DE10328998A1 - IR-ATR basiertes Verfahren und Vorrichtung zur Analyse geringster Probenmengen - Google Patents

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Abstract

Es werden ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, die die Analyse geringster Probenmengen durch Infrarot-spektroskopische Methode erlauben. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Methode, die die folgenden Schritte einschließt: Einsaugen der flüssigen Probe in eine Dosiervorrichtung (1), Dosieren der Probe auf das optische Element (4) einer ATR-Vorrichtung, Eintrocknen der Probe, Durchführen einer ATR-IR-spektroskopischen Messung, Konzentrationsvorhersage der zu detektierenden Analyten gemäß einer modellgestützten Kalibrationsprozedur.

Description

  • Die Erfindung betrifft eine Methode und Vorrichtung für die infrarot-spektroskopische in vitro Analyse von geringsten Mengen von Proben z.B. zur medizinischen Diagnostik von humanen Körperflüssigkeiten wie z.B. interstitieller Flüssigkeit oder Blut. Spektroskopische Analysen können auch eingesetzt werden für die Kontrolle und Steuerung von biotechnologischen Prozessen in der pharmazeutischen, landwirtschaftlichen und Nahrungsmittelindustrie. Spektroskopie vermeidet den Einsatz von Reagenzien und bietet die Möglichkeit für die simultane Bestimmung vieler Komponenten in einer Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Kombination von Methoden zur mechanischen Dosierung und zur totalen internen Reflexion (ATR)-Spektroskopie bzw. eine entsprechende Vorrichtung zur Ausführung dieser Methode.
  • Es ist weithin akzeptiert, dass Infrarot (IR) basierte Methoden ein großes Potential für die reagenzfreie Analyse von Proben besitzen. Ein Überblick für deren Einsatz im klinischen Anwendungen wird gegeben z.B. in H.M. Heise, Infrared and Raman Spectroscopy of Biological Materials, eds. H. Gremlich, B. Yan, Marcel Dekker (New York, Basel), 2001, S. 259 – 322. Nah-Infrarot-Spektroskopie (NIR) charakterisiert durch einen Wellenzahlbereich von 4000 bis 14000 cm–1 adressiert die Oberschwingungen von Schwingungsbanden der zu detektierenden Analyten. Fundamentale Schwingungsbanden werden analysiert von der Mittel-Infrarot-Spektroskopie (MIR), die den Wellenzahlbereich zwischen 800 und 4000 cm–1 abdeckt. Während NIR hauptsächlich zur in vivo Analyse von Körperflüssigkeiten entwickelt wird, wird MIR für die in vitro Analyse bevorzugt. Dies hängt mit der höheren spektralen Auflösung zusammen. So liegt z.B. der Fingerabdruckbereich von Glukose als ein sehr wichtiger klinische Analyt im Bereich zwischen 900 und 1200 cm–1. Aufgrund der hohen Wasserabsorption wird MIR für die in vivo Analyse weniger bevorzugt. Obwohl der Horizont der vorliegenden Erfindung nicht auf MIR begrenzt ist und damit auch NIR umfasst, stellt MIR die bevorzugte Methode für die Umsetzung der Erfindung dar. In vitro MIR Analyse flüssiger Proben interferiert mit der hohen Wasserabsorption. Diese Absorption wird maßgeblich reduziert durch ein Eintrocknen der Probe. Für die klinische Analyse z.B. im Point-of-Care-Bereich sollen geringe Probenvolumina im μl und sub-μl Bereich analysiert werden. Dieser Anforderung folgt eine Diffuse-Reflexions-Methode zur Analyse einer 1 μl Blutprobe, die von G.H. Werner et al., SPIE Vol. 3257, S. 91 – 100 beschrieben wird. Mikrodialyse-Proben mit einem 1 μl Volumen wurden durch eine fiberoptikgestützte ATR-Vorrichtung von H.M. Heise et al., Spectrochimica Acta Pan B 57 (2002), S. 1649 – 1663 getestet. Obwohl Signal zu Rauschverhältnisse die Analyse von Proben mit geringeren Volumina bis in den Submikroliterbereich erlauben würden, bleibt die manuelle Probenaufgabe eine signifikante Fehlerquelle. Eine mechanische Dosiervorrichtung für μl Volumina für eine reflexionsbasierte Methode wird in US 5,334,837 beschrieben. Sogar Volumina von 0.5 nl sind von einem piezoangetriebenen Mikrotropfer für Transmissionsspektroskopie dosiert worden (M. Haberkorn et al., Applied Spectroscopy 56 (2002), S. 902 – 908). Weder Transmissions- noch Reflexionsvorrichtungen sind einfach mit einer Dosiervorrichtung in einem Instrument fest miteinander zu verbinden. Daher wird hier die Probe an einem bestimmten Ort präpariert und darauffolgend zur Probenbühne für die spektroskopische Analyse transferiert. Sowohl für Transmissions- als auch Reflexionsmethoden muss das Probenvolumen sorgfältig eingestellt werden. Geringere Anforderungen sind notwendig für ATR basierte Methoden, die vor allem oberflächenempfindlich sind.
  • Zusammenfassend: es existieren IR-Technologien die Mikrodosiervorrichtungen für die Präparation von μl und sub-μl Proben nutzen, die anschließend von Transmissions- oder Reflexionsmethoden untersucht werden.
    •
  • Die der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe besteht darin, eine Methode und eine Vorrichtung bereitzustellen, die die IR-Analyse geringster Probenmengen erlaubt, die charakterisiert ist durch einfachere Handhabung und reduzierten Anforderungen für die Genauigkeit des einzustellenden Probenvolumens.
  • Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe besteht in einer Methode und einer Vorrichtung, die die spektroskopische Analyse von geringsten Probenmengen erlaubt. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Methode, die die folgenden Schritte einschließt: Einsaugen einer flüssigen Probe in eine Dosiervorrichtung, Dosieren der Probe auf das optische Element einer ATR-Vorrichtung, Eintrocknen der Probe, Durchführung einer ATR-IR-spektroskopischen Messung, Konzentrationsvorhersage der zu detektierenden Analyten gemäß einer modellgestützten Kalibrationsprozedur. Bevorzugt ist die MIR Spektroskopie. In einer bevorzugten Ausführungsform wird insbesondere Glukose in humanen Körperflüssigkeiten detektiert. Es wird eine Vorrichtung beansprucht, die eine Dosiereinrichtung mit einer ATR-Vorrichtung in einem Instrument kombiniert.
  • Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse einer flüssigen Probe, die einen oder mehrere Analyten enthält und die folgenden Schritte umfasst: Einsaugen der Probe in eine Dosiervorrichtung, Dosieren der Probe auf die Messfläche einer ATR-Vorrichtung mittels der Dosiervorrichtung, Messen des ATR-IR Spektrums, Analysieren des Spektrums mit einer Kalibrationsprozedur zur Konzentrationsbestimmung der zu detektierenden Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Messen des ATR-IR-Spektrums die Probe auf der Messfläche getrocknet wird.
  • Bevorzugt ist die Probe ausgewählt aus der Reihe: interstitielle Flüssigkeit, Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Schweiß oder Tränenflüssigkeit.
  • Der Analyt ist bevorzugt ausgewählt aus der Reihe: Glukose, High density lipoproteine (HDL), Low density lipoproteine (LDL), Cholesterin, Triglyceride, Albumin, Gesamtprotein allein oder in beliebiger Kombination, Harnstoff, Harnsäure, Hämoglobin und/oder Creatinin.
  • Das Verfahren wird bevorzugt so durchgeführt, dass das NIR-Spektrum im Wellenzahlbereich von 800 bis 14000 cm– 1 gemessen wird, bevorzugt im Wellenzahlbereich von 900 bis 1200 cm–1.
  • In einem bevorzugten Verfahren werden Probenvolumina von 0,2 bis 1000 nl, bevorzugt 0,5 bis 500 nl eingesetzt und analysiert.
  • Die Probe kann in einem Tropfen auf die ATR-Vorrichtung dosiert werden.
  • In einer bevorzugten Variante des Verfahren wird aber die Probe in mehreren Schritten als Tropfensequenz auf die Messfläche der ATR-Vorrichtung aufgebracht, wobei die Tropfensequenz jeweils aus einem oder mehreren Tropfen besteht und wobei zwischen den Tropfensequenzen die Probe getrocknet wird.
  • Bevorzugt erfolgt die Trocknung der Probe durch Wärmezufuhr, durch Überströmen mit Trocknungsgas oder Evakuieren des Probenraumes.
  • Die Messfläche wird vorteilhafterweise auf dem optischen Element der ATR-Vorrichtung durch einen Rahmen begrenzt.
  • Zusätzlich zu den spektroskopischen Daten können morphologische Daten der eingetrockneten Probe experimentell bestimmt werden. Bevorzugt ist daher ein Verfahren das dadurch gekennzeichnet ist, dass zusätzlich zum IR-Spektrum die Morphologie der eingetrockneten Probe bestimmt wird, insbesondere durch eine Bildaufnahme der Probe oder Interferometrie.
  • Die morphologische Information besteht z.B. aus der Grundfläche der eingetrockneten Probe, in dem Volumen oder in einem dreidimensionalen Höhenprofil der eingetrockneten Probe.
  • Die morphologischen Informationen können z.B. durch Abstandsmessungen von der Oberfläche des eingetrockneten Films zu einem Referenzpunkt mittels eines fokussierten Laserstrahls erzeugt werden.
  • Die zu verwendende spektroskopische Methode beruht vorzugsweise auf FTIR oder basiert auf der Reflexion von diskreten Wellenlängen im NIR und/oder MIR-Bereich.
  • Die spektroskopische Methode kann auch auf der Reflexion eines Teststrahls beruhen, der von einer schmalbandigen IR-Quelle emittiert wird.
  • Alternativ kann die spektroskopische Methode auf einem breitbandigem IR-Emitter und einem oder mehreren Detektoren beruhen, die entweder simultan oder nacheinander ausgelesen werden und für verschiedene Wellenlängenbereiche empfindlich sind, was durch breitbandig empfindliche Detektoren in Verbindung mit wellenlängenselektiven Filtern oder durch abstimmbare schmalbandig empfindliche Detektoren realisiert wird.
  • Die Konzentrationen von einem oder mehrerer Analyten können von spektroskopischen Daten abgeleitet werden, wobei das entsprechende Konzentrationsmodell auf Partial Least Squares (PLS) oder neuronalen Netzen basiert.
  • Die Konzentrationen von einem oder mehrerer Analyten können auch von spektroskopischen Daten und morphologischen Daten wie oben beschrieben abgeleitet werden, wobei das entsprechende Konzentrationsmodell auf PLS oder neuronalen Netzen basiert.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens aufweisend eine Kombination von einer Dosiervorrichtung mit einer ATR-Spektrometer-Vorrichtung, gegebenenfalls mit Trocknereinheit, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiervorrichtung Tropfenvolumen im Bereich von 0,2 bis 1000 ml, bevorzugt 0,5 bis 500 nl dosiert.
  • Bevorzugt ist die Dosiervorrichtung ein piezogetriebener Tropfer oder ein spritzengetriebener Tropfer.
  • Besonders bevorzugt ist die Vorrichtung in einem evakuierbaren Gehäuse montiert und mit zusätzlichen Mitteln zur Evakuierung ausgerüstet.
