DE10330716A1

DE10330716A1 - Process used for eliminating stray light for reading biochips, in fluorescence microscopy and photometric measurements comprises illuminating a specimen to produce a lateral

Info

Publication number: DE10330716A1
Application number: DE2003130716
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Westphal
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2003-07-03
Filing date: 2003-07-03
Publication date: 2005-02-17

Abstract

Process for eliminating stray light during the projection of heterogeneous luminous or illuminated flat specimens (12) onto locally resolving detectors (14) for electromagnetic radiation comprises illuminating the specimen using a lighting device to produce a lateral illumination structure consisting of alternating light/dark regions. At least two dark regions are produced which do not directly adjoin. At least two recordings of the illuminated specimen are produced using a locally resolving detector. For each of these recordings, the illumination structure is displaced laterally relative to the specimen. The intensity measurements in the dark regions of each recording are used for determining locally resolved background signals. A stray light-free projection of the specimen is produced by subtracting the stray light distribution from a previously measured brightness distribution still containing the stray light. An independent claim is also included for an arrangement for carrying out the process.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Eliminierung von Falschlicht bei der Anwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen leuchtenden Objekten auf einen ortsauflösenden Detektor für Strahlung. Solche Objekte können auch Biochips sein, welche auf photolithographischem Wege oder mittels eines Spotters hergestellt wurden, oder Materialoberflächen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist u. a. die quantitative Fluoreszenzmikroskpie.The The invention relates to a method and an arrangement for elimination from stray light when using wide field optics for imaging from heterogeneous luminous objects to a spatially resolving detector for radiation. Such objects can be biochips, which by photolithographic means or by of a spotter or material surfaces. One Another area of application is u. a. the quantitative fluorescence microscopy.

Bei der Verwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen leuchtenden Flächen, bzw. flächenhaften Objekten, auf einen ortsauflösenden Detektor, beispielsweise eine CCD-Kamera, ergibt sich stets das Problem des Vorhandenseins von „Falschlicht", welches die Abbildung des Objektes negativ beeinträchtigt. So wird unter Falschlicht hier jegliches Licht verstanden, das den Kontrast der detektierten Intensitätsverteilung verringert oder verfälscht. Falschlicht entsteht beispielsweise durch Reflexionen und Streulicht an Oberflächen, in Gläsern z. B. Lufteinschlüsse, durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, an Fassungen oder bei Fluoreszenzmessungen durch nicht unterdrücktes Anregungslicht. Weiterhin kann Falschlicht auch aus außerhalb der Fokusebene liegenden Bereichen des Objektes oder der Probe kommen, beispielsweise von der Rückseite eines Objektträgers. Problematisch wird das Falschlicht insbesondere dann, wenn die Helligkeitsverteilung der Probe stark heterogen ist und ein hohes Kontrastverhältnis bei der Detektion verlangt wird.at the use of wide-field optics to image heterogeneously bright ones surfaces, or areal Objects, to a spatially resolving detector, For example, a CCD camera, always results in the problem of Presence of "false-light" the picture of the object negatively affected. Thus, false light is understood here to mean any light which is the light Contrast of the detected intensity distribution is reduced or falsified. False light is caused, for example, by reflections and stray light on surfaces, in glasses z. B. air pockets, by intrinsic fluorescence of the glasses used, sockets or at Fluorescence measurements by non-suppressed excitation light. Farther can be misleading even from outside the focal plane lying areas of the object or the sample, for example, from the back a slide. The problem is the false light in particular when the brightness distribution The sample is highly heterogeneous and has a high contrast ratio the detection is required.

Bei einem Objekt mit minimalem Kontrast setzt sich beispielsweise die helle Fläche aus einer Vielzahl gleichartig fluoreszierender Kügelchen mit einem scharf definierten Durchmesser zusammen. Somit sollte im Idealfall dort, wo sich die Kügelchen befinden maximale Helligkeit vorhanden sein. In den übrigen Bereichen sollte eine vollkommene Dunkelheit herrschen. Tatsächlich ist jedoch auch dort, wo es dunkel sein sollte, eine gewisse Resthelligkeit vorhanden, d, h. ein inhomogener Untergrund, dessen Ursache in dem oben genannten Falschlicht liegt. Wäre dieser Untergrund homogen über das Bild verteilt, könnte er als „offset" betrachtet werden und in einfacher Weise von allen Pixelwerten des Detektors subtrahiert werden. Ein solcher idealer Fall ist jedoch in der Praxis kaum vorhanden, und demzufolge ist diese Vorgehensweise generell nicht anwendbar.at an object with minimal contrast is, for example, the bright area from a multitude of similar fluorescent beads with a sharply defined diameter. Thus, should Ideally, where the beads are located maximum brightness can be present. In the remaining areas should a perfect darkness prevail. In fact, there is where it should be dark, a certain residual brightness exists, d, h. an inhomogeneous underground whose cause is in the above Wrong light is lying. Would this substrate is homogeneous over the picture could be distributed he can be considered as an "offset" and subtracted from all pixel values of the detector in a simple way become. However, such an ideal case hardly exists in practice, and consequently this procedure is generally not applicable.

Bei photometrischen Messungen, speziell bei Biochip-Anwendungen und quantitativer Fluoreszenzmikroskopie im Allgemeinen, wird die nutzbare Intensitätsdynamik, welche das Verhältnis von größtem zu kleinstem detektierbaren Intensitätswert beinhaltet, durch den inhomogenen Untergrund stark eingeschränkt, da bei einer unbekannten Fluorophor-Verteilung das Nutzlicht vom Falschlicht nicht unterschieden werden kann. Dieses ist insbesondere dann problematisch, wenn keine oder kaum Referenzflächen. zur Verfügung stehen, an denen lokal der Untergrund bestimmt werden kann, also z. B. bei hochdichten Biochips, welche photolithographisch hergestellt wurden.at photometric measurements, especially in biochip applications and quantitative fluorescence microscopy In general, the usable intensity dynamics, which is the ratio of largest to smallest detectable intensity value, by the inhomogeneous subsurface severely limited, as in an unknown Fluorophore distribution the useful light from the single light did not differ can be. This is particularly problematic if no or hardly reference surfaces. to disposal stand where the ground can be determined locally, ie z. B. in high-density biochips, which produced photolithographically were.

