DE10329539A1

DE10329539A1 - Method and device for characterizing a culture fluid

Info

Publication number: DE10329539A1
Application number: DE2003129539
Authority: DE
Inventors: Frank Theodor Dr. Gudermann; Marc STÜRZ
Original assignee: innovatis AG
Current assignee: innovatis AG
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2005-01-20
Also published as: WO2005001108A2; WO2005001108A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung spezifischer Produktbildungs- bzw. Substratverbrauchsraten von Zellen in einer Kulturflüssigkeit. Basis für die Bestimmung der spezifischen Bildungs- bzw. Verbrauchsraten ist die Messung der Parameter Lebendzellzahl, Zell-Viabilität und der Produkt- und Substratkonzentration in einer Zellkulturprobe, bei der durch eine mikroskopische Abbildung der Zellen und durch eine Bildauswertung dieser Abbildung in Kombination mit der Bestimmung der Produkt- und Substratkonzentration insbesondere durch SPR (Surface Plasmon Resonance)-Analyse die Kulturflüssigkeit analysiert wird, wobei die Analyse der Parameter derselben Probe erfindungsgemäß gleichzeitig und automatisch durchgeführt wird.The invention relates to a method and an apparatus for determining specific product formation or substrate consumption rates of cells in a culture fluid. The basis for determining the specific rates of formation or consumption is the measurement of the parameters of living cell count, cell viability and the product and substrate concentration in a cell culture sample, in which a microscopic image of the cells and an image analysis of this image in combination with the determination the product and substrate concentration, in particular by SPR (Surface Plasmon Resonance) analysis, the culture liquid is analyzed, wherein the analysis of the parameters of the same sample according to the invention is carried out simultaneously and automatically.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung spezifischer Produktbildungs- bzw. Substratverbrauchsraten von Zellen in einer Kulturflüssigkeit. Basis für die Bestimmung der spezifischen Bildungs- bzw. Verbrauchsraten, ist die Messung der Parameter Lebendzellzahl, Zell-Viabilität und der Produkt- und Substratkonzentration in einer Zellkulturprobe, bei der durch eine mikroskopische Abbildung der Zellen und durch eine Bildauswertung dieser Abbildung in Kombination mit der Bestimmung der Produkt- und Substratkonzentration insbesondere durch SPR (Surface Plasmon Resonance) – Analyse die Kulturflüssigkeit analysiert wird, wobei die Analyse der Parameter derselben Probe erfindungsgemäß gleichzeitig und automatisch durchgeführt wird.The The invention relates to a method and a device for determination specific product formation or substrate consumption rates of cells in a culture fluid. base for the determination of the specific rates of education or consumption, is the measurement of the parameters living cell count, cell viability and the Product and substrate concentration in a cell culture sample, at by a microscopic picture of the cells and by a Image analysis of this figure in combination with the determination the product and Substrate concentration in particular by SPR (Surface Plasmon Resonance) - analysis the culture fluid analyzing, taking the analysis of the parameters of the same sample according to the invention simultaneously and done automatically becomes.

Anwendungsgebietfield of use

Kulturbrühen, die lebende Organismen enthalten, sind in der Biotechnologie von zentraler Bedeutung. Die kultivierten Organismen können selbst das gewünschte Produkt der Kultivierung sein oder aber dazu eingesetzt werden, um spezifische, gewünschte Moleküle als Stoffwechselprodukte zu produzieren oder um bestimmte, zum Beispiel toxische Moleküle, in ihrem Stoffwechsel abzubauen. Es werden Kulturen eukaryotischer und prokaryotischer Zellen in zunehmenden Maße herangezogen, um Biomoleküle für unterschiedliche Zwecke zu produzieren. Ein Beispiel ist die Produktion von Antikörpern mit Hilfe von Kulturen humaner oder tierischer Zellen für diagnostische oder therapeutische Zwecke in der Medizin.Culture broths that containing living organisms are more central in biotechnology Importance. The cultured organisms can themselves produce the desired product be used for cultivation or to be used for specific, desired molecules as metabolites or to produce certain, for example toxic molecules, in their metabolism. There are cultures eukaryotic and prokaryotic cells are increasingly being used to make biomolecules for different purposes to produce. An example is the production of antibodies with Help of cultures of human or animal cells for diagnostic or therapeutic purposes in medicine.

Damit die Organismen sich in der gewünschten Weise vermehren bzw. sich in der gewünschten Weise vermehren und die gewünschten Stoffwechselprozesse optimal ablaufen, d. h. eine optimale Produktivität erzielt wird, müssen sie möglichst optimale und auf den jeweiligen Organismus angepasste Bedingungen vorfinden. Um diese Bedingungen in den jeweiligen Kulturbehältern sicherstellen zu können und steuernd und regelnd in den Verlauf einer Kultivierung eingreifen zu können, ist die ständige Messung verschiedener Parameter über die Dauer einer Kultivierung notwendig. Insbesondere Parameter, welche die Population der Organismen im Kulturmedium betreffen, als auch Parameter, die sowohl die Konzentration von Nährstoffen und anderen Ausgangsstoffen betreffen, als auch die Konzentration von Stoffwechselprodukten im Kulturmedium.In order to the organisms are in the desired Multiply manner or reproduce in the desired manner and the desired Metabolic processes run optimally, d. H. achieving optimum productivity will have to if possible optimal and adapted to the particular organism conditions find. To ensure these conditions in the respective culture containers to be able to and control and regulate intervene in the course of a cultivation to be able to is the permanent one Measurement of various parameters via the duration of a cultivation necessary. In particular parameters, concerning the population of organisms in the culture medium, as well as parameters that both the concentration of nutrients and other starting materials, as well as the concentration of metabolic products in the culture medium.

Die wichtigsten Parameter die Organismenpopulation betreffen sind die Zahl der Organismen pro Volumeneinheit der Kulturbrühe (nachfolgend Zellkonzentration genannt) und der Anteil von der lebenden Organismen an der Zellkonzentration (nachfolgend Viabilität genannt). Hinzu kommen die Konzentrationen der Substrate und Produkte in der Kulturbrühe.The The most important parameters concerning the organism population are the Number of organisms per volume of culture broth (hereafter Called cell concentration) and the proportion of living organisms at the cell concentration (hereinafter called viability). In addition come the Concentrations of the substrates and products in the culture broth.

