DE10322414B4 - Binding of proteins in a native state to a substrate - Google Patents

Abstract

Method for immobilizing at least one protein (18) on a substrate (10),
a) wherein on the substrate (10) a polymer film (12) is immobilized;
b) wherein the polymer film (12) is modified such that it has functional groups (15) on its surface facing away from the substrate (10), wherein the functional groups have at least one of the following functions (16) (chromatographically active functions):
b1) anion exchange function and; or
b2) cation exchanger function and / or
b3) chelating functions and / or
b4) heparin function; and
c) wherein the at least one protein (18) is applied to the modified polymer film (12).

Description

Territory of invention

With gaining the increasing importance of array-based diagnostic and screening methods Methods for the immobilization of biomolecules at defined positions of substrate surfaces more and more weight.

Especially the immobilization of proteins in a native state proves Here, as difficult to achieve, depending on the surface texture of the proteins different strategies for immobilization are chosen have to, to the native state and thus enzyme activities and steric properties to obtain.

Previous Methods for the immobilization of proteins based on substrate surfaces essentially on covalent coupling and covalent modification the proteins to be immobilized.

• 1. Direkte kovalente Kopplung von Seitenketten der Proteinoberfläche an passende chemische Funktionen des Substrats. Die am häufigsten verwendete Kopplungsmethode benutzt die auf der Proteinoberfläche vorhandenen, Aminofunktionen tragenden Seitenketten der Aminosäuren Asparagin, Glutamin, Lysin und Arginin. Durch Aufbringen auf Aldehydfunktionen tragende Substratoberflächen ergibt sich eine Kopplungsreaktion zwischen Amin- und Aldehydfunktionen zur Schiff'schen Base, die nachfolgend durch eine Reduktion mittels Chemikalien wie z. B. NaCNBH₃ in ein stabiles sekundäres Amin überführt werden kann. Ähnlich lassen sich die auf der Proteinoberfläche am häufigsten vertretenen Carboxylfunktionen an Substrate mit Aminofunktionen koppeln: Mittels EDC [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid] umgesetzte Carboxylgruppen der Proteine bilden ein aktiviertes Ester-Zwischenprodukt, das mit primären Aminogruppen auf der Substratoberfläche reagiert und dabei Amidbindungen zwischen Protein und Substrat ausbildet.
• 2. Andere Formen kovalenter Anbindung von Proteinen an Substratoberflächen ergeben sich durch chemische Modifizierung der zu immobilisierenden Proteine vor der endgültigen Kopplung. Hier lassen sich mit den unter 1. beschriebenen Chemischen Kopplungsmethoden in einem ersten Schritt lange, bifunktionelle Linker, wie z. B. Glutaraldehyd oder langkettige Diamine an die Proteine koppeln. In einem zweiten Schritt werden dann die freien Enden dieser Linker an die Substratoberfläche gebunden.
• 3. Weitere, auf Proteinmodifikation beruhende Immobilisierungsverfahren ergeben sich durch die Erzeugung von Fusionsproteinen [Nath N, Chilkoti A, 2003. Fabrication of a Reversible Protein Array Directly from Cell Lysate using a Stimuli-Responsive Polypeptide. Anal. Chem. 75: 709-715]. Fusionsproteine aus dem gewünschten Protein mit z. B. Streptavidineinheiten besitzen Andockstellen für Biotinmoleküle. Damit kann die äußerst stabile, nichtkovalente Biotin-Streptavidin-Bindung zur Verankerung eines Proteins ausgenutzt werden. Umgekehrt lassen sich Biotin-tragende Liganden auch über N-Hydroxysuccinimidfunktionen an Proteine koppeln und dadurch die Proteine auf Streptavidin-beschichteten Oberflächen verankern.

The currently used protein-substrate coupling methods can be divided into three groups:

• 1. Direct covalent coupling of side chains of the protein surface to appropriate chemical functions of the substrate. The most commonly used coupling method uses amino acid-bearing side chains of the amino acids asparagine, glutamine, lysine and arginine, which are present on the protein surface. By applying to Aldehydfunktionen bearing substrate surfaces results in a coupling reaction between amine and aldehyde functions to Schiff's base, which is subsequently reduced by means of chemicals such. B. NaCNBH _{3 can be converted} into a stable secondary amine. Similarly, the carboxyl functions most commonly represented on the protein surface can be coupled to aminofunctional substrates: carboxyl groups of the proteins reacted with EDC [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide] form an activated ester intermediate that reacts with primary amino groups on the amine Substrate surface reacts and forms amide bonds between protein and substrate.
• 2. Other forms of covalent attachment of proteins to substrate surfaces result from chemical modification of the proteins to be immobilized prior to final coupling. Here, in a first step, long, bifunctional linkers, such as. For example, glutaraldehyde or long chain diamines can be coupled to the proteins. In a second step, the free ends of these linkers are then bonded to the substrate surface.
• 3. Other protein modification-based immobilization methods result from the generation of fusion proteins [Nath N, Chilkoti A, 2003. Fabrication of a Reversible Protein Array Directly from Cell Lysates using a Stimuli Responsive Polypeptide. Anal. Chem. 75: 709-715]. Fusion proteins from the desired protein with z. B. Streptavidininheiten have docking sites for biotin molecules. Thus, the extremely stable, noncovalent biotin-streptavidin bond can be exploited for anchoring a protein. Conversely, biotin-bearing ligands can also be coupled to proteins via N-hydroxysuccinimide functions, thereby anchoring the proteins on streptavidin-coated surfaces.

