DE10309169A1

DE10309169A1 - Recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidases, process for their preparation and their use

Info

Publication number: DE10309169A1
Application number: DE10309169A
Authority: DE
Inventors: Götz Dr. Hofhaus; Thomas Prof. Dr. Lisowsky
Original assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Current assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2023-03-01
Also published as: WO2004076669A2; WO2004076669A3; DE10309169B4

Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen, in denen mindestens ein Cysteinrest derart mutiert wurde, dass dies zu einer Veränderung des Absorptionsmaximums im Vergleich zum Wildtypprotein führt, die korrespondierenden Nukleinsäuremoleküle sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Proteine als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbrückenbindungen und deren Übertragung auf Substrate sowie als regulierbare Indikatoren für Redoxreaktionen.The invention relates to recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidases in which at least one cysteine residue has been mutated in such a way that this leads to a change in the absorption maximum compared to the wild type protein, the corresponding nucleic acid molecules and a process for their preparation. The invention further relates to the use of these proteins as biocatalysts for the synthesis of disulfide bridges and their transfer to substrates and as adjustable indicators for redox reactions.

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen, in denen mindestens ein Cysteinrest derart mutiert wurde, dass dies zu einer Veränderung des Absorptionssmaximums im Vergleich zum Wildtypprotein führt, die korrespondierenden Nukleinsäuremoleküle sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Proteine als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbrückenbindungen und deren Übertragung auf Substrate sowie als regulierbare Indikatoren für Redoxreaktionen.The invention relates to recombinant, FAD-dependent Sulfhydryl oxidases in which at least one cysteine residue mutates in this way that this was a change of the absorption maximum in comparison to the wild type protein, which corresponding nucleic acid molecules as well a process for their manufacture. The invention further relates to the use of these proteins as biocatalysts for synthesis of disulfide bonds and their transmission on substrates as well as adjustable indicators for redox reactions.

Sulfhydryloxidasen sind Enzyme, welche die Einführung von Disulfidbrückenbindungen in Proteinsubstrate katalysieren (Übersicht in [1]; [2–3]). Dabei werden Thio-Verbindungen (R-SH) nach der folgenden Gleichung in die korrespondierenden Disulfid-Verbindungen umgesetzt werden: 2 R-SH + O₂ → R-S-S-R + H₂O₂. Sulfhydryl oxidases are enzymes that catalyze the introduction of disulfide bonds in protein substrates (overview in [1]; [2–3]). Thio compounds (R-SH) are converted into the corresponding disulfide compounds according to the following equation: 2 R-SH + O ₂ → RSSR + H ₂ O ₂ .

Prinzipiell unterscheidet man zwischen Metalloproteinen (eisen- oder kupferhaltig) und FAD (Flavinadenindinukleotid)-abhängigen Sulfhydryloxidasen, wobei die Erfindung letztere Gruppe betrifft.A basic distinction is made between Metalloproteins (containing iron or copper) and FAD (flavin adenine dinucleotide) -dependent sulfhydryl oxidases, the invention relates to the latter group.

FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen zeichnen sich gegenüber anderen Enzymen, die Dithiol/Disulfid-Transferreaktionen katalysieren, dadurch aus, dass sie Disulfidbindungen de novo synthetisieren können. Neben FAD als nicht-kovalent gebundenem Cofaktor ist den Vertretern dieser Gruppe gemein, dass sie (1) als Homodimere vorliegen, (2) Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor verwenden und (3) in ihrer Sequenz ein konserviertes CXXC-Motiv besitzen (C = Cystein, X = beliebige Aminosäure), das an der primären Redoxreaktion beteiligt ist (Übersicht in [1]; [4]). Die beiden bislang am besten untersuchten Vertreter dieser Klasse sind die Quiescin-Sulfhydryloxidasen aus Huhn und Mensch (Übersicht in [1]).Draw FAD-dependent sulfhydryl oxidases towards each other other enzymes that catalyze dithiol / disulfide transfer reactions, that they can synthesize de novo disulfide bonds. Next FAD as a non-covalently bound cofactor is the representative of this Common group that they (1) exist as homodimers, (2) oxygen use as terminal electron acceptor and (3) in their sequence have a conserved CXXC motif (C = cysteine, X = any amino acid) that at the primary Redox reaction is involved (overview in [1]; [4]). The two best studied representatives so far This class includes chicken and quiescin sulfhydryl oxidases Human (overview in [1]).

Eine eigene Untergruppe innerhalb der FAD-abhängigen Sulfhydryloxidasen stellt die Familie der Erv/Alr-Sulfhydryloxidasen dar, die nach Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae sowie dessen humanem Homolog Alrp benannt ist (Übersicht in [1]). Diese beiden Enzyme sind auch die ersten dieser Gruppe, deren DNA- und Proteinsequenzen bekannt sind [5, 6]. Ihre Aktivität ist essentiell für das Überleben der Zellen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Biogenese von Mitochondrien, insbesondere hinsichtlich einer intakten Membranmorphologie, sowie in der Versorgung cytoplasmatischer Proteine mit Eisen/Schwefel-Clustern, die in den Mitochondrien gebildet werden (Übersicht in [1]; [7]). Im endoplasmatischen Reticulum von Saccharomyces cerevisiae wurde vor kurzem eine zweite Sulfhydryloxidase gefunden, die als Erv2p bezeichnet wurde [8, 9].A separate sub-group within the FAD-dependent Sulfhydryl oxidases are the family of Erv / Alr sulfhydryl oxidases represents the Erv1p from Saccharomyces cerevisiae and its human Homologue Alrp is named (overview in [1]). These two enzymes are also the first in this group, whose DNA and protein sequences are known [5, 6]. Your activity is essential for survival of the cells. They play an important role in the biogenesis of Mitochondria, especially with regard to an intact membrane morphology, as well as in the supply of cytoplasmic proteins with iron / sulfur clusters, which are formed in the mitochondria (overview in [1]; [7]). In the endoplasmic The Saccharomyces cerevisiae reticulum recently became a second Found sulfhydryl oxidase, which was designated as Erv2p [8, 9].

Die C-terminalen Domänen von Erv1p und Erv2p, die das redoxaktive Zentrum und die FAD-Bindedomäne enthalten, sind einander sehr ähnlich (30% Identität). Sie sind insbesondere durch ein konserviertes YPCXXC-Motiv (Y = Tyrosin, P = Prolin, C = Cystein, X = beliebige Aminosäure) gekennzeichnet, das für die enzymatische Aktivität sowie die Interaktion mit FAD essentiell ist. Bei Erv1p entspricht dieses Motiv den Aminosäureresten 128–133.The C-terminal domains of Erv1p and Erv2p, which contain the redox-active center and the FAD binding domain, are very similar to each other (30% identity). They are particularly characterized by a conserved YPCXXC motif (Y = Tyrosine, P = proline, C = cysteine, X = any amino acid), that for the enzymatic activity and interaction with FAD is essential. At Erv1p corresponds this motif the amino acid residues 128-133.

Ein weiteres Charakteristikum dieser Enzyme ist ihre wenig konservierte N-terminale Domäne, die für die subzelluläre Lokalisation der Proteine, die Homodimerbildung sowie möglicherweise auch für die Substratinteraktion wichtig sind [10]. Erv1p weist in dieser Region ein zweites CXXC-Motiv auf (Aminosäuren 30–33), das Erv2p fehlt. Letzteres enthält allerdings an seinem C-Terminus ein möglicherweise funktionell homologes CGC-Motiv (G = Glycin). Die genauen strukturellen bzw. funktionellen Aufgaben, welche die einzelnen Cysteinreste in Erv1p bzw. Erv2p innehaben, sind bislang noch nicht völlig verstanden, werden aber derzeit intensiv untersucht.Another characteristic of this Enzymes is their little conserved N-terminal domain that for the subcellular localization of proteins, homodimer formation and possibly also for substrate interaction are important [10]. Erv1p shows a second CXXC motif in this region on (amino acids 30-33), the Erv2p is missing. The latter contains however, a possibly functionally homologous CGC motif at its C-terminus (G = glycine). The exact structural or functional tasks, which the individual cysteine residues in Erv1p and Erv2p have, are not yet complete understood, but are currently being intensively investigated.

