DE10260891A1 - Screening procedure for the identification of effective substances against halitosis, gingivitis or periodontitis - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren zur Identifikation wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis, Test-Kits zum Auffinden wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis, die Verwendung von Methionin-Gamma-Lyasen (METase) zum Auffinden wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis sowie ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis.The present invention relates to a screening method for identifying active substances against halitosis, gingivitis or periodontitis, test kits for finding active substances against halitosis, gingivitis or periodontitis, the use of methionine gamma-lyases (METase) for finding active substances against halitosis , Gingivitis or periodontitis; furthermore a test method for proving the effectiveness of substances against halitosis, gingivitis or periodontitis and a method for producing a pharmaceutical preparation for halitosis, gingivitis or periodontitis.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren zur Identifikation wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis, Test-Kits zum Auffinden wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis, die Verwendung von Methionin-Gamma-Lyasen (METase) zum Auffinden wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis sowie ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis.The present invention relates to a screening process to identify active substances against halitosis, gingivitis or periodontitis, test kits to find effective substances against halitosis, gingivitis or periodontitis, the use of methionine gamma lyases (METase) for detection effective substances against halitosis, gingivitis or periodontitis; also a test procedure to prove the effectiveness of substances against halitosis, gingivitis or periodontitis as well as a procedure for the production of a pharmaceutical preparation against halitosis, Gingivitis or periodontitis.
Mundgeruch, auch Halitosis oder „Foetor ex ore" genannt, kann verschiedene Ursachen haben. Bei gesunden Menschen wird Mundgeruch jedoch in den meisten Fällen durch Bakterien im Mund- bzw. Rachenraum hervorgerufen, die Körperzellen oder Nahrungsreste verstoffwechseln, wobei als Abbauprodukte von Proteinen u. a. flüchtige Schwrefelverbindungen ("volatile sulfur compounds", VSC) entstehen, die für den üblen Geruch verantwortlich gemacht werden.Bad breath, also halitosis or "Foetor called ex ore " can have different causes. In healthy people bad breath however in most cases caused by bacteria in the mouth or throat, the body cells or metabolize food residues, being used as breakdown products of proteins u. a. volatile Sulfur compounds ("volatile sulfur compounds ", VSC) arise for the bad Smell to be held responsible.
Diese Schwefelverbindungen sind imsbesondere: H2S = Schwefelwasserstoff (zu etwa 30%), CH3-S-H = Methylmercaptan (zu etwa 60 %) und CH3-S-CH3 = Dimethylsulfid (zu etwa 10 %).These sulfur compounds are in particular: H 2 S = hydrogen sulfide (about 30%), CH 3 -SH = methyl mercaptan (about 60%) and CH 3 -S-CH 3 = dimethyl sulfide (about 10%).
Die flüchtigen Schwefelverbindungen sind teilweise sehr aggressiv und können das Zahnfleisch und die Mundschleimhaut schädigen. So ist beispielsweise aus Ng W, Tonzetich J.; „Effect of hydrogen sulfide and methyl mercaptan on the permeability of oral mucosa"; J Dent Res. 1984 Jul;63(7):994-7; bekannt, daß Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan die Durchlässigkeit der Mund schleimhaut erhöhen und so Zahnfleischerkrankungen Vorschub leisten können.The volatile sulfur compounds are sometimes very aggressive and can damage the gums and the Damage to the oral mucosa. For example, Ng W, Tonzetich J .; "Effect of hydrogen sulfide and methyl mercaptan on the permeability of oral mucosa "; J Dent Res. 1984 July; 63 (7): 994-7; known to be hydrogen sulfide and methyl mercaptan the permeability the mouth increases mucous membrane and so can promote gum disease.
Zahnfleischerkrankungen stellen einen hohen Risikofaktor für die Gesundheit dar. Nach Untersuchungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) leiden über 50% der erwachsenen Bundesbürger an dringend behandlungsbedürftigen Parodontopathien.Gum disease is one high risk factor for represents health. According to studies by the World Health Organization (WHO) suffer over 50% of adult citizens to those in urgent need of treatment Periodontal disease.
Zahnfleischerkrankungen werden im Volksmund oft 'Parodontose' genannt. Dieser Ausdruck ist nicht korrekt, da die Endung "-ose" einen normalen, altersbedingten Rückgang eines Organs beschreibt. Richtig sind die Ausdrücke "Parodontitis" oder auch "entzündliche Parodontopathie".Gum disease is in the Popularly called 'periodontitis'. This Expression is not correct because the ending "-ose" one normal age-related decline describes an organ. The terms "periodontitis" or "inflammatory" are correct Periodontal disease ".
Sie ist neben der Karies die weit verbreiteste Erkrankung der Mundhöhle und tritt hauptsächlich bei Erwachsenen auf.In addition to caries, it is wide most common oral cavity disease and occurs mainly in adults on.
Unter Parodontitis versteht man eine durch Bakterien hervorgerufene entzündliche Veränderung des den Zahn umgebenden Gewebes, besonders des Kieferknochens. Eine Parodontitis (= mit Beteiligung der Zahnfleischtaschen und des Knochens) entwickelt sich immer aus einer Zahnfleischentzündung (Gingivitis) und befällt zuerst die der Reinigung am schlechtesten zugänglichen Zahnzwischenräume. Die sich in der Zahnfleischtasche befindlichen Bakterien wirken durch ihre Stoffwechselprodukte, insbesondere durch die von Ihnen produzierten VSC, destruktiv auf Zahnfleisch, Zahnsubstanz und Knochen ein und verstärken so ständig die bereits bestehende Parodontitis.Periodontitis is one Inflammatory change in the area around the tooth caused by bacteria Tissue, especially the jawbone. Periodontitis (= with Involvement of the gum pockets and bone) always comes from an inflammation of the gums (gingivitis) and affects first the interdental spaces that are most difficult to clean. The Bacteria in the gum pocket work through their metabolic products, especially those you produce VSC, destructive to gums, tooth structure and bones strengthen so constantly the existing periodontitis.
Dieses gesundheitliche Problem ist sehr weit verbreitet: Untersuchungen zeigen, daß etwa ab dem 35. Lebensjahr mehr Zähne durch Parodontopathien (Zahnfleischerkrankungen) als durch Karies verloren gehen.This is a health problem very widespread: Studies show that around the age of 35 more teeth from periodontal diseases (gum disease) than from caries get lost.
Yoshimura M, Nakano Y, Yamashita Y, Oho T, Saito T und Koga T. beschreiben in „Formation of methyl mercaptan from L-methionine by Porphyromonas gingivalis"; Infect Immun. 2000 Dec;68(12):6912-6; eine L-Methionine-alpha deamino-gamma-Mercaptomethan-Lyase (METase) aus P. gingivalis, die große Mengen Methylmercaptan produziert.Yoshimura M, Nakano Y, Yamashita Y, Oho T, Saito T and Koga T. describe in “Formation of methyl mercaptan from L-methionine by Porphyromonas gingivalis "; Infect Immun. 2000 Dec; 68 (12): 6912-6; an L-methionine-alpha deamino-gamma-mercaptomethane lyase (METase) from P. gingivalis, the great one Amounts of methyl mercaptan produced.
METase aus Bakterien der Mundhöhle wurde allerdings bislang nicht im Zusammenhang mit Halitosis beschrieben, wie der Publikation von Yoshimura M, Nakano Y und Koga T; „L-Methionine-gamma-lyase, as a target to inhibit malodorous bacterial growth by trifluoromethionine"; Biochem Biophys Res Commun. 2002 Apr 12;292(4):964-8; Seite 964, rechte Spalte, erster Absatz; zu entnehmen ist.METase from oral cavity bacteria was but not yet described in connection with halitosis, such as the publication by Yoshimura M, Nakano Y and Koga T; "L-Methionine-gamma-lyase, as a target to inhibit malodorous bacterial growth by trifluoromethionine "; Biochem Biophys Res Commun. 2002 Apr 12; 292 (4): 964-8; Page 964, right column, first paragraph; can be seen.
Die Diagnose des Mundgeruchs erfolgt üblicherweise durch Bakterienkulturen, Sulfidnachweismethoden und organoleptische Methoden (Riechen), oder durch Meßgeräte, wie das im Internet unter http://www.halithose.de/halimtr.htm (Stand 16.12.2002) beschriebene „Halimeter®".The diagnosis of bad breath is usually carried out using bacterial cultures, sulfide detection methods and organoleptic methods (smelling), or using measuring devices such as the "Halimeter ® " described on the Internet at http://www.halithose.de/halimtr.htm (as of December 16, 2002). ,
Bislang wurde meistens versucht, Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis durch bakterizide Wirkstoffe zu bekämpfen, die jedoch teilweise starke Nebenwirkungen haben. Ein anderer Ansatz sieht vor, die VSCs mithilfe von zinkhaltigen Verbindungen zu entfernen. Letzteres Verfahren hat allerdings allenfalls eine kurzfristige Abnahme der Geruchsbildung zur Folge und beugt Gingivitis oder Parodontitis nicht vor.So far, attempts have mostly been made Halitosis, gingivitis or periodontitis due to bactericidal agents fight, which, however, sometimes have strong side effects. Another approach intends to remove the VSCs using zinc-containing compounds. The latter procedure, however, only has a short-term acceptance the development of odors and prevents gingivitis or periodontitis not before.