Bei einem konfokalen Laserscanner wird stets nur eine kleine Fläche der Probe von wenigen μm² beleuchtet und zudem bei der Detektion nur diese kleine Fläche betrachtet. Wird dieses mit Hilfe einer gut angepaßten Lochblende konsequent durchgeführt, so wird Falschlicht von vornherein unterdrückt. Laserscanner weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf. Es sind dies die Anregungssättigung und das starke Ausbleichen von Fluorophoren auf Grund der hohen Strahlungsintensität im Fokus. Ferner gibt es deutliche Einschränkungen bei der Wahl der Wellenlänge. Viele bewegliche Komponenten, ein hoher Justieraufwand sowie eine geringe Quanteneffizienz des Detektors, in der Regel ein Photomultiplier, sind weitere Nachteile.With a confocal laser scanner, only a small area of the sample of a few μm ² is always illuminated and, in addition, only this small area is considered during the detection. If this is carried out consistently with the help of a well-adapted pinhole, then false light is suppressed from the outset. However, laser scanners have a number of disadvantages. These are the excitation saturation and the strong fading of fluorophores due to the high radiation intensity in the focus. Furthermore, there are significant limitations in the choice of wavelength. Many moving components, a high adjustment effort and a low quantum efficiency of the detector, usually a photomultiplier, are further disadvantages.

In der DE 199 30 816 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Tiefenselektion von Mikroskopbildern beschrieben, bei denen ein eindimensional periodisches Gitter, z.B. ein Streifengitter, zur Beleuchtung verwendet wird. Dabei werden mindestens n (n > 2) CCD-Kameraaufnahmen gemacht, wobei die Struktur der Beleuchtung um jeweils 1/n der Gitterkonstanten verschoben wird. Aus den mindestens drei Aufnahmen wird anschließend ein konfokaler Schnitt der Probe berechnet.In the DE 199 30 816 A1 For example, a method and apparatus for depth selection of microscope images are described in which a one-dimensionally periodic grating, eg a strip grating, is used for illumination. At least n (n> 2) CCD camera images are taken with the structure of the illumination shifted by 1 / n of the lattice constant. From the at least three images, a confocal section of the sample is then calculated.

Die WO 98/45745 A1 ( DE 698 02 514 T2 ) beschreibt ein Abbildungssystem und -verfahren für Mikroskope, bei denen eine strukturierte Beleuchtung mittels Überlagerung zweier kohärenter Lichtstrahlen vorgesehen ist. Das Verfahren verfolgt ebenso wie das oben beschriebene Verfahren gemäß der DE 199 30 816 A1 hauptsächlich das Ziel, optische Schnitte in verschiedenen Objektebenen analog einem Laser-Scanning-Mikroskop zu generieren.WO 98/45745 A1 ( DE 698 02 514 T2 ) describes an imaging system and method for microscopes in which a structured illumination by means of superposition of two coherent light beams is provided. The method follows as well as the method described above according to the DE 199 30 816 A1 The main goal is to generate optical sections in different object planes analogous to a laser scanning microscope.

Beide Verfahren dienen dazu, mit einer Weitfeldoptik konfokale Schnitte einer im Vergleich zur Tiefenschärfe dicken Probe oder eines Objektes zu erhalten. In beiden Fällen ist der Rechenaufwand relativ groß, weil trigonometrische Gleichungen gelöst werden müssen. Keines der genannten Verfahren kommt mit weniger als drei Aufnahmen aus.Both Procedures are used to confocal with a wide field optics confocal sections one in comparison to the depth of field get thick sample or an object. In both cases the computational effort is relatively large, because trigonometric equations have to be solved. None of the above Procedure can handle less than three shots.

Die genannten Verfahren verfolgen das Ziel, eine Tiefenauflösung von dicken Proben zu erhalten.The The stated methods pursue the goal of a depth resolution of to get thick samples.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, bei einer Anordnung mit einer Weitfeldoptik zur Abbildung flacher Objekte und Proben, bei denen die gesuchte Information innerhalb der Tiefenschärfe des verwendeten Objektivs liegt, den Einfluß von Falschlicht jeglicher Art auf Messungen und Beobachtungen zu eliminieren und den Intensitäts-Dynamikbereich derartiger Anordnungen zu erweitern.The invention is based on the object in a wide field optic arrangement for imaging flat objects and samples where the information sought is within the depth of field of the objective used, eliminating the influence of false light of any sort on measurements and observations and extending the intensity dynamic range of such arrangements.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem Verfahren zur Eliminierung von Falschlicht mit den im ersten Patentanspruch offenbarten Mitteln gelöst. In den weiteren Ansprüchen 2 bis 6 sind Einzelheiten des Verfahrens dargestellt. Eine erfindungsgemäße Anordnung löst die Aufgabe mit den im Anspruch 7 offenbarten Mitteln. Nähere Ein zelheiten der Anordnung sind in den Unteransprüchen 2 bis 14 dargestellt.According to the invention this Task in a method for eliminating false light with the solved in the first claim disclosed means. In the further claims 2 to 6 details of the process are shown. An inventive arrangement solve the Task with the disclosed in claim 7 funds. Further details the arrangement are shown in the subclaims 2 to 14.

So ist es vorteilhaft, wenn vier Detektoraufnahmen des beleuchteten Objektes oder der Probe mit einem ortsauflösenden Detektor hergestellt werden, wobei für jede dieser Aufnahmen die Beleuchtungsstruktur lateral verschoben wird und sich diese periodisch über die gesamte, vom Detektor aufgenommene Probe erstreckt.So it is advantageous if four detector shots of the illuminated Object or sample prepared with a spatially resolving detector be, where for each of these images laterally displaces the illumination structure will and this periodically over the entire sample taken by the detector extends.

Vorteilhaft ist es ferner, daß die jeweils unbeleuchteten Bereiche jeder der vier Detektoraufnahmen zu einem Bild pixelgenau zusammengefaßt werden und daß Bereiche, die bei keiner der vier Detektoraufnahmen unbeleuchtet waren, interpoliert werden.Advantageous is it further that the each unlighted areas of each of the four detector recordings be summarized pixel-exactly to an image and that areas, which were not illuminated in any of the four detector images, interpolated become.

Vorteilhaft kann auch die Aufnahme, die die Falschlichtverteilung beinhaltet, zur Verminderung des Rauschens geglättet werden. Dieses kann beispielsweise durch eine Tiefpassfilterung erfolgen.Advantageous can also the recording, which includes the false light distribution, be smoothed to reduce the noise. This can for example done by a low-pass filtering.