A However, covalent immobilization basically includes one chemical modification of the proteins to be examined, d. H. it leaves no more confident predictions as to whether the modified Protein is still present in a native state or whether a possible enzymatic Activity or certain steric properties are still available.

US 6,117,996 describes a method for immobilizing proteins, in which, for example, various selectively hydrophobic ligands, which can be used inter alia in combination with an agarose substrate for the adsorption of proteins. These are selective ligands. These ligands act by targeted affinity binding to certain selected proteins.

task the invention is to immobilize proteins on a substrate in such a way, that their enzymatic activity preferably preserved.

solution

These The object is achieved by the inventions having the features of the independent claims. advantageous Further developments of the inventions are characterized in the subclaims.

to solution the task becomes a procedure and a process created by the procedure sample carrier specified.

• – Anionenaustauscher-Funktion,
• – Anionenaustauscher-Funktion
• – chelatbildende Funktionen
• - Heparin-Funktion.

The method serves to immobilize at least one protein on a substrate. On the substrate, a polymer film is immobilized. The polymer film is modified such that it has functional groups on its upper side facing away from the substrate surface, wherein the functional groups have at least one of the following functions (chromatographically active functions):

• - anion exchange function,
• - anion exchange function
• - chelating functions
• - heparin function.

The at least one protein is applied to the modified polymer film.

• – 3-Diethylamino-1-propylamin; und/oder
• – 2-Diethylamino-ethylamin; und/oder
• – eine natürlich vorkommende Aminosäure außer Prolin; und/oder
• – Imino-diessigsäure; und/oder
• – Heparin-Albumin.

The polymer film is chosen to have active or activatable functional groups for binding molecules. By binding bifunctional molecules, the polymer film is modified. The bifunctional molecules are chosen such that they carry a first functional group with which they can bind to the active or activated functional groups of the polymer film. Also, the bi-functional molecules are chosen such that a second functional group is chromatographically active. At least one of the following compounds is used as bifunctional molecules:

• 3-diethylamino-1-propylamine; and or
• 2-diethylamino-ethylamine; and or
• A naturally occurring amino acid other than proline; and or
• - imino-diacetic acid; and or
• - heparin albumin.

• – eine sekundäre und/oder tertiäre Aminogruppe; und/oder
• – eine Carboxylgruppe.

In the method, the functional groups have at least one of the following functions:

• A secondary and / or tertiary amino group; and or
• - a carboxyl group.

• – Anionenaustauscher-Funktion und/oder
• – Kationenaustauscher-Funktion und/oder
• – chelatbildende Funktionen und/oder
• – Heparin-Funktion.

The object is also achieved by a sample carrier for immobilizing at least one protein which has a polymer film immobilized on a substrate. In this case, the polymer film is modified such that it has functional groups on its surface facing away from the substrate, wherein the functional groups have at least one of the following functions (chromatographically active functions):

• - anion exchange function and / or
• - cation exchanger function and / or
• Chelating functions and / or
• - heparin function.

• 1. auf die Verwendung von Anionenaustauscher-Funktionen tragenden makroskopischen Oberflächen zur Immobilisierung von Proteinen, wie z. B. Oberflächen mit Aminofunktionen und DEAE-Funktionen (DEAE = O-[2-(Diethylamino)ethyl] als funktionelle Gruppe);
• 2. auf die Verwendung von Kationenaustauscher-Funktionen tragenden makroskopischen Oberflächen, wie z. B. Oberflächen mit Carboxylfunktionen;
• 3. auf die Verwendung von makroskopischen Oberflächen, die chelatbildende Funktionen oder Heparin-Funktionen tragen.

The invention thus preferably relates to:

• 1. on the use of anion exchange functions bearing macroscopic surfaces for the immobilization of proteins, such. B. surfaces with amino functions and DEAE functions (DEAE = O- [2- (diethylamino) ethyl] as a functional group);
• 2. on the use of cation exchange functions bearing macroscopic surfaces such. B. surfaces with carboxyl functions;
• 3. the use of macroscopic surfaces carrying chelating functions or heparin functions.

