligung der Domäne 1 (D1) hin. Diese soll über eine Wechselwirkung mit dem ToIA-Rezeptor des Wirtsorganismus die Abgabe der viralen DNA an das Bakterium vermitteln. 2 zeigt eine schematische Darstellung des P3-Proteins aus einem filamentösen Ff-Phagen (wie M13- Bakteriophage), die Domänenstruktur des P3-Proteins, die unterschiedlichen Funktionen der Domänen bei der Infektion eines Wirtsbakteriums und den Infektionsvorgang (Holliger P. and Riechmann L. (1997) Current biology 5:265 – 275).The 42 kDa protein P3 has a three-domain structure. Each domain is separated from the next by glycine-rich tetra- and pentapeptide repeats. Deletion analyzes allowed different domains to be assigned to each domain. Thus, the protein is linked to the phage shell by the C-terminal membrane anchor of the third domain (D3). The two N-terminal domains, however, are directly involved in the infection of the bacterium. Domain 2 (D2) binds to the primary receptor, the F-pilus of the bacterium, but adsorption alone is not sufficient for successful penetration. Experiments indicate a participation of the domain 1 (D1). This is intended to mediate the delivery of the viral DNA to the bacterium via an interaction with the ToIA receptor of the host organism. 2 Figure 4 shows a schematic representation of the P3 protein from a filamentous Ff phage (such as M13 bacteriophage), the domain structure of the P3 protein, the different functions of the domains in the infection of a host bacterium, and the infection process (Holliger P. and Riechmann L. (J. 1997) Current biology 5: 265-275).

Präparation von HirnkapillarendothelzellenPreparation of brain capillary endothelial cells

Zur Präparation von Hirnkapillarendothelzellen wurde das Gehirn eines Schweins entnommen, in einem geeigneten Puffer gelagert und schnellstmöglich auf Eis ins Labor transportiert. Die zu isolierenden Hirnkapillarendothelzellen befinden sich im Wesentlichen in der grauen Hirnsubstanz. Nach Entfernen der Hirnhäute und der äußeren Blutgefäße wurde die graue Substanz abgeschabt, mechanisch zerkleinert und in ein geeignetes Medium überführt. Ein geeignetes Medium war z.B. M199-Medium (Gibco/BRL, Grand Island, NY) oder Earle's Puffer. In einem ersten enzymatischen Schritt wurde die Hirnsubstanz mit dem Enzym Dipase verdaut. Der Dipaseverdau bewirkt eine Auflösung des Bindegewebes (5 mg Dipase/g graue Substanz). Der Verdau erfolgte für 3 h bei 37°C in M199-Medium unter Rühren. Nach dem Dipaseverdau wurden die Hirnkapillaren mit dem gleichen Volumen 15 %ige (w/v) Dextranlösung unter Schütteln gemischt und bei 8.650xg in einem Festwinkelrotor zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment für den zweiten enzymatischen Verdauungsschritt in Collagenase D-haltigem M199-Medium resuspendiert. Bei der anschließenden Hydrolyse für 1 h bei 37°C wurde auch Na-p-Tosyl-L-Lysin-Chloromethylketon (TLCK) als Proteaseinhibitor zugesetzt.to preparation of brain capillary endothelial cells, the brain of a pig was taken stored in a suitable buffer and opened as soon as possible Ice transported to the laboratory. The brain capillary endothelial cells to be isolated are essentially in the gray matter of the brain. After removal of the meninges and the external blood vessels became scraped off the gray substance, mechanically crushed and into a transferred suitable medium. One suitable medium was e.g. M199 medium (Gibco / BRL, Grand Island, NY) or Earle's Buffer. In a first enzymatic step, the brain substance became digested with the enzyme dipase. The Dipaseverdau causes a resolution of Connective tissue (5 mg dipase / g gray matter). The digestion took place for 3 h at 37 ° C in M199 medium with stirring. After dipase digestion, the brain capillaries became the same Volume 15% (w / v) dextran solution with shaking and centrifuged at 8,650xg in a fixed angle rotor. The supernatant was discarded and the sediment for the second enzymatic Digestion resuspended in Collagenase D-containing M199 medium. In the subsequent Hydrolysis for 1 h at 37 ° C was also Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK) as a protease inhibitor added.

Nach dem zweiten enzymatischen Schritt wurde eine Isolierung der freigesetzten Endothelzellen über eine Percoll-Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Für den Dichtegradienten wurden 9,91 ml Percoll, 0,72 ml 10-fach konzentriertes M199-Medium und 19,37 ml Earle's Puffer (117,2 mM Natriumchlorid, 5,3 mM Kaliumchlorid, 1,0 mM Natriumdihydrogenphosphat, 0,1 mM Magnesiumsulfat, 1,8 mM Calciumchlorid und 5,6 mM Glukose, pH 7,3) gemischt und in der Ultrazentrifuge bei 37.200xg und 4°C im Festwinkelrotor für eine Stunde zentrifugiert. Die Zellsuspension aus dem zweiten enzymatischen Schritt wurde durch mehrfaches Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit, Abziehen des Überstandes und Resuspendieren des Zentrifugationssedimentes gewaschen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Sediment in einer geringen Menge M199-Medium aufgenommen, auf den vorbereiteten Percoll-Dichtegradienten aufgetragen und in der Ultrazentrifuge bei 1.400xg bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die Hirnkapillarendothelzellen enthaltende Bande abpipettiert und erneut wie oben beschrieben gewaschen.To The second enzymatic step was an isolation of the liberated Endothelial cells via a Percoll density gradient centrifugation performed. For the density gradients were 9.91 ml Percoll, 0.72 ml 10x concentrated M199 medium and 19.37 ml Earle's Buffer (117.2 mM sodium chloride, 5.3 mM potassium chloride, 1.0 mM sodium dihydrogen phosphate, 0.1 mM magnesium sulfate, 1.8 mM calcium chloride and 5.6 mM glucose, pH 7.3) and in the ultracentrifuge at 37200xg and 4 ° C in the fixed angle rotor for one hour centrifuged. The cell suspension from the second enzymatic Step was made by multiple centrifugation at low speed, Removing the supernatant and resuspending the centrifugation sediment. To In the last centrifugation step, the sediment was in a small amount M199 medium recorded on the prepared Percoll density gradient and in the ultracentrifuge at 1400xg at 4 ° C for 10 minutes centrifuged. After centrifugation, the brain capillary endothelial cells became containing pipette and washed again as described above.