Es besteht daher ein erheblicher Bedarf an der Bereitstellung neuer Wirkstoffe gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis.There is therefore a significant one Need to provide new agents against halitosis, gingivitis or periodontitis.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß Methionin-Gamma-Lyasen (METasen), insbesondere eine Methionin-Gamma-Lyase aus Treponema denticola, vorteilhaft eingesetzt werden können, um neue Wirkstoffe gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis aufzufinden.Surprisingly it was found that methionine gamma lyases (METases), in particular a methionine gamma lyase from Treponema denticola, can be used to advantage against new active ingredients Find halitosis, gingivitis or periodontitis.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Screening-Verfahren zur Identifikation wirksamer Substanzen gegen Halitosis; Gingivitis oder Parodontitis, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) eine für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure aus einem pro- oder eukaryotischen Organismus isoliert oder in vitro synthetisiert,
- b) die für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure kloniert und in geeigneten Wirtszellen exprimiert oder die Methionin-Gamma-Lyase in vitro synthetisiert,
- c) die Methionin-Gamma-Lyase exprimierenden Wirtszellen in voneinander räumlich getrennten Ansätzen in Gegenwart einer Schwefelquelle und eines geeigneten Nachweisagens für Reaktionsprodukte durch Methionin-Gamma-Lyase katalysierter Reaktionen kultiviert; oder die Methionin-Gamma-Lyase in voneinander räumlich getrennten Ansätzen in Gegenwart von Methionin, Cystein oder Glutathion in ein in vitro Testsystem einbringt,
- d) die Ansätze mit möglicherweise die Funktion der Methionin-Gamma-Lyase hemmenden Substanzen versetzt,
- e) für jeden der voneinander räumlich getrennten Ansätze die Bildung von Reaktionsprodukten durch Methionin-Gamma-Lyase katalysierter Reaktionen bestimmt und so
Vorteilhafterweise ermöglicht das erfindungsgemäße Screening-Verfahren, wenn es mit Methionin-Gamma-Lyase produzierenden bakteriellen Wirtszellen durchgeführt wird, Substanzen zu identifizieren, die die VSC-Bildung verhindern, ohne alle im Mundraum vorhandenen Mikroorganismen abzutöten. Man verwirft hierzu alle Substanzen, die zwar die Bildung von VSC inhibieren, gleichzeitig aber die bakterielle Wirtszelle abtöten.The present invention therefore relates to a screening method for identifying active substances against halitosis; Gingivitis or periodontitis, which is characterized in that one
- a) a nucleic acid coding for a methionine gamma lyase from a pro- or eukaryotic Or ganism isolated or synthesized in vitro,
- b) the nucleic acid coding for a methionine gamma lyase is cloned and expressed in suitable host cells or the methionine gamma lyase is synthesized in vitro,
- c) the host cells expressing methionine-gamma-lyase are cultivated in spatially separate batches in the presence of a sulfur source and a suitable detection agent for reaction products by reactions catalyzed by methionine-gamma-lyase; or the methionine gamma lyase is introduced into an in vitro test system in spatially separated batches in the presence of methionine, cysteine or glutathione,
- d) the approaches are mixed with substances that possibly inhibit the function of methionine gamma lyase,
- e) for each of the spatially separated approaches, the formation of reaction products determined by reactions catalyzed by methionine-gamma-lyase, and so on
Advantageously, the screening method according to the invention, when carried out with bacterial host cells producing methionine gamma-lyase, makes it possible to identify substances which prevent VSC formation without killing all microorganisms present in the oral cavity. For this purpose, all substances are discarded which inhibit the formation of VSC, but at the same time kill the bacterial host cell.
So können Nebenwirkungsfreie oder zumindest nebenwirkungsarme Wirkstoffe aufgefunden werden, die die natürliche und nützliche Keimbesiedelung der Mundhöhle nicht beschädigen.So side effects or at least active substances with little side effects are found, which the natural and useful Germination of the oral cavity do not damage.
Methionin-γ-Lyasen (METasen) gehören zu einer Enzymfamilie, die in Pro- und Eukaryonten (nicht jedoch in Säugern) vorkommen und die Umsetzung von Methionin zu Ammoniak, 2-Oxobutyrat und Methylmercaptan katalysieren. Als Cofaktor ist Pyridoxalphosphat notwendig, das an einer konservierten Region mit der Konsensussequenz [DQ]-[LIMVF]-X(3)-[STAGC]-[STAGCI]-T-K-[FYWQ]-[LIVMF]-X-G-[HQ]-[SGNH] bindet, wobei K als Pyridoxalphosphat-Bindestelle fungiert. Die METasen aus dem Protozoon Trichomonas vaginalis und den Bakterien Pseudomonas putida und Porphyromonas gingivalis wurden bereits beschrieben und charakterisiert. Für Fusobacterium nucleatum wurde durch die Annotation des Genoms das METase-Gen identifiziert.Methionine-γ-lyases (METases) belong to one Enzyme family found in pro- and eukaryotes (but not in mammals) and the conversion of methionine to ammonia, 2-oxobutyrate and methyl mercaptan catalyze. Pyridoxal phosphate is necessary as a cofactor on a conserved region with the consensus sequence [DQ] - [LIMVF] -X (3) - [STAGC] - [STAGCI] -T-K- [FYWQ] - [LIVMF] -X-G- [HQ] - [SGNH] binds, where K acts as a pyridoxal phosphate binding site. The METases from the protozoon Trichomonas vaginalis and the bacteria Pseudomonas putida and Porphyromonas gingivalis have already been described and characterized. For Fusobacterium nucleatum was created by annotating the genome METase gene identified.
Der Anmelderin ist es gelungen, die für das METase-Protein kodierende Sequenz des oralen Bakteriums Treponema denticola aufzuklären und damit erstmals zu zeigen, dass METasen auch in Spirochaeten vorkommen.The applicant has succeeded in for the Sequence of the oral bacterium Treponema encoding METase protein to clear up denticola and thus to show for the first time that METases also in spirochetes occurrence.
Die Basensequenz des mgl1-Gens aus
T. denticola ist zu 64,5% identisch mit der Sequenz aus P. gingivalis
und beinhaltet die Pyridoxal-Phosphat Binderegion, die allerdings
im Unterschied zu den anderen Mgl-Proteinen an Pos. 209 ein Leu
statt eines Val aufweist (CLUSTALW-Alignment):
Besonders interessant
ist in diesem Zusammenhang der Austausch von Glu zu Thr an Pos 320,
das auf eine zusätzliche
Phosphorylierungsstelle in dem Mgl-Protein aus T.denticola hinweisen könnte, die
möglicherweise als
Target für
einen spezifischen Hemmstoff dienen kann.The base sequence of the mgl1 gene from T. denticola is 64.5% identical to the sequence from P. gingivalis and contains the pyridoxal phosphate binding region, which, in contrast to the other Mgl proteins at position 209, is a Leu instead of one Val has (CLUSTALW alignment):
Of particular interest in this context is the exchange of Glu to Thr at position 320, which could indicate an additional phosphorylation site in the Mgl protein from T.denticola, which may possibly serve as a target for a specific inhibitor.
Im folgenden bedeutet ein Ausdruck der Form „mindestens X %" „X % bis 100 % (einschließlich der Eckwerte X und 100 und aller ganzzahligen und nicht ganzzahligen Prozentwerte dazwischen)".In the following means an expression the form “at least X% "" X% to 100% (including the basic parameters X and 100 and all integer and non-integer Percentages in between) ".
Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer zu verstehen. In der vorliegenden Anmeldung werden die 19 proteinogenen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet.Under a protein is in mind of the present application a composed of the natural amino acids, largely linear, mostly to perform its function to understand three-dimensional structure-adopting polymer. In the In the present application, the 19 proteinogenic, naturally occurring L-amino acids with the internationally used 1 and 3 letter codes.
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biochemische Funktion ausübt. Unter Methionin-Gamma-Lyasen sind Proteine zu verstehen, die die Umsetzung von Methionin zu Ammoniak, 2-Oxobutyrat und Methylmercaptan katalysieren.An enzyme is in the sense of present application to understand a protein that a certain has a biochemical function. Under methionine gamma lyases proteins are to be understood, which convert methionine to ammonia, Catalyze 2-oxobutyrate and methyl mercaptan.
Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so daß dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N-terminalen Aminosäuren ausübt.Numerous proteins are called pre-proteins, thus formed together with a signal peptide. Then underneath to understand the N-terminal part of the protein, its function mostly consists in the removal of the protein formed from the producing cell into the periplasm or the surrounding To ensure medium and / or its correct folding. Then will the signal peptide under natural Cleaved conditions from a signal peptidase from the rest of the protein, so this its actual catalytic activity without the existing ones N-terminal amino acids exercises.
Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen Peptide, das heißt die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt.For technical applications are due to their enzymatic activity Peptides, that is the enzymes processed after their production compared to the pre-proteins prefers.
Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet.Pro proteins are inactive precursors of proteins. Their predecessor with signal sequence are called pre-pro proteins designated.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für mole kularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.For the purposes of the present application, nucleic acids are understood to mean the molecules which are naturally built up from nucleotides and serve as information carriers and which are responsible for the linear amino acid sequence encode in proteins or enzymes. They can be present as a single strand, as a single strand complementary to this single strand or as a double strand. As the naturally more permanent information carrier, the nucleic acid DNA is preferred for molecular biological work. In contrast, an RNA is formed for the implementation of the invention in a natural environment, such as, for example, in an expressing cell, which is why RNA molecules essential to the invention also represent embodiments of the present invention.
Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann (Degeneriertheit des genetischen Codes). Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden und angegebene Nukleotidsequenzen sind jeweils nur als eine beispielhafte Codierung für eine bestimmte Aminosäurefolge anzusehen.In DNA, the sequences are both complementary strands in all three possible To take into account reading frames. It must also be taken into account that different Codon triplets for the same amino acids can code, so that one certain amino acid sequence of several different and possibly only minor identities Nucleotide sequences can be derived (degeneracy of the genetic Codes). Moreover different organisms show differences in the use of these codons on. For these reasons have to both amino acid sequences as well as nucleotide sequences when considering the protection area are included and the specified nucleotide sequences are in each case only as an exemplary coding for a particular amino acid sequence to watch.
Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet.The unit of information corresponding to a protein is also referred to as a gene in the sense of the present application.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Herstellung rekombinanter Proteine. Hierunter sind erfindungsgemäß alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, daß die Gene für die interessierenden Proteine in einen für die Produktion geeigneten Wirtsorganismus eingebracht und von diesem transkribiert und translatiert werden. Geeigneterweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren; aber auch über solche, die bewirken, daß das interessierende Gen im Wirtsorganismus in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren gegentischen Elementen wird erfindungsgemäß als Expressionskassette be zeichnet. Sie muß dafür jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.The method according to the invention comprises the production recombinant proteins. According to the invention, these include all genetic engineering or to understand microbiological processes based on that the Genes for the proteins of interest into a suitable one for production Host organism introduced and transcribed and translated by this become. The relevant ones are suitably introduced Genes over Vectors, especially expression vectors; but also about those that cause the gene of interest in the host organism into an existing one genetic element such as the chromosome or other vectors can be inserted can. The functional unit consisting of gene and promoter and any Further counter-elements are used according to the invention as an expression cassette designated. However, you must not necessarily as a physical unit.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus dem „Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1, S. 267-271 und Band 2, S. 227-229, bekannt.To a professional it is about nowadays generally known methods, such as chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in connection with molecular biological and / or protein-chemical standard methods possible, based on known DNA and / or amino acid sequences the corresponding nucleic acids to complete To produce genes. Such methods are, for example, from the "Lexicon biochemistry ", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Volume 1, pp. 267-271 and Volume 2, pp. 227-229.
Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert (shuffling) werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions- Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions- substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen.amendments the nucleotide sequence, as known, for example, from molecular biological methods can be brought about referred to as mutations. Depending on the type of change, one knows, for example Deletion, insertion or substitution mutations or such, in which different genes or parts of genes fused together (shuffling); these are gene mutations. The associated organisms are called mutants. Those derived from mutant nucleic acids Proteins are called variants. For example, deletion, Insertion, substitution mutations or fusions to deletion, insertion-substituted mutation or fusion genes and at the protein level corresponding deletion, insertion or substitution variants, or fusion proteins.
Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines Substrats. Fragmente und Deletionsva rianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.Fragments are all proteins or understood peptides that are smaller than natural proteins or those that are complete correspond to translated genes, and for example also synthetically can be obtained. Because of their amino acid sequences can the relevant complete Proteins are assigned. For example, they can be the same Accept structures or perform proteolytic activities or partial activities, such as for example the complexation of a substrate. Fragments and deletion variants of starting proteins are basically the same; during fragments rather smaller fragments represent, the deletion mutants tend to lack only short areas, and thus only individual sub-functions.
Den Fragmenten entsprechen auf Nukleinsäure-Ebene die Teilsequenzen.The fragments correspond at the nucleic acid level the partial sequences.
Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling oder Fusionsmutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Fusion kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten Proteinteils eine bestimmte enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf welche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können. Zur Realisierung der letztgenannten Alternative ist es beispielsweise möglich, posttranslational oder erst nach einem Aufreinigungsschritt durch eine gezielte proteolytische Spaltung eine einzelne chimäre Polypeptidkette in mehrere zu zerlegen.Among chimeric or hybrid proteins in the sense of the present application, such proteins are to be understood which are composed of elements that are naturally different Polypeptide chains from the same organism or from different Organisms originate. This procedure is also called shuffling or fusion mutagenesis called. The purpose of such a merger can be, for example, with the help of the fused protein part a certain enzymatic Function or to modify. It is within the meaning of the present invention irrelevant whether such a chimeric protein from a single polypeptide chain or multiple subunits exists on which different functions can be distributed. to Realization of the latter alternative is possible, for example, post-translational or only after a purification step by a targeted proteolytic Cleavage a single chimeric Breaking down the polypeptide chain into several.
Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteinen sind solche Varianten zu verstehen, die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen.Proteins obtained by insertion mutation are to be understood as those variants which are known per se by inserting a nucleic acid or protein fragment into the Aus have been obtained. Because of their principle similarity, they can be assigned to the chimeric proteins. They differ from those only in the size ratio of the unchanged protein part to the size of the entire protein. The proportion of foreign protein in such insertion-mutated proteins is lower than in chimeric proteins.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.Inversion mutagenesis, i.e. a partial one Reverse sequence, can be a special form of deletion, as well of the insertion. The same goes for one of the original ones amino acid sequence different regrouping of different molecular parts. It can be used both as Deletion variant, as an insertion variant, as well as a shuffling variant of the original Proteins are viewed.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierfür können molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Sie können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifizierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blokkierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen.Derivatives are defined in the sense of present application understood such proteins, their pure amino acid chain has been chemically modified. Such derivatizations can, for example biologically in connection with protein biosynthesis by the Host organism. Therefor can molecular biological methods are used. But you can also carried out chemically through the chemical conversion of a side chain of a amino acid or by covalently linking another compound to the protein. Such a connection can also be others, for example Proteins act, for example, via bifunctional chemical Compounds bound to proteins of the invention become. Such modifications can, for example, the substrate specificity or binding strength affect the substrate or temporarily block the enzymatic activity bring, if the coupled substance is an inhibitor. For example, for the period of storage may be useful. Likewise is under derivatization understand the covalent bond to a macromolecular support.
Proteine können auch über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefaßt werden. Die Angehörigen einer Gruppe zeichnen sich dadurch aus, daß sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen.Proteins can also react via a Antiserum or a specific antibody to groups immunologically related proteins can be summarized. The relatives of a Groups are characterized by the fact that they are recognized by an antibody have antigenic determinants.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.In the sense of the present invention all enzymes, proteins, fragments and derivatives, provided they do not need to be explicitly addressed as such under summarized the generic term proteins.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfüllten, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.Under vectors in the sense of present invention understood elements consisting of nucleic acids, which as the characteristic nucleic acid region contain a gene of interest. You can do this in one species or a cell line across more generations or cell divisions than from the rest of the genome independently to establish a replicating, stable genetic element. vectors are special plasmids, especially when used in bacteria, circular genetic elements. A distinction is made in genetic engineering on the one hand between such vectors, the storage and thus so to speak also serve genetic engineering work, the so-called cloning vectors, and on the other hand, those who fulfilled the function, the thing of interest Realize gene in the host cell, that is, the expression of the subject To enable proteins. These vectors are called expression vectors.