Erfindungsgemäß wird aus den vier Detektoraufnahmen ein Bild zusammengesetzt. Hierzu gibt es zwei Varianten:

a.) Aus jeder Einzelaufnahme werden nur die beleuchteten Bereiche verwendet und zu einem Bild zusammengesetzt. Da die hellen Bereiche größer sind als die dunklen Bereiche, werden die mehrfach beleuchteten Pixel des Detektors von nur einer Aufnahme verwendet, so daß redundante Bildinformationen verworfen werden. Aufgrund von Beugung können die hellen Bereiche einen Intensitätsab fall zum Rand aufweisen, dem mit einer Referenzierung anhand einer lateral homogen fluoreszierenden Probe begegnet werden kann.
b.) Alle Einzelaufnahmen werden pixelgenau aufaddiert. Die mehrfach beleuchteten Bereiche weisen dann zu hohe Intensitätswerte auf, daher wird eine pixelgenaue Normierung des aufaddierten Bildes durchgeführt. Zu diesem Zweck wird die strukturierte Beleuchtung an einem dünnen, fluoreszierenden oder leuchtenden Referenzobjekt durchgeführt. Das aufaddierte Bild des Referenzobjektes beinhaltet die Normierungsfunktion. Zur Normierung wird das aufaddierte Bild der Probe durch das aufaddierte Bild des homogenen Referenzobjektes dividiert.

According to the invention, an image is assembled from the four detector images. There are two variants for this:

a.) From each single shot only the illuminated areas are used and put together to form a picture. Since the bright areas are larger than the dark areas, the multi-illuminated pixels of the detector are used by only one shot, so that redundant image information is discarded. Due to diffraction, the bright areas may have a drop in intensity towards the edge, which may be counteracted by referencing using a laterally homogeneous fluorescent sample.
b.) All single images are added up with pixel accuracy. The multiply illuminated areas then have too high intensity values, therefore a pixel-precise normalization of the added-up image is performed. For this purpose, the structured illumination is performed on a thin, fluorescent or luminous reference object. The added picture of the reference object contains the normalization function. For normalization, the added image of the sample is divided by the added image of the homogeneous reference object.

Alternativ zu a.) und b.) könnte die gesuchte Bildinformation mittels einer Einzelaufnahme ohne strukturierte Beleuchtung gewonnen werden. Hierzu müßte allerdings die Feldblende gewechselt werden.alternative to a.) and b.) could the image information sought by means of a single image without structured Lighting can be won. However, this would have the field stop change.

Die ortsaufgelöste Falschlichteliminierung besteht nun darin, das Bild mit der Falschlichtinformation von dem Hellbild gemäß a.) bzw. b.) zu subtrahieren. Hierzu werden alle Lichtanteile, die nicht aus der Fokusebene stammen, aus dem Hellbild entfernt.The spatially resolved False light elimination now consists of the image with the misleading information from the bright image according to a.) or b.) to subtract. For this purpose, all lights that are not off come from the focal plane, removed from the bright image.

Eine Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen, leuchtenden (oder beleuchteten), flächenhaften Objekten oder Proben auf ortsauflösenden Detektoren, umfaßt eine Strahlungsquelle mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender Beleuchtungsoptik zur homogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten Feldblendenebene, in welcher eine strukturierte Feldblende zur Erzeugung einer dem Objekt oder der Probe überlagerten Beleuchtungsstruktur angeordnet ist, welche durch erste optische Mittel auf die Probe abgebildet wird, wobei diese ersten optischen Mittel einen Beleuchtungstubus, gegebenenfalls einen Farbteiler und ein Objektiv umfassen können. Es sind ferner zweite optische Mittel zur Abbildung der Probe zusammen mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor, insbesondere für optische Strahlung, vorgesehen. Die Anordnung enthält ferner Einstellmittel, mit denen die Beleuchtungsstruktur in der Objektebene zusammen mit dem Objekt oder der Probe definiert positionierbar ist. Der Detektor ist mit einer Auswerteeinheit zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes verbunden.A Arrangement for implementation the method of eliminating false light in the image of heterogeneous, luminous (or illuminated), planar Objects or samples on spatially resolving detectors, includes a Radiation source with downstream, the radiation homogenizing Illumination optics for homogeneous illumination of a downstream one Field stop plane in which a structured field stop for generating a lighting structure superimposed on the object or the sample is arranged, which by first optical means on the sample which first optical means comprises a lighting tube, optionally may include a color splitter and a lens. It are further second optical means for imaging the sample together with the superimposed Illumination structure on a spatially resolving detector, in particular for optical radiation, intended. The arrangement contains furthermore adjusting means with which the illumination structure in the Object plane can be positioned together with the object or the sample is. The detector is equipped with an evaluation unit for determining and Elimination of the mischief connected.

Dabei ist es vorteilhaft, wenn der ortsauflösende Detektor eine CCD- oder CMOS-Matrix ist.there It is advantageous if the spatially resolving detector a CCD or CMOS matrix is.

Um eine entsprechende Beleuchtungsstruktur zu erzeugen, besitzt die strukturierte Feldblende eine Hell-Dunkel-Struktur von unterschiedlicher Geometrie. Hier hat sich als günstig herausgestellt, wenn die einzelnen hellen und dunklen Bereiche der Feldblende eine quadratische Form besitzen. Hinsichtlich der Gesamtmeßdauer erweist sich eine schachbrettartige Struktur als besonders vorteilhaft, da nur zwei Aufnahmen erforderlich sind.Around To produce a corresponding illumination structure has the structured field stop a light-dark structure of different geometry. Here has been favorable exposed, with the individual light and dark areas of the Field diaphragm have a square shape. In terms of Gesamtmeßdauer proves a checkered structure is particularly advantageous because only two shots are required.

Vorteilhaft ist es auch, wenn zur Erzielung mindestens zweier unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen die Feldblende in den zwei Koordinaten der Feldblendenebene definiert und reproduzierbar durch Verschieben positionierbar ist.Advantageous It is also, if to achieve at least two different Lighting structures the field stop in the two coordinates of Field stop layer defined and reproducible by moving is positionable.

Zur Erzielung dieser mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen kann eine Glasplatte hinter der Feldblende auch vorteilhaft um die zwei Koordinaten, die die Feldblendenebene definieren, definiert und reproduzierbar gekippt werden.to Achieving these at least two lighting structures can one Glass plate behind the field stop also beneficial around the two coordinates, the Define the field diaphragm plane, defined and reproducibly tilted become.

Es ist ferner vorteilhaft, daß zur Positionierung und/oder Verkippung der Glasplatte hinter der Feldblende in der Feldblendenebene oder zur Positionierung der Beleuchtungsstruktur und der Probe in der Objektebene als Antriebs- und Einstellmittel Piezoaktuatoren, Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebsmechanismen vorgesehen sind, die eine entsprechende präzise Verstellung und Positionierung ermöglichen.It is also advantageous that the Positioning and / or tilting the glass plate behind the field stop in the field stop plane or for positioning the illumination structure and the sample in the object plane as drive and adjustment means Piezo actuators, eccentric drives or other suitable drive mechanisms are provided, a corresponding precise adjustment and positioning enable.

