DE10311924A1 - Detection and quantification of bacteria, particularly Alicyclobacillus species in foods, by extraction of DNA, amplification by polymerase chain reaction and analysis of amplicons - Google Patents

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Abstract

Method for detection and quantification of bacteria (A) in a sample comprises extraction of DNA; using this is as matrix for PCR and analysis of the PCR products.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von verschiedenen Alicyclobacillus Spezies.Object of the present invention is a method for the detection and quantification of various Alicyclobacillus species.

Bei Produkten der Lebensmittelindustrie ist eine Kontrolle der mikrobiellen Belastung wesentlich. Diese Belastung kann einerseits krankheitserregende Keime betreffen, andererseits aber auch Keime, die keine gesundheitlichen Auswirkungen auf den Menschen haben, die aber in ausreichend großer Konzentration zu einer deutlichen Beeinträchtigung der Genuss- bzw. Verzehrfähigkeit des Produktes führen.For products in the food industry a control of the microbial load is essential. This Exposure can affect pathogens on the one hand, and on the other but also germs that have no health effects on the People who have enough concentration to become one significant impairment the ability to enjoy or eat of the product.

Alicyclobacillus acidoterrestris führt zu der letztgenannten Art von Keimbelastung. In Produkten, die über eine ausreichende Acidität verfügen, vermehrt sich dieser Organismus und bildet dabei Substanzen, die die Produkte ungenießbar machen. Neben Alicyclobacillus acidoterrestris gibt es noch andere Alicyclobacillen, z.B. Alicyclobacillus acidocaldarius, die zwar ebenso in Lebensmittelprodukten mit ausreichender Acidität wachsen können, dabei aber keine geschmacksintensiven Stoffe bilden.Alicyclobacillus acidoterrestris leads to the latter type of germ load. In products that have a adequate acidity feature, This organism reproduces and thereby forms substances that the Products inedible do. In addition to Alicyclobacillus acidoterrestris, there are others Alicyclobacilli, e.g. Alicyclobacillus acidocaldarius, although also grow in food products with sufficient acidity can, but do not form any flavor-intensive substances.

Eine genaue Kontrolle des Grades einer mikrobiellen Belastung mit Alicyclobacillen und vor allem auch der Art der mikrobiellen Belastung (d.h. Belastung mit welcher Spezies von Alicyclobacillus) eines Lebensmittelproduktes oder -zusatzstoffes ist daher von großer Bedeutung. Zum einen werden gegenwärtig Methoden der selektiven Anreicherung von Alicyclobacillen unter hohen Temperaturen in sauren Medien zur Detektion angewendet (Ref.). Diese Methoden besitzen aber den Nachteil, weder vollständig spezifisch für Alicyclobacillen zu sein noch eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Alicyclobacillen zu ermöglichen. Weiter entwickelte Tests beruhen auf der chemischen Reaktion mit einem Farbsignal, die von den Bakterien beim Wachstum in bestimmten Medien ausgeführt werden (Ref). Eine sichere Unterscheidung verschiedener Alicyclobacillen Spezies ist damit aber weiterhin schwierig.Close control of the degree a microbial load with alicyclobacilli and above all the type of microbial contamination (i.e. contamination with which species from Alicyclobacillus) of a food product or additive is therefore of great Importance. On the one hand, methods of selective Enrichment of alicyclobacilli at high temperatures in acidic Media used for detection (Ref.). Own these methods but the disadvantage, neither completely specific for Alicyclobacillen is still a distinction between different ones To enable alicyclobacilli. Further developed tests are based on the chemical reaction with a color signal determined by the bacteria when growing in Media executed be (ref). A reliable differentiation between different alicyclobacilli But species is still difficult.

Aus dem Stand der Technik hat sich für die vorliegende Erfindung die Aufgabe gestellt, ein Verfahren bereitzustellen, das die sichere Identifizierung und damit sichere Quantifizierung der verschiedenen Alicyclobacillen gewährleistet.From the state of the art for the present invention has for its object to provide a method that is the reliable identification and thus the reliable quantification of the various alicyclobacillas.

