DE10244347A1

DE10244347A1 - Preparation of N-carbamoylamino acid, useful as intermediate in enantioselective synthesis of amino acids, by enzymatic hydrolysis of the corresponding amide

Info

Publication number: DE10244347A1
Application number: DE2002144347
Authority: DE
Inventors: Harald Dr. Trauthwein; Oliver Dr. May; Christiane Sacherer; Uwe Dr. Dingerdissen
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-09-24
Filing date: 2002-09-24
Publication date: 2004-04-01

Abstract

Preparing N-carbamoylamino acid (I) by reacting an N-carbamoylamino acid amide (II) in presence of a hydrolase (III), is new. Independent claims are also included for the following: (1) preparing amino acids (IV) from (I) or hydantoin that includes the new preparation of (I); (2) preparing (IV) from (II) comprising reaction of (II) to (I) and/or enantioselective reaction of (I) to free (IV) that includes the new preparation of (I); and (3) whole cell catalyst (A) comprising cloned genes for (III), a carbamoylase, (V), a hydantoinase (VI) and optionally a hydantoin racemase (VII).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzyamtisches Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von N-Carbamoylaminosäuren aus deren Amiden.The present invention relates to an enzymatic process for the enantioselective production of N-carbamoylamino acids their amides.

Zur Herstellung von Aminosäuren und deren Derivate sind eine Reihe von verschiedenen Synthesemethoden bekannt (ULLMANN'S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, 6th Edition, 1998). Der großtechnisch bedeutendste chemische Zugang zu α-Aminosäuren, ist die Strecker-Synthese bzw. deren Modfikation, die Bucherer-Bergs-Reaktion, bei der zunächst aus einem Aldehyd, Cyanid und Ammoniumcarbonat das Hydantoin der Aminosäure entsteht. Durch Hydrolyse des Hydantoins kann über die Carbamoylaminosäure die freie Aminosäure erhalten werden.For the production of amino acids and their derivatives are a number of different synthetic methods known (ULLMANN'S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, 6th Edition, 1998). The industrial scale most important chemical access to α-amino acids the Strecker synthesis or its modification, the Bucherer-Bergs reaction, at first the hydantoin from an aldehyde, cyanide and ammonium carbonate amino acid arises. By hydrolysis of the hydantoin, the carbamoylamino acid can free amino acid be preserved.

Zur Herstellung enantiomerenreiner Aminosäuen kann auf bekannte Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse des Hydantoins zurückgegriffen werden. Die für die Hydrolyse des Hydantoins (Hydantoinasen) bzw. der Carbamoylaminosäure (Carbamoylase) aktiven Enzyme zeichnen sich durch eine hohe Enantioselektivität aus (Syldatk, C., Müller, R., Siemann, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5-monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds.: Rozzell, J.D. and Wagner, F.). pp75-127, Hanser Publisher, New York.; Syldatk, C., Müller, R., Pietzsch, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5-monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds.: Rozzell, J.D. and Wagner, F.). pp131-176, Hanser Publisher, New York; Syldatk, C. and Pietzsch, M. (1995) Hydrolysis and formation of hydantoins, in: Enzyme catalysis in organic synthesis (eds.: Drauz, K. and Waldmann, H.). pp 409-431, VCH-Verlag, Weinheim.).For the production of enantiomerically pure Aminosäuen can rely on known methods for the enzymatic hydrolysis of hydantoin resorted become. The for hydrolysis of hydantoin (hydantoinases) or carbamoyl amino acid (carbamoylase) active enzymes are characterized by high enantioselectivity (Syldatk, C., Müller, R., Siemann, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5-monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds .: Rozzell, J.D. and Wagner, F.). pp75-127, Hanser Publisher, New York .; Syldatk, C., Miller, R., Pietzsch, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5-monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds .: Rozzell, J.D. and Wagner, F.). pp131-176, Hanser Publisher, New York; Syldatk, C. and Pietzsch, M. (1995) Hydrolysis and formation of hydantoins, in: Enzyme catalysis in organic synthesis (eds .: Drauz, K. and Waldmann, H.). pp 409-431, VCH-Verlag, Weinheim.).