  • Die Vorrichtung kann bevorzugt zusätzlich mit einem Gebläse und damit verbundenen Zuleitung sowie einer oder mehrerer mit der Zuleitung verbundenen Düsen, die auf die Messfläche des optischen Elements der ATR-Vorrichtung gerichtet sind, ausgestattet sein.
  • Besonders bevorzugt wird das die Probe trocknende Gas in einer solchen Anordnung vorgeheizt.
  • Das optische Element der ATR-Vorrichtung kann auch von einer separaten IR-Quelle geheizt werden.
  • Eine Trocknung der Probe wird auch ermöglicht, wenn das optische Element der ATR-Vorrichtung in einem Halter montiert ist, der durch einen elektrischen Strom geheizt werden kann.
  • Das optische Element der ATR-Messvorrichtung ist bevorzugt ein Prisma, ein planarer Wellenleiter oder ein plattenförmiger Wellenleiter und ist jeweils aus Diamant, Silizium, Zinkselenid oder Germanium hergestellt.
  • In einer bevorzugten Variante der Vorrichtung ist das optische Element der ATR-Messvorrichtung eine optische Faser hergestellt aus Chalcogeniden oder Silberhalogeniden.
  • In einer bevorzugten Variante der Vorrichtung ist das optische Element der ATR-Vorrichtung mit einem Einmalfilm überzogen. Dieser Film ist zusätzlich mechanisch abziehbar und auf den Film wird die Probe dosiert.
  • Der Einmalfilm ist vorteilhafterweise aus Polyethylen hergestellt.
  • Bevorzugt ist das optische Element der ATR-Vorrichtung zur Begrenzung der Messfläche mit einem Rahmen versehen.
  • Der Rahmen kann besonders bevorzugt aus einem auf den Einmalfilm aufgedruckten Ring aus hydrophobem Material bestehen.
  • Der mechanische Ring kann mit dem Einmalfilm kombiniert sein oder ist insbesondere in den Einmalfilm durch Prägetechniken integriert.
  • Insbesondere bevorzugt ist die Vorrichtung zusätzlich mit einer Digital-Kamera zur Aufnahme eines Bildes von der Probe ausgestattet ist.
  • Die Vorrichtung ist gegebenenfalls zusätzlich mit einer Lichtquelle ausgestattet, um ein Bild der Probe mit der Digital-Kamera aufzunehmen zu können.
  • In einer besonders bevorzugten Variante ist die Vorrichtung zusätzlich mit einer Schichtdicken-Messvorrichtung insbesondere auf Basis von Laser-Rückstreuung ausgerüstet.
  • Die ATR-Vorrichtung kann ein Interferometer zum Ausführen von FTIR-Spektroskopie beinhalten.
  • Das Ausleseelement der ATR-Messvorrichtung enthält zweckmäßigerweise bevorzugt einen Globar und einen oder mehrere breitbandige IR-Detektoren, die mit dielektrischen Interferenzfiltern ausgestattet sind.
  • Es können auch IR-Strahlen diskreter Wellenlängen von Halbleiterbauelementen oder CO2-Lasern verwendet werden. Die Halbleiterbauelemente bestehen z.B. aus einem oder mehreren Quantenkaskadenlasern oder aus einem oder mehreren Diodenlasern. Bevorzugt sind die Laser durchstimmbar.
  • Besonders effektiv ist eine Vorrichtung, bei der die Dosiervorrichtung und das optische Element der ATR-Messvorrichtung auf einem gemeinsamen Substrat zusammengefasst sind.
  • Das optische Element der ATR-Messvorrichtung kann insbesondere mittels Lichtleiterelementen an die Ausleseeinheit der ATR-Messvorrichtung gekoppelt sein.
  • Ganz besonders bevorzugt ist eine Vorrichtung, bei der die Dosiervorrichtung, das optische Element und das Ausleseelement der ATR-Messvorrichtung auf einem gemeinsamen Substrat integriert sind.
  • ATR-Messvorrichtung:
  • Eine ATR-Messvorrichtung besteht z.B. bevorzugt aus einem optischen Element, einem Ausleseelement und gegebenenfalls aus Lichtleiterelementen, die das optische Element mit dem Ausleseelement verbinden.
  • Optisches Element:
  • Das optische Element ist beispielsweise ein Festkörper, der infrarottransparent mit einem Brechungsindex höher als Wasser oder Proteinschichten ist und daher geeignet ist, Grenzflächen bereitzustellen, an denen totale interne Reflexion eines auftreffenden IR Strahls stattfindet. Beispiele für optische Elemente sind rechtwinklige Prismen hergestellt aus Diamant, Silizium oder Germanium oder Wellenleiter aus den gleichen Materialien. Wellenleiter können entweder planar auf einem Substrat ausgeführt sein, aus plattenförmigen Wellenleitern bestehen oder Wellenleiter sein, die mit einem kreisförmigen Querschnitt als optische Fasern ausgeführt sind.
  • Ausleseelement:
  • Das Ausleseelement besteht beispielsweise aus einer oder mehreren IR-Lichtquellen, gegebenenfalls optischem Zubehör wie Linsen, Spiegel, Interferometern, wellenlängenselektiven Filtern und einem oder mehreren IR- empfindlichen Detektoren. Im allgemeinen kann der Raum, in dem der IR-Strahl frei propagiert, evakuiert werden, um die Wasserabsorption zu eliminieren.
  • Lichtleiterelement:
  • Ein Lichtleiterelement ist beispielsweise ein entsprechend geformter Festkörper, der Licht durch totale interne Reflexion leitet. Beispiele sind IR-leitende optische Fasern hergestellt aus Silberhalogeniden, Chalcogeniden und Wellenleiter, die photolitographisch definiert z.B. als Siliziummikrostrukturen ausgeführt sind. Lichtleiterelemente können mit Linsen ausgestattet sein, um die Lichtstrahlen ein- und auszukoppeln.