In vielen Anwendungsbereichen, z.B. bei der Teigherstellung für Backwaren oder der Entfernung von Fremdaromen aus Milch oder Bier, ist die Oxidation freier Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden erwünscht. Da enzymkatalysierte Reaktionen im Vergleich zum Einsatz unspezifischer Oxidationsmittel (etwa Wasserstoffperoxid, Perazide oder Bromide) keine unerwünschten Nebenprodukte bilden und die Reaktion auch wesentlich schneller abläuft, wurde die Verwendung von Sulfhydryloxidasen für zahlreiche Applikationen beschrieben.In many areas of application, e.g. when making dough for Baked goods or the removal of foreign aromas from milk or beer, the oxidation of free sulfhydryl groups to disulfides is desirable. There enzyme-catalyzed reactions compared to the use of unspecific Oxidizing agents (such as hydrogen peroxide, perazides or bromides) no unwanted Form by-products and the reaction also much faster expires has been the use of sulfhydryl oxidases for numerous applications described.

Die Europäische Patentanmeldung EP 0 705 538 A1 offenbart eine Enzymzusammensetzung aus einer Sulfhydryloxidase und einer Hemicellulase zur Verbesserung der Teigeigenschaften von Brot und anderen Backwaren. Das US Patent 5,547,690 beschreibt eine weitere Enzymzusammensetzung, bestehend aus einer Sulfhydryloxidase und einer Glucoseoxidase, welche die rheologischen Eigenschaften, insbesondere die Stabilität, von Teigzubereitungen verbessert.The European patent application EP 0 705 538 A1 discloses an enzyme composition of a sulfhydryl oxidase and a hemicellulase to improve the dough properties of bread and other baked goods. US Pat. No. 5,547,690 describes a further enzyme composition, consisting of a sulfhydryl oxidase and a glucose oxidase, which improves the rheological properties, in particular the stability, of dough preparations.

Die Deutsche Patentanmeldung DE 198 40 489 A1 beschreibt stabile Wirkstoffzubereitungen für Lebensmittel, Futtermittel oder pharmazeutische Anwendungen, bei denen der/die Wirkstoffe von einer Proteinschicht umgeben sind. Zur Herstellung dieser Zubereitungen wird das Hüllprotein enzymatisch quervernetzt, u.a. durch die Sulfhydryloxidasekatalysierte Synthese von Disulfidbrückenbindungen.The German patent application DE 198 40 489 A1 describes stable active ingredient preparations for food, feed or pharmaceutical applications in which the active ingredient (s) are surrounded by a protein layer. To prepare these preparations, the coat protein is crosslinked enzymatically, inter alia by the sulfhydryloxidase-catalyzed synthesis of disulfide bridge bonds.

Bislang wurden Sulfhydryloxidasen hauptsächlich aus Milch bzw. aus verschiedenen Pilzen isoliert. U.S. Patent 4,087,328 beschreibt ein mehrstufiges, konventionelles Reinigungsverfahren für Sulfhydryloxidase aus Rohmilch von Kühen. Ein anderes Verfahren zur Reinigung von Sulfhydryloxidase aus dem Schimmelpilz Aspergillus niger ist im U.S. Patent 4,894,340 offenbart. Daneben wurde in der Europäischen Patentanmeldung EP 0 565 172 A1 auch ein rekombinantes Verfahren zur Herstellung von Sulfhydryloxidasen aus filamentösen Pilzen, vorzugsweise wiederum aus Aspergillus spec., in biotechnologischem Maßstab offenbart.So far, sulfhydryl oxidases have mainly been isolated from milk or from various fungi. US Patent 4,087,328 describes a multi-stage, conventional cleaning process for sulfhydryl oxidase from raw milk from cows. Another method of cleaning sulfhydryl oxidase from the mold mushroom Aspergillus niger is disclosed in US Patent 4,894,340. In addition, the European patent application EP 0 565 172 A1 also discloses a recombinant process for the production of sulfhydryl oxidases from filamentous fungi, preferably again from Aspergillus spec., on a biotechnological scale.

Bislang war es allerdings nicht möglich, Sulfhydryloxidasen herzustellen, deren katalytische Aktivität reguliert werden kann, obwohl eine derartige enzymatische Steuerungsmöglichkeit von Redoxreaktionen für eine Vielzahl von Anwendungen in der Grundlagenforschung, aber z.B, auch. in der Lebensmitteltechnologie wünschenswert wäre.So far, however, it has not been possible to use sulfhydryl oxidases manufacture, whose catalytic activity can be regulated, though such an enzymatic control option for redox reactions for one Numerous applications in basic research, but also, for example. desirable in food technology would.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, die katalytische Aktivität von Sulfhydryloxidasen steuern zu können.The object of the invention is therefore the catalytic activity control of sulfhydryl oxidases.

Dieses Ziel wird durch die Bereitstellung neuartiger Sulfhydryloxidasen als molekularen Werkzeuge sowie die rekombinante Herstellung solcher FAD-abhängiger Sulfhydryloxidasen in ausreichend großen Mengen gemäß Anspruch 1 erreicht. Bei diesen erfindungsgmäßen Sulfhydryloxidasen wurde mindestens ein Cysteinrest der Amino-säuresequenz derart mutiert, dass das Absorptionssmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist.This goal is achieved through the deployment novel sulfhydryl oxidases as molecular tools and the recombinant production of such FAD-dependent sulfhydryl oxidases in big enough Quantities according to claim 1 reached. In these sulfhydryl oxidases according to the invention at least one cysteine residue of the amino acid sequence mutates in such a way that the absorption maximum is changed compared to the wild type protein.

Die Erfindung beruht dabei auf der überraschenden Entdeckung, dass der Austausch bestimmter Cysteinreste in der Aminosäuresequenz einer Sulfhydryloxidase aus Saccharomyces cerevisiae nicht nur die Enzymaktivität und die Homodimerbildung beeinflusste, sondern auch eine Farbveränderung des Proteins zur Folge hatte. FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen erscheinen aufgrund des gebundenen FAD-Cofaktors gelb. Infolge des Austausches eines einzelnen Cysteinrests ist jedoch eine Farbänderung zu beobachten und so wurde u.a. ein schwarzes Protein erhalten, das weiterhin katalytisch aktiv war.The invention is based on the surprising Discovery that the replacement of certain cysteine residues in the amino acid sequence a Saccharomyces cerevisiae sulfhydryl oxidase not only that enzyme activity and influenced homodimer formation, but also a color change of the protein. FAD-dependent sulfhydryl oxidases appear due to the bound FAD cofactor yellow. However, due to the exchange of a single cysteine residue a color change to observe and so was got a black protein, that was still catalytically active.

Ferner wurde festgestellt, dass die Farbgebung reversibel durch Einstellung des Redoxpotentials gesteuert werden kann. Da sich so Redoxreaktionen sehr leicht anhand der Farbänderung verfolgen lassen, sind die Enzyme der Erfindung ideale Werkzeuge zur gezielten Steuerung von Redoxreaktionen.It was also found that the Coloring reversibly controlled by setting the redox potential can be. Because redox reactions are very easy based on the color change Being tracked, the enzymes of the invention are ideal tools for the targeted control of redox reactions.