TranswellsystemTranswell system

Das hierin verwendete Transwellsystem dient als Labormodell für die Blut-Hirn-Schranke (Verwendung von Hirnkapillarendothelzellen) und andere Zellbarrieren eines Organismus. Zellen, wie die zuvor präparierten Hirnkapillarendothelzellen, wurden gewaschen, in Medium resuspendiert und in mit Kollagen beschichtete Zellkulturflaschen ausgesät, wie es bei Franke et al. (Franke H., Galla H- J. and Beuckmann C.T. (2000) Brain Research Protocols 5:248 – 256) beschrieben ist. Die Kultivierung der Hirnkapillarendothelzellen erfolgte bei 37°C in CO₂-Inkubatoren mit einem konstanten CO₂-Gehalt von 5 %. Andere Zelltypen wurden ggf. in der für den jeweiligen Zelltyp geeigneten Weise kultiviert. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurden sie durch eine Behandlung mit Trypsinlösung abgelöst und in dafür vorbereitete Transwellschalen (1,1 cm², Corning) aufgeteilt. Danach erfolgte eine Weiterkultivierung der Zellen für mindestens 5 Tage unter den zuvor beschriebenen Bedingungen. 4 zeigt eine schematische Darstellung des verwendeten Transwellsystems, wie es für nachfolgend beschriebene Untersuchungen verwendet wurde.The transwell system used herein serves as a laboratory model for the blood-brain barrier (use of brain capillary endothelial cells) and other cell barriers of an organism. Cells, such as previously prepared brain capillary endothelial cells, were washed, resuspended in medium and seeded into collagen-coated cell culture flasks as described in Franke et al. (Franke H., Galla H-J. and Beuckmann CT (2000) Brain Research Protocols 5: 248-256). The brain capillary endothelial cells were cultured at 37 ° C. in CO ₂ incubators with a constant CO ₂ content of 5%. Other cell types were optionally cultured in the manner appropriate for the particular cell type. After the cells reached confluency, they were detached by treatment with trypsin solution and divided into prepared shells (1.1 cm ² , Corning). This was followed by further cultivation of the cells for at least 5 days under the conditions described above. 4 shows a schematic representation of the Transwellsystems used, as it was used for the investigations described below.

Präparation der PhagenPreparation of phages

2xYT/Kan-Medium (5 g/l Natriumchlorid, 16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 25 mg/l Kanamycin, pH 7.0) werden mit 1/1000 Volumen des Mediums VCS-M13-Phagen angeimpft und 16 h – 24 h bei 30°C unter Schütteln inkubiert. Die Bakterien werden dann bei 10.800xg für 15 min sedimentiert und der Überstand dekantiert. Das Volumen des Überstandes wird bestimmt und es erfolgt die Zugabe von PEG/NaCl-Lösung (200 g/l Polyethylenglykol 6000, 2,5 M Natriumchlorid) im Volumenverhältnis Überstand zu PEG/NaCl-Lösung von 4:1. Die Reaktionslösung wird gemischt und mindestens 2 h bei 4°C inkubiert. Danach werden die Phagen durch Zentrifugation bei 10.800xg für 15 min sedimentiert. Das erhaltene Pellet wird in 40 ml H₂O resuspendiert und erneut mit 8 ml PEG/NaCl-Lösung versetzt. Nach dem Mischen wird nun mindestens für 20 min bei 4°C inkubiert, und anschließend werden die Phagen bei 10.800xg sedimentiert. Das Pellet wird nach dem gründlichen Entfernen des Überstandes getrocknet, und dann werden die Phagen in 2 ml SM-Puffer (35 mM Tris-Base, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumsulfat, 100 mg/l Glukose, pH 7.5) resuspendiert und bei 4°C gelagert.2xYT / Kan medium (5 g / l sodium chloride, 16 g / l tryptone, 10 g / l yeast extract, 25 mg / l kanamycin, pH 7.0) are inoculated with 1/1000 volume of the medium VCS-M13 phage and incubated for 16 h - Incubated for 24 h at 30 ° C with shaking. The bacteria are then sedimented at 10,800xg for 15 min and the supernatant decanted. The volume of the supernatant is determined and the addition of PEG / NaCl solution (200 g / l polyethylene glycol 6000, 2.5 M sodium chloride) in the volume ratio of supernatant to PEG / NaCl solution of 4: 1. The reaction solution is mixed and incubated for at least 2 h at 4 ° C. The phages are then sedimented by centrifugation at 10,800xg for 15 min. The resulting pellet is resuspended in 40 ml H ₂ O and added again with 8 ml PEG / NaCl solution. After mixing, incubate for at least 20 min at 4 ° C and then pellet the phages at 10,800xg. The pellet is dried after thorough removal of the supernatant, and then the phages are resuspended in 2 ml SM buffer (35 mM Tris base, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium sulfate, 100 mg / L glucose, pH 7.5) and incubated at 4 ° C stored.

Bestimmung des PhagentitersDetermination of phage titers

Von der erhaltenen Phagenlösung werden Verdünnungen von 10^–6, 10^–7 10^,8 10^–9 und 10^–10 in SM-Puffer hergestellt. Parallel dazu werden E.coli Bakterien, bevorzugt solche, die einen F-Pilus ausbilden, besonders bevorzugt TG1, bis zu einer OD₆₀₀ (600 nm) von 0,2 in 2xYT-Medium angezogen. Jeweils 100 μl dieser Bakterien werden mit 10 μl der oben beschriebenen Phagenverdünnungen versetzt. Die Ansätze werden dann 30 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert und anschließend auf 2xYT/Kan-Platten (5 g/l Natriumchlorid, 16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Agar, 25 mg/l Kanamycin, pH 7.0) ausplattiert. Die Platten werden anschließend für 16 h bei 37°C inkubiert. Die Phagen enthaltenden Bakterienkolonien werden gezählt und der Phagentiter durch die nachfolgende Formel bestimmt:
Gezählte Kolonien × 100 × eingesetzte Verdünnung = Phagen pro ml Phagenstammlösung.From the resulting phage solution, dilutions of 10 ^-6 , 10 ^-7 10 ^{, 8} 10 ^-9, and 10 ^-10 in SM buffer are made. In parallel, E. coli bacteria, especially those that form an F-pilus, become especially preferably TG1, up to an OD ₆₀₀ (600 nm) of 0.2 in 2xYT medium. In each case 100 .mu.l of these bacteria are mixed with 10 ul of the phage dilutions described above. The batches are then incubated for 30 min at 37 ° C without shaking and then on 2xYT / Kan plates (5 g / l sodium chloride, 16 g / l tryptone, 10 g / l yeast extract, 15 g / l agar, 25 mg / l Kanamycin, pH 7.0). The plates are then incubated for 16 h at 37 ° C. The phage-containing bacterial colonies are counted and the phage titer is determined by the following formula:
Counted colonies × 100 × dilution used = phage per ml phage stock solution.

Transportstudien im TranswellsystemTransport studies in the transwell system

Zur Untersuchung des Transportes von Phagen oder Proteinen, Peptiden oder Fragmenten von Phagen oder anderer Stoffe durch eine Zellbarriere (Stoffbarriere) hindurch wurde das oben beschriebene Transwellsystem eingesetzt. Im Model der Blut-Hirn-Schranke unter Verwendung von Hirnkapillarendothelzellen entspricht ein Durchtritt in der Richtung "apikal-basolateral" einem Transport vom Blut in das Gehirn, und ein Durchtritt in der Richtung "basolateral-apikal" entspricht einem Transport in umgekehrter Richtung vom Gehirn ins Blut.to Investigation of the transport of phages or proteins, peptides or fragments of phage or other substances through a cell barrier (Substance barrier) became the Transwell system described above used. In the model of the blood brain barrier using Brain capillary endothelial cells correspond to a passage in the "apical-basolateral" direction of transport from the blood to the brain, and a passage in the direction "basolateral-apical" corresponds to one Transport in the opposite direction from the brain to the blood.