According to the invention soft, chromatographically effective polymer films on macroscopic surfaces for the purpose of noncovalent immobilization of biomolecules, in particular proteins, generated.

This involves the generation and covalent fixation of polymer films on solid substrates with subsequent derivatization of the polymer towards chromatographically active surfaces.

The The present invention thus relates to immobilization of proteins on substrate surfaces based on electrostatic and protein affinity principles, which - in contrast to the previously used methods of covalent immobilization - only one Minimum of protein changes and - impairments [German MP (ed), 1990. Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification. Vol. 28, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA). allows This is achieved by the formation of the chromatographically active functional Groups on the surface of the sample carrier.

With Help the process of the invention remain also in the immobilized state native and thus functional proteins obtained, whereby the following enzymatic Tests and protein recognition reactions are possible.

at The polymers used may be both biopolymers as also be synthetic copolymers whose soft physical Texture preferably for the immobilization of proteins suitable.

Instead of The binding of bifunctional molecules can also be the polymer film chosen yourself like that be that he is chromatographically active or activatable functional Has groups, without the need for subsequent modification. Of the Polymer film is already modified in this case.

On a macroscopic substrate can the non-covalently bound proteins in a spatially defined Arrangement applied and bound. Let that way to make protein chips.

In the following the invention is based on Embodiments explained in more detail, which are shown schematically in the figure. In detail shows:

1 a schematic representation of a sample carrier for proteins which are bound via chromatographically active ligands to the sample carrier.

1 shows a substrate 10 on which a polymer film 12 covalently bound. To the polymer film are ligands 14 bound, which is a chromatographically active group 15 exhibit. The group 15 mediates z. B. via ion exchange 16 a bond between the ligands 14 and proteins 18 ,

Example I:

One first method is the covalent fixation of an oxidized Form of Biopolymer Agarose [Afanassiev V, Hanemann V, Wölfl S, 2000. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose Movie. Nucleic Acids Res 28: e66] on aminated substrate surfaces and the conversion of the agarose-side aldehyde groups in chromatographically active chemical functions by coupling corresponding amino functions containing Ligands. With ligands always those molecules or molecular groups referred to, which can bind with proteins.