Die Erfindung schließt alle modifizierten Sulfhydryloxidasen ein, bei denen das Absorptionsmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist. Das Absorptionsmaximum bezeichnet die Wellenlänge ("Farbe") des Lichtes, bei der eine Substanz beim Durchleuchten die Intensität am stärksten reduziert. Licht anderer Wellenlängen wird besser durchgelassen. Im sichtbaren Licht erscheint dadurch die Substanz in der Komplementärfarbe zu ihrem Absorptionsmaximum. Eine Veränderung des Absorptionsmaximums gemäß der Erfindung umfasst dabei alle Veränderungen des Absorptionsverhaltens, die eine Farbänderung des Sulfhydryloxidase-Proteins zur Folge haben.The invention closes all modified sulfhydryl oxidases, in which the absorption maximum compared to Wild type protein changed is. The absorption maximum denotes the wavelength ("color") of the light at that a substance reduces the intensity most when illuminated. Light of other wavelengths is better let through. It appears in visible light the substance in the complementary color to their absorption maximum. A change in the absorption maximum according to the invention includes all changes the absorption behavior, which is a color change of the sulfhydryloxidase protein have as a consequence.

Die Sulfhydryloxidasen gemäß der Erfindung können mit Hilfe rekombinanten DNA-Technologie hergestellt werden, die eine vollständige Kontrolle der Sequenz und damit auch der Eigenschaften eines bestimmten Enzyms erlaubt. Mutationen können sehr einfach unter Verwendung etablierter Standardverfahren [20] in die Aminosäuresequenz eingeführt werden.The sulfhydryl oxidases according to the invention can using recombinant DNA technology that a complete Control of the sequence and thus also the properties of a certain one Enzyme allowed. Mutations can very simple using established standard methods [20] into the amino acid sequence introduced become.

Die Erfindung schließt alle rekombinanten Sulfhydryloxidasen ein, in denen ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt wurden, wobei Cystein prinzipiell gegen eine beliebige Aminosäure ausgetauscht werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt. Bislang konnte jedoch seitens der Erfinder noch nicht abschließend geklärt werden, ob die spezifische Einführung eines Serinrests in die Aminosäuresequenz in direktem Zusammenhang mit den beobachteten Farbänderungen der mutierten Proteine steht. Es sollte entsprechend dem Verständnis der Erfinder deshalb möglich sein, auch durch Substitution eines oder mehrerer Cysteinreste durch andere Aminosäuren Farbänderungen der mutierten Proteine hervorzurufen, so z.B. durch den Austausch von Cystein gegen Alanin oder Threonin, die beide zu Serin ähnliche Eigenschaften besitzen. Daneben könnte dies aber durchaus auch durch die Einführung z.B. eines Arginin- oder eines Leucinrests anstelle eines Cysteinrests bewirkt werden.The invention closes all recombinant sulfhydryl oxidases in which one or more Cysteine residues were replaced, with cysteine in principle against one any amino acid can be exchanged. In preferred embodiments, the cysteine residue replaced by a serine residue. So far, however, the Inventor not yet final clarified be whether the specific introduction of a serine residue in the amino acid sequence in direct connection with the observed color changes of the mutated proteins. It should be according to the understanding of the Inventors therefore possible be, also by substitution of one or more cysteine residues other amino acids color changes of the mutant proteins, e.g. through the exchange of cysteine versus alanine or threonine, both similar to serine Possess properties. In addition, this could well also through the introduction e.g. an arginine or a leucine residue instead of a cysteine residue.

Grundsätzlich können alle in einer bestimmten Sulfhydryloxidase vorkommenden Cysteinreste gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden jedoch ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt, die redoxreaktiv sind. Unter "redoxreaktiven" Cysteinresten versteht man erfindungsgemäß dabei diejenigen Reste, die im Verlauf der katalytischen Reaktion einen Zyklus aus Oxidation und Reduktion durchlaufen und dabei eine Disulfidbrücke ausbilden. Beispiele für redoxreaktive Cysteinreste sind etwa C130 und C133 in Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae.Basically, everyone can be in a particular Sulfhydryloxidase occurring cysteine residues exchanged for another amino acid become. In preferred embodiments the invention, however, one or more cysteine residues are replaced, who are redox reactive. Under "redox-reactive" cysteine residues understood one according to the invention those residues that unite in the course of the catalytic reaction Go through the cycle of oxidation and reduction and thereby form a disulfide bridge. examples for Redox-reactive cysteine residues are about C130 and C133 in Erv1p Saccharomyces cerevisiae.

Die Erfindung schließt ferner Sulfhydryloxidasen ein, die sich von der als "Wildtyp" anerkannten Sequenz aufgrund von alternativem Splicing einer gemeinsamen prä-mRNA unterscheiden, aber nach wie vor katalytisch aktiv sind.The invention further includes Sulfhydryloxidases, which differ from the sequence recognized as "wild type" due to alternative Splicing a common pre-mRNA distinguish, but are still catalytically active.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen rekombinante Sulfhydryloxidasen aus der Familie der Evr/Alr-Sulfhydryloxidasen, wobei wiederum Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID. Nr. 1) bevorzugt wird.Preferred embodiments of the invention include recombinant sulfhydryl oxidases from the Evr / Alr sulfhydryl oxidase family, again Erv1p from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID No. 1) is preferred becomes.

Bevorzugt sind ferner Sulfhydryloxidasen, die von Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet sind, und bei denen mindestens ein redoxaktiver Cysteinrest ersetzt wurde, insbesondere die Enzyme mit einer Cystein → Serin-Mutation an Position 30 (C30S; SEQ ID Nr. 2) bzw. einer Cystein → Serin-Mutation an Position 130 (C130S; SEQ ID Nr. 3).Also preferred are sulfhydryl oxidases, which are derived from Erv1p from Saccharomyces cerevisiae, and in which at least one redox-active cysteine residue has been replaced, especially the enzymes with a cysteine → serine mutation in position 30 (C30S; SEQ ID No. 2) or a cysteine → serine mutation at position 130 (C130S; SEQ ID No. 3).

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst rekombinante Erv1-Sulfhydryloxidasen aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nr. 4).Another preferred embodiment The invention includes recombinant Erv1 sulfhydryl oxidases from Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 4).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die rekombinante Sulfhydryloxidase ein Protein- oder Peptidaffinitätsepitop an ihrem N-Terminus und/oder C-Terminus, das eine einfache Detektion und/oder Reinigung des Proteins er-möglicht. Geeignete Epitope sind zum Beispiel das myc-Epitop, das FLAG-Epitop, das His₆-Epitop oder das HA-Epitop.In a further preferred embodiment of the invention, the recombinant sulfhydryl oxidase contains a protein or peptide affinity epitope at its N-terminus and / or C-terminus, which enables easy detection and / or purification of the protein. Suitable epitopes are, for example, the myc epitope, the FLAG epitope, the His ₆ epitope or the HA epitope.

Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle (DNA und RNA), die Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche die hier offenbarten Sulfhydryloxidasen kodieren. Da es aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes möglich ist, bestimmte Codons durch andere Codons zu ersetzen, welche die gleiche Aminosäure kodieren, ist die Erfindung nicht auf ein spezifisches Nukleinsäuremolekül beschränkt, das eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodiert, sondern schließt alle Nukleinsäuremoleküle ein, die eine funktionelle Sulfhydryloxidase kodieren.The invention further relates to nucleic acid molecules (DNA and RNA), the nucleic acid sequences encode the sulfhydryl oxidases disclosed herein. Since it is possible due to the degeneracy of the genetic code, replace certain codons with other codons that are the same amino acid encode, the invention is not limited to a specific nucleic acid molecule which a sulfhydryl oxidase according to the invention encodes but closes all nucleic acid molecules, which encode a functional sulfhydryl oxidase.