Von Vorteil ist es auch, wenn die Feldblende in zwei senkrecht zueinander verlaufenden Richtungen periodisch abwechselnde Hell-Dunkel-Kontraste geeigneter Geometrie und Größe aufweist, wobei die dunklen Kontraste (Bereiche) nicht direkt aneinander grenzen sollen, um im Falle von Positionierungsungenauigkeiten keine Bereiche der Probe unbeleuchtet zu lassen.From It is also advantageous if the field stop in two perpendicular to each other extending directions periodically alternating light-dark contrasts suitable Has geometry and size, the dark contrasts (areas) are not directly adjacent to each other in order to avoid any areas in case of positioning inaccuracies to leave the sample unlit.

Vorteilhaft ist ferner, die Feldblende als Streifengitter mit einer streifenförmigen Struktur aus einander abwech selnden Hell-Dunkel-Kontrasten auszubilden, wenn die Beleuchtungsoptik einen Astigmatismus besitzt, hervorgerufen beispielsweise durch Filter, die nicht senkrecht zur optischen Achse des Strahlenganges stehen.Advantageous is further, the field stop as a strip grid with a strip-shaped structure form mutually contrasting light-dark contrasts when the illumination optics has an astigmatism, caused for example, by filters that are not perpendicular to the optical axis of Beam path stand.

Zur Erzeugung von mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen kann auch, wenn es sich als vorteilhafter erweist, das Objekt oder die Probe in den zwei Koordinaten der Objektebene definiert und reproduzierbar positioniert werden. Als Antriebsmittel können auch hier Piezoaktuatoren, Exzenterantriebe oder andere für motorisierte Probentische geeignete Antriebe vorgesehen sein.to Generation of at least two illumination structures can also, if it proves to be more advantageous, the object or the sample defined and reproducible in the two coordinates of the object plane be positioned. As drive means also piezoactuators, Eccentric drives or other for motorized sample tables suitable drives can be provided.

Sowohl das Verfahren als auch die Anordnung, mit der dieses Verfahren durchgeführt wird, können vorteilhaft zum Auslesen von Biochips, in der Fluoreszenzmikroskopie und bei photometrischen Messungen angewendet werden.Either the method as well as the arrangement with which this method is carried out can be advantageous for reading biochips, in fluorescence microscopy and in photometric measurements are applied.

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. In der zugehörigen Zeichnung zeigenThe Invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment. In the associated Show drawing

1 einen optischen Aufbau einer erfindungsgemäßen Anordnung, 1 an optical design of an arrangement according to the invention,

2 eine Variante einer Strukturierung der Feldblende und zugehörige Signalverläufe, 2 a variant of a structuring of the field stop and associated signal curves,

3 eine weitere Variante einer Strukturierung der Feldblende und zugehörige Signalverläufe, 3 a further variant of a structuring of the field stop and associated signal courses,

4 eine weitere Variante einer Strukturierung der Feldblende und zugehörige Signalverläufe, 4 a further variant of a structuring of the field stop and associated signal courses,

5 eine streifenförmig strukturierte Feldblende mit zugehörigen Signalverläufen, 5 a strip-shaped structured field stop with associated signal characteristics,

6 Verstellmittel zur Kippung einer hinter der strukturierten Feldblende angeordneten Glasplatte, 6 Adjusting means for tilting a glass plate arranged behind the structured field stop,

7 Verstellmittel zur lateralen Verstellung der Feldblende und 7 Adjusting means for the lateral adjustment of the field diaphragm and

8 eine Feldblende mit Exzenterverstellung. 8th a field diaphragm with eccentric adjustment.

1 zeigt stark vereinfacht den optischen Gesamtaufbau einer Anordnung, mit dem eine scharfe Abbildung einer strukturierten Feldblende auf ein Objekt oder eine Probe realisiert werden kann. 1 clearly shows the overall optical design of an arrangement with which a sharp image of a structured field stop can be realized on an object or a sample.

Die Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Anwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung heterogener beleuchteter Objekte nach 1 umfaßt eine Licht- oder Strahlungsquelle 1, der beispielsweise ein Filter 2 und ein Verschluß 3 und unter Umständen den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 4, wie z.B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und Beleuchtungsoptiken 5 und 6 zur homogenen Ausleuchtung einer in der Feldblendenebene 7 im Strahlengang angeordneten, strukturierten Feldblende 8 nachgeordnet sind. Diese Feldblende 8 ist im Strahlengang in den beiden Koordinaten der Feldblendenebene 7 definiert positionierbar angeordnet. Sie kann also in dieser Ebene 7 verschoben werden. Durch der Feldblende 8 nachgeordnete, erste optische Mittel, wie z. B. Beleuchtungstubus 9, Strahlenteiler 10 und Objektiv 11, wird die strukturierte Feldblende 8 auf das zu untersuchende oder zu messende Objekt oder die Probe 12 abgebildet. Durch zweite optische Mittel, die beispielsweise auch das Objektiv 11, den Strahlenteiler 10 sowie einen Abbildungstubus 13 umfassen, wird die Probe 12 kontrastreich zusammen mit der ihr überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor 14 für optische Strahlung abgebildet. Dieser Detektor 14 umfaßt eine Matrix aus CCD- oder CMOS-Elementen und kann Bestandteil einer CCD-Kamera sein. Der Detektor 14 ist mit einer Auswerteeinheit 15 verbunden, durch welche die Meßergebnisse erstellt werden und die Ermittlung bzw. Eliminierung des Falschlichtes bei der Abbildung der Probe 12 erfolgt.The arrangement for carrying out the method for eliminating stray light in the application of wide-field optics for imaging heterogeneous illuminated objects according to 1 includes a light or radiation source 1 for example, a filter 2 and a closure 3 and possibly the beam path homogenizing optical elements 4 , such as a light guide rod or an internally mirrored glass hollow rod, and illumination optics 5 and 6 for homogeneous illumination of one in the field diaphragm plane 7 arranged in the beam path, structured field stop 8th are subordinate. This field stop 8th is in the beam path in the two coordinates of the field stop plane 7 defined positionable arranged. So you can be in this plane 7 be moved. Through the field stop 8th downstream, first optical means, such. B. lighting tube 9 , Beam splitter 10 and lens 11 , becomes the structured field stop 8th to the object or sample to be examined or measured 12 displayed. By second optical means, for example, the lens 11 , the beam splitter 10 as well as a picture tube 13 include, the sample becomes 12 Contrast rich together with the superimposed illumination structure on a spatially resolving detector 14 imaged for optical radiation. This detector 14 comprises a matrix of CCD or CMOS elements and may be part of a CCD camera. The detector 14 is with an evaluation unit 15 connected by which the measurement results are created and the determination or elimination of the stray light when imaging the sample 12 he follows.