Die zentralen Parameter zur Beurteilung des Erfolgs einer Kultivierung und die Grundlage zur Steuerung und Regelung biotechnologischer Prozesse sind die spezifischen Verbrauchs- und Produktbildungsraten der Organismen. Diese sind definiert als Verbrauch bzw. Produktion von Stoffen durch einen Organismus in der Kulturbrühe pro Zeiteinheit. Mit ihnen wird die eigentliche Stoffwechselaktivität der Organismen charakterisiert. Diese Parameter sind für eine möglichst präzise Steuerung und Regelung einer Kultivierung, sowie zur Festlegung von Abbruchkriterien oder Erntezeitpunkten in kurzen Zeitabständen zu bestimmen. Ist man in der Lage die Produktiviät eines Kulturbehälters oder die Ände rung derselben in kurzen Zeitabständen mit wenig Personal- und Kostenaufwand zu messen, kann die Ausbeute des Produktionsprozesses gesteigert werden. Die Rentabilität biotechnologischer Prozesse wird erhöht.The central parameters for assessing the success of a cultivation and the basis for controlling and regulating biotechnological Processes are the specific consumption and product formation rates of Organisms. These are defined as consumption or production of Substances by an organism in the culture broth per unit time. With you the actual metabolic activity of the organisms is characterized. These parameters are for one possible precise Control and regulation of a cultivation, as well as for determination of termination criteria or harvest times at short intervals determine. Is one capable of the productivity of a culture container or the change same at short intervals With little manpower and cost to measure, the yield can be of the production process are increased. The profitability of biotechnological Processes are increased.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur automatischen Bestimmung der spezifischen Verbrauchs- und Produktionsraten und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.The The invention relates to a method for automatic determination specific consumption and production rates and a device to carry out of the procedure.

Stand der Technik und Nachteile des Standes der TechnikState of Technology and disadvantages of the prior art

Der Hauptanspruch dieser Patentschrift zielt auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von spezifischen Produkt- und Verbrauchsraten von Organismen in einer Kulturbrühe. Da es sich dabei in der Regel um eukaryote oder prokaryote Zellen handelt, wird im Folgenden nur der Begriff „Zelle" verwendet.Of the The main claim of this patent is directed to a method and a Device for the determination of specific product and consumption rates of organisms in a culture broth. As these are usually eukaryotic or prokaryotic cells In the following, only the term "cell" is used.

Die spezifische Produktivität ist definiert als die Menge an Produkt, die eine Zelle pro Zeiteinheit herstellt und an das sie umgebende Zellkulturmedium abgibt.The specific productivity is defined as the amount of product that is a cell per unit of time and delivers to the surrounding cell culture medium.

Vorrausetzung für die Bestimmung der spezifischen Produktivität sowie anderer Verbrauchs- und Bildungsraten ist, da nur lebende Zellen produktiv sind, die Kenntnis des Parameters der Konzentration lebender Zellen. Die Konzentration lebender Zellen ist definiert als die Anzahl lebender Zellen pro Volumeneinheit. Die Zellkonzentration ist definiert als die Anzahl lebender und toter Zellen pro Volumeneinheit. Als Viabilität bezeichnet man den prozentualen Anteil von lebenden Zellen an der Zellkonzentration.Prerequisite for the determination of the specific productivity as well as other consumption and image Since only living cells are productive, the rate of penetration is the knowledge of the parameter of the concentration of living cells. The concentration of living cells is defined as the number of living cells per unit volume. Cell concentration is defined as the number of live and dead cells per unit volume. Viability is the percentage of living cells in cell concentration.

Zur Bestimmung spezifischer Bildungs- oder Verbrauchsraten muss neben der Konzentration lebender Zellen auch die Konzentration des betreffenden Produkts (in der Regel ein Biomolekül) bekannt sein.to Determination of specific rates of education or consumption must be in addition to the concentration of living cells also the concentration of the relevant Product (usually a biomolecule) be known.

Im folgenden werden die zur Zeit gängigen Methoden zur Bestimmung von Zellkonzentrationen, gefolgt von Methoden zur Messung der Produktkonzentration dargestellt.in the The following are the current ones Methods for determining cell concentrations followed by methods shown for measuring the product concentration.

Methoden zur Bestimmung der Konzentration eukaryoter oder prokaryoter Zellen in einer KulturbrüheMethods for determination the concentration of eukaryotic or prokaryotic cells in a culture broth

Zur Bestimmung von Zellkonzentrationen in Kulturflüssigkeiten werden gegenwärtig verschiedene Methoden eingesetzt. Diese werden im Folgenden kurz beschrieben:to Determination of cell concentrations in culture fluids are currently various Methods used. These are briefly described below:

1. Manuelle Bestimmung der Zellkonzentration1. Manual Determination of cell concentration

Das etablierte Verfahren in Industrie und Forschung zur Bestimmung der Zellkonzentration und Viabilität in Proben aus Zellkulturprozessen ist die manuellen Zellzählung. Diese Methode wird bereits seit den Anfängen der Biotechnologie zur Bestimmung der Zellkonzentration und Viabilität herangezogen (Tennant JR (1964): Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.; Transplantation 2: 685–694).The established procedures in industry and research for the determination of Cell concentration and viability in samples from cell culture processes is the manual cell count. These Method has been used since the dawn of biotechnology Determination of cell concentration and viability (Tennant JR (1964): Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability .; Transplantation 2: 685-694).

Bei der manuellen Zellzählung wird einer Zellsuspension der Farbstoff Trypan Blau oder ein anderer, geeigneter Farbstoff zugesetzt (z.B. Methylenblau, Propidiumjodid, Eosin). Lebende Zellen sind für den Farbstoff undurchlässig, während er in tote Zellen eindringen kann. Tote Zellen werden daher durch den Farbstoff eingefärbt. Anhand der unterschiedlichen Färbungen lassen sich lebende von toten Zellen unterscheiden und mit Hilfe einer Zählkammer unter einem Lichtmikroskop auszählen.at the manual cell count becomes a cell suspension of the dye trypan blue or another, more suitable Dye added (e.g., methylene blue, propidium iodide, eosin). Living cells are for the dye impermeable, while he can invade dead cells. Dead cells are therefore due dyed the dye. Based on the different colors let live cells be differentiated from dead cells and with help a counting chamber counting under a light microscope.