Ein großer Nachteil bei diesen Verfahren liegt im Anfallen von Nebenprodukten bei der Herstellung und Weiterverarbeitung des Hydantoins, die bei der anschließenden enantioselektiven enzymatischen Hydrolyse des Hydantoins bzw. der Carbamoylaminosäure die Ausbeute des Aldehyds erheblich vermindern oder sogar die anschließende Enzymreaktionen komplett inhibieren. Ein solches sehr störendes Nebenprodukt ist das Carbamoylaminosäureamid, das durch Aminolyse des Hydantoins in größeren Mengen (bis zu 30 %) bei den beschriebenen Herstellungsverfahren entsteht.A big disadvantage with these procedures lies in the accumulation of by-products in the manufacture and further processing of hydantoin, which in the subsequent enantioselective enzymatic Hydrolysis of hydantoin or carbamoylamino acid Significantly reduce the yield of the aldehyde or even the subsequent enzyme reactions inhibit completely. Such a very troublesome by-product is the carbamoylamino acid amide, by aminolysis of hydantoin in larger quantities (up to 30%) arises in the manufacturing processes described.

Die Überführung des Carbamoylaminosäureamids zurück in die Carbamoylaminosäure ist daher von wirtschaftlichem Interesse, da so die Effizienz des Gesamtprozesses, insbesondere im Hinblick auf die Ausbeute und die Reaktionsgeschwindigkeiten, deutlich gesteigert werden kann.The transfer of the carbamoylamino acid amide back into the carbamoyl amino acid is therefore of economic interest, since it increases the efficiency of the Overall process, especially with regard to the yield and the Reaction speeds, can be increased significantly.

Die enantioselektive Hydrolyse des Amids mittels Säure oder Base ist schwierig, da es hierbei zu Nebenreaktionen an der Carbamoylgruppe kommen kann. Weiterhin sind die Bedingungen unter denen eine saure oder basische Hydrolyse des Amids erfolgt zu aggressiv, um sie mit den bekannten enzymatischen Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren aus den Carbamoylaminosäuren problemlos kombinieren zu können.The enantioselective hydrolysis of Amids using acid or base is difficult because it leads to side reactions on the Carbamoyl group can come. Furthermore, the conditions are below acidic or basic hydrolysis of the amide is too aggressive, to manufacture them using the known enzymatic processes of amino acids from the carbamoylamino acids easy to combine.

Da die Hydrolyse in Gegenwart von Enzymen wie Carbamoylasen bzw. Hydantoinasen erfolgen soll, ist eine schonendere Methode wünschenswert.Since the hydrolysis in the presence of Enzymes such as carbamoylases or hydantoinases should be done a gentler method is desirable.

Es sind zwar eine Reihe von enzymatischen Hydrolysereaktionen von Amiden der freien Aminosäuren bekannt (K Yonaha, K. Soda, Advances in Biochemical Engineering, Biotechnology, Vol 33, 95-130; T. Sonke, B. Kaptein, W. H. J. Boesten, Q. B. Boxterman, H. E. Schoemaker, J. Kamphuis, F. Formaggio, C. Toniolo, F. P. J. T. Rutjes in Stereoselective Biocatalysis Ed. R. Patel, Marcek Dekker, New York, 2000), wobei allerdings eine enzymatische stereoselektive Verseifung einer Amidgruppe eines N-Carbamoyl-Aminosäure-amids zu der entsprechenden N-Carbamoyl-Aminosäure, wie sie insbesondere als ergänzender Verfahrensschritt bei der Herstellung von α-Aminosäuren wünschenswert wäre, bisher nicht gelungen ist.While there are a number of enzymatic ones Hydrolysis reactions of amides of the free amino acids known (K Yonaha, K. Soda, Advances in Biochemical Engineering, Biotechnology, Vol 33, 95-130; T. Sonke, B. Kaptein, W.H. J. Boesten, Q.B. Boxterman, H.E. Schoemaker, J. Kamphuis, F. Formaggio, C. Toniolo, F. P.J. T. Rutjes in Stereoselective Biocatalysis Ed. R. Patel, Marcek Dekker, New York, 2000), although an enzymatic stereoselective Saponification of an amide group of an N-carbamoyl amino acid amide to the corresponding N-carbamoyl amino acid, such as it in particular as a supplementary procedural step desirable in the manufacture of α-amino acids would be so far has not succeeded.