Die Erfindung schließt ferner Nukleinsäuremoleküle ein, die sich aufgrund von alternativem Splicing eines gemeinsamen prä-mRNA Moleküls von der als "Wildtyp" anerkannten Sequenz unterscheiden. Derartige Splicing-Mechanismen umfassen die alternative Verwendung von Exons (i.e. Nukleinsäuresequenzen, die eine Aminosäuresequenz kodieren), die alternative Anordnung von Exons sowie das "Nicht-entfernen" von Introns (i.e, intervenierende Sequenzen, die normalerweise keine Aminosäuresequenz kodieren) aus dem mRNA-Molekül.The invention further includes Nucleic acid molecules, which differs from that due to alternative splicing of a common pre-mRNA molecule sequence recognized as a "wild type" differ. Such splicing mechanisms include the alternative Use of exons (i.e. nucleic acid sequences that are an amino acid sequence coding), the alternative arrangement of exons and the "non-removal" of introns (i.e., intervening sequences that normally do not have an amino acid sequence encode) from the mRNA molecule.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kodieren die Nukleinsäuremoleküle rekombinante Sulfhydryloxidasen aus der Familie der Evr/Alr-Sulfhydryloxidasen, wobei insbesondere Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID. Nr. 1) bevorzugt wird.In preferred embodiments According to the invention, the nucleic acid molecules encode recombinant sulfhydryl oxidases from the family of Evr / Alr sulfhydryl oxidases, in particular Erv1p from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID No. 1) is preferred.

Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen Nukleinsäuresequenzen für Sulfhydryloxidasen, in denen ein redoxaktiver Cysteinrest ersetzt wurde. Besonders bevorzugt werden Nukleinsäuresequenzen, die von Erv1p aus Sacharomyces cerevisiae abgeleitet sind, und hier insbesondere die Nukleinsäuresequenzen, die für eine Cystein → Serin-Mutation an Position 30 (C30S; SEQ ID Nr. 2) bzw. eine Cystein → Serin-Mutation an Position 130 (C130S; SEQ ID Nr. 3) kodieren.Other preferred embodiments include nucleic acid sequences for sulfhydryl oxidases, in which a redox-active cysteine residue was replaced. Particularly preferred become nucleic acid sequences, which are derived from Erv1p from Sacharomyces cerevisiae, and here especially the nucleic acid sequences that for one Cysteine → serine mutation at position 30 (C30S; SEQ ID No. 2) or a cysteine → serine mutation Code position 130 (C130S; SEQ ID No. 3).

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst Nukleinsäuremoleküle, welche die Erv1-Sulfhydryloxidase aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nr. 4) kodieren.Another preferred embodiment includes nucleic acid molecules which the Erv1 sulfhydryl oxidase from Arabidopsis thaliana (SEQ ID no. 4) encode.

Ein hier offenbartes Nukleinsäuremolekül kann "operativ" mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft sein, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen.A nucleic acid molecule disclosed here can be "operationally" with a regulatory Sequence be linked to enable expression of the nucleic acid molecule.

Ein Nukleinsäuremolekül wird als "fähig zur Expression einer Nukleinsäuresequenz" bezeichnet, wenn es Sequenzelemente umfasst, die Informationen hinsichtlich der Regulation von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente "operativ" mit der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in Prokaryonten aus dem Promotor per se besteht, i.e. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren schließen normalerweise 5' nicht-kodierende Sequenzen ein, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die –35/–10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryonten oder die TATA-Box, CAAT-Sequenzen und 5'-Capping-Elemente in Eukaryonten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten sowie translatierte Signalsequenzen, um die native Polypeptidkette in ein spezielles Kompartiment der Wirtszelle zu dirigieren Zusätzlich können auch die 3' nicht-kodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription, der Polyadenylierung o.ä. beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind.A nucleic acid molecule is said to be "capable for expression of a nucleic acid sequence "if it Sequence elements includes information regarding regulation of transcription and / or translation, and these elements are "operative" with that of the polypeptide coding nucleic acid sequence connected are. An operational link is a link, where the regulatory sequence elements and the protein coding Sequence are connected in such a way that gene expression is possible. The exact nature of the regulatory requirements for gene expression Ranges can vary between different species. Usually however, these areas include a promoter that occurs in prokaryotes consists of the promoter per se, i.e. DNA elements that initiate transcription control, as well as from DNA elements, which after their transcription in mRNA regulate the start of translation. Such promoters normally close 5 'non-coding Sequences involved in the initiation of transcription and translation are involved, such as the -35 / -10 elements and the Shine-Dalgarno element in prokaryotes or the TATA box, CAAT sequences and 5 'capping elements in eukaryotes. These regions can also contain enhancer or repressor elements as well as translated signal sequences, to convert the native polypeptide chain into a special compartment of the Conduct host cell additionally can also the 3 'non-coding Regions contain regulatory elements at the termination transcription, polyadenylation, etc. involved. If this Termination sequences in a special host cell are not or are insufficiently functional, they can be replaced by signals that are sufficiently functional in the cell in question.

Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz umfassen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung eine Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz. Geeignete prokaryontische Promotoren sind zum Beispiel der lacUV5-Promotor oder der T7-Promotor. Beispiele für geeignete eukaryontische Promotoren sind der SV40-Promotor oder der CMV-Promotor.A nucleic acid molecule according to the invention can accordingly comprise a regulatory sequence, in particular a promoter sequence. In another preferred embodiment, the nucleic acid molecule according to the invention comprises a promoter sequence and a transcription termination sequence. suitable prokaryotic promoters are, for example, the lacUV5 promoter or the T7 promoter. Examples of suitable eukaryotic Promoters are the SV40 promoter or the CMV promoter.

Die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können ferner in einem Vektor oder einem anderen Klonierungsvehikel enthalten sein, wie zum Beispiel Phagen, Phagemiden, Cosmiden, Baculoviren oder künstlichen Chromosomen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen Sequenzen und der Nukleinsäuresequenz, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodiert, Replikations- und Kontrollsequenzen umfassen, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt. Eine große Zahl geeigneter Vektoren, z.B. pBluescript, pUC18, pET oder pcDNA3, ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich.The nucleic acid molecules according to the invention can also be contained in a vector or other cloning vehicle, such as phages, phagemids, cosmids, baculoviruses or artificial chromosomes. In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule is contained in a vector, in particular in an expression vector. Such an expression vector can comprise, in addition to the regulatory sequences already described above and the nucleic acid sequence which encodes a sulfhydryl oxidase according to the invention, replication and control sequences which originate from an organism which is compatible with the host used for expression, and furthermore at least one selectivity onsmarker, which transfers a selectable phenotype to a transformed cell. A large number of suitable vectors, for example pBluescript, pUC18, pET or pcDNA3, has been described in detail and is commercially available.

DNA-Moleküle, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodieren, und insbesondere ein Vektor, der die kodierende Sequenz einer solchen Sulfhydryloxidase enthält, können in eine entsprechende Wirtszelle transformiert werden, die zur Expression dieser DNA-Moleküle geeignet ist. Die Transformation kann dabei mit Hilfe etablierter Standardverfahren [20] durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft daher auch eine Wirtszelle, die ein hier offenbartes Nukleinsäuremolekül enthält.DNA molecules that contain a sulfhydryl oxidase according to the invention encode, and especially a vector that encodes the coding sequence contains such a sulfhydryl oxidase can in a corresponding Host cell are transformed, which are suitable for the expression of these DNA molecules is. The transformation can be done with the help of established standard procedures [20] carried out become. The invention therefore also relates to a host cell, the one contains the nucleic acid molecule disclosed here.