Durch Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, läßt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen.By comparison with known enzymes, which are stored, for example, in generally accessible databases are, can from the amino acid or nucleotide sequence the enzymatic activity of a particular enzyme conclude. This can be caused by other areas of the protein that are not are involved in the actual reaction, qualitatively or quantitatively be modified. this could for example enzyme stability, the activity, the reaction conditions or the substrate specificity.
Solch ein Vergleich geschieht dadurch, daß ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der betrachteten Proteine einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Codon-Usage. Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435-1441 beschrieben.Such a comparison happens because that similar Sequences in the nucleotide or amino acid sequences the proteins under consideration are assigned to one another. This calls one homologation. A tabular assignment of the concerned Positions are called alignment. When analyzing nucleotide sequences are both complementary strands and all three possible To consider reading frames; likewise the degeneracy of the genetic code and the organism-specific one Codon usage. Alignments are now created using computer programs, such as through the algorithms FASTA or BLAST; this The procedure is described, for example, by D. J. Lipman and W. R. Pearson (1985) in Science, volume 227, pp. 1435-1441.
Eine Zusammenstellung aller in den werglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.A compilation of all in the matching sequences Positions is called the consensus sequence.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben Positionen widergegeben. Ein weiter gefaßter Homologiebegriff bezieht die konservierten Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.Such a comparison also allows a statement about the similarity or homology of the compared sequences to one another. This will in percent identity, this means the proportion of identical nucleotides or amino acid residues reproduced in the same positions. A broader concept of homology relates the conserved amino acid exchanges in this value. The percent similarity is then mentioned. Such Statements can be made about whole Proteins or genes or just about individual areas are hit.
Die Erstellung eines Alignments ist der erste Schritt zur Definition eines Sequenzraums. Dieser hypothetische Raum umfaßt sämtliche durch Permutation in Einzelpositionen abzuleitenden Sequenzen, die sich unter Berücksichtigung aller in den betreffenden Einzelpositionen des Alignments auftretenden Variationen ergeben. Jedes hypothetisch mögliche Proteinmolekül bildet einen Punkt in diesem Sequenzraum. Beispielsweise begründen zwei Aminosäuresequenzen, die bei weitgehender Identität an lediglich zwei verschiedenen Stellen jeweils zwei verschiedene Aminosäuren aufweisen, somit einen Sequenzraum von vier verschiedenen Aminosäuresequenzen. Ein sehr großer Sequenzraum wird erhalten, wenn zu einzelnen Sequenzen eines Raums jeweils weitere homologe Sequenzen gefunden werden. Über solche, jeweils paarweise bestehenden hohen Homologien können auch sehr niedrig homologe Sequenzen als einem Sequenzraum zugehörig erkannt werden.The creation of an alignment is the first step in defining a sequence space. This hypothetical space encompasses all sequences to be derived by permutation in individual positions, which result taking into account all variations occurring in the relevant individual positions of the alignment. Every hypothetically possible protein molecule forms a point in this sequence space. For example, there are two amino acid sequences which, if largely identical, are based on only two different ones Sites each have two different amino acids, thus a sequence space of four different amino acid sequences. A very large sequence space is obtained if additional homologous sequences are found for individual sequences in a space. Such high homologies, which exist in pairs, can also be used to recognize very low homologous sequences as belonging to a sequence space.
Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind solche mit gleichen Funktionen, die sich durch Übereinstimmungen in der primären Aminosäuresequenz erkennen lassen. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.Homologous areas of different Proteins are those with the same functions, which are characterized by matches in the primary amino acid sequence reveal. It goes down to complete identities in the smallest Areas, so-called boxes, which contain only a few amino acids and mostly for the total activity perform essential functions. The smallest sub-functions are among the functions of the homologous areas that of all protein Understand function, such as the formation of individual hydrogen bonds for complexing a substrate or transition complex.
In Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Nukleinsäure geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Die molekularbiologische Dimension der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen für die entsprechenden Proteine. Dazu können beispielsweise solche gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren, sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.In step b) of the method according to the invention becomes the nucleic acid suitably cloned into a vector. The molecular biological Dimension of the invention thus consists in vectors with the genes for the corresponding Proteins. You can do this such as include which differ from bacterial plasmids, from viruses or from bacteriophages deduce, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of the most varied Origin. With the other existing genetic elements fortune vectors, in the host cells concerned over several generations to establish as stable units. It is in the spirit of the invention irrelevant whether they establish themselves as separate units extrachomosomally or integrate into a chromosome. Which of the numerous from the State-of-the-art systems selected depend on the individual case. decisive can for example, the number of copies that can be achieved Selection systems, including above all antibiotic resistance, or the cultivability of the host cells capable of receiving the vectors his.
Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins und für erfindungsgemäße Weiterentwicklungen und letztlich für die Amplifikation und Produktion erfindungsgemäßer Proteine. Sie stellen insofern Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, als die Sequenzen der enthaltenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche jeweils innerhalb der oben näher bezeichneten Homologiebereiche liegen.The vectors form suitable starting points for molecular biological and biochemical studies of the gene or protein in question and for Further developments according to the invention and ultimately for the amplification and production of proteins according to the invention. In this respect, they pose embodiments of the present invention as the sequences of the contained nucleic acid regions according to the invention each within the above closer designated homology ranges.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Klonierungsvektoren. Diese eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa über das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausfüh rungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagertähige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte für molekularbiologiche Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion.Preferred embodiments of the present Invention are cloning vectors. These are suitable in addition to the Storage, biological amplification or selection of the interesting gene for the characterization of the gene in question, for example via the Create a restriction map or sequencing. cloning vectors are therefore also preferred embodiments of the present Invention because it is a transportable and storable form represent the claimed DNA. They are also preferred starting points for molecular biology Techniques that are not bound to cells, such as the polymerase chain reaction.
Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ähnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Proteinen optimierten Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflußt, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus.Expression vectors are chemical similar to the cloning vectors, but differ in the partial sequences that enable them to the for replicate the production of protein-optimized host organisms and to express the contained gene there. preferred Embodiments are Expression vectors, which themselves are the genetic necessary for expression Wear items. Expression is used, for example, by promoters affected which regulate the transcription of the gene. So expression through the natural, originally promoter localized in front of this gene, but also after genetic engineering Fusion both by one provided on the expression vector Promoter of the host cell as well as by a modified or one completely another promoter of another organism.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche Expressionsvektoren, die über Änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind. Expressionsvektoren ermöglichen, daß das zugehörige Protein heterolog, also in einem anderen Organismus als dem, aus dem es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Auch eine homologe Proteingewinnung aus einem das Gen natürlicherweise exprimierenden Wirtsorganismus über einen passenden Vektor liegt innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Diese kann den Vorteil aufweisen, daß natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationsreaktionen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.Preferred embodiments are such expression vectors the about changes the culture conditions or addition of certain compounds, such as for example, the cell density or special factors, adjustable are. Allow expression vectors that this associated Protein heterologous, i.e. in an organism other than that which it is natural can be won, is produced. Also a homologous protein extraction from one the gene naturally expressing host organism via a matching vector is within the scope of the present Invention. This can have the advantage of being natural, with translation related modification reactions to the resulting Protein done the same way as they are naturally would expire.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.Embodiments of the Present Invention can can also be cell-free expression systems in which protein biosynthesis is reproduced in vitro. Such expression systems are in State of the art also established.
Die In-vivo-Synthese eines erfindungsgemäßen Enzyms, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden.The in vivo synthesis of an enzyme according to the invention, that is to say by living cells, requires the transfer of the associated gene into a host cell, the so-called transformation. In principle, all organisms are suitable as host cells, that is to say prokaryotes, eukaryotes or cyanophyta. Preferred are host cells that are genetically easy to handle, for example as regards transformation with the expression vector and its stable establishment, for example unicellular fungi or bacteria. In addition, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling out. This applies, for example, to easy cultivation, high growth rates, low demands on fermentation media and good production and secretion rates for foreign proteins. Often the optimal expression systems for the individual case must be determined experimentally from the abundance of different systems available according to the prior art. In this way, each protein according to the invention can be obtained from a large number of host organisms.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine.Preferred embodiments are such Host cells represent that due to genetic regulatory elements that provided for example on the expression vector will be present in these cells from the start can, in their activity are adjustable. For example, through the controlled addition of chemical compounds that serve as activators by change the cultivation conditions or when a certain one is reached Cell density can these are stimulated for expression. This enables a very economical one Production of the proteins of interest.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegenüber Eukaryonten in der Regel durch kürzere Generationszeiten und geringere Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Proteine etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales, besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so daß sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells. Bacteria are distinguished from eukaryotes usually by shorter ones Generation times and lower demands on the cultivation conditions out. This allows inexpensive Methods for obtaining proteins according to the invention are established. Gram-negative bacteria such as E. coli a large number of proteins are secreted into the periplasmic space, that is, in the compartment between the two membranes enclosing the cells. This can be for special applications may be advantageous. Gram positive bacteria, such as Bacilli or Actinomyceten or other representatives the Actinomycetales, in contrast, have no outer membrane, so that secreted Proteins are immediately released into the nutrient medium surrounding the cells, from which emerges according to another preferred embodiment the expressed proteins of the invention let it clean up directly.