Es besteht daher die Aufgabe, ein Verfahren zu entwickeln, das schonend und selektiv N-Carbamoylaminosäureamide in die N-Carbamoylaminosäure überführt und somit eine Rückführung des Nebenprodukts in den Produktkreislauf des Hydantoinhydrolyseprozesses ermöglicht.There is therefore the task of a Process to develop the gentle and selective N-carbamoylamino acid amides converted into the N-carbamoylamino acid and thus a return of the By-product in the product cycle of the hydantoin hydrolysis process allows.

Die Aufgabe kann durch die Umsetzung von N-Carbamoylaminosäureamiden in Gegenwart einer Hydrolase zu den entsprechenden N-Carbamoylaminosäuren gelöst werden. Dabei kann überraschend gezeigt werden, dass die Hydrolasen spezifisch oder zumindest bevorzugt die Amidgruppe des N-Carbamoylaminosäureamid-Eduktes verseifen, wobei die Carbamoylgruppe erhalten bleibt. Dabei zeigen die Hydrolasen eine ausgezeichnete Enantioselektivität mit ee-Werten von über 95%, die in den Ausführungsbeispielen getesteten sogar von über 98%.The task can be implemented of N-carbamoylamino acid amides be dissolved in the presence of a hydrolase to give the corresponding N-carbamoylamino acids. It can be surprising be shown that the hydrolases are specific or at least preferred the amide group of the N-carbamoylamino acid amide starting material saponify, the carbamoyl group being retained. Show the hydrolases have excellent enantioselectivity with ee values from above 95% in the working examples tested even from over 98%.

Somit wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum einen die Rückführung des N-Carbamoylaminosäureamid-Nebenproduktes in den Produktkreislauf des Hydantoinhydrolyseprozesses bei der Herstellung von Aminosäuren ermöglicht, zum anderen kann aber auch direkt das jeweilige N-Carbamoylaminosäureamid als Edukt bei der Herstellung von Aminosäuren verwendet werden.Thus, with the method according to the invention, on the one hand, the recycling of the N-carbamoylamino acid amide by-product into the product cycle of the hydantoin hydrolysis process during production of amino acids, but on the other hand the respective N-carbamoylamino acid amide can also be used directly as an educt in the production of amino acids.

Durch die ausgezeichnete Enantioselektivität der Umsetzung vom Amid zur Carbamoylaminosäure kann die Enantioselektivität bei der Herstellung der freien Aminosäuren mit den herkömmlichen Verfahren weiter gesteigert werden. Darüber hinaus können nun auch nicht-enantioselektive Enzyme bei der enantioselktiven Herstellung von Amoinosäuren aus N-Carbamoylaminosäuren genutzt werden, da über das beanspruchte Verfahren bereits enantioselektiv die N-Carbamoylaminosäure bereit gestellt werden können.Due to the excellent enantioselectivity of the implementation from amide to carbamoylamino acid the enantioselectivity in the production of the free amino acids with the conventional ones Procedures can be further increased. In addition, now also non-enantioselective Enzymes in the enantioselective production of amino acids N-carbamoylamino be used because over the claimed process already provides the N-carbamoylamino acid enantioselectively can be put.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der schonenden enzymatischen Umsetzung der N-Carbamoylaminosäureamide unter milden Bedingungen. Somit ist es problemlos möglich die beschriebene Umsetzung mit weiteren Verfahrensschritten, insbesondere auch weiteren enzymatischen Umsetzungen zu kombinieren. Die enzymatische Hydrolyse von N-Carbamoylaminosäureamiden kann folglich mit der enzymatischen Herstellung von Aminosäuren kombiniert werden, wobei die Umsetzung auch als „Eintopf"-Reaktion ausgestaltet werden kann (Hydantoinase, Carbamoylase, Hydrolase).Another advantage of the present The invention lies in the gentle enzymatic conversion of the N-carbamoylamino acid amides under mild conditions. So it is easily possible Implementation described with further process steps, in particular to combine further enzymatic reactions. The enzymatic Hydrolysis of N-carbamoylamino acid amides can therefore be combined with the enzymatic production of amino acids the reaction can also be designed as a "one-pot" reaction (hydantoinase, Carbamoylase, hydrolase).