• a. Agarose-Oxidierungsvorschrift: 0,4 g einer Agarose, vorzugsweise vom Typ IIa, werden in 25 ml Wasser durch Aufkochen gelöst, dann auf 45°C abgekühlt und gerührt. 20 ml einer 0,4 M meta-NaJO₄-Lösung in Wasser werden zugefügt und die Reaktionslösung eine weitere Stunde bei 40°C gerührt. Die Oxidationsreaktion wird durch Zugabe von 20 ml 100% Glycerin und Rühren gestoppt. Die Reaktionslösung wird in eine Form zur Ausbildung eines Gels gegossen, um eine möglichst große Oberfläche zu erzielen und durch eine Abkühlperiode bei 4°C verfestigt. Anschließend wird das Gel durch mehrstündige Dialyse gegen 10 l destilliertes Wasser von niedermolekularen Verbindungen befreit.
• b. Beschichtung aminierter Glas-Objektträger mit oxidierter Agarose: Da ein Film aus Agarose sehr empfindlich gegen mechanische Beanspruchung ist, empfiehlt sich eine nur einseitige Beschichtung eines Objektträgers mit Agarose, um Beschädigun gen der Agarose-Schicht zu vermeiden. Deshalb ist es sinnvoll, vor der Beschichtung des Objektträgers eine Seite des Objektträgers mit Selbstklebefolie abzukleben. Als Substrate des Objektträgers dienen handelsübliche aminierte ("silylated") Glas-Objektträger (Telechem Inc., Sunnyvale, CA, USA; Quantifoil GmbH, Jena, Deutschland). Nach der Dialyse des Gels aus oxidierter Agarose wird dieses aufgeschmolzen, auf eine Temperatur von ca. 70°C gebracht und die Lösung auf die vorbereiteten Objektträger gegossen. Nach 10 min bei 70°C wird die überschüssige Agarose-Lösung von den Objektträgern abgeklopft und die Träger mindestens 1 h bei Raumtemperatur getrocknet. Eine Aufbewahrung bei Luft und Raumtemperatur vor der sich anschließenden Modifizierungsreaktion für die Agarose sollte 24 Stunden nicht überschreiten um Degradationseffekte der Aldehydgruppen an Luft so gering wie möglich zu halten. Die endgültige Stabilisierung der bei der Aldehyd-Amin-Reaktion zwischen Agarose und Substrat entstandenen Schiff'schen Basen mittels NaCNBH₃ wird sinnvollerweise erst nach der Inkubation der Agarose-Oberfläche mit den entsprechenden Liganden vorgenommen, weil die Liganden mit der Agarose ihrerseits Schiff'sche Basen bilden, die dann in einer gemeinsamen Reaktion zum sekundären Amin reduziert werden können.
• c. Die Modifizierung von oxidierten Agarose-Oberflächen zu chromatographisch aktiven Oberflächen lässt sich durch Inkubation und nachfolgende Reduktion der Agarose-beschichteten Substrate mit den nachfolgend aufgeführten Substanzen erreichen (für die Erzeugung jeder Spezies einer chromatographisch aktiven Oberfläche werden hier stellvertretend ein oder zwei Beispiele aufgeführt): 1. Erzeugung von Anionenaustausch-Funktionen: Inkubation der Agarose-Oberfläche mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits sekundäre oder tertiäre Aminofunktionen, wie z. B. eine Diethylaminoalkyl-Funktion umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind 3-Diethylamino-1-propylamin oder 2-Diethylamino-ethylamin. 2. Erzeugung von Kationenaustausch-Funktionen: Inkubation der Agarose-Oberfläche mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits Carboxylfunktionen umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind alle natürlich vorkommenden Aminosäuren außer Prolin, insbesondere die sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure. 3. Vergleichsbeispiel: Erzeugung von Oberflächen mit hydrophoben Funktionen: Inkubation der Agarose-Oberfläche mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits hydrophobe aliphatische oder aromatische Reste umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind 2-(Trifluormethyl)benzylamin oder Octylamin. 4. Erzeugung von Oberflächen mit proteinaffinen Funktionen, z. B. mit chelatbildenden Gruppen oder Heparin-Gruppen: Inkubation der Agarose-Oberfläche mit Verbindungen, die einerseits eine primäre oder sekundäre Amino-Funktion und andererseits Chelatbildner oder Heparin-Gruppen umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind Iminodiessigsäure oder Heparin-Albumin. Die Chelat-Funktionen müssen im Anschluss an die Bindung bzw. Inkubation noch mit Salzen zweiwertiger Metalle, wie z. B. Nickel oder Zink, komplexiert werden, bevor sie spezifisch für die Bindung von Proteinen mit Histidin-Funktionen eingesetzt werden können. Für die Modifizierung der Filme aus oxidierter Agarose auf den Festsubstraten durch Inkubation empfehlen sich möglichst konzentrierte Lösungen der, meist mit Wasser mischbaren, Aminogruppen tragenden Verbindungen. Für Verbindungen, die als Feststoffe vorliegen, sind deshalb gesättigte, wässrige Lösungen sinnvoll. Für in flüssiger Form vorliegende Verbindungen sind Lösungen mit 10%igem Wasseranteil sinnvoll. Der Wasserzusatz erleichtert später vor allem die Durchmischung der Lösung mit der nachfolgend aufzutragenden wässrigen Fixierungslösung. Die pH-Werte der Lösungen sollten mittels HCl oder NaOH auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,5 eingestellt werden. Für einen Objektträger sind ca. 300 μl der Ligandenlösung erforderlich; für eine gleichmäßige Bedeckung der Oberfläche mit Reagenz bietet sich ein Abdecken der Lösung mit Deckgläsern in Objektträgergröße an. Als Inkubationsparameter eignen sich Zeiten von 60 min bei 37°C.
• d. Fixierung bzw. Reduktion der Schiff'schen Basen zum sekundären Amin mittels NaCNBH₃: Die Reduktion mit NaCNBH₃ schließt sich direkt an die jeweilige Modifizierungsreaktion an. Als Reduktionslösung dienen 300 μl einer frischen, wässrigen 0,25 M NaCNBH₃-Lösung in einem Fixierungspuffer (0,1 M Na-PO₄-Puffer, pH 7.4) pro Objektträger.

The agarose oxidation and the coating of aminated substrate surfaces with the finished oxidation product can be achieved by the following method:

• a. Agarose Oxidation Procedure: 0.4 g of an agarose, preferably of type IIa, are dissolved in 25 ml of water by boiling, then cooled to 45 ° C. and stirred. 20 ml of a 0.4 M meta-NaJO ₄ solution in water are added and the reaction solution is stirred for a further hour at 40 ° C. The oxidation reaction is stopped by adding 20 ml of 100% glycerol and stirring. The reaction solution is poured into a mold to form a gel to obtain the largest possible surface area and solidified by a cooling period at 4 ° C. Subsequently, the gel is freed by dialysis for several hours against 10 liters of distilled water of low molecular weight compounds.
• b. Coating aminated glass slides with oxidized agarose: Since a film of agarose is very sensitive to mechanical stress, it is recommended to coat only one side with agarose in order to avoid damage to the agarose layer. Therefore, it is useful to mask one side of the slide with self-adhesive film before coating the slide. Commercially available silylated glass slides (Telechem Inc., Sunnyvale, CA, USA; Quantifoil GmbH, Jena, Germany) serve as substrates of the slide. After the dialysis of the oxidized agarose gel, it is melted, brought to a temperature of about 70 ° C., and the solution is poured onto the prepared slides. After 10 min at 70 ° C, the excess agarose solution is knocked off the slides and the support dried at room temperature for at least 1 h. Storage at room temperature and air before the subsequent modification reaction for the agarose should not exceed 24 hours to minimize degradation effects of the aldehyde groups in air. The final stabilization of the Schiff bases formed in the aldehyde-amine reaction between agarose and substrate by means of NaCNBH ₃ is expediently carried out only after the incubation of the agarose surface with the corresponding ligands, because the ligands with the agarose in turn Schiff bases form, which can then be reduced in a common reaction to the secondary amine.
• c. The modification of oxidized agarose surfaces to chromatographically active surfaces can be achieved by incubation and subsequent reduction of the agarose-coated substrates with the substances listed below (for the production of each species of a chromatographically active surface, one or two examples are given by way of example): 1 Generation of anion exchange functions: Incubation of the agarose surface with compounds which on the one hand have a primary amino function and on the other hand secondary or tertiary amino functions, such as, for example, B. include a diethylaminoalkyl function to form corresponding ligands. Examples of such compounds are 3-diethylamino-1-propylamine or 2-diethylamino-ethylamine. 2. Generation of Cation Exchange Functions: Incubation of the agarose surface with compounds comprising, on the one hand, a primary amino function and, on the other hand, carboxyl functions to form corresponding ligands. Examples of such compounds are all naturally occurring amino acids except proline, especially the acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid. 3. Comparative Example: Generation of Surfaces Having Hydrophobic Functions: Incubation of the agarose surface with compounds comprising, on the one hand, a primary amino function and, on the other hand, hydrophobic aliphatic or aromatic radicals to form corresponding ligands. Examples of such compounds are 2- (trifluoromethyl) benzylamine or octylamine. 4. Generation of surfaces with protein affinity Functions, eg With chelating groups or heparin groups: incubation of the agarose surface with compounds comprising on the one hand a primary or secondary amino function and on the other chelating or heparin groups to form corresponding ligands. Examples of such compounds are iminodiacetic acid or heparin albumin. The chelate functions must after the binding or incubation with salts of divalent metals such. As nickel or zinc complexed before they can be used specifically for the binding of proteins with histidine functions. For the modification of the films of oxidized agarose on the solid substrates by incubation, highly concentrated solutions of the compounds, which are usually water-miscible, which carry amino groups, are recommended. For compounds that are present as solids, therefore, saturated, aqueous solutions are useful. For compounds present in liquid form solutions with 10% water content are useful. The addition of water later facilitates above all the thorough mixing of the solution with the aqueous fixation solution to be applied subsequently. The pH of the solutions should be adjusted to between 6.5 and 8.5 using HCl or NaOH. For a slide, about 300 μl of the ligand solution is required; For uniform coverage of the surface with reagent, it is advisable to cover the solution with coverslips in slide size. As incubation parameters are times of 60 min at 37 ° C.
• d. Fixation or reduction of the Schiff bases to the secondary amine by means of NaCNBH ₃ : The reduction with NaCNBH ₃ directly follows the respective modification reaction. The reduction solution used is 300 μl of a fresh, aqueous 0.25 M NaCNBH ₃ solution in a fixation buffer (0.1 M Na-PO ₄ buffer, pH 7.4) per slide.

The excess modification reaction solutions are previously knocked off the agarose substrate supports, and the reducing solution becomes direct applied. The incubation period is 15 minutes at room temperature.

To In the reduction reaction, the slides are washed thoroughly in water and dried in the air.

Example II:

A second method consists in the covalent fixing of a polyacrylamide film on surfaces with aldehyde functions, such as. As aldehyde-modified glass surfaces, and subsequent reduction of the resulting Schiff bases by NaCNBH ₃ to stable secondary amines. Subsequently, the acid amide functions of the polyacrylamide can be converted by transamidation with amino functions of corresponding compounds into chromatographically active chemical functions or ligands.

Usually Thus, the polyacrylamide film is modified on the aldehyde Substrate immobilized that a solution of - at least partially - polyacrylamide monomers is applied to the substrate. The polymerization reaction for the monomer solution is started a few seconds before application. During this reaction comes it leads to a covalent bond between the monomers. The transamidation reaction, with a covalent bond between polyacrylamide film and the Aldehyde functions of the substrate is generated, then carried out during a minute 30 Incubation at 90 ° C.