Die Transwelleinsätze wurden vorbereitet, wie es oben beschrieben ist. Am Versuchstag wurde der endotheliale Widerstand (TEER) der Transwelleinsätze gemessen und die geeigneten Transwelleinsätze in frische Schalen überführt. Als geeignet wurde ein Widerstand von mindestens 600 Ω × cm² bestimmt. Ein Medienwechsel erfolgte durch Zugabe von 400 μl (apikal) und 1,5 ml (basolaterale) frischem, auf 37°C vorgewärmtem Medium (DMEM/Ham's F12-Medium im Falle von Hirnkapillarendothelzellen).The trans shaft inserts were prepared as described above. On the day of the experiment, the endothelial resistance (TEER) of the trans-wave inserts was measured and the appropriate trans-wave inserts were transferred to fresh dishes. As appropriate, a resistance of at least 600 Ω × cm ^{2 was} determined. The medium was changed by adding 400 μl (apical) and 1.5 ml (basolateral) fresh medium preheated to 37 ° C (DMEM / Ham's F12 medium in the case of brain capillary endothelial cells).

Das bezüglich des Durchtritts durch die Stoffbarriere zu untersuchende Material (Phagen oder Proteine, Peptide oder Fragmente von Phagen oder andere Stoffe) wurde in definierter Menge in das apikale oder basolaterale Kompartiment des Transwellsystems eingebracht. Zum Startzeitpunkt T0 des Experimentes wurden den apikalen und basolateralen Kompartimenten Proben entnommen.The in terms of the passage through the material barrier material to be examined (Phages or proteins, peptides or fragments of phages or others Substances) was in a defined amount in the apical or basolateral Compartment of the transwell system introduced. At the start time T0 of the experiment became the apical and basolateral compartments Samples taken.

Das Transwellsystem wurde für den Verlauf des Experimentes bei 37°C inkubiert, und weitere Proben zu definierten Zeitpunkten entnommen. Nach der Probennahme wurden die jeweiligen Mengen bzw. Konzentrationen des bezüglich des Transports zu untersuchenden Materials in den apikalen und basolateralen Proben mit geeigneten Mitteln untersucht und die Effizienz bzw. der zeitliche Verlauf des Durchtritts durch die Stoffbarriere festgestellt.The Transwell system was for incubate the course of the experiment at 37 ° C, and add more samples taken at defined times. After sampling, the respective quantities or concentrations of the transport to be examined Materials in the apical and basolateral samples with appropriate Investigated funds and the efficiency or the time course the passage through the fabric barrier.

Zur Bestimmung von in den Zellen des Zellrasens verbliebenem Material (in den Figuren mit INT-Zell oder internalisiert bezeichnet) wurde der Zellrasen sechsmal mit PBS-Puffer und anschließend dreimal mit Stripping-Puffer (50 mM Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, 2 M Harnstoff, 20 g/l PVP 40, pH 2.8) gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 500 μl Triethanolamin (100 mM) lysiert. Nach Inkubation für 10 min bei RT wurde der Ansatz durch Zugabe von Tris-Puffer (1 M Tris-Base, pH 7.5) neutralisiert. Die jeweiligen Mengen bzw. Konzentrationen des bezüglich des Transports zu untersuchenden Materials in den Proben wurden mit geeigneten Mitteln untersucht.to Determination of remaining material in the cells of the cell lawn (in the figures with INT cell or called internalized) the cell lawn was washed six times with PBS buffer and subsequently three times with stripping buffer (50 mM glycine, 0.5 M sodium chloride, 2 M urea, 20 g / l PVP 40, pH 2.8). The cells were by adding 500 μl Triethanolamine (100 mM) lysed. After incubation for 10 min at RT, the reaction was started by adding Tris buffer (1 M Tris base, pH 7.5). The respective quantities or concentrations of re transport of material to be examined in the samples examined by suitable means.

Die Konzentrationen von Phagen in den Proben wurden durch Infektion von E.coli Bakterien und Titerbestimmung in der oben beschriebenen Art und Weise festgestellt. Konzentrationen von Fluoreszenzfarbstoff in den Proben wurden durch Messung im ELISA-Reader bei geeigneter Wellenlänge bestimmt.The Concentrations of phage in the samples were confirmed by infection of E. coli bacteria and titer determination in the above Way determined. Concentrations of fluorescent dye in the samples were by measurement in the ELISA reader at appropriate wavelength certainly.

Expression von einzelnen Domänen des P3-ProteinsExpression of individual domains of the P3 protein

Für die Expression von einzelnen Domänen (D1-2 und D2) wurden Konstrukte zur Herstellung des Proteins in E.coli Bakterien hergestellt. Dazu wurde Phagen-DNA nach Standard-DNA-Präparationsmethoden gewonnen und das entsprechende DNA-Fragment mit den dazu passenden Primern mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) vervielfältigt. Jeweils zwei 50 μl PCR-Ansätze wurden für die Herstellung jedes Fragmentes hergestellt (1xPuffer, 1,5 mM MgCl₂, 200 nM dNTPs, 600 nM Primer, 2,5 Einheiten Proof-reading Taq-Polymerase). Nach der PCR-Reaktion wurden die Proben gelelektrophoretisch getrennt und die DNA-Banden aus dem Gel ausgeschnitten. Nach Elution der DNA-Fragmente aus dem Agarosegel wurde der DNA-Gehalt bestimmt und jeweils 100 pmol Fragment in eine BP-Clonase-Reaktion (Gateway^TM-System, Invitrogen) eingesetzt und ü. N. bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl Proteinase K-Lösung und Inkubation bei 37°C für 10 min gestoppt. E.coli-Zellen wurden dann mit der DNA transformiert und auf Agarplatten ausgesät. Die DNA positiver Klone wurde sequenziert und dann zur Herstellung eines mit sechs Histidinen (His₆) N-terminal markierten Konstruktes mittels einer LR-Clonase-Reaktion (Gateway^TM-System, Invitrogen) in einen entsprechenden Expressionsvektor überführt. Nach 16 h Inkubation bei 25°C und 10 min Inkubation mit Proteinase K-Lösung bei 37°C, wurden erneut E.coli-Zellen mit der erhaltenen DNA in den Reaktionsansätzen transformiert und auf Agarplatten ausgesät.For expression of single domains (D1-2 and D2), constructs were made for production of the protein in E. coli bacteria. For this purpose, phage DNA was obtained by standard DNA preparation methods and the corresponding DNA fragment with the appropriate primers by PCR (polymerase chain reaction) amplified. Two 50 μl PCR batches each were prepared for the preparation of each fragment (1x buffer, 1.5 mM MgCl ₂ , 200 nM dNTPs, 600 nM primer, 2.5 units proof-reading Taq polymerase). After the PCR reaction, the samples were separated by gel electrophoresis and the DNA bands were excised from the gel. After elution of the DNA fragments from the agarose gel, the DNA content was determined and each 100 pmol fragment in a BP-Clonase reaction (Gateway ^™ system, Invitrogen) used and ü. N. incubated at 25 ° C. The reaction was stopped by adding 2 μl proteinase K solution and incubating at 37 ° C for 10 min. E. coli cells were then transformed with the DNA and seeded on agar plates. The DNA of positive clones was sequenced and then used to prepare a construct labeled with six histidines (His ₆ ) N-terminal by means of an LR-clonase reaction (Gateway ^™ system, Invitrogen). converted into a corresponding expression vector. After 16 h incubation at 25 ° C and 10 min incubation with proteinase K solution at 37 ° C, E. coli cells were again transformed with the resulting DNA in the reaction mixtures and seeded on agar plates.