Insbesondere für die enzymatische Umsetzung von N-Carbamoylaminosäureamiden geeignet sind Hydrolasen aus den Klassen der Proteasen, Lipasen, Amidasen oder Acylasen, wobei die Verwendung von Proteasen, wie z.B. von alkalinen Endoproteinasen, bevorzugt ist.Especially for the enzymatic implementation of N-carbamoylamino acid amides hydrolases from the classes of proteases, lipases, Amidases or acylases, the use of proteases such as e.g. of alkaline endoproteinases is preferred.

Bevorzugt ist weiterhin die Verwendung von Serinproteasen, wie sie z.B. die Subtilisine darstellen, wobei insbesondere bakterielle Serinproteasen von besonderem Interesse sind.Use is also preferred of serine proteases, e.g. represent the subtilisins, where bacterial serine proteases of particular interest in particular are.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Proteasen ausgewählt aus der Gruppe Chirazyme P1 oder P2, Novozyme 539, Subtilisin, Chymotrypsin oder Acylasen ausgewählt aus der Gruppe Acylase"Amano" und Acylase I Porcine Kidney oder Lipasen ausgewählt aus der Gruppe Lipase candida antarctica, Lipase hog pancreas, Lipase A „Amano" und Lipase AK „Amano"20.Use is particularly preferred selected by proteases from the group Chirazyme P1 or P2, Novozyme 539, subtilisin, chymotrypsin or acylases selected from the group Acylase "Amano" and Acylase I Porcine Kidney or lipases selected from the group Lipase candida antarctica, Lipase hog pancreas, Lipase A "Amano" and Lipase AK "Amano" 20.

Als Edukt können alle N-Carbamoylaminosäureamide eingesetzt werden. Bevorzugte Edukte sind die der Formel (I), die zu den entsprechenden Carbamoylaminosäuren der Formel (II) umgesetzt werden,

wobei
X und Y für einen Rest ausgewählt aus der Gruppe H-, (C₁-C₁₀)-Alkyl-, (C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, (C₅-C₁₄)-Aryl, (C₅-C₁₄)-Aryl-O- steht und
R¹ und R² unabhängig voneinander für einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe der H-, (C₁-C₁₀)-Alkyl-, R'O-, R'O-Alkyl-(C₁-C₁₀)-, (C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, R'S-, R'S-Alkyl-(C₁-C₁₀)-, (C₁-C₁₀) -Alkyl-S- , R' R' ' N-, R' R' ' N-Alkyl- (C₁-C₁₀) -, (C₁-C₁₀)-Alkyl-NR'-, R'OOC-, R'OOC-Alkyl-(C₁-C₁₀)-, (C₁-C₁₀)-Alkyl-COO-(R R N-)(R N=)CNR , (R R N-)(R N=)C-NR Alkyl-(C₁-C₁₀)-, R'R''NCO-, R'R''NCO-Alkyl-(C₁-C₁₀)-, (C₅-C₁₄)-Aryl-, R'O-Aryl-(C₅-C₁₄)-, (C₅-C₁₄)-Aryl-O-, R'S-Aryl-(C₅-C₁₄)-_,(C₅-C₁₄)-Aryl-S-, (C₅-C₁₄)-Aryl-NR'-, R'R''N-Aryl-(C₅-C₁₄)-, R'OOC-Aryl-(C₅-C₁₄)-, (C₅-C₁₄)-Aryl-COO-, (R'R''N-)(R'''N=)C-NR''''-Aryl-(C₅-C₁₄)-, R'R''NCO-Aryl-(C₅-C₁₄)-Reste, stehen, wobei R', R'', R''', R'''' unabhängig voneinander für einen (C₁-C₁₀)-Alkyl- oder für einen (C₅-C₁₄)-Aryl-Rest stehen können und worin die Reste X, Y, R¹, R², R' , R'', R''', R'''' ein oder mehrfach substituiert sein können und wobei
Alkyl- für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Rest stehen kann, wobei auch ein oder zwei Kohlenstoffatome durch Heteroatome aus der Gruppe Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff ersetzt sein können und wobei bis zu vier Substituenten eleminiert sein können, so dass ein ein oder zweifach ungesättigter Rest vorliegt und wobei
Aryl- für einen aromatischen Rest steht, wobei ein bis drei Kohlenstoffatome durch Heteroatome aus der Gruppe Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff ersetzt sein können, so dass ein heteroaromatischer Rest vorliegt.All N-carbamoylamino acid amides can be used as starting material. Preferred starting materials are those of the formula (I) which are converted to the corresponding carbamoylamino acids of the formula (II)