Der Strahlenteiler 10 kann auch als Farbteiler ausgebildet sein und Filter 16; 17 umfassen, mit denen unerwünschte oder störende Strahlungsanteile ausgefiltert werden können. Der Strahlenteiler 10 und die Filter 16; 17 sind Bestandteile einer Anordnung für Auflichtfluoreszenz, wobei es vorteilhaft ist, wenn die Filter 16 und 17 um einige Winkelgrade schräg gestellt sind, um so störende Reflexe aus dem Strahlengang zu entfernen.The beam splitter 10 can also be designed as a color divider and filter 16 ; 17 include, with which unwanted or disturbing radiation components can be filtered out. The beam splitter 10 and the filters 16 ; 17 are components of an arrangement for incident light fluorescence, wherein it is advantageous if the filters 16 and 17 are tilted by a few degrees, so as to remove disturbing reflections from the beam path.

Die in 2 dargestellte Variante einer strukturierten Feldblende 8 umfaßt eine Hell-Dunkel-Struktur oder eine Struktur aus Hell-Dunkel-Kontrasten, bestehend aus matrixartig angeordneten hellen Bereichen 18 und dunklen Bereichen 19, wobei die dunklen Bereiche 19 insgesamt flächenmäßig kleiner sind als die hellen Bereiche 18, da die Stege 20 zwischen den einzelnen Bereichen 18; 19 hell sind. Die Bereiche 18 und 19 haben in ihren zwei orthogonalen Richtungen die Abmessungen b und d und die Abstände einander benachbarter Bereiche werden in diesen Richtungen mit a und c bezeichnet.In the 2 illustrated variant of a structured field stop 8th comprises a light-dark structure or a structure of light-dark contrasts consisting of bright areas arranged like a matrix 18 and dark areas 19 , where the dark areas 19 in total areal smaller than the bright areas 18 because the bridges 20 between the different areas 18 ; 19 are bright. The areas 18 and 19 have dimensions b and d in their two orthogonal directions, and the distances of adjacent areas are designated a and c in these directions.

Nach dem Verfahren werden auf der Probe 12 durch die Abbildung der strukturierten Feldblende 8 eine aus Hell-Dunkel-Strukturen bestehende Beleuchtungsstruktur erzeugt. Diese Hell-Dunkel-Strukturen weisen bevorzugt eine der im Zusammenhang mit der Beschreibung der 2 bis 5 angegebenen Geometrien auf. Die schwarz dargestellten Flächen entsprechen nichttransparenten, die hellen Flächen transparenten Bereichen der Feldblende 8. Durch Verschiebung der Feldblende 8 in der Feldblendenebene 7 wird die abgebildete Hell-Dunkel-Struktur in der Objektebene relativ zur Probe 12 so verschoben, daß mindestens zwei unterschiedliche Beleuchtungsstrukturen reproduzierbar eingestellt werden können. Mögliche Verstellmechanismen für die Feldblende 8 werden im Zusammenhang mit der Beschreibung der 6 bis 8 weiter unten erläutert. Alternativ kann bei feststehender Feldblende 8 die Probe 12 verschoben werden. Hierzu kann ein nicht dargestellter, motorisierter Tisch verwendet werden, auf welchem die Probe 12 angeordnet ist.After the procedure will be on the sample 12 by the image of the structured field stop 8th creates a lighting structure consisting of light-dark structures. These light-dark structures preferably have one of those described in connection with the description of FIG 2 to 5 specified geometries. The areas shown in black correspond to non-transparent, the bright areas transparent areas of the field stop 8th , By shifting the field stop 8th in the field diaphragm level 7 the depicted light-dark structure in the object plane becomes relative to the sample 12 moved so that at least two different lighting structures can be adjusted reproducible. Possible adjustment mechanisms for the field diaphragm 8th be related to the description of the 6 to 8th explained below. Alternatively, with fixed field stop 8th the sample 12 be moved. For this purpose, an unillustrated, motorized table can be used, on which the sample 12 is arranged.

Für die Abmessungen (Strecken) a; b; c; und d gelten folgende Randbedingungen: b < a und d < c. Die genauen Verhältnisse b/a und d/c werden so eingestellt, daß sie möglichst nahe bei 1 (eins) liegen. Es wird aber gleichzeitig sichergestellt ist, daß jeder Punkt auf der Probe 12 bei mindestens einer Beleuchtungsposition hell ist. Abhängig ist dieses von der lateralen Positioniergenauigkeit der strukturierten Beleuchtung auf der Probe 12. Die Stecken a und c werden der Probenstruktur und -beschaffenheit und der gewünschten Ortsauflösung für die Falschlichtmessung angepaßt. Probenseitig liegen die Strecken a und c im μm-Bereich.For dimensions (distances) a; b; c; and d the following boundary conditions apply: b <a and d <c. The exact ratios b / a and d / c are set to be as close as possible to 1 (one). At the same time it is ensured that every point on the sample 12 is bright in at least one lighting position. This is dependent on the lateral positioning accuracy of the structured illumination on the sample 12 , The pins a and c are adapted to the sample structure and condition and the desired spatial resolution for the stray light measurement. On the sample side, the distances a and c are in the μm range.