Die erhaltenen fertigen Plasmide wurden in E.coli-Expressionsstämme, z.B. BI21(DE3)LysS, Tuner(DE3)LysS oder JM109(DE3) transformiert, und durch Zugabe von IPTG wurde die Expression des entsprechenden Proteins bzw. Proteinfragmentes induziert. Die Induktion erfolgte jeweils für 4 h bei 37°C unter Schütteln.The final plasmids obtained were expressed in E. coli expression strains, e.g. BI21 (DE3) LysS, tuner (DE3) LysS or JM109 (DE3), and addition of IPTG resulted in the expression of the corresponding protein or protein fragment induced. The induction took place in each case for 4 h at 37 ° C with shaking.

Reinigung der Domäne D2 des P3-ProteinsPurification of D2 domain P3 protein

Die Bakterienzellen, in welchen die Expression durchgeführt worden war, wurden sedimentiert, in IB-Puffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 25 % (w/v) Saccharose, 0,1 mg/ml Lysozym pH 8,0) resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen im Ultraschallbad behandelt und zum vollständigen Aufschluss zunächst 1 h bei –20°C eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur wieder aufgetaut.The Bacterial cells in which expression has been carried out was sedimented in IB buffer (50mM Tris-base, 1mM EDTA, 25% (w / v) sucrose, 0.1mg / ml lysozyme pH 8.0) and resuspended for Incubated on ice for 30 min. Thereafter, the cells were in an ultrasonic bath treated and for complete digestion first Frozen for 1 h at -20 ° C and subsequently thawed again at room temperature.

Zu der viskosen Suspension wurden nun Magnesiumchlorid, Manganchlorid und 1 μl Benzonase zugegeben. Anschließend wurde im Verhältnis 1:1 mit Detergenz-Puffer (0,2 M Natriumchlorid, 1 (w/v) Desoxycholat, 1 % (v/v) Nonidet P40) gemischt und der Ansatz zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und das Sediment mit TriED-Lösung gewaschen (1 % (v/v) Triton X-100, 1 mM EDTA). Die Probe wurde erneut zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Sediment in Solubilisierungspuffer (100 mM Tris-Base, 6 M Guanidiumhydrochlorid, 2 mM EDTA) resuspendiert. Die erhaltene Lösung wurde 1:100 in Renaturierungspuffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 1 M Arginin, pH 8,0) verdünnt und über Nacht bei 10°C inkubiert. Danach erfolgte jeweils täglich eine weitere Zugabe eines Anteils der Probe zum Renaturierungspuffer bis zu einem Verdünnungsverhältnis von 1:25. Der komplette Ansatz wurde anschließend zentrifugiert und im Überstand die Fraktion mit dem Protein D2 erhalten.To The viscous suspension was now magnesium chloride, manganese chloride and 1 μl Benzonase added. Subsequently was in proportion 1: 1 with detergent buffer (0.2 M sodium chloride, 1 (w / v) deoxycholate, Mix 1% (v / v) Nonidet P40) and centrifuge the batch. The supernatant was pipetted off and the sediment was washed with TriED solution (1% (v / v) Triton X-100, 1mM EDTA). The sample was centrifuged again, the supernatant removed and the sediment in solubilization buffer (100 mM Tris base, 6 M guanidium hydrochloride, 2 mM EDTA). The obtained solution was 1: 100 in renaturation buffer (50 mM Tris base, 1 mM EDTA, 1 M arginine, pH 8.0) and over Night at 10 ° C incubated. This was followed by a further addition of one daily Proportion of the sample to the renaturation buffer up to a dilution ratio of 1:25. The complete batch was then centrifuged and in the supernatant obtained the fraction with the protein D2.

Reinigung der Domänen D1-2 des P3-ProteinsPurification of domains D1-2 of the P3 protein

Zu der viskosen Suspension wurden nun Magnesiumchlorid, Manganchlorid und 1 μl Benzonase zugegeben. Anschließend wurde im Verhältnis 1:1 mit Detergenz-Puffer (0,2 M Natriumchlorid, 1 (w/v) Desoxycholat, 1 % (v/v) Nonidet P40) gemischt und der Ansatz zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und das Sediment mit TriED-Lösung gewaschen (1 % (v/v) Triton X-100, 1 mM EDTA). Die Probe wurde erneut zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Sediment in Solubilisierungspufter (100 mM Tris-Base, 6 M Guanidiumhydrochlorid, 2 mM EDTA) resuspendiert. Die erhaltene Lösung wurde 1:100 in Renaturierungspufter (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 1M Arginin, pH 8,0) verdünnt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach erfolgte jeweils täglich eine weitere Zugabe eines Anteils der Probe zum Renaturierungspuffer bis zu einem Verdünnungsverhältnis von 1:25. Der komplette Ansatz wurde anschließend zentrifugiert und im Überstand die Fraktion mit dem Protein D1-2 erhalten.To The viscous suspension was now magnesium chloride, manganese chloride and 1 μl Benzonase added. Subsequently was in proportion 1: 1 with detergent buffer (0.2 M sodium chloride, 1 (w / v) deoxycholate, Mix 1% (v / v) Nonidet P40) and centrifuge the batch. The supernatant was pipetted off and the sediment was washed with TriED solution (1% (v / v) Triton X-100, 1mM EDTA). The sample was centrifuged again, the supernatant removed and the sediment in Solubilisierungspufter (100 mM Tris base, 6 M guanidium hydrochloride, 2 mM EDTA). The obtained solution was 1: 100 in renaturation buffer (50 mM Tris base, 1 mM EDTA, 1M arginine, pH 8.0) and over Night at 4 ° C incubated. This was followed by a further addition of one daily Proportion of the sample to the renaturation buffer up to a dilution ratio of 1:25. The complete batch was then centrifuged and in the supernatant obtained the fraction with the protein D1-2.

Beispiel 1: Phagen-Transport-StudienExample 1: Phage Transport Studies

Zur Untersuchung des Transportes von Wildtyp-M13-Bakteriophagen in den Richtungen apikalbasolateral und basolateral-apikal wurden zwei unabhängige Dreifach-Bestimmungen im oben beschriebenen Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen durchgeführt. Hierfür wurden jeweils drei Transwelleinsätze mit einem Mindestwiderstand von 600 Ohmxcm² vorbereitet, wie es oben beschrieben ist.To investigate the transport of wild-type M13 bacteriophage in the apical-basolateral and basolateral-apical directions, two independent triplicate determinations were performed in the above-described brain capillary endothelial cell transwell system. For this purpose, three Transwelleinsätze were prepared with a minimum resistance of 600 Ohmxcm ² , as described above.