Die transformierten Wirtszellen werden in der Folge unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression der Nukleotidsequenzen, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodieren, geeignet sind. Die verwendeten Wirtszellen können prokaryontischen Ursprungs sein, wie z.B. Escherichia coli (E. coli) oder Bacillus subtilis, oder eukaryontischen Ursprungs, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 oder High5 Insektenzellen, immortalisierte Säugetierzelllinien (z.B. HeLa-Zellen oder CHO-Zellen) oder primäre Säugetierzellen.The transformed host cells will subsequently cultivated under conditions necessary for the expression of the Nucleotide sequences containing a sulfhydryl oxidase according to the invention encode, are suitable. The host cells used can be prokaryotic Be of origin, e.g. Escherichia coli (E. coli) or Bacillus subtilis, or of eukaryotic origin, such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 or High5 insect cells, immortalized Mammalian cell lines (e.g. HeLa cells or CHO cells) or primary mammalian cells.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Klonieren eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Sulfhydryloxidase kodiert, in einen geeigneten Vektor, und
(b) Einbringen des in (a) erhaltenen rekombinanten Vektors in eine geeignete Wirtszelle oder einen geeigneten Zellextrakt.

The invention also relates to a method for the recombinant production of a sulfhydryl oxidase according to the invention. This procedure includes the following steps:

(a) cloning a nucleic acid molecule encoding a sulfhydryl oxidase into an appropriate vector, and
(b) introducing the recombinant vector obtained in (a) into a suitable host cell or a suitable cell extract.

Schritt (a) kann dabei mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, das nur die Sulfhydryloxidase kodiert. Alternativ kann er aber auch mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, in dem die Sulfhydryloxidase operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist. Optional kann das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung auch mit einem Fusionspartner verknüpft sein, wie etwa einem Affinitätsepitop, das eine einfache Reinigung und/oder Detektion des rekombinanten Proteins erlaubt. Die Expression der so klonierten Nukleinsäuremoleküle kann in einer rekombinanten Zelle oder einem Zellextrakt erfolgen, die/der alle für die Transkription und Translation erforderlichen Faktoren enthält.Step (a) can be done with a Nucleic acid molecule are carried out that only encodes the sulfhydryl oxidase. Alternatively, it can also be carried out with a nucleic acid molecule, in which the sulfhydryl oxidase surgically with a regulatory Sequence linked is. Optionally, the nucleic acid molecule according to the invention may also be linked to a fusion partner, such as an affinity epitope that easy cleaning and / or detection of the recombinant protein allowed. The expression of the cloned nucleic acid molecules can done in a recombinant cell or a cell extract, all of which for the Contains transcription and translation necessary factors.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, die mindestens eine rekombinante Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung enthält. Die Zusammensetzung kann dabei ausschließlich Sulfhydryloxidasen umfassen, aber auch weitere enzymatisch aktive Proteine enthalten, wie z.B. Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Lysyloxidasen, Tyrosinoxidasen, Hemicellulasen oder Glucoseoxidasen. Ferner kann die Zusammensetzung je nach Verwendungszweck auch Trägerstoffe (z.B. Stärke, Laktose, Gelatine, Fette, Wachse, Öle oder Polyole), verschiedenen Zusatzstoffe (etwa Füllstoffe, Stabilisierungsmittel, Emulgiermittel oder Konservierungsmittel, Puffersubstanzen, Lösungsmittel oder Lösungsvermittler) oder Transportvehikel umfassen. Die Zusammensetzung kann in fester Form vorliegen, z.B. lyophilisiert oder kristallin, oder aber gelöst, z.B. als Suspension oder Emulsion.The invention further relates to a composition containing at least one recombinant sulfhydryl oxidase according to the invention contains. The composition can exclusively comprise sulfhydryl oxidases, but also contain other enzymatically active proteins, e.g. Lipoxygenases, protein disulfide isomerases, lysyl oxidases, tyrosine oxidases, Hemicellulases or glucose oxidases. Furthermore, the composition Depending on the intended use, also carriers (e.g. strength, Lactose, gelatin, fats, waxes, oils or polyols), various Additives (such as fillers, Stabilizers, emulsifiers or preservatives, Buffer substances, solvents or solubilizer) or include transport vehicles. The composition can be solid Form, e.g. lyophilized or crystalline, or else dissolved, e.g. as a suspension or emulsion.

Außerdem wird die Verwendung der rekombinanten Sulfhydryloxidasen als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbrückenbindungen sowie deren Übertragung auf Substrate offenbart, z.B. auf Dithiothreitol, Cystein oder Homocystein. Im Vergleich zu herkömmlichen Sulfhydryloxidasen besitzen die gentechnologisch modifizierten Enzymen der Erfindung den entscheidenden Vorteil, dass sie regulierbar sind, und diese Regulation anhand von Farbänderungen des Proteins leicht verfolgt werden kann. Die Steuerung der Farbgebung des Proteins erfolgt dabei reversibel durch Einstellung des Redoxpotentials über Dithiothreitol, β-Mercaptoethanol bzw. über Luftsauerstoff. Dadurch wird es möglich, eine Disulfidbindung gezielt auf ein bestimmtes Substratmolekül zu übertragen und die Reaktion anhand der Farbänderung des Proteins zu verfolgen.It also uses of recombinant sulfhydryl oxidases as biocatalysts for synthesis of disulfide bonds as well as their transmission disclosed on substrates, e.g. for dithiothreitol, cysteine or homocysteine. Compared to conventional ones Sulfhydryl oxidases have the genetically modified enzymes the decisive advantage of the invention that it can be regulated, and this regulation easily based on color changes of the protein can be tracked. Controlling the coloring of the protein takes place reversibly by setting the redox potential via dithiothreitol, β-mercaptoethanol or via atmospheric oxygen. This makes it possible to transfer a disulfide bond specifically to a specific substrate molecule and the reaction based on the color change to track the protein.

Die Besonderheit der Erv1/Alr Sulfhydryloxidasen ist ihre Substratspezifität für Dithiole mit einem definierten Abstand, da sie so in der zellulären Umgebung unabhängig vom Glutathionspiegel gezielte Disulfidbrücken einfügen können. Jüngste Untersuchungen der Erfinder zeigen folgende Reihenfolge von künstlichen in vitro Substraten: Thioredoxin (reduziertes CXXC) > Dithiothreitol > Di-Mercaptoethanol Lysozym (reduziert) > Cystein. Demzufolge scheinen Erv/Alr Sulfhydryloxidasen eine starke Präferenz für Dithiole in Proteinen mit einem genau definierten Abstand zu haben. Thioredoxin der Haupt-Redoxregulator der Zelle bei den aufgeführten Phänomenen. Dabei wirkt Erv/Alrp als Thioredoxin-Oxidase und kann so in die Regulation eingreifen.The specialty of Erv1 / Alr sulfhydryl oxidases is their substrate specificity for dithiols with a defined distance because it is in the cellular environment independently be able to insert targeted disulfide bridges from the glutathione level. Recent investigations by the inventors show the following sequence of artificial in vitro substrates: Thioredoxin (reduced CXXC)> dithiothreitol> di-mercaptoethanol Lysozyme (reduced)> cysteine. As a result, Erv / Alr sulfhydryl oxidases appear to be a strong preference for dithiols in proteins with a precisely defined distance. thioredoxin the main redox regulator of the cell in the phenomena listed. Erv / Alrp acts as a thioredoxin oxidase and can thus be incorporated into the Intervene regulation.