    •
  • Die Erfindung wird nachstehend anhand der Figuren beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:
  • 1a Dosiervorrichtung und ATR-Vorrichtung, dessen optisches Element ein Prisma ist.
  • 1b Dosiervorrichtung und ATR-Vorrichtung, dessen optisches Element ein plattenförmiger Wellenleiter ist.
  • 2 Vorrichtung montiert in einem Gehäuse, das evakuiert werden kann.
  • 3 Vorrichtung mit zusätzlichem Luftventilator, um die Eintrocknung der flüssigen Probe zu beschleunigen.
  • 4 Aufsicht auf ein optisches Element, das in einem Halter montiert ist.
  • 5a Vorrichtung ausgestattet mit einer Einheit, die oberhalb des optischen Elements montiert ist, zur Aufnahme eines Probenbildes.
  • 5b Vorrichtung ausgestattet mit einer Einheit, die unterhalb des optischen Elements montiert ist, zur Aufnahme eines Probenbildes.
  • 5c Vorrichtung ausgestattet mit einer Laser-Rückstreu-Einheit, die oberhalb des optischen Elements montiert ist, um ortsaufgelöst Höheninformationen der Probe zu generieren.
  • 6 Dosiervorrichtung und optisches Element auf einem Chip.
  • 7 Spritzenbasierte Dosiervorrichtung und optisches Element auf einem Chip.
  • 8 Dosiervorrichtung und optisches Element gekoppelt mit einem Auswerteelement über planare Wellenleiter und optischen Fasern auf einem Chip.
  • 9 Dosiervorrichtung und ATR-Vorrichtung auf einem Chip.
  • 10a MIR-ATR-Spektren von wässrigen Glukoselösungen für verschiedene Konzentrationen.
  • 10b Basislinienkorrigierte MIR-ATR-Spektren von wässrigen Glukoselösungen für verschiedene Konzentrationen.
  • 11 Glukosesignal abgeleitet von basislinienkorrigierten MIR-ATR-Spektren von wässrigen Glukoselösungen für verschiedene Konzentrationen.
  • 12 Vorhergesagte Glukosekonzentrationen abgeleitet von basislinienkomgierten MIR-ATR-Spektren von wässrigen Glukoselösungen für verschiedene Konzentrationen in Kombination mit einem monoexponentiellen Kalibrationsmodell als Funktion der Glukosekonzentration.
  • Die grundlegende Neuheit der Erfindung ist die Kombination einer Dosiervorrichtung mit einer ATR-Vorrichtung um Proben im Sub-μl-Bereich von 0,2 nl bis 1000 nl in einem Instrument zu präparieren und zu analysieren. Diese kleinen Volumina sind vorteilhaft für die Analyse von Körperflüssigkeiten, die nur in diesen Volumina gewonnen werden können. Z.B. für die Analyse von interstitieller Flüssigkeit, die durch die Haut gewonnen wird, liegen typische Probenvolumina zwischen 100 und 500 nl vor. Die grundlegenden Funktionsprinzipien werden anhand von 1a erläutert. Die Dosiervorrichtung 1 saugt die Probe 2 durch eine Einlassleitung 3 ein und dosiert die Probe anschließend auf das optische Element 4 der ATR-Vorrichtung durch eine Auslassdüse 5. Hier ist das optische Element ein Prisma. Die nachfolgende Eintrocknung der Probe erhöht die Konzentration des Analyten und eliminiert die Wasserabsorption für die MIR-Spektroskopie. Der Trockenfilm 6 der Probe wird mit einem IR-Strahl beaufschlagt, der von einem Ausleseelement 7 emittiert und detektiert wird und als Option von und zur Probe 6 über Lichtleiterelemente 8 geführt wird. In der Variante nach 1b ist das Prisma durch einen planaren Wellenleiter 9 ersetzt. Die spektroskopischen Daten werden in Bezug auf ein oder mehrere Analyten entsprechend eines Kalibrationsmodells analysiert. Dieses Modell ist aus der Analyse eines Testdatensatzes mittels PLS (partial least squares) oder neuronaler Netze abgeleitet. Die Kombination einer Dosiervorrichtung 1 mit einer ATR-Vorrichtung in einem Instrument ist vorteilhaft, da eine ATR-Vorrichtung einen freien Zugang zur Oberfläche des optischen Elements 4 gewährleistet. Es werden keine zusätzlichen Mittel wie reflektierende Oberflächen für Diffuse-Reflexions-Methoden oder -Detektoren bzw. Spiegel oder Lichtleiterelemente für die Transmissionsmethode benötigt, die den freien Zugang zur Oberfläche der Probenbühne blockieren. Das zu analysierende Probevolumen wird durch die Parametereinstellungen der Dosiervorrichtung 1 bestimmt. Daher werden keine Küvetten benötigt, die das Probenvolumen definieren. Da die ATR-Methode aufgrund der evaneszenten Natur des IR-Teststrahls oberflächenempfindlich ist, ist die Dicke des dosierten Probenfilms 6 nicht so entscheidend wie bei der Reflexions- oder Transmissionsmethode solange die Schichtdicke deutlich oberhalb der Eindringtiefe des evaneszierenden Feldes liegt.
  • Die zu analysierende Probe liegt zunächst flüssig vor. Im Rahmen der medizinischen Diagnostik werden bevorzugt Körperflüssigkeiten wie interstitielle Flüssigkeit, Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Schweiß oder Tränenflüssigkeit untersucht. Analyten sind alle klinisch relevanten Komponenten, die von der IR-Spektroskopie unterschieden werden können: insbesondere Glukose, HDL und LDL Cholesterin, Triglyceride, Albumin, Gesamtproteingehalt, Harnstoff, Harnsäure, Hämoglobin und Creatinin. IR-Spektroskopie ist aufgeteilt in den Nah-Infrarotbereich (NIR) zwischen 4000 und 14000 cm–1 und dem Mittel-Infrarotbereich zwischen 800 und 4000 cm–1. Beide Methoden können grundsätzlich für die Erfindung genutzt werden, obwohl MIR-Spektroskopie aufgrund der höheren Auflösung die bevorzugte Methode ist.