So werden mit der Variante nach 2, bei welcher die hellen Bereiche 18 mehr als 50 % betragen, vier Beleuchtungsstrukturen auf der Probe 12 eingestellt, wobei die dargestellte Beleuchtungsstruktur entweder horizontal um a oder vertikal um c oder um beide Strecken relativ zur Probe verschoben wird, wobei jeder der angegebenen Bereiche 18; 19 einmal unbeleuchtet ist. Die Ziffern 1 bis 4 in den Bereichen geben exemplarisch die sukzessiven Positionen des dunklen Bereiches an. Die strukturierte Beleuchtung erstreckt sich über das gesamte von dem Detektor 14 aufgenommene Bild der Probe 12.So will with the variant 2 in which the bright areas 18 more than 50%, four lighting structures on the sample 12 adjusted, wherein the illustrated illumination structure is shifted either horizontally by a or vertically by c or both distances relative to the sample, wherein each of the specified ranges 18 ; 19 once unlit. The numbers 1 to 4 in the ranges indicate by way of example the successive positions of the dark area. The structured illumination extends over the whole of the detector 14 taken picture of the sample 12 ,

Wird die Helligkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 21 in 2 betrachtet, so werden bei einer homogen leuchtenden Probe 12 die in dieser Fig. unten angegeben Signalverläufe 1 bis 4 erhalten, welche zu den vier Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 12 bzw. auf dem Detektor 14 korrespondieren. Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 12 vor und werden die Helligkeitswerte aller vier aufgenommenen Bilder addiert, so wird entlang der gestrichelten Linie 21 der unterste Signalverlauf (1+2+3+4) erhalten. Da die hellen Bereiche 18 hier überwiegen, wird durch die Addition der vier Aufnahmen eine gute Signalausbeute in den hellen Bereichen 18 erhalten.Will the brightness distribution along the dashed line 21 in 2 considered to be in a homogeneously glowing sample 12 the waveforms 1 to 4 given in this figure below, which correspond to the four illumination positions of the image of the field stop 8th on the test 12 or on the detector 14 correspond. For example, is a homogeneous reflective or fluorescent sample 12 before and the brightness values of all four recorded images are added, so along the dashed line 21 the lowest signal (1 + 2 + 3 + 4) obtained. Because the bright areas 18 here outweighs, by the addition of the four shots a good signal yield in the bright areas 18 receive.

Die vier addierten Bilder, aufgenommen an einer homogen leuchtenden Normierungsprobe, können zur pixelgenauen Helligkeitsnormierung verwendet werden. Die Normierung kann dann zur Anwendung kommen, wenn die Helligkeitsverteilung einer realen Probe 12 mit einer beliebigen Reflektivität und/oder Fluorophorverteilung durch Addition der vier aufgenommenen Bilder nach dem o. g. Verfahren ermittelt wird. Alternativ kann die Helligkeitsverteilung der realen Probe 12 auch durch eine einzige Aufnahme mit einer unstrukturierten Beleuchtung der Probe 12 ermittelt werden, wobei jedoch die Feldblende 8 entfernt oder ausgetauscht werden muß.The four added images, taken on a homogeneously bright standardization sample, can be used for pixel-precise brightness normalization. The normalization can be used when the brightness distribution of a real sample 12 with any reflectivity and / or fluorophore distribution by addition of the four recorded images is determined by the above method. Alternatively, the brightness distribution of the real sample 12 also by a single image with an unstructured illumination of the sample 12 be determined, but the field stop 8th removed or replaced.

Eine ortsaufgelöste Eliminierung von Falschlicht bei einer beliebig leuchtenden Probe 12 wird durch die folgende Verfahrensweise erreicht:

– Die jeweils dunklen Bereiche 19 jeder der vier Aufnahmen (Bilder) werden in einem neuen Bild pixelgenau zusammengefaßt. Diejenigen Bereiche, die bei keiner der Aufnahmen unbeleuchtet waren, werden interpoliert.
– Das entstandene Bild mit der ortsaufgelösten Falschlichtverteilung kann bei Bedarf geglättet werden, um das Rauschen im Bild zu vermindern. Dieses kann beispielsweise durch eine Tiefpaßfilterung vorgenommen werden.
– Es wird eine pixelgenaue Subtraktion der ortsaufgelösten Falschlichtverteilung von einer gemessenen Helligkeitsverteilung, in welcher die Falschlichtanteile noch enthalten sind, vorgenommen.

A spatially resolved elimination of stray light on an arbitrarily bright sample 12 is achieved by the following procedure:

- The respective dark areas 19 Each of the four shots (pictures) are summarized in a new image pixel-precise. Those areas that were not illuminated in any of the recordings are interpolated.
- The resulting image with the spatially resolved false light distribution can be smoothed if necessary to reduce the noise in the image. This can be done for example by a low-pass filtering.
- It is a pixel-accurate subtraction of the spatially resolved false light distribution of a measured brightness distribution, in which the Falssichtanteile are still included, made.

Bei der in 3 dargestellten, weiteren Variante einer strukturierten Feldblende 8 und des zugehörigen Signalverlaufes überwiegen die dunklen Bereiche 19 mit mehr als 50%. Wird die Helligkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 22 in 3 betrachtet, so werden die in dieser Fig. unten angegebenen Signalverläufe 1 bis 4 erhalten, welche zu den vier Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 12 bzw. auf dem Detektor 14 korrespondieren. Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 12 vor und werden die Helligkeitswerte aller vier aufgenommenen Bilder addiert, so wird entlang der gestrichelten Linie 21 der unterste Signalverlauf (1+2+3+4) erhalten. So wird eine gute Signalausbeute in den dunklen Bereichen 19 erhalten, also bezüglich des Falschlichtes.At the in 3 represented, further Vari ante of a structured field stop 8th and the associated waveform outweigh the dark areas 19 with more than 50%. Will the brightness distribution along the dashed line 22 in 3 When looking at the signal waveforms 1 to 4 given in this figure below, the four illumination positions of the field stop image are obtained 8th on the test 12 or on the detector 14 correspond. For example, is a homogeneous reflective or fluorescent sample 12 before and the brightness values of all four recorded images are added, so along the dashed line 21 the lowest signal (1 + 2 + 3 + 4) obtained. So will a good signal yield in the dark areas 19 received, so with respect to the wrong-way.

Bei der in 4 dargestellten Variante einer Feldblende 8, bei welcher bei jeder Aufnahme die unbeleuchtete Fläche nahezu 50% einnimmt, werden nur zwei Aufnahmen mit lateral in Bezug auf die Probe verschobener Beleuchtungsstruktur benötigt. Wird die Helligkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 23 in 4 betrachtet, so werden die in dieser 4 unten angegeben Signalverläufe 1 und 2 erhalten, welche zu den zwei Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 12 bzw. auf dem Detektor 14 korrespondieren. Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 12 vor und werden die Helligkeitswerte der beiden aufgenommenen Bilder addiert, so wird entlang der gestrichelten Linie 21 der unterste Signalverlauf (1+2) erhalten.At the in 4 illustrated variant of a field stop 8th , in which the unlit area occupies nearly 50% with each shot, only two shots are needed with a laterally shifted illumination structure with respect to the sample. Will the brightness distribution along the dashed line 23 in 4 considered, so in this 4 below, waveforms 1 and 2 are obtained which correspond to the two illumination positions of the image of the field stop 8th on the test 12 or on the detector 14 correspond. For example, is a homogeneous reflective or fluorescent sample 12 before and the brightness values of the two recorded images are added, so along the dashed line 21 the lowest signal curve (1 + 2) is obtained.