Am Versuchstag wurde der endotheliale Widerstand (TEER) der Transwelleinsätze gemessen und die geeigneten Transwelleinsätze in frische Schalen überführt. Ein Medienwechsel erfolgte durch Zugabe von 400 μl (apikal) und 1,5 ml (basolateral) frischem, auf 37°C vorgewärmtem DMEM/Ham's F12-Medium. Danach wurden jeweils apikal 6 μl FITC-Inulin-Lösung (1 mM FITC-Inulin) und apikal (Untersuchung des Transports in Richtung apikal-basolateral) bzw. basolateral (Untersuchung des Transports in Richtung basolateral-apikal) 100 μl Phagensuspension (10¹³ pfu/ml) zugegeben.On the day of the experiment, the endothelial resistance (TEER) of the trans-wave inserts was measured and the appropriate trans-wave inserts were transferred to fresh dishes. A medium change was made by adding 400 μl (apical) and 1.5 ml (basolateral) fresh 37 ° C preheated DMEM / Ham's F12 medium. Thereafter apical 6 μl FITC-inulin solution (1 mM FITC-inulin) and apical (assaying for apical-basolateral transport) or basolateral (assaying for basolateral-apical transport) 100 μl phage suspension (10 ¹³ pfu / ml).

Zur Überprüfung, ob eine Beschädigung im Zellrasen vorlag, die einen unspezifischen Durchtritt ermöglichte, wurde ein möglicher Durchtritt von FITC-Inulin-Lösung gemessen. Hierfür wurden zum Zeitpunkt T0 50 μl apikal entnommen und die Fluoreszenzintensität bei 520 nm im ELISA-Reader bestimmt. Nach 30 min (T30) Inkubation bei 37°C wurden apikal und basolateral jeweils 50 μl Proben entnommen und die Fluoreszenzintensität erneut gemessen. Die Endothelzellen in den eingesetzten Transwellschalen blieben für FITC-Inulin undurchlässig, so dass eine Beschädigung des Zellrasens und ein unspezifischer Stoffdurchtritt ausgeschlossen werden konnten.To check if a damage present in the cell lawn, which allowed a non-specific passage, became a possible Passage of FITC inulin solution measured. Therefor at time T0 50 μl taken from the apical and the fluorescence intensity at 520 nm in the ELISA reader certainly. After 30 min (T30) incubation at 37 ° C became apical and basolateral 50 μl each Samples were taken and the fluorescence intensity was measured again. The endothelial cells in the inserted Transwellschalen remained impermeable to FITC-inulin, so that a damage of the cell lawn and a non-specific passage of material excluded could become.

In den zu den Zeitpunkten T0 und T30 apikal und basolateral entnommenen Proben wurden die Phagentiter in der oben beschriebenen Weise bestimmt. Überraschenderweise zeigte sich dabei ein Durchtritt von ca. 10 % der eingesetzten Wildtyp-M13-Bakteriophagen in der Richtung apikalbasolateral. Demgegenüber war der Durchtritt in umgekehrter Richtung basolateral-apikal um den Faktor 50 geringer. Da ein unspezifischer Stofftransport ausgeschlossen werden konnte, konnten die Ergebnisse zeigen, dass M13-Bakteriophagen, zumindest im etablierten Modellsystem, spezifisch die Blut-Hirn-Schranke überwinden konnten. Darüber hinaus erwies sich der Transport überraschenderweise als polar, d. h. dass 10 % der eingesetzten Phagen im Modell vom Blut ins Gehirn transportiert werden, aber nur 0,2 % aus dem Gehirn in der gleichen Zeit wieder zurücktransportiert werden. Die Ergebnisse sind in 5 graphisch dargestellt.In the apical and basolateral samples taken at T0 and T30, the phage titers were determined in the manner described above. Surprisingly, it showed a passage of about 10% of the wild-type M13 bacteriophages used in the apical basolateral direction. In contrast, the passage in the reverse direction was lower by a factor of 50 basolateral-apical. Since nonspecific mass transport could be ruled out, the results showed that M13 bacteriophages, at least in the established model system, were able to specifically cross the blood-brain barrier. In addition, the transport surprisingly proved to be polar, ie 10% of the phages used in the model are transported by the blood to the brain, but only 0.2% are transported back out of the brain at the same time. The results are in 5 shown graphically.

Beispiel 2: Vergleich zweier verschiedenen ZellbarrieresystemeExample 2: Comparison two different cell barrier systems

In einem weiteren Experiment wurden als Zellbarriere Hirnkapillarendothelzellen einerseits und Ca-Co-2-Zellen andererseits wie in Beispiel 1 vorbereitet. Die CaCo-2-Zellen wurden bei einem Widerstand größer 400 Ohm × cm² im Test verwendet. Wiederum wurde der Durchtritt von Wildtyp-M13-Bakteriophagen durch die zwei verschiedenen Zellbarrieren untersucht. Während die Phagen die Barriere aus Hirnkapillarendothelzellen wie in Beispiel 1 spezifisch in der Richtung apikal-basolateral überwinden konnten, wurde bei den CaCo-2-Zellen nur ein geringer Durchtritt der Phagen (nur 0,05 %) beobachtet. 6 zeigt den Vergleich der prozentualen Anteile der durchgetretenen Phagen. Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 zusammengefasst sind, lassen auf einen selektiven Transport der Phagen über Hirnkapillarendothelzellen schließen.In another experiment, brain capillary endothelial cells, on the one hand, and Ca-Co-2 cells, on the other hand, were prepared as in Example 1 as a cell barrier. The CaCo-2 cells were used at a resistance greater than 400 ohm.cm ² in the assay. Again, the passage of wild-type M13 bacteriophages through the two different cell barriers was examined. While the phages were able to overcome the barrier of brain capillary endothelial cells specifically in the apical-basolateral direction as in Example 1, only a small passage of the phages (only 0.05%) was observed in the CaCo-2 cells. 6 shows the comparison of the percentages of well-passed phages. The results, summarized in Table 1, suggest selective transport of the phages via brain capillary endothelial cells.

Tabelle 1: Zusammenfassung der Ergebnisse des Transportvergleiches über die Zellbarrieren in den zwei verschiedenen untersuchten Zellkulturmodellen. Verwendet wurden ein BHS-Modell (BHS) und ein Modell für Darmepithelbarrieren (CaCo-2). In Spalte 2 ist die Richtung des Transportes dargestellt. Bei der Simulation des Transportes vom Blut ins Gehirn wurden die M13-Phagen apikal zugegeben und der Durchtritt durch basolaterale Entnahme des Mediums nach 30 min bestimmt. Beim Transport vom Gehirn ins Blut wurden die Phagen basolateral zugegeben und der Durchtritt nach 30 min durch Entnahme des apikalen Mediums bestimmt. Die dritte Spalte gibt den Durchtritt als jeweiligen prozentualen Anteil der eingesetzten Phagen an, und der in Spalte 4 dargestellte Faktor zeigt einen Vergleich zwischen den einzelnen Transportraten mit dem Durchtritt im BHS-Modell vom Blut ins Gehirn.