  • Die Dosiervorrichtung 1 ist ein mechanischer Apparat der vordefinierte Volumina einer flüssigen Probe einsaugen und dosieren kann. Die grundlegende Funktion beruht auf dem Anlegen von Druck an die Probe mittels eines Piezokristalls oder mittels einer Spritze. Piezokristallbasierte Dosiervorrichtungen werden bevorzugt für ultrakleine Volumina zwischen 0,1 und 100 nl, während spritzenbasierte Dosiervorrichtungen für größere an diesen Bereich anschließende Volumenbereiche eingesetzt werden.
  • Das Probenvolumen kann wie oben beschrieben in einem einzigen Tropfen oder in einer Sequenz aufeinander folgender Tropfen dosiert werden. Innerhalb der Sequenz wird zwischen der Dosierung einzelner Tropfen soviel Zeit eingeräumt, dass die individuellen Tropfen eingetrocknet sind, bevor der nächste Tropfen dosiert wird. Pro Dosierungsschritt innerhalb der Sequenz kann auch mehr als ein Tropfen dosiert werden.
  • Die sequentielle Dosierung hat den Vorteil, geringere Grundflächen des eingetrockneten Films zu realisieren als die Methode, die Probe des gleichen Volumens in einem Tropfen zu dosieren. Um den Eintrocknungsprozess zu beschleunigen, können zusätzliche Methoden angewendet werden. 2 zeigt ein Beispiel, bei dem die Dosiervorrichtung und die ATR-Messvorrichtung in einem Gehäuse 10 montiert sind, das über eine Leitung 11 mittels einer Pumpe 12 evakuiert werden kann.
  • In einer anderen Ausführungsform dargestellt in 3 wird die Eintrocknung durch einen Gasstrom über die dosierte Probe 6 beschleunigt. Zusätzlich kann der Gasstrom vorgeheizt sein. Dies kann durch einen Luftventilator 13, einer Zuleitung 14 und einer Düse 15 bewerkstelligt werden. Wärme kann auch appliziert werden durch eine Lichtquelle, die eine signifikante Emission im IR hat, um das Wasser der wässrigen Probe beschleunigt zu verdampfen. Diese Lichtquelle kann eine Glühbirne sein, die an der gleichen Stelle montiert ist wie die Luftdüse 15 in 13.
  • In einer anderen Ausführungsform, s. 4 (Aufsicht), ist das optische Element 4 in einem Halter 16 montiert, der beispielsweise auf 40 bis 70 °C geheizt ist. Aufgrund der Wärmebrücke zwischen Halter 16 und optischem Element 4 wird die Verdampfung der flüssigen Probe befördert.
  • Das optische Element 4 der ATR-Messvorrichtung hat wenigstens eine Oberfläche, an der der IR-Strahl totalreflektiert wird. An dieser Grenzfläche wird der auf das optische Element 4 dosierte Probenfilm durch das evaneszente Feld getestet. Eine geeignete Oberfläche ist eine Oberfläche eines optischen Elements der ATR-Vorrichtung. Bevorzugte Materialien für die optischen Elemente sind Diamant, Silizium, Zinkselenid oder Germanium. In einer anderen Ausführungsform dienen optische Fasern als optische Elemente, die aus Chalcogeniden oder Silberhalogeniden bestehen. Um die Vorrichtung in Richtung Point-of-Care-Anwendungen zu entwickeln, kann das optische Element 4 mit einem Einmalfilm vorzugsweise einem Polymerfilm wie z.B. Polyethylen zum Schutz der Oberfläche und schnellen Erneuerung ausgestattet werden. Dieser Film hat beispielsweise eine Dicke von 100 bis 1000 nm und ist in einem engen Kontakt, d.h. ohne jeden Zwischenraum, mit dem optischen Element. Nach der spektroskopischen Messung wird der Film mechanisch von dem optischen Element 4 abgezogen und ein neuer Film wird auf das optische Element aufgezogen.
  • Um die Reproduzierbarkeit des ATR-Signals zu erhöhen, kann die Grundfläche des Probenfilms auf dem optischen Element 4 durch einen Rahmen eingegrenzt werden. Der Rahmen kann aus einem Teflonring bestehen, der auf das optische Element gepresst wird. Ein Alternative besteht darin, einen hydrophoben Ring auf das optische Element mit einem hydrophoben Stempelprozess aufzubringen. Diese Ringe können auch mit dem zuvor erwähnten Einmalfilm kombiniert werden, wobei der Film den Boden des Teflonrings überspannt oder der hydrophobe Ring auf den Einmalfilm gedruckt wird. Eine weitere Alternative besteht darin, einen mechanischen Ring aus demselben Material wie der Einmalfilm durch Prägetechniken in den Einmalfilm zu integrieren. Als eine alternative Methode die Grundfläche des Trockenfilms oder sogar die Filmgestalt zu bestimmen, kann ein Bild aufgenommen oder ein Laser-Rückstreu-Scan des Trockenfilms durchgeführt werden. Diese Daten liefern zusätzliche Informationen für die Vorhersage von Analytkonzentrationen gemäß einer Kalibration. Ein Bild der Grenzfläche der Totalreflexion des optischen Elements wird von einer CCD-Kamera 17 aufgenommen, die oberhalb, s. 5a, oder unterhalb, s. 5b, des optischen Elements 4 montiert ist. Für die Montage der Kamera 17 unterhalb des optischen Elements wird entweder eine separate Lichtquelle 18 oder die IR-Strahlung selber als Lichtquelle genutzt, um ein Bild des Probenfilms 6 zu generieren. Ist die Kamera 17 oberhalb des optischen Elements 4 etwas verkippt gegen die Dosiervorrichtung 1 montiert, muss eine zusätzliche Lichtquelle 18 genutzt werden, um die Probe 6 von oben zu beleuchten. Aus dem Bild wird die Grundfläche des Probenfilms 6 mittels handelsüblicher Bildbearbeitungssoftware bestimmt. Darüber hinaus kann aus einem Farbbild zusätzliche Informationen zur Topographie des Probenfilms 6 aufgrund von optischen Interferenzphänomenen abgeleitet werden. Diese können als zusätzliche Parameter für die quantitative Vorhersage von Analytkonzentrationen dienen.