Gelöst wurde diese Aufgabe mit einem Verfahren bestehend aus den Teilschritten:

  • a) Extraktion der DNA in der Probe,
  • b) Verwendung der DNA als Matrize für eine Polymerase Ketten Reaktion (PCR) und
  • c) Analyse der Produkte der PCR
This task was solved with a procedure consisting of the sub-steps:
  • a) extraction of the DNA in the sample,
  • b) use of the DNA as a template for a polymerase chain reaction (PCR) and
  • c) Analysis of the products of the PCR

Überraschend hat sich mit diesem Verfahren gezeigt, dass unter Verwendung spezifischer Nukleotidsequenzen als Primer für eine Polymerase Kettenreaktion analysierbare Signale generiert werden können, die die Identität verschiedener Alicyclobacillus Spezies preisgeben.Surprised has shown with this method that using specific Nucleotide sequences as primers for a polymerase chain reaction generates analyzable signals can, the the identity of various Alicyclobacillus species.

Jeder Mikroorganismus ist einzigartig in einigen seiner DNA Sequenzen. Viele andere Sequenzen werden allerdings mit anderen Organismen geteilt. Verschiedene Organismen innerhalb einer Spezies haben einen sehr großen Anteil ihrer DNA gemeinsam. Verschiedene Spezies innerhalb eines Genus besitzen einen geringeren Teil an Sequenzidentität untereinander. Noch geringer ist der Anteil an Identität zwischen verschiedenen Genera. Diese Unterschiede kann man sich zunutze machen, um spezifische Primer zu entwickeln, die DNA Sequenzen enthalten, welche im Wesentlichen spezifisch für einen bestimmten Genus sind (z.B. für den Genus Alicyclobacillus) oder für bestimmte Spezies (z.B. Alicyclobacillus acidoterrestris) oder für eine bestimmte Gruppe von Spezies (z.B. Alicyclobacillus acidoterrestris, Alcyclobacillus acidocaldarius und Alicyclobacillus cycloheptanicus). Die biologische Verwendung der DNA ist dabei irrelevant, wichtig ist, dass die DNA Sequenzen ausreichend konserviert sind, um entsprechende Identitäten zwischen Spezies bzw. Genera zu gewährleisten. Die 16S rDNA ist dabei für Bakterien besonders geeignet.Every microorganism is unique in some of his DNA sequences. Many other sequences, however shared with other organisms. Different organisms within a species have a very large proportion of their DNA in common. Different species within a genus have fewer Part of sequence identity among themselves. The share of identity between is even lower different genera. You can take advantage of these differences to develop specific primers that contain DNA sequences, which are essentially specific to a particular gender (e.g. for the genus Alicyclobacillus) or for certain species (e.g. Alicyclobacillus acidoterrestris) or for a certain group of species (e.g. Alicyclobacillus acidoterrestris, Alcyclobacillus acidocaldarius and Alicyclobacillus cycloheptanicus). The biological use of DNA is irrelevant, important is that the DNA sequences are sufficiently conserved to match identities between species or genera. The 16S rDNA is doing for Bacteria particularly suitable.

Wird eine PCR mit Primern durchgeführt, die beide für das zu untersuchende Bakterium spezifische DNA Sequenzen enthalten, und die dabei genomische DNA dieses Bakteriums als Matrize benutzt, so kann nur dann ein Produkt der entsprechenden Anzahl an Nukleotiden gewonnen werden, wenn beide Primer entsprechend ihrer vorausgesagten Spezifität binden können. Die Spezifität der Analyse ist damit nicht nur von der Spezifität eines Primers abhängig, sondern von der Spezifität beider Primer und des entsprechenden Abstandes, den die beiden zu Grund liegenden spezifischen Sequenzen zueinander besitzen. Die Analyse der Reaktion der PCR bzw. ihres Reaktionsproduktes kann zum einem über konventionelle Agarose-Gelelektrophorese erfolgen, mit anschließender Visualisierung über Färbung mit Ethidumbromid oder Hybridisierung mit gelabelten, detektierbaren, spezifischen DNA Sequenzen, oder zum anderen über Kapillarelektrophorese. Alternativ kann die Analyse auch parallel während der Reaktion selbst über Real-Time PCR durchgeführt werden.If a PCR is carried out with primers which both contain DNA sequences specific to the bacterium to be examined and which uses the genomic DNA of this bacterium as a template, a product of the corresponding number of nucleotides can only be obtained if both primers have been predicted according to their prediction Can bind specificity. The specificity of the analysis is therefore not only dependent on the specificity of a primer, but on the specificity of both primers and the corresponding distance that the two underlying specific sequences have from one another. The analysis of the reaction of the PCR or its reaction product can be carried out on the one hand via conventional agarose gel electrophoresis, with subsequent visualization via staining with ethidum bromide or hybridization with labeled, detectable, specific DNA sequences, or on the other hand via capillary electrophoresis. Alternatively, the analysis can also be carried out in parallel during the reaction itself using real-time PCR the.