Die Nachteile dieser Methode bestehen darin, dass die mikroskopische Auswertung der Zellfärbung sehr arbeitsintensiv, langwierig und ermüdend ist. Zum anderen ist sie stark benutzerabhängig, da die Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen subjektiven Schwankungen unterliegt (Farbempfinden, Ermüdungsgrad, Präzision der Zählung).The Disadvantages of this method are that the microscopic Evaluation of cell staining very labor-intensive, tedious and tedious. For another, she is strongly user-dependent, because the differentiation between living and dead cells is subjective Fluctuations are subject to (color perception, fatigue, precision of Count).

2. Automatisierte optische Bildanalyseverfahren zur Bestimmung der Zellkonzentration2. Automated optical image analysis methods for determining the cell concentration

Seit kurzer Zeit sind automatisierte Systeme am Markt (Cedex, Vi-CELL, NucleoCounter), die das manuelle Verfahren der Zellzählung automatisch ausführen. Die Arbeitsschritte der manuellen Methode (Probenfärbung, Überführen der gefärbten Probe in eine Messkammer, Zählen der gefärbten und ungefärbten Objekte im mikroskopischen Bild) wurden übernommen und werden von den Geräten automatisch ausgeführt. Fehler beim Probenhandling und die subjektive Differenzierung von lebenden und toten Zellen werden so elimi viert. Die Ergebnisse der automatisch arbeitenden Geräte sind im Vergleich zur manuellen Methode präziser und benutzerunabhängig.since For a short time, automated systems are on the market (Cedex, Vi-CELL, NucleoCounter), which is the manual method of cell counting automatically To run. The steps of the manual method (sample staining, transfer of the colored Sample in a measuring chamber, counting the dyed and undyed Objects in the microscopic picture) were taken over and used by the devices automatically executed. Error in sample handling and the subjective differentiation of living and dead cells are thus eliminated. The results of automatically working devices Compared to the manual method, they are more precise and user-independent.

Für den Benutzer beschränkt sich das Probenhandling auf die Bereitstellung einer Probe, die dem Gerät in einem Probengefäß zugeführt wird. Diese Probe wird automatisch mit Trypan Blau oder einem anderen geeigneten Farbstoff gemischt und in eine Messkammer oder Küvette überführt. Mit einer vergrößernden Optik werden Bilder der gefärbten Zellsuspension erzeugt, die von einer CCD Kamera aufgenommen werden. Diese Bilder werden dann von einer computergestützten Bildverarbeitungssoftware ausgewertet. Messergebnisse sind die Gesamtkonzentration der Zellen, die Konzentration lebender Zellen, die Konzentration toter Zellen und die Viabilität der Kultur. Sekundäre Parameter, wie Zelldurchmesser, Zellgeometrie oder die Anzahl und Größe von Zellaggregaten werden zur Verfügung gestellt. Bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur Färbung der Zellen oder ihrer Zellkerne kann das entstehende Bild auch direkt, ohne eine vergrößernde Optik auf eine CCD Kamera projiziert und anschließend automatisch von einer computergestützten Bildverarbeitungssoftware ausgewertet werden.For the user limited sample handling is based on providing a sample that the device is supplied in a sample vessel. This sample will automatically scan with Trypan Blue or another suitable one Dye mixed and transferred to a measuring chamber or cuvette. With a magnifying Optics are pictures of the colored ones Cell suspension generated by a CCD camera. These images are then processed by computer-aided image processing software evaluated. Measurement results are the total concentration of cells, the concentration of living cells, the concentration of dead cells and the viability the culture. secondary Parameters, such as cell diameter, cell geometry or number and Size of cell aggregates will be available posed. When using fluorescent dyes for staining the Cells or their nuclei, the resulting image can also directly, without a magnifying optic projected onto a CCD camera and then automatically from one computerized Image processing software are evaluated.

Neben den auf der automatischen Aufnahme und Analyse von Zellbildern beruhenden Methoden wurden auch andere Verfahren zur Bestimmung der Zellkonzentration entwickelt. Diese nutzen spezielle Farbstoffe oder messen Umgebungsparameter, wie etwa die Änderung des elektrischen Widerstands oder der Kapazität, die sich durch die Anwesenheit von Zellen ändern. Diese sind:Next based on the automatic recording and analysis of cell images Methods were also other methods for determining the cell concentration developed. These use special dyes or measure environmental parameters, like the change of electrical resistance or capacity, characterized by the presence change from cells. These are:

3. Durchflußzytometrie und fluoreszenzbasierte Methoden3. Flow cytometry and fluorescence-based methods

Die Durchflußzytometrie ( Moore A, Donahue CJ, Hooley J, Stocks DL (1995): Apoptosis in CHO cell batch cultures: Examination by flow cytometry.; Cytotechnology 17: 1–11) kann prinzipiell sowohl zur Zellzählung und zur Bestimmung der Viabilität der Zellen, als auch zur Quantifizierung von Apoptoseraten eingesetzt werden (Becton Dickenson, Guava PCA System). Die Bedienung dieser Geräte und die notwendige Interpretation der erhaltenen Daten setzen hohe Anforderungen an den Benutzer dieser Geräte. Die Probenfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen verursachen vergleichsweise hohe laufende Kosten.The flow cytometry (Moore A, Donahue CJ, Hooley J, Stocks DL (1995): Apoptosis in CHO cell batch cultures: Examination by flow cytometry .; Cytotechnology 17: 1-11) can in principle be used both for cell counting and for determination of viability the cells, as well as for the quantification of Apoptoseraten be used (Becton Dickenson, Guava PCA System). The operation of these devices and the The necessary interpretation of the data obtained places high demands to the user of these devices. The sample staining with Fluorescent dyes cause comparatively high running Costs.

4. Partikelzählung auf Basis der Messung des elektrischen Wiederstands4. Particle counting on Basis of measurement of electrical resistance

Diese Systeme (Coulter Counter, CASY System) nutzen die Eigenschaft von Zellen eine Widerstandsänderung in einer Messzelle herbeizuführen. Die Änderung des elektrischen Widerstands wird genutzt, um die Partikel/Zellen zu zählen und ihr Volumen zu bestimmen. (Coulter WH (1956): High speed automatic blood cell counter and cell size analyser; National Electronics Conference III, Chicago). Eine Differenzierung von lebenden und toten Zellen ist jedoch nur sehr eingeschränkt möglich.These Systems (Coulter Counter, CASY System) use the property of Cells a resistance change in a measuring cell. The change The electrical resistance is used to control the particles / cells to count and to determine their volume. (Coulter WH (1956): High speed automatic blood cell counter and cell size analyzer; National Electronics Conference III, Chicago). A differentiation of living and however, dead cells are only possible to a very limited extent.