Table 1: Summary of the results of the transport comparison across the cell barriers in the two different cell culture models studied. A BHS model (BBB) and a model for intestinal epithelial barriers (CaCo-2) were used. Column 2 shows the direction of the transport. In the simulation of the transport of blood into the brain, the M13 phages were added apically and the passage was determined by basolateral removal of the medium after 30 min. When transported from the brain to the blood, the phages were added basolaterally and the passage was determined after 30 minutes by removing the apical medium. The third column indicates the passage as the respective percentage of the phages used, and the factor shown in column 4 shows a comparison between the individual transport rates with the passage in the BHS model from the blood to the brain.

Beispiel 3: Bestimmung von kinetischen Daten des Transports von M13-Phagen im BHS-ModellExample 3: Determination kinetic data on the transport of M13 phages in the BHS model

Zur Bestimmung der maximalen Transportgeschwindigkeit im Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen gemäß Beispiel 1 in der Richtung apikal-basolateral wurden in vorbereitete Transwellschalen zum Zeitpunkt T0 apikal 100 μl M13-Bateriophagensuspension zugegeben (10¹³ pfu/ml) und bei 37°C inkubiert. Dem basolateralen Kompartiment wurden nach verschiedenen Zeiten Proben entnommen und der Phagentiter in den Proben bestimmt. Der gleiche Versuch wurde auch bei basolateraler Zugabe der Phagensuspension und apikaler Entnahme nach verschiedenen Zeiten durchgeführt. Es zeigte sich eine maximale Transportrate von 750 Phagenpartikeln pro Minute für den Transport in der Richtung apikal-basolateral und von 150 Phagenpartikeln pro Minute für den retrograden Transport, d. h. in umgekehrter Richtung basolateral-apikal. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt.To determine the maximum transport velocity in the transwell system with brain capillary endothelial cells according to Example 1 in the apical-basolateral direction, apical 100 μl of M13-bateriophil suspension were added to prepared transwell dishes at time T0 (10 ¹³ pfu / ml) and incubated at 37 ° C. The basolateral compartment was sampled at various times and the phage titer in the samples was determined. The same experiment was also performed with basolateral addition of the phage suspension and apical removal performed at different times. There was a maximum transport rate of 750 phage particles per minute for transport in the apical-basolateral direction and 150 phage particles per minute for retrograde transport, ie, in the reverse direction, basolateral-apical. The results are in 7 shown.

Der Km-Wert des Transportes in der Richtung apikal-basolateral, entsprechend der Richtung vom Blut ins Gehirn, wurde ebenfalls im Transwellsystem ermittelt. Dazu wurden Transwells wie beschrieben vorbereitet und apikal unterschiedliche molare Mengen M13-Phage zugegeben. Nach 20 min wurde basolateral das Medium entnommen und der Titer bestimmt. In 8 ist die erhaltene Michaelis-Menten-Kinetik dargestellt. Der daraus ermittelte Km-Wert beträgt 2,0 × 10¹³ M.The Km value of the transport in the apical-basolateral direction, corresponding to the direction from the blood to the brain, was also determined in the Transwell system. For this purpose, Transwells were prepared as described and added apically different molar amounts of M13 phage. After 20 min, the medium was removed basolaterally and the titer was determined. In 8th the Michaelis-Menten kinetics obtained is shown. The resulting Km value is 2.0 × 10 ¹³ M.

Beispiel 4: TransporttestsExample 4: Transport Tests

Weitere Untersuchungen lieferten deutliche Anzeichen dafür, dass eine Blockierung oder Modifizierung des P3-Proteins des M13-Bakteriophagen die Transportrate gegenüber dem Wildtyp-Phagen herabsetzen kann.Further Investigations provided clear evidence that a blockage or Modification of the P3 protein of M13 bacteriophage the transport rate across from the wild-type phage.

Bei diesen Versuchen wurden 2 verschiedene Phagenpopulationen im Vergleich zum Wildtyp eingesetzt. Zunächst wurde der in 9, mittlere Darstellung gezeigte genetisch manipulierte Phage verwendet. Dieser präsentiert statistisch ein oder kein modifiziertes P3-Protein, d.h. dann nur unmo difizierte P3-Moleküle auf seiner Oberfläche. Diese Phagen wurden, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, apikal in dem Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen eingestetzt. Nach 30 min wurden Proben entnommen und die Phagentiter bestimmt. Überraschenderweise hatte keiner der durchgetretenen Phagen ein funktionelles modifiziertes P3-Protein auf seiner Oberfläche präsentiert, da die selektierten Phagen entweder keinen funktionellen Leserahmen enthielten (ORF, open reading frame) oder gar keine genetische Manipulation enthielten (Insert). Dies erwies sich als statistisch relevant, da in der eingesetzten Ausgangspopulation 80 % der untersuchten Phagen ein funktionelles, modifiziertes P3-Protein auf der Oberfläche präsentieren. Tabelle 2 fasst die Ergebnisse dieser Tests zusammen.In these experiments, 2 different phage populations were used compared to the wild type. First, the in 9 , middle representation used genetically engineered phage shown. This randomly presents one or no modified P3 protein, ie only unmodified P3 molecules on its surface. These phages were apically inserted into the brain capillary endothelial cell transwell system as described in the previous examples. After 30 minutes, samples were taken and the phage titers were determined. Surprisingly, none of the trespassed phage had presented a functional modified P3 protein on its surface, as the selected phage either contained no functional reading frame (ORF, open reading frame) or contained no genetic manipulation (insert). This turned out to be statistically relevant since in the starting population used, 80% of the phages examined present a functional, modified P3 protein on the surface. Table 2 summarizes the results of these tests.

Tabelle 2: Analyse der modifizierten Phagen. Getestet wurde dabei, ob ein Phagenklon von A) der Ausgangspopulation und B) der selektierten Population eine Insertion enthielt (Spalte 1) und ob diese Insertion einen durchgängigen und vollständigen Leserahmen besaß (Spalte 2) (ORF open reading frame)

Table 2: Analysis of the modified phages. It was tested whether a phage clone of A) the starting population and B) of the selected population contained an insertion (column 1) and whether this insertion had a continuous and complete reading frame (column 2) (ORF open reading frame)

Aufgrund dieser Ergebnisse, wurde das Experiment mit den in 9, untere Darstellung gezeigten Phagen wiederholt. Diese unterschieden sich von den bisher verwendeten dadurch, dass alle auf der Oberfläche präsentierten P3-Proteine modifiziert waren. Diese Phagen wurden, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, apikal in dem Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen eingesetzt. Nach 30 min wurden Proben entnommen und die Phagentiter bestimmt. Es konnten überraschenderweise keine Phagenklone detektiert werden, d.h. es fand kein Transport der Phagen über die Hirnkapillarendothelzellen statt. 10 fasst die Ergebnisse aus Beispiel 4 nochmals zusammen.Based on these results, the experiment with the in 9 , bottom phage shown repeatedly. These differed from those used to date in that all P3 proteins presented on the surface were modified. These phages were inserted apically in the brain capillary endothelial cell transwell system as described in the previous examples. After 30 minutes, samples were taken and the phage titers were determined. Surprisingly, no phage clones could be detected, ie no transport of the phages via the brain capillary endothelial cells took place. 10 summarizes the results from Example 4 again.