  • In einer weiteren Ausführungsform in 5c ist ein Beispiel für eine Laser-Rückstreu-Einrichtung dargestellt. Ein fokussierter Strahl 19 von einem Laser 20 wird über die Probe 6 gerastert. Sein reflektierter Strahl 21 wird von einer CCD-Kamera 22 aufgenommen. Sowohl der Laser 20 als auch die Kamera 22 können mit beispielsweise Objektiven zur Erhöhung der Auflösung ausgestattet sein. Das beschriebene Triangulationsprizip liefert Informationen für die Höheninformation der Probe 6 mit Bezug auf die Oberfläche des optischen Elements. Räumliche Rasterung erlaubt die dreidimensionale Rekonstruktion der Probengestalt. Außer diesem Satz von Höheninformationen, die als zusätzliche individuelle Parameter für die Vorhersage der Analytkonzentration herangezogen werden können, kann hieraus auch das Probevolumen berechnet werden und dies anstelle des Satzes der jeweiligen Höhenangaben als ein zusätzlicher Parameter verwendet werden.
  • Das optische Element 4 ist in den optischen Weg integriert, um entweder Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) durchzuführen oder eine nichtinterferometrische Methode anzuwenden. Die Letztere ist dadurch charakterisiert, dass die Probe 6 mit Licht diskreter Wellenlängen, Wellenlängenbereichen oder breitbandigem Licht (in Verbindung mit wellenlängenselektiven Detektoren) im NIR und/oder MIR-Bereich bestrahlt wird. Diskrete Wellenlängen können von Lasern wie z.B. CO2-Lasern oder Halbleiterlasern bereitgestellt werden, die zusätzlich auch durchstimmbar sein können. Beispiele für Halbleiterlaser sind Quantenkaskadenlaser oder Diodenlaser. Verschiedene Wellenlängenbereiche werden von mehreren entsprechend unterschiedlichen Laserquellen abgedeckt. Wellenlängenbereiche werden von breitbandigen Lichtquellen bereitgestellt wie z.B. einem Globar in Verbindung mit wellenlängenselektiven Filtern. Um Hintergrundlicht zu eliminieren, werden Infrarotdetektoren wie z.B. MCT, DTGS, DLATGS, Thermoelementdetektoren oder Bolometer mit wellenlängenselektiven Filtern ausgerüstet. Die Filter basieren auf dielektrischen Vielfachschichten mit einstellbaren Wellenlängenfenstern. Außerdem können durchstimmbare Emitter, Filter und Detektoren, die z.B. auf der photonischen Bandlücken-Technologie (z.B. von Ion Optics Inc., Waltham, MA, USA) beruhen, eingesetzt werden. Mehrere Detektoren, die empfindlich für verschiedene Wellenlänge oder Wellenlängenbereiche sind, können nacheinander oder simultan ausgelesen werden. Die parallele Auslesung hat den Vorteil, zeitliche Fluktuation von Signalen zu eliminieren.
  • Die Kombination einer Dosiervorrichtung mit einer ATR-Vorrichtung besitzt das Potential, auf einem gemeinsamen Chip integriert zu werden. Ein erster Schritt ist die Integration der Dosiervorrichtung mit dem optischen Element 4 auf einem Chip. Kanalstrukturen 23 und druckerzeugenden Vorrichtungen 24 wie z.B. Membranpumpen oder ein z.B. ein Prisma 25 als optisches Element 4 können auf einem Siliziumwafer 26, (s. 6), erzeugt werden.
  • Ein druckerzeugende Vorrichtung kann auch mit Piezokristallen realisiert werden, die auf einem Kanal sitzen, oder durch eine Spritze 27 in Verbindung mit einem Dreiwegehahn 28 in 7, die beide in Mikrosystemtechnik (MEMS) ausgeführt sind. Das optische Element 4 auf dem Chip in 6 oder 7 kann mit dem Ausleseelement 7 über ein Lichtleiterelement verbunden werden. Diese Wellenleiter können auf dem Chip mittels photolitographischer Techniken integriert werden.
  • Alternativ können sie auch in separaten optischen Fasern oder in einer Kombination von integrierten Wellenleitern 29 und optischen Fasern 30 bestehen, s. 8. Die optischen Fasern können auf dem Chip positioniert werden, in dem sie in auf dem Chip erzeugte Rillen 31 eingelegt werden. Die größtmögliche Integration ist erreicht, indem die Dosiervorrichtung und die ATR-Vorrichtung auf einem gemeinsamen Chip realisiert werden. Eine Ausführungsform beruht auf MEMS-Technologie wie z.B. der photonischen Bandlückentechnologie, s. Ion Optics Inc. In Erweiterung von 6 in 9 ist eine sog. Mikrobrücke 32 als IR emittierende Quelle und eine weitere Mikrobrücke 33 als Detektor ausgeführt. Mikrobrücken sind z.B. Teile von Ion Optics IR gas SensorChipTM.