5. Radiofrequenzmethoden5. Radio Frequency Methods

Zellen mit intakten Plasmamembranen verhalten sich unter dem Einfluss elektrischer Felder wie Kondensatoren. Die resultierende Kapazität kann gemessen werden, sie hängt vom Zelltyp ab und ist proportional zur Konzentration lebender Zellen (Fehrenbach R, Comerbach M, Petre JO (1992): On-line biomass monitoring by capacitance measurement., Journal of Biotechnology 23: 303–314). Mit dieser Methode können tote Zellen nicht nachgewiesen werden Die Bestimmung der Viabilität der Probe ist nicht möglich. Dieses Verfahren kann als on-line Messung ausgelegt werden und erlaubt auch die Bestimmung der Konzentration lebender Zellen in Zellaggregaten und Microcarrierkulturen. Entsprechende Sonden sind am Markt erhältlich.cell with intact plasma membranes behave under the influence of electrical Fields like capacitors. The resulting capacity can be measured be, she hangs depends on the cell type and is proportional to the concentration of living cells (Fehrenbach R, Comerbach M, Petre JO (1992): On-line biomass monitoring by capacitance measurement., Journal of Biotechnology 23: 303-314). With this method can dead cells are not detected Determining the viability of the sample can not. This method can be designed as on-line measurement and allowed also the determination of the concentration of living cells in cell aggregates and microcarrier cultures. Appropriate probes are available on the market.

6. Laserdiffraktometrie6. Laser diffractometry

Die Methode der Laserdiffraktometrie (Murakawa K, Kohno M, Kinoshita Y, Takeda T (1992): Application of diffractometry and a linear image sensor to measurement of erythrocyte deformability. Biorheology. Mar–Jun; 29(2-3): 323–35.) nutzt die Eigenschaft von Zellen eingestrahltes Laserlicht um einen Winkel zu streuen, der umgekehrt proportional zur Größe der Zellen ist. Die Auswertung des Streulichts ermöglicht die Bestimmung der Zellkonzentration und der Größenverteilung der Zellen. Eine Differenzierung lebender und toter Zellen ist nicht möglich.The Method of laser diffractometry (Murakawa K, Kohno M, Kinoshita Y, Takeda T (1992): Application of diffractometry and a linear image sensor to measurement of erythrocyte deformability. Biorheology. Mar-Jun; 29 (2-3): 323-35.) uses the property of cells irradiated laser light by one To scatter angles that are inversely proportional to the size of the cells is. The evaluation of the scattered light makes it possible to determine the cell concentration and the size distribution the cells. A differentiation of living and dead cells is not possible.

Methoden zur Bestimmung der Konzentration von Biomolekülen in einer KulturbrüheMethods for Determination of the concentration of biomolecules in a culture broth

Zur Bestimmung von Biomolekül-Konzentrationen, insbesondere als Produkte einer Kulturbrühe, existieren unterschiedliche Verfahren. Alle im Folgenden beschriebenen Verfahren sind prinzipiell zur Bestimmung von Biomolekülkonzentrationen geeignet. Im industriellen Routineeinsatz erfordert ihre korrekte Durchführung ein hohes Maß an Expertenwissen. Diese Methoden setzen zum Teil eine langwierige und häufig mehrere Arbeitsschritte umfassende Probenvorbereitung voraus. Dies führt zu einer hohen Fehleranfälligkeit. Um die Präzision der Ergebnisse dieser Verfahren zu erhöhen, werden Experten zur Durchführung der jeweiligen Verfahren ausgebildet. Die Messergebnisse stehen zum Teil, als Beispiel sei hier der ELISA Test genannt, erst Tage oder sogar Wochen nach der Probenentnahme zur Verfügung, da im Routinebetrieb zunächst alle Proben eins Kultivierungsprozesses oder eines Abschnitts daraus gesammelt und dann zusammen gemessen werden müssen.to Determination of biomolecule concentrations, especially as products of a culture broth, there are different ones Method. All procedures described below are in principle for the determination of biomolecule concentrations suitable. In industrial routine use requires their correct Implementation high level Expert knowledge. These methods are sometimes a lengthy one and often several steps of comprehensive sample preparation. This leads to a high error rate. To the precision To increase the results of these procedures, experts will carry out the formed respective method. The results are available for Part, as an example here is the ELISA test called, only days or even weeks after sampling, as in routine operations first all samples from a cultivation process or a part of it collected and then measured together.

1. ELISA1. ELISA

Sehr häufig werden Proteinkonzentrationen durch den sogenannten ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Test ermittelt (Lütkemeyer D, Büntemeyer H (1990): Kinetische ELISA-Messungen; Tecnorama News 1: 2–3). Dabei handelt es sich um einen zur Bestimmung festphasengebundener Antigene modifizierten, immunologischen Test. Grundlage des Verfahrens sind Wechselwirkungen zwischen dem spezifischem Antikörper und dem Antigen, denen das Schlüssel/Schloss-Prinzip zugrunde liegt.Very often are protein concentrations by the so-called ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test determined (Lütkemeyer D, Büntemeyer H (1990): Kinetic ELISA Measurements; Tecnorama News 1: 2-3). there it is an antigen used for the determination of solid-phase-bound antigens modified, immunological test. Basis of the procedure are Interactions between the specific antibody and the antigen to which the key / lock principle underlying.

2. Elektrophorese2. electrophoresis

Bei der Elektrophorese (Freitag R, Reif OW, Weidemann R, Kretzmer G (1996): Production of recombinant h-AT III with mammalian cell cultures using capillary electrophoresis for product monitoring. Cytotechnology 21: 205–215) werden Biomoleküle in Gele eingebreacht und einem elektrischen Felde ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen setzt eine Wanderung der Moleküle ein, die von der Größe und der Ladung der einzelnen Moleküle abhängt. Auf diese Weise können Substanzen voneinander getrennt und quantifiziert werden.In electrophoresis (Freitag R, Reif OW, Weidemann R, Kretzmer G (1996): Production of recom binant h-AT III with mammalian cell cultures using capillary electrophoresis for product monitoring. Cytotechnology 21: 205-215) biomolecules are incorporated into gels and exposed to an electric field. Under these conditions, migration of the molecules commences, depending on the size and charge of the individual molecules. In this way, substances can be separated and quantified.

3. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)3. HPLC (High Performance Liquid chromatography)

Mit dem HPLC Verfahren werden die verschiedenen Bestandteile einer Probe aufgrund der unterschiedlich starken Wechselwirkungen zwischen der Säulenmatrix und den in der Probe enthaltenen Biomolekülen getrennt. (Ozturk SS, Thrift JC, Blackie JD, Naveh D (1995): Real-time monitoring of protein secretion in mammalian cell fermentation: Measurement of monoclonal antibodies using a computer-controlled HPLC system. Biotechnology and Bioengineering 48: 201–206) Die getrennten Bestandteile können dann quantifiziert werden.With The HPLC method involves the different components of a sample due to the different strong interactions between the column matrix and the biomolecules contained in the sample. (Ozturk SS, Thrift JC, Blackie JD, Naveh D (1995): Real-time monitoring of protein secretion in mammalian cell fermentation: Measurement of monoclonal antibodies using a computer-controlled HPLC system. Biotechnology and Bioengineering 48: 201-206) The separated components can then be quantified.

4. Nephelometrie4. Nephelometry

Die Nephelometrie (Owen WE, Roberts WL (2003): Performance characteristics of four immunonephelometric assays for the quantitative determination of IgA and IgM in cerebrospinal fluid. Am J Clin Pathol. 119: 689–93.) ist ein quantitatives analytisches Verfahren. Die zu messende Probe wird mit monochromatischem Laserlicht beleuchtet und das Streulicht analysiert. Über die Auswertung des Streulichtes kann die Konzentration von Biomolekülen bestimmt werden.The Nephelometry (Owen WE, Roberts WL (2003): Performance characteristics of four immunonephelometric assays for the quantitative determination of IgA and IgM in cerebrospinal fluid. At the J Clin Pathol. 119: 689-93.) a quantitative analytical procedure. The sample to be measured is illuminated with monochromatic laser light and the stray light analyzed. about the evaluation of the scattered light can determine the concentration of biomolecules become.

5. SPR (Surface Plasmon Resonance)5. SPR (Surface Plasmon Resonance)

Die SPR Technologie nutzt die Oberflächen-Plasmon-Resonanz (Surface-Plasmon-Resonance, SPR). Bindet ein zu messender Analyt an einen immobilisierten Rezeptor, ändert sich der refraktive Index in der Nähe der Sensoroberfläche, auf der der Rezeptor immobilisiert wurde. (Cullen DC, Brown RG, Lowe CR (1987–88): Detection of immunocomplex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings. Biosensors. 3: 211–25.). Die Änderung des refraktiven Index der Sensoroberfläche ist direkt proportional zur Konzentration der an den Rezeptor bindenden Substanz. Sowohl Komplexbildung als auch -dissoziation können "on-line" verfolgt und innerhalb kürzester Zeit analysiert werden. Der Messprozess und die Datenauswertung benötigen im Vergleich zu konventionellen Methoden nur einen geringen Zeitaufwand und sind automatisierbar. Nach der Analyse des ersten Zyklus erfolgt die Regeneration der Sensoroberfläche. Danach kann derselbe Sensor erneut zur Messung benutzt werden.The SPR technology uses surface plasmon resonance (Surface Plasmon Resonance, SPR). When an analyte to be measured binds to an immobilized receptor, it changes the refractive index in the vicinity the sensor surface, on which the receptor was immobilized. (Cullen DC, Brown RG, Lowe CR (1987-88): Detection of immunocomplex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings. Biosensor. 3: 211-25.). The change the refractive index of the sensor surface is directly proportional to the concentration of the substance binding to the receptor. Either Complex formation as well as dissociation can be traced "on-line" and within shortest time Time to be analyzed. The measuring process and the data evaluation need compared to conventional methods only a small amount of time and are automatable. After the analysis of the first cycle takes place the regeneration of the sensor surface. After that, the same sensor can be used be used again for measurement.

Dies macht deutlich, dass die SPR-Technologie zur Bestimmung der Konzentration von Biomolekülen in Proben aus Zellkulturprozessen gut geeignet ist (siehe auch Disley, D. M., Morill, P.R., Sproule, K., Lowe, C.R., 1999. An optical biosensor for monitoring recombinant proteins in process media. Biosensors & Bioelectronics (14) 481–493).This makes it clear that the SPR technology for determining the concentration of biomolecules in Samples from cell culture processes is well suited (see also Disley, D.M., Morill, P.R., Sproule, K., Lowe, C.R., 1999. An optical biosensor for monitoring recombinant proteins in process media. Biosensors & Bioelectronics (14) 481-493).

Methoden zur Bestimmung der spezifischen Produktivität von Zellen in einer KulturbrüheMethods for determination specific productivity of cells in a culture broth

Die spezifische Produktivität von Zellen einer Zellkultur ist einer der wichtigsten Parameter zur Bewertung und Steuerung von Kultivierungsprozessen. Er ist definiert als die Produktmenge, die eine Zelle pro Zeiteinheit an das Kulturmedium abgibt. Unterschiedliche Prozessführungen, wie etwa Batchprozesse, Chemostat oder Perfusionsbetrieb, führen zu unterschiedlichen mathematischen Beziehungen zur Berechnung der spezifischen Produktivität.The specific productivity of cells of a cell culture is one of the most important parameters for the evaluation and control of cultivation processes. He is defined as the amount of product containing one cell per unit of time to the culture medium emits. Different process controls, such as batch processes, Chemostat or perfusion operation, lead to different mathematical Relationships to calculate specific productivity.

Zellspezifische Produktivität bei Batchprozessen:

Cell Specific Productivity in Batch Processes:

Zellspezifische Produktivität bei kontinuierlichem Chemostatbetrieb:

Cell Specific Productivity in Continuous Chemostat Operation:

Zellspezifische Produktivität bei Perfusionsbetrieb:

Cell Specific Productivity in Perfusion Operation:

Diese Gleichungen zeigen, dass die spezifische Produktivität neben dem Reaktorvolumen und den Zu- und Abflussraten in erster Linie von den Produkt- und Zellkonzentration abhängt. Den Gleichungen liegt die Annahme zugrunde, das sich die spezifische Produktivität zwischen zwei Zeitpunkten linear verändert. Diese Annahme gilt umso besser, je kleiner der betrachtete Zeitraum ist. Die Genauigkeit der Bestimmung von spezifischen Verbrauchs- und Produktionsraten ist also abhängig von der Messpräzision und der Zeit, die zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen der Konzentrationen von Produkt und lebenden Zellen verstreicht. Nach derzeitigem Stand der Technik existiert aber weder ein Verfahren noch eine technische Lösung, welche die ständige, genaue und prozessbegleitende Messung von spezifischen Verbrauchs- und Produktionsraten in Kulturbrühen ermöglicht.These Equations show that specific productivity alongside the reactor volume and the inflow and outflow rates in the first place depends on the product and cell concentration. The equations is the Assumption underlying the specific productivity between changed linearly at two points in time. This assumption is the better, the smaller the considered period is. The accuracy of the determination of specific consumption and production rates is thus dependent on the measurement precision and the time between two consecutive measurements of concentrations of product and living cells. According to the current status However, neither technology nor technology exist in technology Solution, which the constant, accurate and in-process measurement of specific consumption and production rates in culture broths allows.