Die Enzyme der Erfindung können z.B. klinisch bei der Entwicklung diagnostischer Reagenzien und Testsysteme von Bedeutung sein. Reduziertes Thioredoxin ist z.B. ein essentieller Cofaktor der intrazellulären Signalübertragung, der Steuerung von Apoptose und Nekrosenbildung sowie der Modulation der Fragilität roter Blutkörperchen. Auch als Antioxidationsmittel ist es von großer Bedeutung. Die dabei stattfindende Oxidation schützt u.a. das vaskuläre Endothel vor einer Schädigung durch freie Radikale. Die gezielte Steuerung bzw. der Nachweis einer erfolgten Disulfidbrückenbildung können daher für die Diagnose, aber auch Therapie einer Reihe von Krankheiten vorteilhaft sein Die rekombinanten Sulfhydryloxidasen der Erfindung können ferner als regulierbare Sensoren/Indikatoren für Redoxreaktionen verwendet werden. SO kann z. B. die Sauerstoffkonzentration des Mediums über das Redoxpotential die Farbe des Proteins beeinflussen.For example, the enzymes of the invention can be of clinical importance in the development of diagnostic reagents and test systems. Reduced thioredoxin is, for example, an essential cofactor for intracellular signal transmission, the control of apoptosis and necrosis formation and the modulation of fragility of red blood cells. It is also of great importance as an antioxidant. The oxidation taking place protects the vascular endothelium from damage by free radicals. The targeted control or detection of disulfide bridge formation can therefore be advantageous for the diagnosis and also therapy of a number of diseases. The recombinant sulfhydryl oxidases of the invention can also be used as adjustable sensors / indicators for redox reactions. SO z. B. the Sauer concentration of the medium influence the color of the protein via the redox potential.

Umgekehrt kann aber auch die Farbe des Proteins durch Änderung des Redoxpotentials variiert werden. Die Enzyme gemäß der Erfindung können demnach auch als redox-regulierte Pigmente verwendet werden. Ein Protein der Erfindung kann z.B. zwischen zwei Glasscheiben eingebracht werden, welche mit Elektroden verbunden sind. Durch elektrische Steuerung des Redoxpotentials kann das Protein die Glasfläche einfärben und somit als Lichtschutz fungieren.Conversely, the color can also of the protein through change of the redox potential can be varied. The enzymes according to the invention can therefore also be used as redox-regulated pigments. On Protein of the invention can e.g. inserted between two glass panes which are connected to electrodes. By electrical Controlling the redox potential, the protein can color the glass surface and thus act as light protection.

Da die hier offenbarten Enzyme nach den bislang vorliegenden Ergebnissen für Zellen nicht toxisch zu sein scheinen, sollten sie auch in vivo als Lichtschutzfaktor einsetzbar sein, da sich die Lichtdurchlässigkeit von Zellen wiederum über das Redoxpotential regulieren lässt.Because the enzymes disclosed here after the results available so far are not toxic to cells seem, they should also be used in vivo as a sun protection factor be because the translucency of Cells turn over regulates the redox potential.

Die rekombinanten Enzyme der Erfindung, und insbesondere die C30S-Variante von Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID Nr. 2) können weiterhin als Akzeptormoleküle in Resonanzenergietransfer (RET)-Applikationen zur Bestimmung von Abständen zwischen Makromolekülen eingesetzt werden. Beispiele derartiger Verfahren sind Fluoreszenz-RET (FRET) und Biolumineszenz-RET (BRET) [17, 18]. Das Prinzip beruht dabei auf dem strahlungslosen Transfer von Lichtenergie von einem direkt angeregten Donormolekül auf ein sich in der Nähe befindliches Akzeptormoleül. Damit ein Energietransfer stattfinden kann, müssen die Emmissions- bzw. Absorptionsspektren von Donor bzw. Akzeptor überlappen. Aufgrund seiner schwarzen Farbe und des breiten Absorptionsspektrums kann die Q30S-Variante von Erv1p als universelle Akzeptordomäne eingesetzt werden, die sich mit einem beliebigen Donormolekül kombinieren lässt.The recombinant enzymes of the invention and in particular the C30S variant of Erv1p from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID No. 2) can continue as acceptor molecules in resonance energy transfer (RET) applications for the determination of intervals between macromolecules be used. Examples of such methods are fluorescence RET (FRET) and bioluminescence RET (BRET) [17, 18]. The principle is based doing so on the radiationless transfer of light energy from one directly excited donor molecule on a close up located acceptor molecule. For an energy transfer to take place, the emission or absorption spectra must be of donor or acceptor overlap. Because of its black color and wide absorption spectrum the Q30S variant of Erv1p can be used as a universal acceptor domain that can be combined with any donor molecule.

Die Erfindung wird ferner durch die folgenden nicht-einschränkenden Figuren und Beispiele veranschaulicht.The invention is further enhanced by the following non-limiting Figures and examples illustrated.

Dabei zeigt 1 die Expression von Wildtyp (WT)-Erv1p sowie verschiedener mutierter Varianten (C = Cystein, S = Serin). Die gereinigten Proteine (vgl. auch Beispiel 1) tragen an ihrem C-Terminus jeweils ein His₆-Affinitätsepitop, das sowohl eine schnelle Reinigung als auch den immunchemischen Nachweis erlaubt. Pro Spur wurden 200 ng gereinigtes Protein mit (+) bzw. ohne (–) 20 mM DTT im Probenpuffer auf 4%–12% nicht-reduzierende SDS-Polyacrylamiggele (Novex/Invitrogen) aufgetragen. Die Proteine wurden über einen primären anti-His₅ Antikörper und einen AP-gekoppelten sekundären Antikörper chemiluminometrisch nachgewiesen.It shows 1 the expression of wild-type (WT) -Erv1p and various mutated variants (C = cysteine, S = serine). The purified proteins (cf. also Example 1) each have a His ₆ affinity epitope at their C-terminus, which allows both rapid purification and immunochemical detection. For each lane, 200 ng of purified protein with (+) or without (-) 20 mM DTT were applied in the sample buffer to 4% –12% non-reducing SDS polyacrylamigels (Novex / Invitrogen). The proteins were detected chemiluminometrically using a primary anti-His ₅ antibody and an AP-coupled secondary antibody.

2 zeigt die Bestimmung der in vitro-Aktivität von Wildtyp (WT)-Erv1p sowie verschiedener mutierter Varianten. Die Enzymaktivität der gereinigten Proteine (vgl. auch Beispiel 2) wurde photometrisch mit DTT (entsprechend 50 nmol reduzierte Thiol-Gruppen) als Substrat gemessen. Der Substratumsatz wurde dabei pro proteingebundenes FAD-Molekül (gemäß der spektroskopischen Bestimmung) angegeben. Die Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten. 2 shows the determination of the in vitro activity of wild-type (WT) -Erv1p and various mutated variants. The enzyme activity of the purified proteins (cf. also Example 2) was measured photometrically with DTT (corresponding to 50 nmol reduced thiol groups) as the substrate. The substrate turnover was specified for each protein-bound FAD molecule (according to the spectroscopic determination). The results represent the mean ± standard deviation from three independent experiments.

3 zeigt die unterschiedlichen Färbungen von gereinigtem Wildtyp (WT)-Erv1p sowie verschiedener mutierter Varianten. Aufgrund von unterschiedlicher Expression in E. coli variieren die Proteinkonzentrationen der einzelnen Lösungen. Erv1p (5.9 mg/ml), C30S (36 mg/ml), C33S (10.8 mg/ml), C130S (14.1 mg/ml), C133S (4.1 mg/ml), C159S (9.9 mg/ml), C176S (6.0 mg/ml) und ΔN-Erv1p (4.1 mg/ml). 3 shows the different colors of purified wild-type (WT) -Erv1p as well as different mutated variants. Due to different expression in E. coli, the protein concentrations of the individual solutions vary. Erv1p (5.9 mg / ml), C30S (36 mg / ml), C33S (10.8 mg / ml), C130S (14.1 mg / ml), C133S (4.1 mg / ml), C159S (9.9 mg / ml), C176S ( 6.0 mg / ml) and ΔN-Erv1p (4.1 mg / ml).