In 5 ist eine Feldblende 8 mit einer streifenförmigen, einander abwechselnden Hell-Dunkel-Bereichen 24 und 25 dargestellt. Wird die Helligkeitsverteilung entlang der gestrichelten Linie 26 in 5 betrachtet, so werden die in dieser 5 unten angegeben Signalverläufe 1 und 2 erhalten, welche zu den zwei Beleuchtungspositionen des Bildes der Feldblende 8 auf der Probe 12 bzw. auf dem Detektor 14 korrespondieren. Liegt beispielsweise eine homogen reflektierende oder fluoreszierende Probe 12 vor und werden die Helligkeitswerte der beiden aufgenommenen Bilder addiert, so wird entlang der gestrichelten Linie 26 der unterste Signalverlauf (1+2) erhalten.In 5 is a field stop 8th with a strip-shaped, alternating light-dark areas 24 and 25 shown. Will the brightness distribution along the dashed line 26 in 5 considered, so in this 5 below, waveforms 1 and 2 are obtained which correspond to the two illumination positions of the image of the field stop 8th on the test 12 or on the detector 14 correspond. For example, is a homogeneous reflective or fluorescent sample 12 before and the brightness values of the two recorded images are added, so along the dashed line 26 the lowest signal curve (1 + 2) is obtained.

Je nach Applikation kann eine der Varianten der Feldblende 8 besonders vorteilhaft eingesetzt werden. So ist eine streifenförmige Beleuchtungsstruktur besonders dann von Vorteil, wenn der Einfluß astigmatischer Fehler der Beleuchtungsoptik auf die Messungen oder Beobachtungen zu minimieren ist.Depending on the application, one of the variants of the field diaphragm 8th be used particularly advantageous. Thus, a strip-shaped illumination structure is particularly advantageous if the influence of astigmatic errors of the illumination optics on the measurements or observations is to be minimized.

Eine definierte, reproduzierbare Positionierung des Bildes der Feldblende 8 relativ zur Probe 12 kann entweder durch eine definierte Verschiebung bzw. Positionierung der Feldblende 8 in der Feldblendenebene 7 oder durch eine definierte Verschiebung bzw. Positionierung der Probe 12 selbst in der Proben- oder Objektebene erzielt werden, wobei diese Positionierung durch eine Verschiebung in der entsprechenden Ebene oder durch Kippung einer hinter der Feldblende 8 angeordneten Glasplatte 27 realisiert wird, um so durch den erzeugten Strahlenversatz mindestens zwei reproduzierbare Beleuchtungsstrukturen zu erzeugen.A defined, reproducible positioning of the image of the field stop 8th relative to the sample 12 can either by a defined displacement or positioning of the field stop 8th in the field diaphragm level 7 or by a defined displacement or positioning of the sample 12 even in the sample or object plane, this positioning being due to a shift in the corresponding plane or by tilting one behind the field stop 8th arranged glass plate 27 is realized so as to generate at least two reproducible lighting structures by the generated beam offset.

6 zeigt vereinfacht eine Vorrichtung zur Erzeugung unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen durch Kippung einer der strukturierten Feldblende 8 in Lichtrichtung nachgeordneten, planparallelen Glasplatte 27. Zur gesteuerten, definierten Kippung dieser Glasplatte 27 sind in vorteilhafter Weise Piezoaktuatoren 28 vorgesehen, welche durch eine nicht dargestellte Ansteuereinheit entsprechend angesteuert werden. Durch die Kippung der Glasplatte 27 erfolgt bekanntermaßen ein optischer Strahlenversatz des Strahlenganges und damit eine versetzte Abbildung der Feldblende 8 auf der Probe 12. Die in der 6 eingezeichneten Pfeile kennzeichnen die Kipprichtungen der Glasplatte 27. Zur Erzeugung des Strahlenversatzes können auch andere geeignete Elemente eingesetzt werden. Als Antriebe für die Glasplatte 27 können auch Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebsmechanismen vorgesehen werden. 6 shows a simplified device for generating different illumination structures by tilting one of the structured field stop 8th downstream in the light direction, plane-parallel glass plate 27 , For controlled, defined tilting of this glass plate 27 are advantageously piezoactuators 28 provided which are driven accordingly by a drive unit, not shown. By tilting the glass plate 27 is known to be an optical beam offset of the beam path and thus an offset image of the field stop 8th on the test 12 , The in the 6 marked arrows mark the tilting directions of the glass plate 27 , To generate the beam offset, other suitable elements can be used. As drives for the glass plate 27 It is also possible to provide eccentric drives or other suitable drive mechanisms.

7 zeigt eine weitere Vorrichtung zur Erzeugung und definierten Positionierung einer Beleuchtungsstruktur in der Probenebene relativ zur Probe 12. Diese Vorrichtung umfaßt Piezoaktuatoren 29 und 30, welche mit der Feldblende 8 in Wirkverbindung stehen und durch welche die Feldblende 8 definiert durch laterale Verschiebung längs der Koordinaten x und y der Feldblendenebene 7 verstellt werden kann. Durch die Abbildung der in unterschiedlichen Positionen eingestellten Feldblende 8 auf die Probe 12 werden unterschiedliche Beleuchtungsstrukturen in den Probenebene erzeugt, welche dann zusammen mit der Probe 12 auf den Detektor 14 abgebildet werden. 7 shows a further device for generating and defined positioning of a lighting structure in the sample plane relative to the sample 12 , This device comprises piezoactuators 29 and 30 , which with the field stop 8th are in operative connection and through which the field stop 8th defined by lateral displacement along the coordinates x and y of the field stop plane 7 can be adjusted. By mapping the field stop set in different positions 8th to the test 12 different lighting structures are generated in the sample plane, which then together with the sample 12 on the detector 14 be imaged.

In 8 ist eine weitere Vorrichtung dargestellt, bei welcher mit der Feldblende 8 in Wirkverbindung stehende Exzenterantriebe 31 und 32 vorgesehen sind, mit denen die Feldblende 8 lateral verschoben und auf diese Weise definiert in der Feldblendenebene 7 positioniert werden kann. Es ist für jede der beiden Koordinaten x und y der Feldblendenebene 7 ein Exzenterantrieb vorgesehen.In 8th another device is shown in which with the field stop 8th operatively connected eccentric drives 31 and 32 are provided, with which the field stop 8th shifted laterally and thus defined in the field stop plane 7 can be positioned. It is for each of the two coordinates x and y of the field stop plane 7 provided an eccentric drive.