Ein Liste von spezifischen Primern ist hier angeführt:

Figure 00030001
Figure 00040001
A list of specific primers is given here:
Figure 00030001
Figure 00040001

Eine spezifische Detektion eines bestimmten Bakteriums oder einer Gruppe bestimmter Bakterien kann durch die Kombination jeweils eines A und eines B-Primers in der PCR Reaktion erreicht werden.A specific detection of a certain bacteria or a group of certain bacteria by combining an A and a B primer in the PCR Response can be achieved.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die spezifischen Primer in ihrer Nukleotidzusammensetzung variiert werden können. So können z.B. Primer verwendet werden, die eine Teilsequenz enthalten, die zu 90% homolog zu den hier angegeben Sequenzen ist. Außerdem kann eine DNA Sonde in der Analyse ergänzt werden, die spezifisch für Sequenzabschnitte ist, die zwischen den den Primern zugrundeliegenden Abschnitten liegt.In summary it can be stated that the specific primers vary in their nucleotide composition can be. So can e.g. Primers are used that contain a partial sequence that is 90% homologous to the sequences given here. Besides, can a DNA probe can be added to the analysis that is specific for sequence sections which lies between the sections on which the primers are based.

1. Test ob isolierte Bakterien zur Spezies Alicyclobacillus acidoterrestris gehören1. Test whether isolated bacteria for the species Alicyclobacillus acidoterrestris belong

Alicyclobacillus acidocaldarius und Alicyclobacillus acidoterrestris Bakterien lagen isoliert als Kolonie auf Agar Platte vor.Alicyclobacillus acidocaldarius and Alicyclobacillus acidoterrestris bacteria were isolated as a colony Agar plate in front.

Für je 3 Kolonien wurden 20 μl PCR-Mix vorbereitet: (0,2 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, pH 8,5, 50 mM KCl, 0.8% Nonident P40, 0,5 u Taq-Polymerase, 0,4 mM Primer 1 (5'-CGGATAATACACGGGT) (SEQ ID NO: 1), 0,4 mM Primer 2 (5'-CACTTCAGACTTACACA) (SEQ ID NO: 4))20 μl PCR mix were prepared for each 3 colonies: (0.2 mM dNTP, 3 mM MgCl 2 , 10 mM Tris / HCl, pH 8.5, 50 mM KCl, 0.8% Nonident P40, 0.5 u Taq- Polymerase, 0.4 mM Primer 1 (5'-CGGATAATACACGGGT) (SEQ ID NO: 1), 0.4 mM Primer 2 (5'-CACTTCAGACTTACACA) (SEQ ID NO: 4))

Mit einer sterilen Pipetenspitze wurde etwas Bakterienmasse von jeder Kolonie in den PCR Mix übertragen.With a sterile pipette tip some bacterial mass from each colony was transferred to the PCR mix.

Die Proben durchliefen folgenden Temperaturzyklus: 1 min 95°C, repeat 30 times: (30 sec 95 °C, 30 sec 52 °C, 45 sec 72 °C), 5 min 72 °CThe samples went through the following Temperature cycle: 1 min 95 ° C, repeat 30 times: (30 sec 95 ° C, 30 sec 52 ° C, 45 sec 72 ° C), 5 min 72 ° C

Anschließend wurden die Proben mit 4 μl of Gelladepuffer versetzt (60 mM EDTA, 60 % Glycerol, 0.09 % bromophenol blue, 0.09 % xylene cyanol FF), über ein 1%iges Agarosegel aufgetrennt und nach Einfärbung mit Ethidiumbromid unter UV analysiert (Siehe 1)The samples were then mixed with 4 μl of gel loading buffer (60 mM EDTA, 60% glycerol, 0.09% bromophenol blue, 0.09% xylene cyanol FF), separated on a 1% agarose gel and, after staining with ethidium bromide, analyzed under UV (see 1 )

Bei den drei Alicyclobacillus acidoterrestris Proben konnte eine Bande von ca. 440 bp detektiert werden. Diese Proben wurden somit als richtig identifiziert.In the three Alicyclobacillus acidoterrestris A band of approx. 440 bp could be detected in samples. This Samples were thus identified as correct.