Eine Variante dieses Versuchsprinzips stellen Expressionssysteme dar, bei denen zusätzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beinflussen.A variant of this experimental principle represent expression systems in which additional genes, for example those that are provided on other vectors, production proteins of the invention influence. This can be modifying gene products act or those with the protein of the invention are to be cleaned up together, for example for its enzymatic Influence function. For example, it may be others Proteins or enzymes, inhibitors or such elements, that affect the interaction with different substrates.
Aufgrund der weitreichenden Erfahrungen, die man beispielsweise hinsichtlich der molekularbiologischen Methoden und der Kultivierbarkeit mit coliformen Bakterien hat, stellen diese bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Besonders bevorzugt sind solche der Gattungen Escherichia coli, insbesondere nichtpathogene, für die biotechnologische Produktion geeignete Stämme.Because of the extensive experience, for example with regard to molecular biological methods and which can be cultivated with coliform bacteria, these represent preferred embodiments of the present invention. Those are particularly preferred of the genera Escherichia coli, especially non-pathogenic, for the biotechnological Production of suitable strains.
Repräsentative Vertreter dieser Gattungen sind die K12-Derivate und die B-Stämme von Escherichia coli. Stämme, die sich nach an sich bekannten genetischen und/oder mikrobiologischen Methoden von diesen ableiten lassen, und somit als deren Derivate angesehen werden können, besitzen für genetische und mikrobiologische Arbeiten die größte Bedeutung und werden vorzugsweise zur Entwicklung erfindungsgemäßer Verfahren eingesetzt. Solche Derivate können beispielsweise über Deletions- oder Insertionsmutagenese hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbeosndere um solche Derivate handeln, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäß hergestelleten Protein weitere wirtschaftlich interessante Proteine exprimieren.Representative representatives of this Genera are the K12 derivatives and the B strains from Escherichia coli. strains which are based on known genetic and / or microbiological Let methods be derived from them, and thus as their derivatives can be viewed own for genetic and microbiological work of the greatest importance and are preferred for the development of methods according to the invention used. Such derivatives can for example about Deletion or insertion mutagenesis with regard to their requirements changed to the cultural conditions be other or additional Have selection markers or express other or additional proteins. In particular, these can be derivatives that are additional to the manufactured according to the invention Protein express other economically interesting proteins.
Auch solche Mikroorganismen sind bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie nach Transformation mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten worden sind. Dabei kann es sich beispielsweise um Klonierungsvektoren handeln, die zur Lagerung und/oder Modifikation in einen beliebigen Bakterienstamm eingebracht worden sind. Solche Schritte sind in der Lagerung und in der Weiterentwicklung betreffender genetischer Elemente allgemein verbreitet. Da aus diesen Mikroorganismen die betreffenden genetischen Elemente in zur Expression geeignete gram-negative Bakterien unmittelbar übertragen werden können, handelt es sich auch bei den vorangegenagenen Transformationsprodukten um Verwirklichungen des betreffenden Erfindungsgegenstands.Such microorganisms are also preferred, which are characterized in that after transformation with one of the vectors described above have been obtained. there can be, for example, cloning vectors that for storage and / or modification in any bacterial strain have been introduced. Such steps are in storage and in the further development of relevant genetic elements in general common. Because from these microorganisms the relevant genetic elements immediately transferred into gram-negative bacteria suitable for expression can be are also the predicted transformation products for realizations of the subject matter of the invention.
Auch eukaryontische Zellen können sich zur Produktion erfindungsgemäßer Proteine eignen. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Dazu gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccaride.Eukaryotic cells can also develop for the production of proteins according to the invention suitable. Examples of this are mushrooms like Actinomycetes or yeasts like Saccharomyces or Kluyveromyces. This can be particularly advantageous, for example, if the Proteins specific modifications related to their synthesis experience that enable such systems. These include, for example the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or Oligosaccharides.
Die Wirtszellen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den rekombinanten Bakterienstämmen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen telweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.The host cells of the method according to the invention are cultivated and fermented in a manner known per se, for example in discontinuous or continuous systems. In the first Case becomes a suitable nutrient medium inoculated with the recombinant bacterial strains and the product after an experimentally determined period from the medium harvested. Continuous fermentations are characterized by reaching a steady state from where about for a comparatively long period of time, cells die telly but also regrow and at the same time product is removed from the medium can be.
Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik wohlbekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar; gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode.Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step; followed by a suitable purification method.
Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgeführten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.All fermentation processes that on one of the above Processes for the production of the recombinant proteins are based correspondingly preferred embodiments this subject of the invention.
Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Proteine jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden.The manufacturing processes used, for the Host cells and / or the proteins to be produced are each optimal Conditions based on the previously optimized culture conditions of the concerned strains to the knowledge of the person skilled in the art, for example with regard to fermentation volume, Media composition, oxygen supply or stirrer speed can be determined experimentally.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden, die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Proteins erreicht werden.Fermentation process thereby are marked that the Fermentation over carried out an inflow strategy will also be considered. Here, the media components, that are consumed by ongoing cultivation, fed; you also speaks of a feeding strategy. hereby can considerable Increases in cell density as well as in dry biomass and / or especially the activity of the protein of interest.
Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, daß unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.Similarly, the fermentation also be designed so that unwanted metabolites filtered out or by adding buffer or suitable in each case Counterions are neutralized.
Das hergestellte Protein kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfodert jedoch die Zurverfügungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme.The protein produced can subsequently be made the fermentation medium are harvested. This fermentation process is opposite the product preparation from the dry matter preferred, required however the provision suitable secretion markers and transport systems.
Ohne Sekretion ist u.U. die Aufreinigung des Proteins aus der Zellmasse erforderlich, auch dazu sind verschiedene Verfahrer bekannt, wie Fällung z.B durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung, wenn erforderlich bis zur Homogenität. Die Mehrzahl der beschriebenen technischen Verfahren dürfte jeoch mit einer angereicherten, stabilisierten Präparation auskommen.Without secretion, the purification of the protein from the cell mass is required, and there are also several Traffickers known as precipitation e.g. by ammonium sulfate or ethanol, or the chromatographic Cleaning if necessary until homogeneous. The majority of those described technical process is likely however with an enriched, stabilized preparation get along.
Alle bereits oben ausgeführten Elemente können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muß für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.All the elements already mentioned above can can be combined into processes to produce proteins according to the invention. It is there for any protein of the invention a variety of possible combinations possible process steps. The best practice must be for everyone concrete individual case can be determined experimentally.
Vorzugsweise isoliert oder synthetisiert man in Schritt a) eine für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure, die ausgewählt ist unter METase-Genen aus dem Protozoon Trichomonas vaginalis und den Bakterien Treponema denticola, Pseudomonas putida, Clostridium sporogenes und Fusobacterium nucleatum, besonders bevorzugt Treponema denticola.Preferably isolated or synthesized one in step a) one for a nucleic acid encoding methionine gamma lyase which is selected among METase genes from the protozoon Trichomonas vaginalis and the bacteria Treponema denticola, Pseudomonas putida, Clostridium sporogenes and Fusobacterium nucleatum, particularly preferably Treponema denticola.
Eine METase aus Clostridium sporogenes ist beispielsweise beschrieben in der Publikation von Kreis W und Hession C; „Isolation and purification of L-methionine-alpha-deamino-gamma-mercaptomethane-lyase (L-methioninase) from Clostridium sporogenes"; Cancer Res. 1973 Aug;33(8):1862-5.A Clostridium sporogenes METase is described for example in the publication of Kreis W and Hession C; "Isolation and purification of L-methionine-alpha-deamino-gamma-mercaptomethane-lyase (L-methioninase) from Clostridium sporogenes "; Cancer Res. 1973 Aug; 33 (8): 1862-5.
Ebenfalls bevorzugt wird in Schritt a) eine für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure isoliert oder synthetisiert, deren Nukleotidsequenz mit der in Seq. 6 (METase-Gen aus Pseudomonas putida) angegebenen Nukleotidsequenz zu mindestens 50 %, zu mindestens 75 %, zu mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.It is also preferred in step a) one for isolated or synthesized a nucleic acid encoding methionine gamma lyase, whose nucleotide sequence with that in Seq. 6 (Pseudomonas METase gene putida) specified nucleotide sequence at least 50%, at least 75%, at least 80%, preferably at least 85%, in particular at least 90%, particularly preferably at least 95% and very particularly preferably 100% matches.