Stattdessen kann die spezifische Produktivität von Zellen erst mit großer Zeitverzögerung und durch den Einsatz verschiedener, voneinander unabhängiger Meßsysteme bestimmt werden. Dies bringt die schon erwähnten Nachteile der Benutzerabhängigkeit, der hohen statistischen Schwankungen und der durch die vielen Arbeitsschritte bedingten langen Analysezeiten mit sich. Jede Zeitverzögerung ist aber von großem Nachteil für die optimale Bewertung des Kulturverlaufs.Instead can the specific productivity of cells only with great Time Delay and through the use of different, independent measuring systems be determined. This brings the already mentioned disadvantages of user dependency, the high statistical fluctuations and the many work steps conditional long analysis times. Every time delay is but of great Disadvantage for the optimal evaluation of the culture course.

Ideal wäre ein Verfahren und eine Vorrichtung, welches) in der Lage ist, sowohl die Lebendzellen- als auch die Produktkonzentration schnell und möglichst auf Basis ein und derselben Probe zu bestimmen und daraus die spezifische Produktivität der Zellen zu ermitteln.ideal would be a Method and device which is capable of both the live cells as well as the product concentration fast and preferably on the basis of one and the same sample and from this the specific one productivity to determine the cells.

Dies gilt prinzipiell auch für alle weiteren Parameter, die außer der Lebendzellzahl, der Viabilität der Zellen und der Produktkonzentration einen Einfluss auf den Kultivierungsverlauf haben.This applies in principle also for all other parameters except the viable cell count, the viability the cells and the product concentration influence the cultivation process to have.

Lösung der AufgabeSolution of the task

Das Verfahren und eine Vorrichtung zur Lösung dieser Aufgabe sind in den Patentansprüchen offenbart.The Methods and apparatus for solving this problem are in the claims disclosed.

Der Erfindung stellt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung, mit dem spezifische Produktbildungs- und Substratverbrauchsraten von Organismen einer Kulturprobe, z.B. aus einem Bioreaktor, präzise und zeitnah gemessen werden können. Das Verfahren ist automatisiert, einfach auszuführen und kann daher schnell, ohne Experten ausbilden zu müssen, in den laufenden Routinebetrieb integriert werden.Of the The invention provides a method and an apparatus for carrying out the Method available with the specific product formation and substrate consumption rates of organisms of a culture sample, e.g. from a bioreactor, accurate and can be measured promptly. The process is automated, easy to perform and can therefore be quickly without having to train experts be integrated into the routine routine operation.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, automatisch den Prozess der Zellkonzentrationsbestimmung und den Prozess der Produkt- oder Substratkonzentrationsbestimmung zu kombinieren, um so mittels direkter Aussagen über die Produktions- und Verbrauchsraten die Bewertung, Steuerung und Regelung des Kultivierungsprozesses zu verbessern.The inventive method allows automatically the process of cell concentration determination and the process of product or substrate concentration determination by direct statements about production and consumption rates the evaluation, control and regulation of the cultivation process to improve.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt es, Proben aus der Kultur an die Sensoren zu übergeben, um diese nach den gewählten Merkmalen zu untersuchen.The inventive device allows to pass samples from the culture to the sensors this according to the chosen To examine characteristics.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Bestimmung der spezifischen Verbrauchs- und Produktionsraten von einem oder mehreren Organismen in einer Kulturbrühe durch eine gleichzeitige, automatisierte Zellkonzentration- und Produkt- bzw. Substratkonzentrationsbestimmung durchgeführt. Für die Ermittlung der Zellkonzentration in einer Kulturbrühe wird eine computergestützte digitale Bildverarbeitungseinrichtung in Verbindung mit einer standarisierten Färbemethode verwendet. Die Produkt- bzw. Substratanalysebestimmung wird über eine automatisierte Surface-Plasmon-Resonance-Vorrichtung durchgeführt.At the inventive method will determine the specific consumption and production rates of one or more several organisms in a culture broth by a simultaneous, automated cell concentration and product or substrate concentration determination carried out. For the Determination of cell concentration in a culture broth is a computer-aided Digital image processing device in conjunction with a standardized Dyeing uses. The product or substrate analysis determination is via a automated surface plasmon resonance device performed.

Diese Art der Parameterermittlung für die Zellkonzentration und Produkt- bzw. Substratkonzentration ist damit im Gegensatz zu bisherigen Verfahren benutzerunabhängig, da die manuelle Zellkonzentrationsbestiminung (z.B. Thoma-Kammer) und Produktkonzentrationsbestimmung (z.B. ELISA-Test) entfällt. Die Messergebnisse sind präziser, weil die Ermittlung der Parameter an ein und derselben Probe durchgeführt wird und somit Streuungen in der Probenzusammensetzung eliminiert werden. Der Messvorgang ist aufgrund der Automatisierung schneller und reproduzierbarere und weniger fehleranfällig, da die zum Teil komplexe Probenaufbereitung (z.B. für die Elektrophorese) durch den Menschen entfällt.These Type of parameter determination for the cell concentration and product or substrate concentration is thus, in contrast to previous methods user-independent, since manual cell concentration determination (e.g., Thoma chamber) and Product concentration determination (e.g., ELISA test) omitted. The Measurement results are more precise, because the determination of the parameters is carried out on one and the same sample and thus scattering in the sample composition can be eliminated. The measurement process is faster and more reproducible due to automation and less error prone, since the sometimes complex sample preparation (for example for electrophoresis) deleted by humans.