4 zeigt Spektren für Wildtyp (WT)-Erv1p sowie die beiden Cystein → Serin Varianten C30S und C130S. Die gereinigten Proteine wurden in einem Zeiss S10 Dioden-Array Photometer in einem Wellenlängebereich von 320 nm bis 700 nm analysiert (vgl. auch Beispiel 3). Die verwendeten Proteinlösungen hatten die folgenden Konzentrationen: 2.2 mg/ml (Erv1p), 5.1 mg/ml (C30S) und 4.2 mg/ml (C130S). Da der FAD-Gehalt der Proben unterschiedlich ist, und auch die molaren Absorptionskoeffizienten für die mutierten Proteine variieren können, werden die Spektren nur qualitativ bewertet. 4 shows spectra for wild-type (WT) -Erv1p and the two cysteine → serine variants C30S and C130S. The purified proteins were analyzed in a Zeiss S10 diode array photometer in a wavelength range from 320 nm to 700 nm (see also Example 3). The protein solutions used had the following concentrations: 2.2 mg / ml (Erv1p), 5.1 mg / ml (C30S) and 4.2 mg / ml (C130S). Since the FAD content of the samples is different and the molar absorption coefficients for the mutated proteins can also vary, the spectra are only evaluated qualitatively.

Beispiel 1example 1

Klonierung und Reinigung von rekombinanten Erv1p-Varianten aus Saccharomyces cerevisiaeCloning and cleaning of recombinant Erv1p variants from Saccharomyces cerevisiae

Die cDNAs für das vollständige ERV1-Gen sowie eine 5'-terminal verkürzte Variante (ΔN-Erv1p; entspricht Aminosäure 73–189 des Wildtyps) wurden mittels etablierter Standardverfahren [20] amplifiziert und als NdeI/XhoI- Fragmente in den Vektor pET24a(+) (Novagen) kloniert [5]. Der rekombinante Vektor, der die vollständige cDNA-Sequenz kodierte, wurde im folgenden zur oligonukleotid-gerichteten Mutagenese ("Excite" PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit/Stratagene) verwendet. Die zur Einführung der einzelnen Mutationen (C = Cystein, S = Serin) verwendeten Primer (jeweils vorwärts/rückwärts) haben die folgenden Sequenzen:

The cDNAs for the complete ERV1 gene and a 5'-terminally truncated variant (ΔN-Erv1p; corresponds to amino acid 73-189 of the wild type) were amplified using established standard methods [20] and converted into the vector pET24a (+ as NdeI / XhoI fragments ) (Novagen) cloned [5]. The recombinant vector which encoded the complete cDNA sequence was subsequently used for oligonucleotide-directed mutagenesis ("Excite" PCR-based site-directed mutagenesis kit / Stratagene). The primers used to introduce the individual mutations (C = cysteine, S = serine) (each forward / backward) have the following sequences:

Die Identität der mutierten Sequenzen wurde anhand von Restriktions- bzw. Sequenzanalysen verifiziert.The identity of the mutated sequences was changed verified using restriction or sequence analysis.

Die gereinigten Plasmide (Plasmid Purification Kit/QIAGEN) wurden in E. coli BL21(+) (Novagen) transformiert und amplifiziert [20]. Die Reinigung der einzelnen Proteine erfolgte über ein His₆-Affinitätsepitop (in der Sequenz von pET24a(+) kodiert) an deren C-Termini. Die Reinigung wurde mit Hilfe von Ni²⁺ NTA-Agarose unter nativen Bedingungen in Phosphatpuffer (50mM NaCl, 50mM KH₂PO₄, 10mM Imidazol, pH 7.5) nach Herstelleranweisung (QIAGEN) durchgeführt. Die Homogenität der Proteinpräparationen wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Analyse verifiziert. Dazu wurden jeweils 200 ng Protein in 4%–12% nicht-reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen (Novex/Invitrogen) aufgetrennt. Die Bildung von Protein-Dimeren (oder -Multimeren) wurde durch Zugabe bzw. Weglassen von DTT (20mM) im Probenpuffer untersucht (siehe 1).The purified plasmids (Plasmid Purification Kit / QIAGEN) were transformed into E. coli BL21 (+) (Novagen) and amplified [20]. The individual proteins were purified via a His ₆ affinity epitope (encoded in the sequence of pET24a (+)) at their C-termini. The cleaning was carried out using Ni ²⁺ NTA agarose under native conditions in phosphate buffer (50mM NaCl, 50mM KH ₂ PO ₄ , 10mM imidazole, pH 7.5) according to the manufacturer's instructions (QIAGEN). The homogeneity of the protein preparations was verified using SDS polyacrylamide gel electrophoresis and Western analysis. For this purpose, 200 ng protein were separated in 4% -12% non-reducing SDS-polyacrylamide gels (Novex / Invitrogen). The formation of protein dimers (or multimers) was examined by adding or omitting DTT (20mM) in the sample buffer (see 1 ).

Aus 1 ist ersichtlich, dass die N-terminal verkürzte Erv1p ausschließlich als Monomer, das Wildtypprotein jedoch als eine Mischung aus Monomeren und Dimeren vorliegt. Dies zeigt, dass die N-terminale Domäne für die Bildung von Dimeren entscheidend ist. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen findet man mit Ausnahme von C133S keine Monomere. Die mutierten Proteine C30S, C33S und in geringerem Maße C130S liegen vornehmlich als Dimere vor, d.h. zumindest die beiden Cysteinreste an Position 30 bzw. 33 sind an der Dimerbildung beteiligt. Das Vorliegen hochmolekularer Proteinmultimere bei den Varianten C133S, C159S und C176S deutet hingegen eine unspezifische Aggregation dieser Proteine an.Out 1 it can be seen that the N-terminally shortened Erv1p exists exclusively as a monomer, but the wild type protein is present as a mixture of monomers and dimers. This shows that the N-terminal domain is crucial for the formation of dimers. With the exception of C133S, no monomers are found under non-reducing conditions. The mutated proteins C30S, C33S and to a lesser extent C130S are primarily present as dimers, ie at least the two cysteine residues at positions 30 and 33 are involved in the formation of the dimer. The presence of high molecular weight protein multimers in the variants C133S, C159S and C176S, however, indicates an unspecific aggregation of these proteins.

Beispiel 2Example 2

Analyse der in vitro-Enzymaktivität von Erv1p-VariantenAnalysis of the in vitro enzyme activity of Erv1p variants

Zur Aktivitätsbestimmung wurden die Konzentrationen der einzelnen Proteine auf 10 pmol proteingebundenes FAD pro 100 μl Reaktionsansatz eingestellt.The concentrations were used to determine the activity of the individual proteins to 10 pmol protein-bound FAD per 100 μl reaction mixture set.

Die Enzymreaktion wurde in PBS (68mM NaCl, 75mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.5, der 3mM EDTA enthält) mit DTT als Substrat (entsprechend 50 nmol reduzierter Thiolgruppen) durchgeführt. Für jede Messung wurde ein 100 μl Aliquot dieser Reaktionsmischung entnommen. Zur Bestimmung des Thiolgehalts wurden die Aliquots mit 800 μl PBS und 100 μl DTNB-Lösung (5,5'-Dithio-bis-2-nitrobenzoesäure, Ellman's Reagens; Endkonzentration 10mM) versetzt. Nach 2 min Inkubation wurde die Extinktion bei 412 nm gemessen und der Thiolgehalt berechnet (molarer Extinktionskoeffizient 14mM^–1 cm^–1 [21]). Der Thiolgehalt in der Ausgangsmischung wurde in einer Probe ohne Enzymzugabe ermittelt. Der Substratumsatz wurde pro proteingebundenes FAD-Molekül angegeben. Die in 2 dargestellten Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.The enzyme reaction was carried out in PBS (68mM NaCl, 75mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, which contains 3mM EDTA) with DTT as substrate (corresponding to 50 nmol reduced thiol groups). A 100 μl aliquot of this reaction mixture was removed for each measurement. To determine the thiol content, 800 μl PBS and 100 μl DTNB solution (5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, Ellman's reagent; final concentration 10 mM) were added to the aliquots. After 2 min incubation, the absorbance was measured at 412 nm and the thiol content was calculated (molar extinction coefficient 14mM ^-1 cm ^-1 [21]). The thiol content in the starting mixture was determined in a sample without enzyme addition. The substrate turnover was given per protein-bound FAD molecule. In the 2 The results presented represent the mean values ± standard deviation from three independent experiments.