Die Erzeugung mindestens zweier unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen auf der Oberfläche der Probe 18 kann auch bei feststehender Feldblende 8 durch eine entsprechende laterale, definierte Positionierung und Einstellung der Probe 12 relativ zur der durch die Abbildung der Feldblende 8 in der Probenebene erzeugten Beleuchtungsstruktur erfolgen. Zur Positionierung der Probe 12 in der Probenebene sind ebenfalls die oben genannten Piezoaktuatoren, Exzenterantriebe oder andere geeignete Verstellmechanismen einzusetzen, vorzugsweise aber ein motorisierter Mikroskoptisch.The generation of at least two different illumination structures on the surface of the sample 18 can even with fixed field stop 8th by a corresponding, lateral, defined positioning and adjustment of the sample 12 relative to the by the picture of the field stop 8th done in the sample plane generated illumination structure. For positioning the sample 12 In the sample level, the abovementioned piezoactuators, eccentric drives or other suitable adjustment mechanisms are also to be used, but preferably a motorized microscope stage.

11: Strahlungsquelleradiation source
22: Filterfilter
33: Verschlußshutter
44: homogenisierendeshomogenizing
: optisches Elementoptical element
5, 65, 6: Beleuchtungsoptikillumination optics
77: FeldblendenebeneField stop plane
88th: Feldblendefield stop
99: Beleuchtungstubusillumination tube
1010: Strahlenteilerbeamsplitter
1111: Objektivlens
1212: Probesample
1313: Abbildungstubusimaging tube
1414: Detektordetector
1515: Auswerteeinheitevaluation
16, 1716 17: Filterfilter
1818: heller Bereichbrighter Area
1919: dunkler Bereichdark Area
2020: Stegweb
21, 22, 2321 22, 23: gestrichelte Liniedashed line
2424: heller Bereichbrighter Area
2525: dunkler Bereichdark Area
2626: gestrichelte Liniedashed line
2727: Glasplatteglass plate
28, 29, 3028 29, 30: Piezoaktuatorpiezo actuator
31, 3231 32: Exzenterantriebeccentric

Claims

Method for eliminating false light in the imaging of heterogeneous luminous or illuminated planar objects or specimens onto spatially resolving electromagnetic radiation detectors, characterized in that - the specimen ( 12 ) is illuminated in such a structured manner by a lighting device that the lateral illumination structure in one direction or in two mutually orthogonal directions periodically alternating light-dark regions (contrasts) on the sample ( 12 ) and at least two dark areas ( 19 ; 25 ), which are not directly adjacent to each other, - that at least two images of the illuminated object or the sample ( 12 ) with a spatially resolving detector ( 14 ), wherein for each of these images the illumination structure in the object plane is laterally relative to the sample ( 12 ), that from the intensity measurements in the dark areas ( 19 ; 25 ) of each recording a spatially resolved background signal is determined - and that by subtracting the determined spatially resolved stray light distribution of a previously measured, the stray light nor brightness distribution still contained a non-saccrible image of the sample ( 12 ) is realized.

Method according to Claim 1, characterized in that - two, four, nine or sixteen detector recordings of the illuminated object or of the sample ( 12 ) with a spatially resolving detector ( 14 ), wherein for each of these images the illumination structure is laterally displaced and extends periodically over the entire sample taken by the CCD camera.

Method according to claim 2, characterized in that - that each unlit areas of each of the at least two detector receptacles be summarized pixel-precise to a picture - and that areas, which were not illuminated in any of these detector images, interpolated become.

Method according to 1 to 3, characterized - that for extraction of complete Image information (with background) regarding the detector images the measured intensities added and spatially resolved normalized or the bright areas of the individual images are summarized - and that the spatially resolved background signals from added detector shots or from a recording without structured lighting can be subtracted.

Method according to Claims 1 to 4, characterized that this Image with the false light distribution to reduce the noise is smoothed.

Method according to claim 5, characterized in that that the smoothing done by a low-pass filtering.

Arrangement for carrying out the method for eliminating stray light in the imaging of heterogeneous luminous (or illuminated) planar objects or samples ( 12 ) on spatially resolving detectors ( 14 ), comprising - a radiation source ( 1 ) with downstream, the radiation homogenizing illumination optics ( 5 ; 6 ) for homogeneous illumination of a downstream field stop plane ( 7 ), - one in the field diaphragm level ( 7 ), structured field stop ( 8th ) for generating in the object plane the object or the sample ( 12 ) to be superposed illumination structure, - first optical means for imaging the strukturier field stop ( 8th ) to the test ( 12 ), - second optical means for imaging the sample ( 12 ) with the superimposed illumination structure on a spatially resolving detector ( 14 ) for optical radiation, - adjusting means for the defined positioning of the illumination structure in the object plane in different positions relative to the sample ( 12 ) - and one with the detector ( 14 ) associated evaluation unit for determining and eliminating the stray light.

Arrangement according to claim 7, characterized in that the spatially resolving detector ( 14 ) is a CCD or CMOS matrix.

Arrangement according to claim 7, characterized in that the structured field stop ( 8th ) has a light-dark structure of different geometry.

Arrangement according to one of claims 7 to 9, characterized in that to achieve at least two illumination structures, the field stop ( 8th ) in the two coordinates (x; y) of the field diaphragm plane ( 7 ) is defined and reproducibly positionable.

Arrangement according to one of Claims 7 to 9, characterized in that, to obtain at least two illumination structures, a glass plate ( 27 ) behind the field stop ( 8th ) is defined by two orthogonal coordinates (x; y) and is reproducibly tiltable.

Arrangement according to one of Claims 7 to 11, characterized in that the field diaphragm ( 8th ) in two mutually perpendicular directions periodically alternating light and dark areas ( 18 ; 19 ), the dark areas ( 19 ) do not directly adjoin one another.

Arrangement according to one of Claims 7 to 11, characterized in that the field diaphragm ( 8th ) a strip-shaped structure of alternating light and dark areas ( 24 ; 25 ) having.

Arrangement according to claim 7, characterized in that in order to obtain at least two illumination structures, the object or the sample ( 12 ) is defined in the two coordinates of the object plane and can be positioned reproducibly.

Arrangement according to one of claims 7 to 11, characterized in that for the positioning and / or tilting of the behind the field diaphragm ( 8th ) arranged glass plate ( 27 ) Piezo actuators ( 28 ), Eccentric drives or other suitable drives are provided.

Process according to claims 1 to 6, characterized that it for reading biochips, in fluorescence microscopy and to photometric measurements is applied.

Arrangement according to claims 7 to 15, characterized that she for reading biochips, in fluorescence microscopy and to photometric measurements is applied.