in which
X and Y for a radical selected from the group H-, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-O-, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl, (C ₅ -C ₁₄ ) aryl-O- and
R ¹ and R ² independently of one another for a substituent selected from the group consisting of H-, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-, R'O-, R'O-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, ( C ₁ -C ₁₀ ) alkyl-O-, R'S-, R'S-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-S-, R 'R''N-, R 'R''N-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-NR'-, R'OOC-, R'OOC-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) - , (C ₁ -C ₁₀ ) alkyl-COO- (RR N -) (RN =) CNR, (RR N -) (RN =) C-NR alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, R'R '' NCO-, R'R''NCO-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, (C ₅ -C ₁₄ ) aryl-, R'O-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, ( C ₅ -C ₁₄ ) aryl-O-, R'S-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) - _, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl-S-, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl-NR ' -, R'R''N-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, R'OOC-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl-COO-, (R 'R''N -) (R''' N =) C-NR '''' - aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, R'R''NCO-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) Radicals, where R ', R'',R''', R '''' independently of one another represent a (C ₁ -C ₁₀ ) alkyl or a (C ₅ -C ₁₄ ) aryl Radical can stand and in which the radicals X, Y, R ¹ , R ² , R ', R'',R''', R '''' can be substituted one or more times and where at
Alkyl can represent a linear, branched or cyclic radical, it also being possible for one or two carbon atoms to be replaced by heteroatoms from the group consisting of nitrogen, sulfur and oxygen and for up to four substituents to be eliminated, so that a mono- or di-unsaturated radical can be eliminated is present and where
Aryl is an aromatic radical, where one to three carbon atoms can be replaced by heteroatoms from the group consisting of nitrogen, sulfur or oxygen, so that a heteroaromatic radical is present.

Die Reste X, Y, R¹, R², R' , R'', R''', R'''' können unabhängig voneinander ein oder mehrfach substituiert sein, wobei bevorzugt Substituenten ausgewählt sind aus der Gruppe H, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₁₀-Haloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₂-C₉-Heteroalkyl, C₁-C₉-Heteroalkenyl, C₅-C₁₄-Aryl, Phenyl, Naphthyl, Fluorenyl, C₂-C₆-Heteroaryl, wobei die Zahl der Heteroatome, insbesondere aus der Gruppe N, O, S, 1-4 betragen kann, C₁-C₁₀ Alkoxy, C₁-C₉ Trihalomethylalkyl, Trifluormethyl, Trichlormethyl, Fluoro, Chloro, Bromo, Iodo, Hydroxy,
Trifluormethylsulfonato, Oxo, Thio, Thiolato, Amino, C₁-C₈ substituierte Amino der Formen NH₂, NH-Alkyl-C₁-C₈, NH-Aryl-C₅-C₆, N-Alkyl₂-C₁-C₆, N-Aryl₂-C₅-C₆, N-Alkyl₃-C₁-C₈ ⁺, N-Aryl₃-C₅-C₆ ⁺, Cyano, Carboxylato der Formen COOH und COOQ wobei Q entweder ein einwertiges Kation oder C₁-C₈-Alkyl darstellt, C₁-C₆-Acyloxy, Sulfinato, Sulfonato der Formen SO₃H und SO₃Q wobei Q entweder ein einwertiges Kation, C₁-C₈-Alkyl oder C₆-Aryl darstellt, Phosphato der Formen PO₃H₂, PO₃HQ und PO₃Q₂ wobei Q entweder ein einwertiges Kation, C₁-C₈-Alkyl oder C₆-Aryl darstellt, Tri-C₁-C₆-Alkylsilyl, substituiert sein können,
und wobei zwei dieser Substituenten auch verbrückt sein können, wobei bevorzugt jeweils benachbarte Substituenten so miteinander verbrückt sind, dass eine 5-7 gliedrige cyclische aromatische oder aliphatische Verbindung vorliegt.The radicals X, Y, R ¹ , R ² , R ', R'',R''', R '''' can be substituted, independently of one another, one or more times, preference being given to selecting substituents from the group H, C ₁ -C ₂₀ alkyl, C ₂ -C ₂₀ alkenyl, C ₁ -C ₁₀ haloalkyl, C ₃ -C ₈ cycloalkyl, C ₃ -C ₈ cycloalkenyl, C ₂ -C ₉ heteroalkyl, C ₁ -C ₉ heteroalkenyl, C ₅ -C ₁₄ aryl, phenyl, naphthyl, fluorenyl, C ₂ -C ₆ heteroaryl, the number of heteroatoms, in particular from the group Can be N, O, S, 1-4, C ₁ -C ₁₀ alkoxy, C ₁ -C ₉ trihalomethylalkyl, trifluoromethyl, trichloromethyl, fluoro, chloro, bromo, iodo, hydroxy,
Trifluoromethylsulfonato, oxo, thio, thiolato, amino, C ₁ -C ₈ substituted amino of the forms NH ₂ , NH-alkyl-C ₁ -C ₈ , NH-aryl-C ₅ -C ₆ , N-alkyl ₂ -C ₁ - C ₆ , N-aryl ₂ -C ₅ -C ₆ , N-alkyl ₃ -C ₁ -C ₈ ⁺ , N-aryl ₃ -C ₅ -C ₆ ⁺ , cyano, carboxylato of the forms COOH and COOQ where Q is either a represents monovalent cation or C ₁ -C ₈ alkyl, C ₁ -C ₆ acyloxy, sulfinato, sulfonato of the forms SO ₃ H and SO ₃ Q where Q is either a monovalent cation, C ₁ -C ₈ alkyl or C ₆ - Represents aryl, phosphato of the forms PO ₃ H ₂ , PO ₃ HQ and PO ₃ Q ₂ where Q represents either a monovalent cation, C ₁ -C ₈ alkyl or C ₆ aryl, tri-C ₁ -C ₆ alkylsilyl, can be substituted,
and wherein two of these substituents can also be bridged, preferably in each case adjacent substituents being bridged to one another in such a way that a 5-7-membered cyclic aromatic or aliphatic compound is present.