Beispiel 5: Transportstudien ProteinfragmenteExample 5: Transport Studies protein fragments

Die Ergebnisse aus Beispiel 4 lassen den Schluss zu, dass es sich bei dem Molekül, das den Transport bedingt, um das Protein P3 handelt oder zumindest handeln könnte. Daher wurden 2 Fragmente davon (D1-2 und D2), denen auch bei der Infektion und Penetration von E. coli die entscheidene Rolle zukommt, rekombinant als N-terminal mit 6 Histidinresten und einer Enterokinaseschnittstelle (DDDDK) markierte Proteine in E. coli hergestellt, wie es oben beschrieben ist (siehe auch 3, 13 und 14).The results from Example 4 allow the conclusion that the molecule that causes the transport is or could at least be the protein P3. Therefore, 2 fragments thereof (D1-2 and D2), which also play a crucial role in the infection and penetration of E. coli, were recombinantly produced as N-terminal with 6 histidine residues and an enterokinase (DDDDK) labeled proteins in E. coli as described above (see also 3 . 13 and 14 ).

Eingesetzt wurden D1-2 und D2, sowie Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Rinderserumalbumin (Fraktion V, BSA, beide Sigma). Verwendet wurden gleiche molare Mengen der eingesetzten Proteine (Tab. 3). Die Widerstände der wie oben beschriebenen Transwellschalen wurden gemessen und Schalen mit einem Widerstand größer 900 Ohm×cm² wurden verwendet.Used were D1-2 and D2, as well as horseradish peroxidase (HRP) and bovine serum albumin (fraction V, BSA, both sigma). Equal molar amounts of the proteins used were used (Table 3). The resistances of the transwell shells as described above were measured and trays with a resistance greater than 900 ohm.cm ² were used.

Die Proteine wurden zusammen mit Na-Fluorescein apikal in das Transwellsystem eingebracht und 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurden apikal und basolateral die Proben entnommen. Für D1-2, D2 und BSA wurden entsprechende Mengen der apikalen und basolateralen Proben auf Nitrocellulosemembran übertragen und mit einer entsprechenden Antikörperkombination wurden die Proteine nachgewiesen. Die quantitative Bestimmung erfolgte durch Vergleich mit einer jeweils entsprechenden mitgeführten Standardeichreihe. Die Auswertung erfolgte nach Scannen der gefärbten Membranen über die 2D-Auswerte-Software AIDA (Raytest). Das Protein HRP wurde in entsprechenden Verdünnungen in einer ELISA-Platte mit dem Substrat ABTS (Fluka) versetzt und die Farbreaktion durch Absorptionsmessung im ELISA-Reader bei 450 nm quantifiziert. Der Durchtritt des Na-Fluoresceins wurde durch eine Quantifizierung im ELISA-Reader (Anregung 480 nm, Emission 520 nm) bestimmt.The Proteins became apical in the transwell system together with Na-fluorescein introduced and at 37 ° C for 30 min incubated. Thereafter, the samples were taken apically and basolaterally. For D1-2, D2 and BSA were corresponding amounts of apical and basolateral Samples transferred to nitrocellulose membrane and with a corresponding Antibody combination the proteins were detected. The quantitative determination was made by comparison with a corresponding respective entrained Standardich series. The evaluation was carried out after scanning the colored membranes over the 2D evaluation software AIDA (Raytest). The HRP protein was transformed into corresponding dilutions in an ELISA plate with the substrate ABTS (Fluka) and the color reaction by absorption measurement in the ELISA reader at 450 quantified. The passage of Na-fluorescein was quantified determined in the ELISA reader (excitation 480 nm, emission 520 nm).

Überraschenderweise zeigte sich bei diesen Versuchen, dass die Proteinfragmente D1-2 (50 %) und D2 (20 %) sehr gut über das Transwellsystem transportiert werden. Im Vergleich dazu werden vergleichbar große Proteine BSA (66 kDa) und HRP (40 kDa) nur zu 0,2 % bzw. 1 % über die BMECs in den Transwellschalen transportiert. Der als Kontrolle mitgeführte Permeabilitätsmarker Na-Fluorescein zeigte keinerlei signifikante Unterschiede in den einzelnen Transwells und der Kontrolle ohne Protein.Surprisingly showed in these experiments that the protein fragments D1-2 (50%) and D2 (20%) very well over the transwell system are transported. In comparison, will be comparably large Proteins BSA (66 kDa) and HRP (40 kDa) only to 0.2% and 1% over the Transported BMECs in the Transwellschalen. The permeability marker carried as control Na-fluorescein showed no significant differences in the individual transwells and the control without protein.

Dass die Proteinfragmente besser transportiert wurden als der Phage selbst, könnte auf eine höheren maximalen Geschwindigkeit, aber auch zusätzlich auf den verwendeten N-terminalen 6-Histidin-Tag, der eine positive Ladung am N-Terminus einführt, zurückzuführen sein. Die Verwendung eines Hiss-Tags hat sich daher als positiv für die Transportrate erwiesen.That the protein fragments were transported better than the phage itself, could to a higher maximum Speed, but also in addition on the used N-terminal 6-histidine tag, which has a positive charge at the N-terminus introduces, be due. The use of a hiss tag has therefore been positive for the transport rate proved.

Tabelle 3 und 11 fassen die erhaltenen Ergebnisse zusammen.Table 3 and 11 summarize the results obtained.

Beispiel 7: Phagen-Transport-Studie von mit Fluoreszenzfarbstoff beladenen PhagenExample 7: Phage Transport Study of fluorescent dye-loaded phages

Wildtyp-M13-Bakteriophagen wurden wie oben beschrieben präpariert. Das erhaltene Phagenpellet wurde in 1 ml Lucifer-Yellow-Lösung (10 mM) resuspendiert. Anschließend wurden 100 μl dieser Suspension in eine Elektroporationsküvette (auf Eis vorgekühlt) überführt und bei einer Transformationsspannung von 0,2–1,3 kV mit dem Farbstoff beladen bzw. gefüllt. Der Ansatz wurde mit 900 μl SM-Puffer aufgenommen und in ein Eppendorffgefäß (1,5 ml) überführt. Durch Zugabe von 200 μl PEG/NaCl-Lösung und Inkubation für 16 h auf Eis wurden die Phagen gefällt. Durch Zentrifugation bei 7.400xg und 4°C wurden die Phagen sedimentiert. Das Sediment wurde anschließend in SM-Puffer/PEG/NaCl (4:1) resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit auf Eis von mindestens 20 min wurde erneut sedimentiert und das Pellet dann in 100 μl SM-Puffer aufgenommen.Wild-type M13 bacteriophage were prepared as described above. The resulting phage pellet was dissolved in 1 ml Lucifer Yellow solution (10 mM). Subsequently 100 μl this suspension in an electroporation cuvette (pre-cooled on ice) and transferred loaded at a transformation voltage of 0.2-1.3 kV with the dye or filled. The approach was with 900 ul SM buffer and transferred to an Eppendorf tube (1.5 ml). By adding 200 .mu.l PEG / NaCl solution and Incubation for The phages were precipitated for 16 h on ice. By centrifugation at 7,400xg and 4 ° C the phages were sedimented. The sediment was subsequently in SM buffer / PEG / NaCl (4: 1) resuspended. After an incubation period on ice of at least The sedimentation was carried out again for 20 minutes and the pellet was then sedimented in 100 μl of SM buffer added.