Ebenfalls bevorzugt wird in Schritt a) eine für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure isoliert oder synthetisiert, deren Nukleotidsequenz mit der in Seq. 5 (METase-Gen aus Fusobacterium nucleatum) angegebenen Nukleotidsequenz zu mindestens 50 %, zu mindestens 75 %, zu mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.It is also preferred in step a) one for isolated or synthesized a nucleic acid encoding methionine gamma lyase, whose nucleotide sequence with that in Seq. 5 (METase gene from Fusobacterium nucleatum) specified nucleotide sequence at least 50%, at least 75%, at least 80%, preferably at least 85%, in particular at least 90%, particularly preferably at least 95% and very particularly preferably 100% matches.
Besonders bevorzugt wird in Schritt a) eine für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure isoliert oder synthetisiert, deren Nukleotidsequenz mit der in Seq. 4 (METase-Gen aus Treponema denticola) angegebenen Nukleotidsequenz zu mindestens 50 %, zu mindestens 75 %, zu mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz: besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.In step is particularly preferred a) one for isolated or synthesized a nucleic acid encoding methionine gamma lyase, whose nucleotide sequence with that in Seq. 4 (Treponema METase gene denticola) specified nucleotide sequence at least 50%, at least 75%, at least 80%, preferably at least 85%, in particular at least 90%, particularly preferably at least 95% and entirely: particularly preferably 100% matches.
Ebenfalls bevorzugt wird in Schritt a) eine Nukleinsäure isoliert oder synthetisiert, die für eine Methionin-Gamma-Lyase codiert, deren Aminosäuresequenz mit einer der in Seq. 1 bis 3 angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist, oder deren Aminosäuresequenz einen Teil enthält, der mit einer der in Seq. 1 bis 3 angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist.It is also preferred in step a) a nucleic acid isolated or synthesized for a methionine gamma lyase encoded whose amino acid sequence with one of the in Seq. 1 to 3 specified amino acid sequences to at least 70%, preferably at least 80%, in particular at least 90%, particularly preferably at least 95% and very particularly preferably is 100% identical, or whose amino acid sequence contains a part which with one of the in Seq. 1 to 3 specified amino acid sequences to at least 70%, preferably at least 80%, in particular at least 90%, particularly preferably at least 95% and very particularly preferably is 100% identical.
Besonders bevorzugt wird in Schritt a) eine Nukleinsäure isoliert oder synthetisiert, die für eine Methionin-Gamma-Lyase codiert, deren Aminosäuresequenz mit einer der in Seq. 1 bis 3 angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist, oder deren Aminosäuresequenz einen Teil enthält, der mit einer der in Seq. 1 bis 3 angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist.In step a) it is particularly preferred to isolate or synthesize a nucleic acid which codes for a methionine gamma lyase, the amino acid sequence of which corresponds to one of those described in Seq. 1 to 3 specified amino acid sequences are at least 70%, preferably at least 80%, in particular at least 90%, particularly preferably at least 95% and very particularly preferably 100% identical, or the amino acid sequence of which contains a part which corresponds to one of those described in Seq. 1 to 3 specified amino acid sequences to at least 70%, preferably at least 80%, in particular at least 90%, particularly preferably at least 95% and very particularly preferably 100% identical.
Besonders bevorzugt wird in Schritt a) eine Nukleinsäure isoliert oder synthetisiert, die für eine Methionin-Gamma-Lyase codiert, deren Aminosäuresequenz einen Teil enthält, der mit der Konsensus-Sequenz [DQ]-[LIMVF]-X(3)-[STAGC]-[STAGCI]-T-K-[FYWQ]-[LIVMF]-X-G-[HQ]-[SGNH] (Seq. ID 7) zu mindestens 96 %, insbesondere zu mindestens 97 %, vorzugsweise zu mindestens 98 %, bevorzugt zu mindestens 99 %, besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist.In step is particularly preferred a) a nucleic acid isolated or synthesized for a methionine gamma lyase encoded whose amino acid sequence contains a part with the consensus sequence [DQ] - [LIMVF] -X (3) - [STAGC] - [STAGCI] -T-K- [FYWQ] - [LIVMF] -X-G- [HQ] - [SGNH] (Seq. ID 7) at least 96%, in particular at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99%, particularly is preferably 100% identical.
Vorzugsweise wird in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Methionin-Gamma-Lyase exprimiert oder eingesetzt, deren Aminosäuresequenz mit der in Seq. 3 (METase aus Pseudomonas putida) angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.Preferably in step c) inventive method expresses or uses a methionine gamma lyase whose amino acid sequence with the one in Seq. 3 (METase from Pseudomonas putida) given amino acid sequence at least 50%, preferably at least 70%, in particular at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferred 100% matches.
Ebenfalls bevorzugt wird in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Methionin-Gamma-Lyase exprimiert oder eingesetzt, deren Aminosäuresequenz mit der in Seq. 2 (METase aus Fusobacterium nucleatum) angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.It is also preferred in step c) the method according to the invention expresses or uses a methionine gamma lyase whose amino acid sequence with the one in Seq. 2 (METase from Fusobacterium nucleatum) amino acid sequence at least 50%, preferably at least 70%, in particular at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferred 100% matches.
Besonders bevorzugt wird in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Methionin-Gamma-Lyase exprimiert oder eingesetzt, deren Aminosäuresequenz mit der in Seq. 1 (METase aus Treponema denticola) angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.In step is particularly preferred c) the method according to the invention expresses or uses a methionine gamma lyase whose amino acid sequence with the one in Seq. 1 (METASE from Treponema denticola) given amino acid sequence at least 50%, preferably at least 70%, in particular at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferred 100% matches.
Erfindungsgemäß geeignete Wirtszellen für die Expression in Schritt b) sind Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, besonders bevorzugt E. coli.Host cells suitable for expression according to the invention in step b), microorganisms, in particular bacteria, are special preferably E. coli.
Erfindungsgemäß geeignete Nachweisagenzien für Reaktionsprodukte durch Methionin-Gamma-Lyase katalysierter Reaktionen sind beispielsweise Salze von Metallen, die mit Sulfidionen schwerlösliche Salze mit einem Löslichkeitsprodukt von < 10 – 20 bilden, vorzugsweise ein Schwermetallsalz, das mit Sulfidionen als schwer lösliche Verbindung ausfällt. Geeignet ist zum Beispiel Bleiacetat (bevorzugte Konzentration: etwa 4 mg/l weiteste Konzentration: etwa 0,1 bis etwa 10 mg/l). Möglich sind ausserdem Salze von Hg, Ni, Sb, Sn, Zn, Ag, Cu, Co, Cd, wobei neben Pb Ag und Cu bevorzugt sind. Da die Löslichkeit von Sulfidionen im Sauren besonders gering ist, ist ein leicht saures Medium bevorzugt (pH kleiner oder gleich 7). Als Schwefelquelle können neben Methionin auch andere schwefelhaltige Aminosäuren (insb. Cystein) und organische Schwefelverbindungen (Glutathion) dienen (bevorzugte Konzentration: etwa 500 mg/l weiteste Konzentration: etwa 50 bis etwa 1000 mg/l). Von den Zellen aufgrund der METase-Akfivität aus Methionin als Schwefelquelle gebildete Sulfide werden als Bleisuffid ausgefällt und führen zu einer Schwarzfärbung der Kolonie.Detection agents suitable according to the invention for reaction products Examples are reactions catalyzed by methionine gamma lyase Salts of metals, the salts which are sparingly soluble with sulfide ions with a solubility product form from <10 - 20, preferably a heavy metal salt that is heavy with sulfide ions soluble Connection fails. For example, lead acetate is suitable (preferred concentration: about 4 mg / l widest concentration: about 0.1 to about 10 mg / l). Possible are also salts of Hg, Ni, Sb, Sn, Zn, Ag, Cu, Co, Cd, where in addition to Pb, Ag and Cu are preferred. Since the solubility of sulfide ions in Acid is particularly low, a slightly acidic medium is preferred (pH less than or equal to 7). In addition to methionine, other sulfur sources can also be used sulfur-containing amino acids (esp. cysteine) and organic sulfur compounds (glutathione) serve (preferred concentration: about 500 mg / l widest concentration: about 50 to about 1000 mg / l). From the cells due to the METase activity from methionine Sulfides formed as a sulfur source are precipitated as lead sulfide and to lead to a black color the colony.