Besonders bevorzugte N-Carbamoylamide sind die der natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäurederivate, wobei bevorzugt N-Carbamoylaminosäureamide der Formel (I) mit
R¹ gleich Alanin-, Arginin-, Asparagin-, Asparaginsäure-, Cystein-, Glutamin-, Glutaminsäure-, Glycin-, Histidin-, Isoleucin-, Leucin-, Lysin-, Methionin-, Phenylalanin-, Serin-, Threonin-, Tryptophan-, Tyrosin- oder Valinrest und
R² gleich Wasserstoff sind.Particularly preferred N-carbamoylamides are those of the naturally occurring amino acids and amino acid derivatives, preference being given to N-carbamoylamino acid amides of the formula (I)
R ¹ is alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine , Tryptophan, tyrosine or valine residue and
R ² are hydrogen.

Auch unnatürliche N-Carbamoylaminosäureamide werden in der beanspruchten Reaktion umgesetzt. Als solche können u.a. die entsprechenden Amide der α-Amino-adipinsäure, α-Amino-buttersäure, γ-Amino-buttersäure, Anthranilsäure, ε-Amin-capronsäure, 1-Amino-cyclohexancarbonsäure, 1-Amino-cyclopentancarbonsäure, α-Amino-isobuttersäure, β-Amino-isobuttersäure, β-Alanin, Amino-malonsäure, 1-Amino-cyclopropancarbonsäure, Azetidincarbonsäure, Aziridincarbonsäure, 4-Chlor-phenylalanin, α,γ-Diamino-buttersäure, α,β-Diamino-propionsäure, 3,4-Dihydroxy-phenylalanin, 2,2-Dimethyl-1,3-thiazolidin-4-carbonsäure, 4-Fluor-phenylalanin, Homocystein, Homoserin, δ-Hydroxylysin, 4-Hydroxy-phenylglycin, 4-Hydroxy-prolin, 3-Hydroxy-prolin, Isoserin, Isovalin, Lanthionin, 2-Naphthylalanin, Neopentylglycin, Norleucin, Norvalin, Oxylysin, Ornithin, Pipecolinsäure, Penicillamin, Phenylglycin, Picolinsäure, β-Phenylserin, Pyridylalanin, Chinoxalincarbonsäure, Sarkosin, Thiazolidin-4-carbonsäure oder des tert.-Leucins dienen.Also unnatural N-carbamoylamino acid amides are implemented in the claimed reaction. As such, i.a. the corresponding amides of α-amino-adipic acid, α-amino-butyric acid, γ-amino-butyric acid, anthranilic acid, ε-amine-caproic acid, 1-amino-cyclohexane carboxylic acid, 1-amino-cyclopentane carboxylic acid, α-amino-isobutyric acid, β- Amino isobutyric acid, β-alanine, Amino-malonic acid, 1-amino-cyclopropanecarboxylic acid, azetidinecarboxylic acid, aziridinecarboxylic acid, 4-chlorophenylalanine, α, γ-diamino-butyric acid, α, β-diamino-propionic acid, 3,4-dihydroxyphenylalanine, 2,2-dimethyl-1,3- thiazolidine-4-carboxylic acid, 4-fluoro-phenylalanine, Homocysteine, homoserine, δ-hydroxylysine, 4-hydroxy-phenylglycine, 4-hydroxy-proline, 3-hydroxy-proline, isoserine, Isovalin, lanthionine, 2-naphthylalanine, neopentylglycine, norleucine, Norvaline, oxylysine, ornithine, pipecolic acid, penicillamine, phenylglycine, Picolinic acid, β-phenylserine, pyridylalanine, quinoxaline carboxylic acid, Sarcosine, thiazolidine-4-carboxylic acid or serve the tert-leucine.