Von diesen 100 μl wurden der Phagentiter und die Fluoreszenzintensität bestimmt. Jeweils 10¹² Phagen wurden apikal in ein mit Hanks-Puffer gewaschenes Transwell zu 400 μl Hanks-Puffer pipettiert und sofort 50 μl apikal und basolateral zum Zeitpunkt T0 entnommen. Nach Inkubation für 30 min (T30) bei 37°C wurden apikal und basolateral Proben entnommen. Die Fluoreszenzintensitäten der Proben wurden im ELISA-Reader gemessen und die Titer der Phagen bestimmt, wie es oben beschrieben ist.From these 100 μl, the phage titer and the fluorescence intensity were determined. Each 10 ¹² Pha were pipetted apically into a transwell washed with Hanks buffer to 400 μl of Hanks buffer and immediately removed 50 μl apical and basolateral at time T0. After incubation for 30 min (T30) at 37 ° C, apical and basolateral samples were taken. The fluorescence intensities of the samples were measured in the ELISA reader and the titers of the phages determined, as described above.

Die Phagenpartikel waren mit Fluoreszenzfarbstoff beladbar bzw. befüllbar. Diese beladenen Phagenpartikel waren in der Lage, den Farbstoff über die Endothelzellbarriere in Richtung apikalbasolateral zu transportieren. Die Transportrate wurde durch die Beladung mit Farbstoff nicht beeinflusst und lag etwas höher bei 20%, wie bei unbeladenen Phagen.The Phage particles were loadable or fillable with fluorescent dye. These loaded phage particles were able to cross the dye over the Endothelial cell barrier to transport apicalbasolateral. The transport rate was not affected by the dye loading and was a bit higher at 20%, as with unloaded phages.

Auch die Fluoreszenzintensität, die basolateral nachgewiesen werden konnte, bestätigte dieses Ergebnis. 20 % der gesamten Fluoreszenz wurden basolateral gefunden (12).The fluorescence intensity, which could be detected basolaterally, confirmed this result. 20% of the total fluorescence was found basolaterally ( 12 ).

Claims

Active substance transport system, in active ingredient-containing or drug-free form, which is suitable for overcoming a substance barrier or for transporting active substance across a material barrier and comprises at least one transport mediator and optionally one connected to the transport mediator and different from this carrier, wherein the transport mediator and / or Carriers are adapted to receive, entrap, bind, adsorb and / or otherwise couple directly or indirectly via the carrier to the transport mediator, or the transport mediator and / or the carrier, one or more active substances included, included bound , adsorbed and / or otherwise directly or indirectly coupled via the support to the transport mediator, characterized in that the transport mediator comprises one or more substances selected from the group consisting of: filamentous phages; Parts, fragments, particles and fragments of filamentous phage particles; Proteins, parts or regions of proteins and peptides of filamentous phages; Combinations, fusions, derivatives and homologs of the aforementioned substances, wherein filamentous phages comprise intact natural filamentous phages and genetically engineered forms or analogues thereof.

Drug delivery system according to claim 1, characterized characterized in that the material barrier is a biological membrane or a cell membrane, preferably the blood-brain barrier (BBB) of a vertebrate, more preferably the blood-brain barrier of the People is.

Drug delivery system according to claim 1 or 2, characterized in that the transport mediator one or comprises several substances selected from the following group: M13 bacteriophage; Parts, fragments, Particles and fragments of particles of M13 bacteriophages; Proteins, parts or Regions of proteins and peptides of M13 bacteriophages; Combinations, mergers, Derivatives and homologs of the aforementioned substances, M13 bacteriophages intact natural M13 bacteriophages and genetically engineered forms or analogs include.

Drug delivery system according to one of the preceding Claims, characterized in that the transport mediator is comprised of surface proteins, Parts or regions of surface proteins and / or peptides with amino acid sequences of surface proteins of the M13 bacteriophage or combinations, fusions, derivatives and / or Homologs selected from them is.

Drug delivery system according to one of the preceding Claims, characterized in that the transport mediator among the surface proteins P3, P6, P7, P9 of the M13 bacteriophage, parts or regions thereof and / or peptides with amino acid sequences from these surface proteins or combinations, fusions, derivatives and / or homologs thereof selected is.

Drug delivery system according to one of the preceding Claims, characterized in that the transport mediator is below the surface protein P3, parts or regions thereof and / or peptides having amino acid sequences this surface protein of the M13 bacteriophage or combinations, fusions, derivatives and / or Homologs selected from them is.

Drug delivery system according to one of the preceding Claims, characterized in that it is one with the transport intermediary and belonging to this different carrier.

Drug delivery system according to one of the preceding Claims, characterized in that the carrier comprises polymers, solid lipids, liquid Lipids, phospholipid vesicles, nanoparticles or microparticles.

Drug delivery system according to one of the preceding claims, characterized in that the transport mediator comprises a number of immediately consecutive histidine residues, preferably 3 to 10 histidine residues, more preferably 6 histidine residues (His ₆ ; 6-His-tag), preferably at the amino-terminal end of the transport mediator.

Drug delivery system according to one of the preceding Claims, characterized in that it further comprises pharmaceutically acceptable additives and / or auxiliaries.

Use of at least one transport intermediary and optionally one associated with the transport broker and from this different vehicle for the production of a drug or drug delivery system, in drug-containing or drug-free form, which helps to overcome a substance barrier or for the transport of active ingredient via a Stoffbarriere is suitable, the transport agent and / or the carrier are suitable for receiving or enclosing one or more active substances bind, adsorb and / or otherwise directly or indirectly through the carrier to couple to the transport agent, or the transport agent and / or the carrier one or more active substances included, included, bound, adsorbed and / or otherwise directly or indirectly via the carrier coupled to the transport agent, characterized in that that the transport intermediary comprises one or more substances, which are selected from the following group: filamentous phages; Parts, fragments, Particles and fragments of particles of filamentous phages; Proteins, parts or regions of proteins and peptides of filamentous phages; Combinations, fusions, derivatives and homologs of the foregoing substances being filamentous Phages intact natural filamentous Phage and genetically engineered forms or analogs thereof.