Das Verfahren erlaubt erstmals eine kontinuierliche Überwachung von Kultivierungsprozessen, da problemlos in kurzen Zeitintervallen gemessen werden kann. Diese kontinuierlich Überwachung ist wiederum eine Voraussetzung für eine kontinuierliche Steuerung oder Regelung zur Optimierung des Prozesses.The Method allows for the first time a continuous monitoring of cultivation processes, as can be measured easily in short time intervals. These continuous monitoring is again a requirement for continuous control or regulation to optimize the process.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht die Zufuhr einer Kulturprobe zu den einzelnen Analyseeinrichtungen. Die Probe einer Kulturbrühe kann entweder manuell aus einem Kulturbehälter oder mehreren Kulturbehältern gezogen werden, oder über eine automatische (on-line) Probenzufuhr, der Analysevorrichtung, zugeführt werden. Durch eine automatische Zuführung (z.B. mit Hilfe eines Röhren- oder Robotersystems) und durch die Anbindung einer in-situ Sonde ließen sich die Messintervalle immer weiter verkürzen, was eine Steigerung der Präzision von Regelungvorgängen ermöglicht.The inventive device allows the supply of a culture sample to the individual analysis facilities. The sample of a culture broth can either be pulled manually from a culture container or several culture containers be, or over an automatic (on-line) sample supply, the analysis device, supplied become. By an automatic feeder (for example by means of a tubular or robotic system) and by the connection of an in-situ probe could the measuring intervals shorten ever further, what an increase of the precision of control operations allows.

Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren durch Ankopplung von und/oder Austausch gegen andere Analysemethoden erweiterbar, um noch mehr Prozessparameter zu ermitteln (z.B. Nährstoffgehalt oder Partialdrücke von Gasen) oder dazu andere Meßmethoden zu verwenden. Mit Hilfe einer derart verbesserten Sensorik lassen sich Kultivierungsprozesse noch weiter optimieren. Darüber hinaus kann das umfangreiche Datenmaterial dazu genutzt werden, neue, verbesserte Modelle der Vorgänge in Kultivierungsbehälter zu entwickeln, die wiederum durch Simulation zu weiteren Optimierungen genutzt werden können.Besides that is the inventive method by coupling and / or exchange with other methods of analysis expandable to detect even more process parameters (e.g., nutrient content or partial pressures of gases) or other measuring methods to use. With the help of such an improved sensor technology to further optimize cultivation processes. Furthermore the extensive data material can be used, new, improved Models of events in cultivation tank to develop, in turn, through simulation to further optimizations can be used.

Zusätzliche Analytenadditional analytes

Neben den spezifischen Produktionsraten sind weitere Parameter bzw. Analyte zur Bewertung, Steuerung und Regelung biotechnologischer Kultivierungsprozesse von Bedeutung. Diese werden im folgenden beispielhaft und nicht abschließend aufgezählt. Die gleichzeitige und präzise Messung eines oder mehrerer dieser Parameter sind mögliche Erweiterungen des hier beschriebenen Verfahrens und der hier beschriebenen Vorrichtung.Next the specific production rates are other parameters or analytes for the evaluation, control and regulation of biotechnological cultivation processes significant. These are exemplary in the following and not finally enumerated. The simultaneous and accurate Measurement of one or more of these parameters are possible extensions the method described here and the device described here.

Die wichtigsten Parameter sind

• die Konzentration von Nährstoffen, wie etwa Nährsalze, verschiedene Zucker, Proteine, Aminosäuren, Fette
• die Konzentration an Stoffwechselprodukten (z.B. Laktat, organische Säuren, Hormonen, Proteinen, Fetten, Zuckern)
• die genauen Produkteigenschaften (Bindungskonstanten, molekulare Eigenschaften des produzierten Biomoleküls, Glykosilierung und Faltung des Biomoleküls)
• die Temperatur im Kultivierungsbehälter
• die Partialdrücke verschiedener Gase (z.B. O₂, CO₂)
• die Konzentration an freien Wasserstoffionen (der pH-Wert)

The most important parameters are

• the concentration of nutrients, such as nutrient salts, various sugars, proteins, amino acids, fats
• the concentration of metabolic products (eg lactate, organic acids, hormones, proteins, fats, sugars)
• the exact product properties (binding constants, molecular properties of the produced biomolecule, glycosylation and folding of the biomolecule)
• the temperature in the culture tank
• the partial pressures of different gases (eg O ₂ , CO ₂ )
• the concentration of free hydrogen ions (the pH value)

Die gleichzeitige und automatisierte Messung und Verarbeitung all dieser Parameter ermöglicht eine bisher unerreichte Präzision bei der Steuerung/Regelung von Kultivierungsprozessen.The simultaneous and automated measurement and processing of all this Parameter allows an unprecedented precision in the control of cultivation processes.

Auf Basis dieser Messergebnisse können neue und präzisere mathematische Modelle von Kultivierungsverläufen entwickelt werden, die für die Prozessentwicklung von großer Bedeutung sind. Ausbeute und Produktqualität können so gesteigert werden. Die Wirtschaftlichkeit biotechnologischer Prozesse kann mit den beschriebenen Verfahren drastisch erhöht werden.On Basis of these measurements can new and more precise mathematical models of cultivation histories are developed that for the Process development of great Meaning are. Yield and product quality can be increased. The economy of biotechnological processes can be described with the described Procedure drastically increased become.

Beschreibung der Ausführungsbeispieledescription the embodiments

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen näher erläutert:The The invention will be explained in more detail below with reference to the drawings.

1 zeigt eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. 1 shows a schematic representation of a first embodiment of the device according to the invention.

2 zeigt eine zweite Ausführungsform mit einer veränderten Probenzufuhr. 2 shows a second embodiment with a changed sample supply.