Insbesondere die Derivate primärer Aminosäure mit aromatischem und alkylischem Rest sind sehr gute Substrate, die mit sehr guten Ausbeuten und Selektivitäten umgesetzt werden können.In particular, the derivatives of primary amino acid aromatic and alkyl radical are very good substrates that can be implemented with very good yields and selectivities.

Besonders bevorzugt sind in jedem Fall solche N-Carbamoylaminosäureamide der Formel (I) einzusetzen, bei denen
Y gleich H, Methyl, Ethyl und/oder
X gleich H, Methyl, Ethyl ist.In any case, particular preference is given to using N-carbamoylamino acid amides of the formula (I) in which
Y is H, methyl, ethyl and / or
X is H, methyl, ethyl.

Neben der enzymatischen Umsetzung der N-Carbamoylaminosäureamide zu den entspechenden N-Carbamoylaminosäuren ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Nutzung der beanspruchten Reaktion bei der Aminosäuresynthese, insbesondere bei der enzymatischen Spaltung von Hydantoinen oder Carbamoylaminosäuren. Die relevanten Synthesewege für die Herstellung freier Aminosäuren sind zur Verdeutlichung exemplarische in 1 dargestellt.In addition to the enzymatic conversion of the N-carbamoylamino acid amides to the corresponding N-carbamoylamino acids, another object of the present invention is the use of the claimed reaction in amino acid synthesis, in particular in the enzymatic cleavage of hydantoins or carbamoylamino acids. The relevant synthetic routes for the production of free amino acids are exemplified in 1 shown.

Gemäß dem Stand der Technik kann die freie Aminosäure über die entsprechende Carbamoylaminosäure (Hydantoinsäurederivat) (II) direkt mit Hilfe einer Carbamylase (2) oder über das Hydantoin (III) mit Hilfe der Bucherer-Reaktion oder unter Verwendung einer Hydantoinase (1) hergestellt werden, wobei als Nebenprodukt durch die aminolytische Ringspaltung (3) mit H₂NX das Carbamoylaminosäureamid (I) anfällt. Die Herstellung der freien Aminosäuren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Rückführung des Amid-Nebenproduktes kann dabei in einem Zwei-Schritt-Verfahren oder auch als „Eintopf"-Reaktion durchgeführt werden.According to the prior art, the free amino acid can be prepared directly via the corresponding carbamoyl amino acid (hydantoic acid derivative) (II) using a carbamylase (2) or via the hydantoin (III) using the Bucherer reaction or using a hydantoinase (1) , the carbamoylamino acid amide (I) being obtained as a by-product of the aminolytic ring cleavage (3) with H ₂ NX. The production of the free amino acids using the recycling of the amide by-product according to the invention can be carried out in a two-step process or as a “one-pot” reaction.