Die mutierten Proteine zeigen unter in vitro Bedingungen keine (C130S, C133S) oder nur eine stark verminderte (C30S, C33S, C159S, C176S) Enzymaktivität, sodass alle sechs getesteten Cysteinreste für die volle Aktivität der Erv1p-Sulfhydryloxidase wichtig zu sein scheinen. Die Aktivität der N-terminal verkürzten Erv1p ist erstaunlicherweise mit der des Wildtypproteins vergleichbar. Eine weitere Studie [19] hat jedoch gezeigt, dass das verkürzte Protein den Wildtyp in vivo nicht ersetzen kann.The mutated proteins show below in vitro conditions none (C130S, C133S) or only a greatly reduced one (C30S, C33S, C159S, C176S) enzyme activity, so all six tested Cysteine residues for the full activity the Erv1p sulfhydryl oxidase seem to be important. The activity of the N-terminal shortened Erv1p is surprisingly comparable to that of wild type protein. Another study [19], however, showed that the truncated protein cannot replace the wild type in vivo.

Beispiel 3Example 3

Spektroskopische Analyse von Erv1p-VariantenSpectroscopic analysis of Erv1p variants

Der Austausch von Cystein- gegen Serinreste hatte in einigen Fällen auch eine Veränderung der Proteinfärbung zur Folge (siehe 3). Während das Wildtypprotein und die N-terminal verkürzte Erv1p aufgrund des gebundenen FAD intensiv gelb erscheinen, führt eine Mutation an Position 30 zu einer Schwarzfärbung des Proteins, eine Mutation an Position 130 hingegen zu einer Orangefärbung. Erv1p(C159S) erscheint farblos, und die anderen drei Varianten (C33S, C133C und C176S) sind ähnlich dem Wildtyp gelb gefärbt.The exchange of cysteine residues for serine residues also resulted in a change in protein staining in some cases (see 3 ). While the wild type protein and the N-terminally shortened Erv1p appear intensely yellow due to the bound FAD, a mutation at position 30 leads to a black coloration of the protein, a mutation at position 130, however, to an orange coloration. Erv1p (C159S) appears colorless, and the other three variants (C33S, C133C and C176S) are colored yellow, similar to the wild type.

Alle Farben verschwinden nach Reduktion der Proteine mit Dithionit. Nach Reoxidation in der Luft verfärben sich die Proteinlösungen gelb. Auch bei längerer Lagerung (über mehrere Tage) verändern sich die Farben der mutierten Proteine hin zum Gelb des Wildtyps, vermutlich ebenfalls durch Oxidation mit Luftsauerstoff. Im Stand der Technik gelang es nach einer derartigen Verfärbung nicht, die ursprüngliche Farbe eines mutierten Proteins wiederherzustellen.All colors disappear after reduction of the proteins with dithionite. Discolor after reoxidation in the air the protein solutions yellow. Even with longer ones Storage (over several days) change the colors of the mutated proteins change to the yellow of the wild type, probably also by oxidation with atmospheric oxygen. In the state After such discoloration, the technology failed, the original To restore the color of a mutant protein.

Die Farbveränderungen der beiden Erv1p-Varianten C30S und C130S wurden in einem Zeiss S10 Dioden-Array Photometer im Detail untersucht. Es wurden Spektren in einem Wellenlängebereich von 320 nm bis 700 nm aufgenommen (vgl. 4). Die verwendeten Proteinlösungen hatten die folgenden Konzentrationen: 2.2 mq/ml (WT-Erv1p), 5.1 mg/ml (C30S) und 4.2 mg/ml (C130S). Da der FAD-Gehalt der Proben unterschiedlich ist, und auch die molaren Absorptionskoeffizienten für die mutierten Proteine variieren können, werden die Spektren nur qualitativ bewertet. Auffällig sind bei der C30S-Variante ein zusätzliches Absorptionsmaximum bei 580 nm sowie eine Verbreiterung der Absorption bei 460 nm (entspricht FAD) bei der C130S-Variante. Die Spektren aller anderen mutierten Proteine entsprechen dem Wildtypprotein (nicht gezeigt).The color changes of the two Erv1p variants C30S and C130S were examined in detail in a Zeiss S10 diode array photometer. Spectra were recorded in a wavelength range from 320 nm to 700 nm (cf. 4 ). The protein solutions used had the following concentrations: 2.2 mq / ml (WT-Erv1p), 5.1 mg / ml (C30S) and 4.2 mg / ml (C130S). Since the FAD content of the samples is different and the molar absorption coefficients for the mutated proteins can also vary, the spectra are only evaluated qualitatively. What is striking in the C30S variant is an additional absorption maximum at 580 nm and a broadening of the absorption at 460 nm (corresponds to FAD) in the C130S variant. The spectra of all other mutant proteins correspond to the wild type protein (not shown).

Referenzen:Credentials:

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SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENCE LISTING

Claims

Recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidase, in the at least one cysteine residue of the amino acid sequence has been mutated in such a way that the absorption maximum is changed compared to the wild type protein.

Sulfhydryl oxidase according to claim 1, which is from the family the Erv / Alr sulfhydryl oxidases is selected.

Sulfhydryl oxidase according to claim 1 or 2, wherein a redox-active cysteine residue was replaced.

Sulfhydryl oxidase according to any one of claims 1-3, wherein is the sulfhydryl oxidase Erv1p from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID No. 1).

The sulfhydryl oxidase according to claim 4, wherein the cysteine residue at position 30 (SEQ ID No. 2) or at position 130 (SEQ ID No. 3) was replaced by a serine residue.

Sulfhydryl oxidase according to any one of claims 1-3, wherein is the sulfhydryl oxidase Erv1 from Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 4).

Sulfhydryl oxidase according to any one of claims 1-6, which a protein or peptide affinity epitope has at their N and / or C terminus.

Nucleic acid molecule, the one Sulfhydryl oxidase according to one of claims 1–7 coded.

Nucleic acid molecule according to claim 8, the nucleic acid molecule being operative is linked to a regulatory sequence to express of the nucleic acid molecule.

Nucleic acid molecule according to claim 9, wherein the regulatory sequence is a promoter sequence and a Includes transcription termination sequence.

Nucleic acid molecule according to one of claims 8-10, that is contained in a vector.

Host cell containing a nucleic acid molecule according to any one of claims 8-11.

Process for the preparation of a sulfhydryl oxidase according to one of claims 1-7, the includes: (a) Cloning a nucleic acid molecule that is a sulfhydryl oxidase encoded into an appropriate vector, and (b) Introducing the recombinant vector obtained in (a) into a suitable host cell or a suitable cell extract.

Composition containing at least one sulfhydryl oxidase according to one of claims Contains 1-7.

Use of a sulfhydryl oxidase according to one of claims 1-7 as adjustable biocatalyst for the synthesis of disulfide bonds and their transmission on substrates.

Use of a sulfhydryl oxidase according to any one of claims 1-7 as a sensor / indicator for redox reactions.

Use of a sulfhydryl oxidase according to one of claims 1-7 as redox-regulated pigment.

Use of a sulfhydryl oxidase according to one of claims 1-7 as acceptor in resonance energy transfer applications.