  • Kalibrationsmodelle werden mit mathematischen Prozeduren realisiert. Diese Modelle übersetzen Daten, die von spektroskopischen Daten abgeleitet sind, in gesuchte Analytkonzentrationen. Das generelle Prinzip ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Satz von Trainingsdaten benutzt wird, um ein Modell zu generieren. Mit diesem Modell werden anschließend die Konzentration für den Satz von Testdaten bestimmt. Einfache Modell benutzen Funktionen, die auf einem oder mehreren Parametern beruhen, die im allgemeinen aus nichtlinearen Anpassungsprozessen unter Verwendung des Satzes von Trainingsdaten resultieren. Ein einfaches Beispiel ist die lineare Regressionsanalyse. Komplexe Abhängigkeiten der spektroskopischen Daten von den Analytkonzentrationen werden modelliert von Standard-Partial-Least-Squares-Methoden (PLS) oder neuronalen Netzen. Diese Modelle können sogar erweitert werden, indem sie mehrere Parameter über die spektroskopischen Daten hinaus wie z.B. morphologische Parameter wie Probenfilmgrundflächengröße, Probenvolumen oder Höhenprofil berücksichtigen.
  • Beispiel
  • Methode und Vorrichtung zur Detektion von Glukose in wässrigen Glukoselösungen
  • Das Beispiel beschreibt eine Ausführungsform, bei der eine wässrige Glukoselösung auf ein ATR-Prisma mittels eines Micro Droppers dosiert wird. Dieses Beispiel illustriert das Prinzip der Erfindung aber limitiert die Erfindung nicht hierauf.
  • Wässrige Lösungen enthaltend Glukose (Fluka, Deisenhofen, Deutschland, purity > 99.5 %) in deionosiertem Wasser mit Konzentrationen von 10, 25, 50, 100, 200, 400 und 600 mg/dl wurden präpariert. Als Dosiervorrichtung 1 wurde ein microdrop-AutoDrop-System in Verbindung mit einem AD-K-501 Dosierkopf und einem computerkontrollierten 3D Positioniersystem (alle von MicroDrop, Norderstedt, Deutschland) verwendet. Die Spitze des Dosierkopfes besteht aus einer Glaskapillare, die zu einer Düse (Innendurchmesser = 70 μm) ausgeformt ist. Aus dieser Düse werden einzelne Tropfen mit einem Volumen von 0.2 nl von einem auf die Glaskapillare wirkenden piezokristallbasierten Antrieb herausgeschleudert. Ein Protokoll wurde erarbeitet, dass die reproduzierbare Dosierung von Nanolitervolumina auf die Oberfläche eines Golden-Gate-Diamant-ATR-Kristalls (Specac, Smyrna, GA, USA) erlaubt. Die Glukoselösung wurde in 20 Serien, die jeweils zwei Tropfen enthielten, mit einer Rate von 100 Hz aufgetropft. Der resultierende Tropfen aus der ersten Serie auf dem Prisma trocknete während 30 s ein, bevor die zweite Serie auf die gleiche Stelle aufgetropft wurde. Hieraus ergab sich die Probenmenge zu 8 nl. Der Abstand zwischen Düse und der Prismenoberfläche betrug 0.5 mm. Mit diesem Protokoll wurden eingetrocknete Glukosefilme mit einem nahezu konstantem Durchmesser von ca. 200 μm erzeugt unabhängig von der eingesetzten Glukosekonzentration. Die FTIR-Messungen wurden durchgeführt mit einem Bruker Tensor 27 Fourier Transform IR Spektrometer (Bruker GmbH, Ettlingen, Deutschland). Das Spektrometer war ausgerüstet mit einem Standard-Globar als Lichtquelle und einem DLATGS pyroelektrischem Detektor. Das Golden-Gate-ATR-System wurde in der Probenkammer des Spektrometers montiert. Referenzmessungen wurden nach jeder Probe und Reinigung der ATR-Kristalloberfläche mit Äthanol und Wasser aufgenommen. Hierdurch konnten Abweichung zwischen Proben- und Referenzmessungen aufgrund von Repositionierungsfehlern des ATR-Kristalls im Spektrometer vermieden werden. Es wurde darauf geachtet, dass Äthanol vollständig verdampfte, bevor die Referenzmessung durchgeführt wurde. Folglich diente Umgebungsluft als Referenzmedium. Alle Spektren wurden mit einer Auflösung von 4 cm–1 im Spektralbereich zwischen 500 und 6000 cm–1 aufgenommen und 256-fach gemittelt. Die Zeit für eine Messung betrug 300 s. Proben wurden vielfach gemessen mit N = 4 bis 6. Die erhaltenen Spektren, s. 10a, wurden anschließend basislinienkorrigiert im Spektralbereich zwischen 950 und 1150 cm–1, s. 10b. Gepunktete Linien in 10a und 10b zeigen die Variabilität der Spektren im Rahmen einer Standardabweichung um den Mittelwert innerhalb eines experimentellen Satzes der gleichen Glukosekonzentration. Zur Analyse der Signalantwortunktion in Abhängigkeit der Konzentration c, wurde die Fläche unterhalb des basislinienkorrigierten Spektrums im Bereich zwischen 950 und 1150 cm–1 als Glukosesignal s definiert. 11 zeigt eine nahezu lineare Antwortfunktion für den Konzentrationsbereich zwischen 10 und 100 mg/dl. Für diesen Bereich haben wir ein Kalibrationsmodell aufgestellt, dass eine monoexponentielle Form s = s0 + A exp (–c/t) mit (s0, A, t) als Anpassungsparameter besitzt. Die Güte des Modells spiegelt sich in einem hohen Korrelationsfaktor R2 = 0.997. Folglich ist der Standardfehler der Konzentrationsvorhersage, der von einer leave-one-out Kreuzvalidierung stammt, mit 2.6 mg/dl sehr klein. Vorhergesagte Glukosekonzentrationen gegen Glukosekonzentrationen sind in 12 dargestellt. Ein vorhergesagter Konzentrationswert stammt von einer Prozedur, bei der alle Glukosesignaldaten bis auf die des zu betrachtenden Falls herangezogen werden, um die Ampassungsparameter (s0, A, t) zu bestimmen. Mithilfe dieser Parameter und des ausgelassenen Glukosesignals wird die entsprechende vorherzusagende Glukosekonzentration berechnet. Die Anpassungsroutine, die das monoexponentielle Modell verwendet, ist Bestandteil einer kommerziell erhältlichen Software (ORIGIN6.1G, OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). Zwischen 100 und 600 mg/dl sättigt das Signal, weil die Probenfilmdicke die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes übersteigt. Jedoch besitzen die nicht basislinienkorrigierten Spektren aus 10a genug spektral unterschiedliche Informationen, die einen erfolgversprechenden Einsatz von PLS und neuronalen Netzen versprechen, um den Vorhersagebereich entsprechend auszudehnen. Zusammenfassend demonstriert die beschriebene Kombination einer Dosiervorrichtung mit einer ATR-Vorrichtung die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zur Detektion von Glukose bis zu 10 mg/dl in einem 8 nl Probenvolumen.