• 1. Erzeugung von Anionenaustausch-Funktionen: Inkubation des Polyacrylamid-Films mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits sekundäre oder tertiäre Aminofunktionen, wie z. B. eine Diethylaminoalkyl-Funktion umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele sol cher Verbindungen sind 3-Diethylamino-1-propylamin oder 2-Diethylamino-ethylamin.
• 2. Erzeugung von Kationenaustausch-Funktionen: Inkubation des Polyacrylamid-Films mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits Carboxylfunktionen umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind alle natürlich vorkommenden Aminosäuren außer Prolin, insbesondere die sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure.
• 3. Vergleichsbeispiel: Erzeugung von Oberflächen mit hydrophoben Funktionen: Inkubation des Polyacrylamid-Films mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits hydrophobe aliphatische oder aromatische Reste umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind 2-(Trifluormethyl)benzylamin oder Octylamin.
• 4. Erzeugung von Oberflächen mit proteinaffinen Funktionen, z. B. mit Heparin-Gruppen: Inkubation des Polyacrylamid-Films mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits Heparin-Gruppen umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Ein Beispiele einer solchen Verbindung ist Heparin-Albumin.
• 5. Erzeugung von Oberflächen mit proteinaffinen Funktionen, z. B. mit chelatbildenden Gruppen: Inkubation des Polyacrylamid-Films mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits Chelatbildner umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Ein Beispiele einer solchen Verbindung ist Iminodiessigsäure.
• 6. Erzeugung von Oberflächen mit proteinaffinen Funktionen, z. B. mit chelatbildenden Gruppen: Inkubation des Polyacrylamid-Films mit Verbindungen, die die Säureamid-Funktionen des Poly acrylamids zu Chelat-Funktionen modifizieren, wie z. B. Bromessigsäure.

The transamidation of polyacrylamide films to chromatographically active surfaces can be achieved by incubation with the substances listed below (for the generation of each species of a chromatographically active surface, one or two examples are again given by way of example):

• 1. Generation of anion exchange functions: Incubation of the polyacrylamide film with compounds which on the one hand a primary amino function and on the other hand secondary or tertiary amino functions, such as. B. include a diethylaminoalkyl function to form corresponding ligands. Examples of such compounds are 3-diethylamino-1-propylamine or 2-diethylamino-ethylamine.
• 2. Generation of Cation Exchange Functions: Incubation of the polyacrylamide film with compounds comprising, on the one hand, a primary amino function and, on the other hand, carboxyl functions to form corresponding ligands. Examples of such compounds are all naturally occurring amino acids except proline, especially the acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid.
• 3. Comparative Example: Generation of Surfaces Having Hydrophobic Functions: Incubation of the polyacrylamide film with compounds comprising, on the one hand, a primary amino function and, on the other hand, hydrophobic aliphatic or aromatic radicals to form corresponding ligands. Examples of such compounds are 2- (trifluoromethyl) benzylamine or octylamine.
• 4. Generation of surfaces with protein affine functions, eg. With heparin groups: Incubation of the polyacrylamide film with compounds comprising on the one hand a primary amino function and on the other hand heparin groups to corre sponding training ligands. An example of such a compound is heparin albumin.
• 5. Generation of surfaces with protein affine functions, eg. With chelating groups: Incubation of the polyacrylamide film with compounds comprising, on the one hand, a primary amino function and, on the other hand, chelating agents to form corresponding ligands. An example of such a compound is iminodiacetic acid.
• 6. Generation of surfaces with protein-affine functions, eg. With chelating groups: incubation of the polyacrylamide film with compounds which modify the acid amide functions of the polyacrylamide to chelate functions, such as. B. bromoacetic acid.

The Chelation functions need following binding or incubation with salts of divalent Metals, such as As nickel or zinc, be complexed before they specific for the binding of proteins with histidine functions are used can.

Example III:

One the third method is the covalent fixation of a polymer film with hydroxy functions such. B. the copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate and ethylene dimethyl acrylate on amino functional surfaces. The Activation of the hydroxy groups of the polymer may be e.g. B. by CNBr respectively. Subsequently can chromatographically active chemical functions by coupling corresponding Ligands over whose amino functions are generated.

• 1. Erzeugung von Anionenaustausch-Funktionen: Inkubation des aktivierten Hydroxy-Polymerfilms mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits sekundäre oder tertiäre Aminofunktionen, wie z. B. eine Diethylaminoalkyl-Funktion umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind 3-Diethylamino-1-propylamin oder 2-Diethylamino-ethylamin.
• 2. Erzeugung von Kationenaustausch-Funktionen: Inkubation des aktivierten Hydroxy-Polymerfilms mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits Carboxylfunktionen umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind alle natürlich vorkommenden Aminosäuren außer Prolin, insbesondere die sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure.
• 3. Vergleichsbeispiel Erzeugung von Oberflächen mit hydrophoben Funktionen: Inkubation des aktivierten Hydroxy-Polymerfilms mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits hydrophobe aliphatische oder aromatische Reste umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Beispiele solcher Verbindungen sind 2-(Trifluormethyl)benzylamin oder Octylamin.
• 4. Erzeugung von Oberflächen mit proteinaffinen Funktionen, z. B. mit Heparin-Gruppen: Inkubation des aktivierten Hydroxy-Polymerfilms mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits Heparin-Gruppen umfassen, um entsprechende Liganden auszubilden. Ein Beispiele einer solchen Verbindung ist Heparin-Albumin.