Die Bestimmung von Reaktionsprodukten
durch Methionin-Gamma-Lyase katalysierter Reaktionen kann durch
eines der obengenannten Nachweisagenzien erfolgen oder z. B. durch
Nachweis der bei folgender Reaktion gebildeten Produkte:
Die Enzymaktivität der METase wird beispielsweise indirekt über die Umsetzung von α-Ketobutyrat und NADH2 zu 2-Hydroxybutyrat und NAD+ im Photometer bei 340 nm (Absorptionsmaximum des NADH2) über die Abnahme der Extinktion gemessen.The enzyme activity of the METase is measured indirectly, for example, by converting α-ketobutyrate and NADH 2 to 2-hydroxybutyrate and NAD + in a photometer at 340 nm (absorption maximum of NADH 2 ) by reducing the absorbance.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren, die erfindungsgemäß isolierte oder synthetisierte Nukleinsäuren enthalten.Other objects of the present invention are cloning vectors and expression vectors isolated according to the invention or synthesized nucleic acids contain.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Auffinden wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis, das Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt.Another subject of the present Invention is a test kit for finding effective substances against Halitosis, gingivitis or periodontitis, the means of carrying out the inventive method includes.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung von Methionin-Gamma-Lyasen (METase)
zum Auffinden wirksamer Substanzen gegen Halitosis, Gingivitis oder
Parodcntitis;
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von Substanzen
gegen Halitosis Gingivitis oder Parodontitis, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
- a) eine für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure aus einem pro- oder eukaryotischen Organismus isoliert oder in vitro synthetisiert,
- b) die für eine Methionin-Gamma-Lyase codierende Nukleinsäure kloniert und in geeigneten Wirtszellen exprimiert oder die Methionin-Gamma-Lyase in vitro synthetisiert,
- c) die Methionin-Gamma-Lyase exprimierenden Wirtszellen in voneinander räumlich getrennten Ansätzen in Gegenwart einer Schwefelquelle und eines geeigneten Nachweisagens für Reaktionsprodukte durch Methionin- Gamma-Lyase katalysierter Reaktionen kultiviert oder; die Methionin-Gamma-Lyase in voneinander räumlich getrennten Ansätzen in Gegenwart von Methionin, Cystein oder Glutathion in ein in vitro Testsystem einbringt,
- d) die Ansätze mit möglicherweise die Funktion der Methionin-Gamma-Lyase hemmenden Substanzen versetzt,
- e) für jeden der voneinander räumlich getrennten Ansätze die Bildung von Reaktionsprodukten durch Methionin-Gamma-Lyase katalysierter Reaktionen bestimmt und so
Another object of the present invention is a test method for detecting the effectiveness of substances against halitosis gingivitis or periodontitis, which is characterized in that
- a) a nucleic acid coding for a methionine gamma lyase is isolated from a pro- or eukaryotic organism or synthesized in vitro,
- b) the nucleic acid coding for a methionine gamma lyase is cloned and expressed in suitable host cells or the methionine gamma lyase is synthesized in vitro,
- c) the host cells expressing methionine-gamma-lyase are cultivated in spatially separate batches in the presence of a sulfur source and a suitable detection agent for reaction products or reactions catalyzed by methionine-gamma-lyase; the methionine gamma lyase in spatially separated batches in the presence of methionine, cysteine or glutathione in an in vitro test system brings in,
- d) the approaches are mixed with substances that possibly inhibit the function of methionine gamma lyase,
- e) for each of the spatially separated approaches, the formation of reaction products determined by reactions catalyzed by methionine-gamma-lyase, and so on
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung gegen Halitosis, Gingivitis oder Parodontitis, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) wirksame Wirkstoffe (Hemmstoffe der METase) mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens, oder der erfindungsgemäßen Verwendung bestimmt und
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe (Hemmstoffe der METase) mit pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
- a) active substances (inhibitors of METase) are determined using the screening method according to the invention or the use according to the invention and
- b) active ingredients found to be effective (inhibitors of METase) mixed with pharmacologically suitable and compatible carriers.
Eine Enzympräparation des überexprimierten METase-Proteins kann verwendet werden, um in einer technischen Anwendung aus Methionin Methylmercaptan bzw aus Cystein Schwefelwasserstoff freizusetzen. Vorteile dieses Verfahrens liegen in der kontrollierten, schonenden Freistzung der agressiven, flüchtigen Produkte. Ein enzymatischer Prozess unter Verwendung von Methionin als Substrat kann zur strukturgebenden Behandlung von schwefelhaltigen Fasern, wie z.B. Haaren, Federn und Wolle dienen. Dabei wird die entstehende freie SH-Gruppe zur Öffnung der die Tertiärstruktur der Proteinfaser stabilisiernden Disulfidbrücken verwendet und kann z.B. als Ersatz für die Verwendungvon Thioglykolsäure dienen.An enzyme preparation of the overexpressed METase protein can be used to in a technical application from methionine methyl mercaptan or from cysteine hydrogen sulfide release. The advantages of this process are the controlled, gentle release of aggressive, volatile products. An enzymatic Process using methionine as a substrate can be used for structuring treatment of sulfur-containing fibers, e.g. Serve hair, feathers and wool. The resulting free SH group opens the tertiary structure the protein fiber stabilizing disulfide bridges and can e.g. as replacement for the use of thioglycolic acid serve.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung einer der obengenannten METasen, insbesondere einer METase, deren Aminosäuresequenz mit der in Seq. 1 (METase aus Treponema denticola) angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt, zur strukturgebenden Behandlung von schwefelhaltigen Fasern, wie z.B. Haaren, Federn und Wolle.Another subject of the present The invention is therefore the use of one of the above-mentioned METases, in particular a METase, the amino acid sequence of which in Seq. 1 (METASE from Treponema denticola) given amino acid sequence at least 50%, preferably at least 70%, in particular at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferred 100% matches for the structuring treatment of sulfur-containing fibers, such as e.g. Hair, feathers and wool.
Die der Freisetzung schwefelhaltiger Verbindungen zugrunde liegende ß-Eliminierungsreaktion erzeugt eine Doppelbindung, die in freien Aminosäuren durch nachfolgende Umlagerung zur Deaminierung führt, alternativ in gebundenen peptidischen Aminosäuren aber durch Wasseranlagerung zur Generierung einer Hydroxyaminosäure führt. Letzlich kann somit aus Cystein Serin und aus Methionin Threonin erzeugt werden. Somit kann ein METase-Protein zur Entschwefelung eines schwefelhaltigen Proteins, z. B. eines kosmetischen Rohstoffs verwendet werden.The release of sulfur Compounds underlying β-elimination reaction creates a double bond in free amino acids by subsequent rearrangement leads to deamination, alternatively in bound peptide amino acids but through water addition leads to the generation of a hydroxyamino acid. Ultimately, it can Cysteine serine and methionine threonine. So can a METase protein for the desulfurization of a sulfur-containing protein, z. B. a cosmetic raw material can be used.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung einer der obengenannten METasen, insbesondere einer METase, deren Aminosäuresequenz mit der in Seq. 1 (METase aus Treponema denticola) angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt, zur Entschwefelung eines schwefelhaltigen Proteins, z. B. eines kosmetischen Rohstoffs.Another subject of the present The invention is therefore the use of one of the above-mentioned METases, in particular a METase, the amino acid sequence of which in Seq. 1 (METASE from Treponema denticola) given amino acid sequence at least 50%, preferably at least 70%, in particular at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferred 100% matches for desulfurization of a sulfur-containing protein, e.g. B. one cosmetic raw material.
Schliesslich können in einem Syntheseverfahren durch Umkehrung der enzymatischen Reaktion (zweckmäßigerweise unter hohem Druck) unter Verwendung von gasförmigen Schwefelwasserstoff bzw Methylmercaptan sowie Ammoniak aus Pyruvat bzw a-Ketobutyrat die wertvollen Aminosäuren Cystein und Methionin erzeugt werden.Finally, in a synthetic process by reversing the enzymatic reaction (expediently under high pressure) using gaseous hydrogen sulfide or methyl mercaptan and ammonia from pyruvate or a-ketobutyrate the valuable amino acids Cysteine and methionine are generated.
Methionin besitzt als Zusatz für tierische Futtermittel eine erhebliche technische Bedeutung und wird in in aufwändigen Verfahren hergestellt.Methionine has an additive for animal Feed is of considerable technical importance and is used in complex Process manufactured.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich die Verwendung einer der obengenannten METasen, insbesondere einer METase, deren Aminosäuresequenz mit der in Seq. 1 (METase aus Treponema denticola) angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt, zur Synthese der Aminosäuren Cystein und Methionin.Another subject of the present The invention is therefore the use of one of the above-mentioned METases, in particular a METase, the amino acid sequence of which in Seq. 1 (METASE from Treponema denticola) given amino acid sequence at least 50%, preferably at least 70%, in particular at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferred 100% matches for the synthesis of amino acids Cysteine and methionine.