1 zeigt im Anschlus an eine Probenzufuhr 18 einen Verteiler 1, in dem die Probe einer Kulturbrühe in Probenteile aufgeteilt wird. Probenteil I wird durch die Probenleitung 2 in die Probenkammer mit Probenaufbereitung 4 geführt und mit geeigneten Reagenzien über die Reagenzienzufuhr 3 für die Zellkonzentrations- und Viabilitätsbestimmung vorbe reitet. Das mit der Bildnahme 6 erzeugte Bild liegt als Signal an dem Steuer- und Auswertecomputer 9 an. Der Steuer- und Auswertecomputer 9 liefert die Werte für die Zellkonzentration und Viabilität. Anschließen wird der Probenteil I durch die Abfalleitung 8 in den Abfall 7 geleitet und die Probenkammer 4 mit Probenaufbereitung 4 auf eine neue Probe vorbereitet. Der Probenteil II aus dem Verteiler 1 wird durch die Probenleitung 10 in die Probenkammer 4 mit Probenaufbereitung, Sensorchip und Chipaufbereitung 12 geführt und mit geeigneten Reagenzien über die Reagenzienzufuhr 11 für die Bestimmung der Produktkonzentration vorbereitet. Mit dem SPR-Detektor wird die Produktkonzentration im Probenteil II ermittelt. Das erzeugte Signal liegt danach am Steuer- und Auswertecomputer 9 an, welcher aus der Zellkonzentration, Viabilität und Analytkonzentration die spezifischen Produkt- und Verbrauchsraten bestimmt. Anschließen wird der Probenteil II durch die Abfalleitung 8 in den Abfall 7 geleitet und die Probenkammer 4 mit Probenaufbereitung, Sensorchip und Chipaufbereitung 12 auf eine neue Probe vorbereitet Der Steuer- und Auswertecomputer 9 steuert und regelt über die Datenleitung 5 den Ablauf der Messungen und führt die Datenverarbeitung, den Datentransfer und die Datensicherung durch. 1 shows at the end of a sample supply 18 a distributor 1 in which the sample of a culture broth is divided into sample parts. Sample Part I is passed through the sample line 2 into the sample chamber with sample preparation 4 guided and with appropriate reagents on the reagent supply 3 Prepared for cell concentration and viability determination. The picture taking 6 generated image is as a signal to the control and evaluation computer 9 at. The control and evaluation computer 9 provides the values for cell concentration and viability. The sample part I is connected by the waste line 8th in the trash 7 passed and the sample chamber 4 with sample preparation 4 prepared for a new rehearsal. Sample part II from the distributor 1 is through the sample line 10 into the sample chamber 4 with sample preparation, sensor chip and chip processing 12 guided and with appropriate reagents on the reagent supply 11 prepared for the determination of product concentration. With the SPR detector the product concentration in sample part II is determined. The generated signal is then on the control and evaluation computer 9 which determines the specific product and consumption rates from the cell concentration, viability and analyte concentration. The sample part II is connected through the waste line 8th in the trash 7 passed and the sample chamber 4 with sample preparation, sensor chip and chip processing 12 prepared for a new test The control and evaluation computer 9 controls and regulates via the data line 5 the course of the measurements and performs the data processing, data transfer and backup.

2 zeigt einen Behälter mit einer Kulturbrühe 15. In den Behälter 16 ist eine in-situ-Mikroskop-Sonde 17 eingeführt. Die Sonde liefert die Bilder aus der Kulturbrühe. An die Stelle der Mikroskop-Sonde 3 kann auch eine on-line Sonde zur Messung der elektrischen Kapazität der Kulturflüssigkeit, mit der die Konzetration lebender Zellen in der Kulturflüssigkeit bestimmt werden kann, treten. Die Probenzufuhr 18 in eine Probenkammer für die Zellkonzentrations- und Viabilitätsbestimmung entfällt damit. 2 shows a container with a culture broth 15 , In the container 16 is an in situ microscope probe 17 introduced. The probe delivers the images from the culture broth. In place of the microscope probe 3 For example, an on-line probe for measuring the electrical capacity of the culture fluid with which the concentration of living cells in the culture fluid can be determined can also be used. The sample feed 18 in a sample chamber for cell concentration and viability determination is thus eliminated.

Claims

Method for determining the specific product formation and / or substrate consumption rates of organisms in a culture broth, with following features: a) the concentration of organisms in the culture broth (Cell concentration) and / or the proportion of living organisms on the Cell concentration (viability) are determined by automated procedures, b) the concentrations of added substrates and / or products of the organisms are determined by automated procedures, c) the results of steps a) and b) are automatic, especially on-line, for determining the specific product formation and / or substrate consumption rates linked to the organisms or processed.

A method according to claim 1, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms by SPR (Surface Plasmon Resonance) is performed.

Method according to claim 1 or 2, characterized that the concentration of the organisms in the culture broth (cell concentration) and the proportion of living organisms in cell concentration (viability) Transfer the culture broth or a sample thereof with dye and computer aided digital image processing be determined.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the cell concentration and the concentration of living cells based on a measurement of the electrical resistance of the culture broth.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the cell concentration and the concentration of living cells with the aid of fluorescence markers and / or a flow cytometer he follows.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the concentration of living cells in the culture broth is determined on the basis of a measurement of the capacity of the culture broth.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the cell concentration is based on Laser diffractometry is determined.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the cell concentration or the determination of cell concentration and viability with a in situ microscope, which measures these parameters directly in the culture vessel.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the specific substrate consumption and product formation rates is combined with the determination of a or several further analytes or parameters.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the sample of the culture broth is automatic is removed sterile and a device for determining the specific Product formation and substrate consumption rates manually or automatically supplied becomes.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the concentration of living cells is on-line in the culture container is measured with an in situ microscope and a sample of the culture broth in particular manually a device for determining the substrate and product concentrations supplied becomes.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the density of living cells online in Culture containers is determined with a probe for measuring the capacity of the cell culture and a sample of the culture broth in particular manually a device for determining the substrate and product concentration supplied becomes.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms using an automated enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) becomes.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms with the help of an automated nephelometer.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms with the help of an automated High Performance Liquid Chromatography (HPLC) performed becomes.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms with the help of automated gel electrophoresis.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms with the help of micro arrays.

Method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms is carried out with the help of immobilized enzymes.

Device for automatic determination of specific Product formation and substrate consumption rates of organisms in one Culture broth with the following features: a) a device consisting of an optics, an electronic camera for image recording, a Device for adding a dye to the culture broth Distinction of living and dead organisms and a computerized digital Processing device for determining the concentration of the organisms in the culture broth (Cell concentration) and the proportion of living organisms in the cell concentration (Viability) b) a means for determining the concentration of added Substrates and / or products of the organisms in particular Basis of Surface Plasmon Resonance (SPR), c) a computer system for controlling the measuring processes from sample distribution, sample preparation, image acquisition or SPR detection and data evaluation and data storage and for determining specific product formation and substrate consumption rates.

Device according to claim 19, characterized in that that the sample of the culture broth is conveyed via a hose or capillary system directly from the culture vessel or from several culture vessels a device to determine the specific product formation and substrate consumption rates can be supplied is (on-line connection).

Apparatus according to claim 19 or one of the others Claims, characterized in that the sample of the culture broth via a Hose or capillary system directly from the culture tank or several culture containers a device for determining the substrate and / or product concentrations can be fed.