The following substances can be used as ligands for coupling to polymer films with activated hydroxy functions (for the generation of each species of a chromatographic surface, in turn one or two examples are given by way of example):

• 1. Generation of anion exchange functions: incubation of the activated hydroxy polymer film with compounds which on the one hand a primary amino function and on the other hand secondary or tertiary amino functions, such as. B. include a diethylaminoalkyl function to form corresponding ligands. Examples of such compounds are 3-diethylamino-1-propylamine or 2-diethylamino-ethylamine.
• 2. Generation of Cation Exchange Functions: Incubation of the activated hydroxy polymer film with compounds comprising on the one hand a primary amino function and on the other carboxyl functions to form corresponding ligands. Examples of such compounds are all naturally occurring amino acids except proline, especially the acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid.
• 3. Comparative Example Generation of Surfaces Having Hydrophobic Functions: Incubation of the activated hydroxy polymer film with compounds comprising, on the one hand, a primary amino function and, on the other hand, hydrophobic aliphatic or aromatic radicals to form corresponding ligands. Examples of such compounds are 2- (trifluoromethyl) benzylamine or octylamine.
• 4. Generation of surfaces with protein affine functions, eg. With heparin groups: Incubation of the activated hydroxy polymer film with compounds comprising on the one hand a primary amino function and on the other hand heparin groups to form corresponding ligands. An example of such a compound is heparin albumin.

Example IV:

One Fourth method consists in the covalent fixation of a glycidyl functions containing polymer film (Hermanson GT, Mallia AK, Smith PK, 1992. Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press Inc., San Diego, CA, USA], such as B. the copolymer of 33% glycidyl methacrylate, 60% 2-hydroxymethacrylate and 7% ethylene dimethacrylate, on aminated substrate surfaces and the conversion of the glycidyl functions of the copolymer into chromatographic active chemical functions. This is done by reacting appropriate, Amino-functional ligands containing the glycidyl functions under strong heat.

• 1. Erzeugung von Anionenaustausch-Funktionen: Inkubation des Copolymer-Films mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion als Ankopplungsstelle für die Glycidyl-Funktionen des Copolymers aufweisen, und andererseits Anionenaustausch-Funktionen, wie z. B. eine Diethylaminoalkyl-Funktion. Beispiele solcher Verbindungen sind 3-Diethylamino-1-propylamin oder 2-Diethylamino-ethylamin.
• 2. Erzeugung von Kationenaustausch-Funktionen: Eine Inkubation des Glycidyl-Funktionen tragenden Copolymers in Gegenwart von Wasser erzeugt über eine Ketenzwischenstufe eine Polycarbonsäureoberfläche. Diese kann direkt als Kationenaustauscher eingesetzt werden, für den in der Regel Carboxylgruppen benötigt werden.
• 3. Vergleichsbeispiel: Erzeugung von Oberflächen mit hydrophoben Funktionen: Inkubation des Glycidyl-Funktionen tragenden Copolymers mit Verbindungen, die einerseits eine primäre Amino-Funktion und andererseits hydrophobe aliphatische oder aromatische Reste umfassen nach Aktivierung der Carboxylgruppen des Polymer-Films mittels EDC. Beispiele solcher Verbindungen sind 2-(Trifluormethyl)benzylamin oder Octylamin.
• 4. Erzeugung von Oberflächen mit proteinaffinen Funktionen wie z. B. Heparin-Gruppen: Inkubation des Glycidyl-Funktionen tra genden Copolymers mit Verbindungen, die einerseits primäre Amino-Funktionen und andererseits Heparin-Gruppen umfassen, wie z. B. Heparin-Albumin.