Um das METase-Protein zur Verwendung in technischen, kosmetischen oder pharmazeutischen Präparaten bereitzustellen, kommen alle Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine in Betracht.To use the METase protein in technical, cosmetic or pharmaceutical preparations To provide, all methods for the production of recombinant come Proteins into consideration.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:The following examples illustrate the Invention without, however, restricting it to:
Beispiel 1: heterologe Expression des mgl1-Gens aus T. denticolaExample 1: heterologous Expression of the mgl1 gene from T. denticola
Die kodierende Sequenz des mgl1-Gens
(METase-Gens) aus T. denticola wurde mithilfe von Datenbankvergleichen über PCR
amplifiziert und in einen kommerziell verfügbaren Vektor (pGEM-TEasy,
Promega) kloniert. Die Expression in E. coli kann wie folgt zum
Screening nach erfindungsgemäßen wirksamen
Substanzen genutzt werden:
Die mit dem das mgl1-Gen enthaltenden
Vektor transformierten E. coli-Zellen werden auf festen Nährmedien (z.B.
LB-Medium, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1-2% Agar) angezogen.
Zum Nachweis der Bildung von schwefelhaltigen Verbindungen wird
dem Medium eine Schwefelquelle (Methionin; bevorzugte Konzentration:
350 mg/l weiteste Konzentration: 50-1000 mg/l) und ein Schwermetallsalz
zugegeben, das mit Sulfidionen als schwer lösliche Verbindung ausfällt. Im
Beispiel wurde dem Medium Bleiacetat zugegeben (bevorzugte Konzentration:
4 mg/l weiteste Konzentration: 0,1-10 mg/l).The coding sequence of the mgl1 gene (METase gene) from T. denticola was amplified using PCR using database comparisons and cloned into a commercially available vector (pGEM-TEasy, Promega). Expression in E. coli can be used for screening for active substances according to the invention as follows:
The E. coli cells transformed with the vector containing the mgl1 gene are grown on solid nutrient media (for example LB medium, 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1-2% agar). To detect the formation of sulfur-containing compounds, a sulfur source (methionine; preferred concentration: 350 mg / l, furthest concentration: 50-1000 mg / l) and a heavy metal salt, which precipitates as a poorly soluble compound with sulfide ions, are added to the medium. In the example, lead acetate was added to the medium (preferred concentration: 4 mg / l broadest concentration: 0.1-10 mg / l).
Die Anzucht der Bakterien erfolgt bei 37°C für 2-7 Tage (bevorzugt 3 Tage) unter anaeroben Bedingungen in Petrischalen oder Multiwell-Platten. Auch aerobe Inkubation ist möglich, erfordert aber Inkubationsdauern von 5-10 Tagen.The bacteria are grown at 37 ° C for 2-7 Days (preferably 3 days) under anaerobic conditions in petri dishes or multiwell plates. Aerobic incubation is also possible, required but incubation periods of 5-10 days.
Die Hemmwirkung der zu testenden Substanz wird durch die fehlende Schwarzfärbung der Kolonien sichtbar. Dabei ist von Vorteil, dass gleichzeitig eine wachstumshemmende Eigenschaft der Substanz überprüft werden kann, da die Expression des mgl1-Gens alleine keinen Einfluss auf das Wachstum hat.The inhibitory effect of those to be tested Substance becomes visible through the lack of blackening of the colonies. It is advantageous that at the same time a growth-inhibiting Property of the substance to be checked can, since the expression of the mgl1 gene alone has no influence that has growth.
Beispiel 2: Enzymatische Tests mit aufgereinigten Mgl-Proteinen Example 2: Enzymatic Tests with purified Mgl proteins
Das mgl1-Gen aus T. denticola wird am 5'-Ende mit einer Sequenz versehen, die für sechs Histidin-Reste kodiert und in einen Expressionsvektor mit konstitutiv exprimiertem Promotor kloniert (pGEM). Die mit diesem Plasmid transformierten Zellen werden über Nacht in LB-Medium angezogen, anschließend wird eine weitere 50 ml Kultur mit einer OD600 = 0,05 aus der vorherigen Kultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 = 0,2 angezogen. Die Kultur wird abzentrifugiert, in 1 ml Lysis-Puffer (50 mM NaHP2O4; 300 mM NaCl; 10 mM Imidazol; pH 8) resuspendiert und mindestens über Nacht bei –70°C eingefroren. Der Aufschluss erfolgt nach Lysozym-Zugabe (Endkonz. 1 mg/ml) und einem Inkubationsschritt von 30 min. auf Eis unter nativen Bedingungen mittels Ultraschall (insgesamt 2 min. mit je 5 sek. Pulsen und 5 sek. Pause). Das Lysat wird für 20-30 min. bei 13.000 Upm zentrifugiert und 600 μl des Überstandes über eine Ni-NTA-Säule (Qiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt.The mgl1 gene from T. denticola is provided at the 5 'end with a sequence which codes for six histidine residues and clones into an expression vector with a constitutively expressed promoter (pGEM). The cells transformed with this plasmid are grown overnight in LB medium, then a further 50 ml culture with an OD 600 = 0.05 from the previous culture is inoculated and grown at 37 ° C. to an OD 600 = 0.2 , The culture is centrifuged off, resuspended in 1 ml of lysis buffer (50 mM NaHP 2 O 4 ; 300 mM NaCl; 10 mM imidazole; pH 8) and frozen at least at -70 ° C. overnight. The digestion takes place after addition of lysozyme (final concentration 1 mg / ml) and an incubation step of 30 min. on ice under native conditions using ultrasound (in total 2 min. with 5 sec. pulses and 5 sec. pause). The lysate is kept for 20-30 min. Centrifuged at 13,000 rpm and 600 μl of the supernatant purified on a Ni-NTA column (Qiagen) according to the manufacturer's instructions.
Der eigentliche Enzymassay zum Screening
nach erfindungsgemäßen wirksamen
Substanzen wird wie folgt durchgeführt:
10-100 μg (1-1000μg) des aufgereinigten
Enzyms werden in 50 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7 (6-8)) zusammen mit 100 mM Methionin (10-1000 mM), 2 mM (1-10 mM) NADH, 100 μM Pyridoxalphosphat
und 10U Lactatdehydrogenase Roche, bevorzugt aus Herzmuskelzellen,
Isoenzym LDH-1) oder Hydroxybutyratdehydrogenase (TEso Diagnostics)
bei 25°C
inkubiert (in Eppendorf-Reaktionsgefäßen oder
Mikrotiterplatten). Die Enzymaktivität der METase wird indirekt über die
Umsetzung von 2-Oxobutyrat und NADH2 zu
2-Hydroxybutyrat und NAD+ im Photometer
bei 340 nm (Absorptionsmaximum des NADH2) über die
Abnahme der Extinktion gemessen. Alternativ kann die Umsetzung in
Küvetten
unter direkter Beobachtung im Photometer gemessen werden. Inkubationsdauer
10-30 min bei 25°C.The actual enzyme assay for screening for active substances according to the invention is carried out as follows:
10-100 μg (1-1000μg) of the purified enzyme are dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7 (6-8)) together with 100 mM methionine (10-1000 mM), 2 mM (1-10 mM) NADH, 100 μM pyridoxal phosphate and 10U lactate dehydrogenase Roche, preferably from cardiac muscle cells, isoenzyme LDH-1) or hydroxybutyrate dehydrogenase (TEso Diagnostics) incubated at 25 ° C (in Eppendorf tubes or microtiter plates). The enzyme activity of the METase is measured indirectly via the conversion of 2-oxobutyrate and NADH 2 to 2-hydroxybutyrate and NAD + in a photometer at 340 nm (absorption maximum of NADH 2 ) via the decrease in absorbance. Alternatively, the conversion in cuvettes can be measured under direct observation in the photometer. Incubation time 10-30 min at 25 ° C.
Mithilfe dieses Assays können Substanzen auf ihre Hemmwirkung gegenüber der METase getestet werden, wichtig ist eine Kontrolle, bei der die Substanz auf ihre Hemmwirkung auf LDH getestet wird. Dazu führt man obigen Versuch ohne Methionin und METase, jedoch in Anwesenheit von 2 mM Pyruvat durch. Etwaige Hemmwirkungen können durch Zugabe von Na2SO3 beseitigt werden.With the help of this assay, substances can be tested for their inhibitory effect on the METase. A control in which the substance is tested for its inhibitory effect on LDH is important. To do this, the above experiment is carried out without methionine and METase, but in the presence of 2 mM pyruvate. Any inhibitory effects can be eliminated by adding Na 2 SO 3 .
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