Claims (24)

  1. Verfahren zur Analyse einer flüssigen Probe, die einen oder mehrere Analyten enthält und die folgenden Schritte umfasst: Einsaugen der Probe in eine Dosiervorrichtung (1), Dosieren der Probe auf die Messfläche des optischen Elementes (4) einer ATR-Vorrichtung mittels der Dosiervorrichtung, Messen des ATR-IR Spektrums, Analysieren des Spektrums mit einer Kalibrationsprozedur zur Konzentrationsbestimmung der zu detektierenden Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Messen des ATR-IR-Spektrums die Probe auf der Messfläche getrocknet wird.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt ist aus der Reihe: interstitielle Flüssigkeit, Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Schweiß oder Tränenflüssigkeit.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ausgewählt ist aus der Reihe: Glukose, High density lipoproteine (HDL), Low density lipoproteine (LDL), Cholesterin, Triglyceride, Albumin, Gesamtprotein allein oder in beliebiger Kombination, Harnstoff, Harnsäure, Hämoglobin und/oder Creatinin.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das NIR-Spektrum im Wellenzahlbereich von 800 bis 14000 cm–1 gemessen wird, bevorzugt von 900 bis 1200 cm–1.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Probenvolumina von 0,2 bis 1000 nl, bevorzugt 0,5 bis 500 nl eingesetzt und analysiert werden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in mehreren Schritten als Tropfensequenz auf die Messfläche der ATR- Vorrichtung aufgebracht wird, wobei die Tropfensequenz jeweils aus einem oder mehreren Tropfen besteht und wobei zwischen den Tropfensequenzen die Probe getrocknet wird.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung der Probe durch Wärmezufuhr, durch Überströmen mit Trocknungsgas oder Evakuieren des Probenraumes erfolgt.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Messfläche auf dem optischen Element (4) der ATR-Vorrichtung durch einen Rahmen begrenzt wird.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zum IR-Spektrum die Morphologie der eingetrockneten Probe bestimmt wird, insbesondere durch eine Bildaufnahme der Probe oder Interferometrie.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Morphologie durch Abstandsmessungen von der Oberfläche des eingetrockneten Films zu einem Referenzpunkt mittels eines fokussierten Laserstrahls ermittelt wird.
  11. Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 10 mindestens aufweisend eine Kombination von einer Dosiervorrichtung (1) mit einer ATR-Spektrometer-Vorrichtung, gegebenenfalls mit Trocknereinheit (13), dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiervorrichtung (1) Tropfenvolumen im Bereich von 0,2 bis 1000 ml, bevorzugt 0,5 bis 500 nl dosiert.
  12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiervorrichtung (1) ein piezogetriebener Tropfer oder ein spritzengetriebener Tropfer ist.
  13. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung in einem evakuierbaren Gehäuse (10) angebracht ist, das mit Mitteln zur Evakuierung ausgerüstet ist.
  14. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zusätzlich mit einem Gebläse (13) und damit verbundenen Zuleitung (14) und einer oder mehrerer mit der Zuleitung verbundenen Düsen (15), die auf die Messfläche des optischen Elements (4) der ATR-Vorrichtung gerichtet sind, ausgestattet ist.
  15. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (4) der ATR-Messvorrichtung ein Prisma, ein planarer Wellenleiter oder ein plattenförmiger Wellenleiter ist und jeweils aus Diamant, Silizium, Zinkselenid oder Germanium hergestellt ist.
  16. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (4) der ATR-Messvorrichtung eine optische Faser hergestellt aus Chalcogeniden oder Silberhalogeniden ist.
  17. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (4) der ATR-Messvorrichtung mit einem abziehbaren Einmalfilm überzogen ist.
  18. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Einmalfilm aus Polyethylen besteht.
  19. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (4) der ATR-Messvorrichtung mit einem Rahmen zur Begrenzung der Messfläche versehen ist.
  20. Vorrichtung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Rahmen aus einem auf den Einmalfilm aufgedruckten Ring aus hydrophobem Material besteht.
  21. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zusätzlich mit einer Digital-Kamera (17) zur Aufnahme eines Bildes von der Probe ausgestattet ist.
  22. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zusätzlich mit einer Schichtdicken-Messvorrichtung (20; 22) insbesondere auf Basis von Laser-Rückstreuung ausgerüstet ist.
  23. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiervorrichtung (1) und das optische Element (4) der ATR-Messvorrichtung auf einem gemeinsamen Substrat zusammengefasst sind.
  24. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 11 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiervorrichtung (1), das optische Element (4) und das Ausleseelement der ATR-Messvorrichtung auf einem gemeinsamen Substrat zusammengefasst sind.
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