2. Test ob isolierte Bakterien zur Gruppe Alicyclobacillus acidoterrestris/Alicyclobacillus acidocaldarius gehören2. Test for isolated bacteria to the group Alicyclobacillus acidoterrestris / Alicyclobacillus acidocaldarius belong

Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris Bakterien und ein Brevibakerium lagen isoliert als Kolonie auf Agar Platte vor.Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris bacteria and a brevibakerium were isolated as a colony on agar plate.

Für je zwei Kolonien Alicyclobacillus und eine Kolonie Brevibakterium wurden 20 μl PCR-Mix vorbereitet: (0,2 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, pH 8,5, 50 mM KCl, 0.8 % Nonident P40, 0,5 u Taq-Polymerase, 0,4 mM Primer 1 (5'-CACGTGGGYAATCTGCCTTTC) (SEQ ID NO: 6), 0,4 mM Primer 2 (5'-CCTTCGGCACTG GGGTGTGT) (SEQ ID NO: 9))For each two colonies of Alicyclobacillus and one colony of Brevibacterium, 20 μl PCR mix was prepared: (0.2 mM dNTP, 3 mM MgCl 2 , 10 mM Tris / HCl, pH 8.5, 50 mM KCl, 0.8% Nonident P40, 0 , 5 u Taq polymerase, 0.4 mM primer 1 (5'-CACGTGGGYAATCTGCCTTTC) (SEQ ID NO: 6), 0.4 mM primer 2 (5'-CCTTCGGCACTG GGGTGTGT) (SEQ ID NO: 9))

Mit einer sterilen Pipetenspitze wurde etwas Bakterienmasse von jeder Kolonie in den PCR Mix übertragen.With a sterile pipette tip some bacterial mass from each colony was transferred to the PCR mix.

Die Proben durchliefen folgenden Temperaturzyklus: 1 min 95°C, repeat 30 times: (30 sec 95 °C, 30 sec 52 °C, 45 sec 72 °C), 5 min 72 °CThe samples went through the following Temperature cycle: 1 min 95 ° C, repeat 30 times: (30 sec 95 ° C, 30 sec 52 ° C, 45 sec 72 ° C), 5 min 72 ° C

Anschließend wurden die Proben mit 4 μl of Gelladepuffer versetzt (60 mM EDTA, 60 % Glycerol, 0.09 % bromophenol blue, 0.09 % xylene cyanol FF), über ein 1%iges Agarosegel aufgetrennt und nach Einfärbung mit Ethidiumbromid unter UV analysiert (Siehe 2)The samples were then mixed with 4 μl of gel loading buffer (60 mM EDTA, 60% glycerol, 0.09% bromophenol blue, 0.09% xylene cyanol FF), separated on a 1% agarose gel and, after staining with ethidium bromide, analyzed under UV (see 2 )

Bei allen Alicyclobacillus-Proben konnte eine Bande von ca. 750 bp detektiert werden. Diese Proben wurden somit richtig identifiziert.For all Alicyclobacillus samples a band of approximately 750 bp could be detected. These samples were thus correctly identified.

Claims (16)

Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von Bakterien in einer Probe, gekennzeichnet durch die Teilschritte a) Extraktion der DNA in der Probe, b) Verwendung der DNA als Matrize für eine Polymerase Ketten Reaktion (PCR) und c) Analyse der Produkte der PCRMethods for the detection and quantification of Bacteria in a sample, characterized by the sub-steps a) Extraction of the DNA in the sample, b) using the DNA as Die for a polymerase chain reaction (PCR) and c) Analysis of the products the PCR Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Teilschritt 1a) durch einfaches Erhitzen eines Teils der Probe auf 95°C in wässrigen Medium durchgeführt wird.A method according to claim 1, characterized in that sub-step 1a) by simply heating part of the sample to 95 ° C in watery Medium performed becomes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Teilschritt 1c) durch Analyse der PCR Produkte über Agarose-Ggelelektrophorese, über Kapillarelektrophorese oder über Fluoreszenzentwicklung während der PCR (real-time PCR) erfolgt.Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that that sub-step 1c) by analysis of the PCR products via agarose gel electrophoresis, via capillary electrophoresis or about Fluorescence development during the PCR (real-time PCR) takes place. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu den Spezies Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus hesperidum, Alicyclobacillus hesperidensis, Alicyclobacillus acidiphilus, Alicyclobacillus rittmannii oder Alicyclobacillus sendainensis zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-TGTTGCTCGGGGAGAGC (SEQ ID NO: 12) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus hesperidum, Alicyclobacillus hesperidensis, Alicyclobacillus acidiphilus, Alicyclobacillus rittmannii or Alicyclobacillus sendainensis count and in the PCR in substep 1a) at least one PCR primer has the sequence 5'-TGTTGCTCGGGGAGAGC (SEQ ID NO: 12). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu den Spezies Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus hesperidum, Alicyclobacillus hesperidensis, Alicyclobacillus rittmannii und Alicyclobacillus sendainensis, Alicyclobacillus cycloheptanicus oder Alicyclobacillus herbarius zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-TCACTGTCCAGCAAGG (SEQ ID NO: 14) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus hesperidum, Alicyclobacillus hesperidensis, Alicyclobacillus rittmannii and Alicyclobacillus sendainensis, Alicyclobacillus cycloheptanicus or Alicyclobacillus count herbarius and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-TCACTGTCCAGCAAGG (SEQ ID NO: 14). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu den Spezies Alicyclobacillus cycloheptanicus oder Alicyclobacillus herbarius zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-AGTCACTCGGGAAGAGC (SEQ ID NO: 11) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus cycloheptanicus or Alicyclobacillus herbarius count and in the PCR in partial step 1a) at least one PCR primer has the sequence 5'-AGTCACTCGGGAAGAGC (SEQ ID NO: 11). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu den Spezies Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus rittmannii oder Alicyclobacillus sendainensis zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-CACGTGGGTAATCTGCCTTTC (SEQ ID NO: 15) oder 5'-CACGTGGGCAATCTGCCTTTC (SEQ ID NO: 16) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus rittmannii or Count Alicyclobacillus sendainensis and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-CACGTGGGTAATCTGCCTTTC (SEQ ID NO: 15) or 5'-CACGTGGGCAATCTGCCTTTC (SEQ ID NO: 16). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu den Spezies Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus rittmannii oder Alicyclobacillus sendainensis zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-CCTTCGGCACTGGGGTGTGT (SEQ ID NO: 9) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus rittmannii or Count Alicyclobacillus sendainensis and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-CCTTCGGCACTGGGGTGTGT (SEQ ID NO: 9). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidocaldarius zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-ATACGCCCGCGAGG (SEQ ID NO: 7) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus acidocaldarius counting and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-ATACGCCCGCGAGG (SEQ ID NO: 7). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidocaldarius zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-GCGGGGAAAGGCC (SEQ ID NO: 5) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus acidocaldarius counting and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-GCGGGGAAAGGCC (SEQ ID NO: 5). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidocaldarius zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-CACTCCAGACTTGCTCG (SEQ ID NO: 8) aufweist. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria to the species Alicyclobacillus acidocaldarius counting and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-CACTCCAGACTTGCTCG (SEQ ID NO: 8). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidoterrestris zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-CGGATAATACACGGGT (SEQ ID NO: 1) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria lead to the species Alicyclobacillus acidoterrestris counting and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-CGGATAATACACGGGT (SEQ ID NO: 1). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidoterrestris zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-TACTTGTGTTGAAAGATG (SEQ ID NO: 2) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria lead to the species Alicyclobacillus acidoterrestris counting and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-TACTTGTGTTGAAAGATG (SEQ ID NO: 2). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidoterrestris zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-CACTTCAGACTTACACA (SEQ ID NO: 4) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria lead to the species Alicyclobacillus acidoterrestris counting and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-CACTTCAGACTTACACA (SEQ ID NO: 4). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidoterrestris zählen und in der PCR in Teilschritt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-GCGGGGAAAACGGC (SEQ ID NO: 3) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria lead to the species Alicyclobacillus acidoterrestris counting and in the PCR in sub-step 1a) at least one PCR primer Sequence 5'-GCGGGGAAAACGGC (SEQ ID NO: 3). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien zu der Spezies Alicyclobacillus acidiphilus zählen und in der PCR in Teilschnitt 1a) wenigstens ein PCR-Primer die Sequenz 5'-TTTCTGTCCAGCAAGG (SEQ ID NO: 17) aufweist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the bacteria belong to the species Alicyclobacillus acidiphilus and in the PCR in partial section 1a) at least one PCR primer the sequence 5'-TTTCTGTCCAGCAAGG (SEQ ID NO: 17).
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WO2005118804A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-15 San-Ei Gen F.F.I., Inc. Method of specifically detecting bacterium belonging to the genus alicyclobacillus

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WO2005118804A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-15 San-Ei Gen F.F.I., Inc. Method of specifically detecting bacterium belonging to the genus alicyclobacillus

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