Conversion of films of the copolymer to chromatographically active surfaces can be achieved by incubation at 90 ° C for 10 minutes with the following substances (one or two examples are given by way of example for the generation of each species of a chromatographic surface):

• 1. Generation of anion exchange functions: Incubation of the copolymer film with compounds which on the one hand have a primary amino function as a coupling site for the glycidyl functions of the copolymer, and on the other hand anion exchange functions, such as. B. a diethylaminoalkyl function. Examples of such compounds are 3-diethylamino-1-propylamine or 2-diethylamino-ethylamine.
• 2. Generation of cation-exchange functions: Incubation of the glycidyl-functional copolymer in the presence of water produces a polycarboxylic acid surface via a ketene intermediate. This can be used directly as a cation exchanger, for which carboxyl groups are generally required.
• 3rd Comparative Example: Generation of Surfaces with Hydrophobic Functions: Incubation of the Glycidyl-bearing copolymers with compounds comprising on the one hand a primary amino function and on the other hand hydrophobic aliphatic or aromatic radicals after activation of the carboxyl groups of the polymer film by means of EDC. Examples of such compounds are 2- (trifluoromethyl) benzylamine or octylamine.
• 4. Generation of surfaces with protein affine functions such. B. Heparin groups: Incubation of the glycidyl functions of the ing copolymer with compounds comprising on the one hand primary amino functions and on the other hand heparin groups, such as. B. heparin albumin.

Application of biomolecules such. B. Proteins on the prepared substrates:
Proteins to be bound by non-covalent immobilization have to be solved in special application buffers depending on the chromatographic characteristics of the selected polymer surface. While buffers with the lowest possible ionic strength are suitable for the application of proteins to surfaces with an anion, cation or protein-related characteristics, buffers with the highest ionic strength must be selected for surfaces with a hydrophobic characteristic.

Vice versa can be immobilized proteins on surfaces with anion, cation or protein-affine characteristic by high ionic strength or replace a high content of a competitor molecule again. Corresponding finds a replacement of proteins on surfaces with hydrophobic characteristics rather with low ionic strength buffers.

To Applying the proteins on the prepared surface of the sample carrier it should continue to be used at temperatures between 0 ° C and 4 ° C the binding equilibria between proteins and surface Sample carrier as possible far on the side of protein binding.

To the Application of protein solutions suitable are ink-jet processes, Dripping or spraying better than dot-matrix printing, because hard-hitting needle tips are soft, mechanically sensitive polymer surfaces easily damage can.

10

substratum

12

polymer film

14

ligand

15

chromatographically active group of the ligand 14

16

binding mediating interaction

18

protein

List of quoted literature:

• 1. German MP (ed), 1990. Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification. Vol. 28, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA.
• 2. Afanassiev V, Hanemann V, Wölfl S, 2000. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose Movie. Nucleic Acids Res 28: e66.
• 3. Hermanson GT, Mallia AK, Smith PK, 1992. Immobilized affinity Ligand Techniques. Academic Press Inc., San Diego, CA, USA.
• 4. Nath N, Chilkoti A, 2003. Fabrication of a Reversible Protein Array Directly from cell lysates using a stimuli-responsive polypeptide. Anal. Chem. 75: 709-715.

Claims (5)

Method for immobilizing at least one protein ( 18 ) on a substrate ( 10 ), a) wherein on the substrate ( 10 ) a polymer film ( 12 ) is immobilized; b) wherein the polymer film ( 12 ) is modified so that it has functional groups ( 15 ) at its from the substrate ( 10 ), wherein the functional groups have at least one of the following functions ( 16 ) (chromatographically active functions) have: b1) anion exchange function and; or b2) cation exchange function and / or b3) chelating functions and / or b4) heparin function; and c) wherein the at least one protein ( 18 ) on the modified polymer film ( 12 ) is applied. Method according to the preceding claim; characterized in that d) the polymer film ( 12 ) is selected such that it contains active or activatable functional groups ( 15 ) for binding molecules ( 18 ) Has; e) that the polymer film ( 12 ) by binding of bifunctional molecules ( 14 ) is modified; f) that the bifunctional molecules ( 14 ) are chosen such that they carry a first functional group with which they can bind to the active or activated functional groups of the polymer film; g) that the bifunctional molecules are chosen such that a second functional group ( 15 ) is chromatographically active; h) that as bifunctional molecules ( 14 ) at least one of the following compounds is used: - 3-diethylamino-1-propylamine; and / or 2-diethylamino-ethylamine; and / or - a naturally occurring amino acid other than proline; and / or - imino-diacetic acid; and / or heparin albumin. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the functional groups at least one have the following features: - a secondary and / or tertiary amino group; and or - one Carboxyl group. Method according to one of the preceding claims, characterized in that a macroscopic substrate ( 10 ) is selected; that the noncovalently bound proteins ( 18 ) on the macroscopic substrate ( 10 ) are applied and bound in a spatially defined arrangement. Sample carrier for immobilizing at least one protein ( 18 ) a) with one on a substrate ( 10 ) immobilized polymer film ( 12 ); b) wherein the polymer film ( 12 ) is modified in such a way that it contains functional groups ( 15 ) at its from the substrate ( 10 ), wherein the functional groups have at least one of the following functions ( 16 ) (chromatographically active functions) have: b1) anion exchange function and / or b2) cation exchange function and / or b3) chelating functions and / or b4) heparin function.