Wie aus 1 deutlich wird, kann mit dem beanspruchten Verfahren das racemisch anfallende Carbamoylaminosäureamid-Nebenprodukt aus der Hydantoinase/Carbamoylase-Route der Aminosäure-Herstellung in die enantiomerenreine Carbamoylaminosäure überführt werden, wobei die Ausbeute an freier Aminosäure deutlich gesteigert werden kann.How out 1 it becomes clear that the racemic carbamoylamino acid amide by-product from the hydantoinase / carbamoylase route of the amino acid production can be converted into the enantiomerically pure carbamoylamino acid with the claimed process, the yield of free amino acid being able to be significantly increased.

Weiterhin kann das Carbamoylaminosäureamid selbst als Edukt zur enantioselektiven Aminosäureherstellung eingesetzt werden. Da die Amidspaltung hoch enantioselektiv verläuft, kann bei der enantioselektiven Aminosäureherstellung im weiteren Verfahrensverlauf (1 (1), (2)) auch auf nicht-enantioselektiver Enzyme zurückgegriffen werden.Furthermore, the carbamoylamino acid amide itself can be used as a starting material for the enantioselective production of amino acids. Since the amide cleavage is highly enantioselective, enantioselective amino acid production can be carried out in the further course of the process ( 1 (1) . (2) ) non-enantioselective enzymes can also be used.

Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren bei denen enantioselektiv eine Carbamoylaminosäure erfindungsgemäß erzeugt wird, die dann unter Verwendung bekannter Carbamoylasen oder Hydantoinasen (wie z.B. in Syldatk, C., Müller, R., Siemann, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5-monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds.: Rozzell, J.D. and Wagner, F.). pp75-127, Hanser Publisher, New York.; Syldatk, C., Müller, R., Pietzsch, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5- monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds.: Rozzell, J.D. and Wagner, F.). pp131-176, Hanser Publisher, New York; Syldatk, C. and Pietzsch, M. (1995) Hydrolysis and formation of hydantoins, in: Enzyme catalysis in organic Synthesis (eds.: Drauz, K. and Waldmann, H.). pp 409-431, VCH-Verlag, Weinheim beschrieben) zu den freien Aminosäuren weiter umgesetzt werden. Aufgrund der enantiomerenrein vorliegenden Carbamoylaminosäuren muss die Carbamoylaminosäurespaltung nicht mehr zwangsläufig enantioselektiv erfolgen, um eine enantioselektive Aminosäuresynthese durchzuführen.Another object of the present invention is thus a process for the production of amino acids in which a carbamoyl amino acid is generated enantioselectively according to the invention, which is then produced using known carbamoylases or hydantoinases (as described, for example, in Syldatk, C., Müller, R., Siemann, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5-monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds .: Rozzell, JD and Wagner, F.). Pp75-127 , Hanser Publisher, New York .; Syldatk, C., Müller, R., Pietzsch, M. and Wagner, F. (1992) Microbial and enzymatic production of D-amino acids from DL-5 monosubstituted hydantoins, in: Biocatalytic production of amino acids and derivatives (eds .: Rozzell, JD and Wagner, F.). pp131-176, Hanser Publisher, New York; Syldatk, C. and Pietzsch, M. (1995) Hydrolysis and formation of hydantoins, in: Enzyme catalysis in organic Synthesis (eds .: Drauz, K. and Waldmann, H.). pp 409-431, VCH-Verlag, Weinheim)) to the free amino acids. Due to the enantiomerically pure carbamoylamino acids, the carbamoylamino acid cleavage no longer necessarily has to be enantioselective in order to carry out enantioselective amino acid synthesis.

Besonders bevorzugt wird die beanspruchte Amidspaltung bei der enantioselektiven Synthese von Aminosäuren mit Hydrolasen durchgeführt, die keine Carbamylase oder Hydantoinaseaktivität besitzen, um eine störende, nicht ausreichend enantioselektive Carbamoylaminosäure- oder Hydantoinspaltung zu vermeiden. In dieser Hinsicht bevorzugte Hydrolasen sind Chirazym P1, Chirazym P2, Novozym 539, Subtilisin B. licheniformis, Acylase "Amano" und Lipase hog pancreas. Davon zeichnen sich insbesondere Chirazym P2, Novozym 539 und Subtilisin B. licheniformis weiterhin durch die damit erreichbaren Ausbeuten an Carbamoylaminosäuren aus.The one claimed is particularly preferred Amide cleavage in the enantioselective synthesis of amino acids Carried out hydrolases, which have no carbamylase or hydantoinase activity, to be a nuisance, not sufficient enantioselective carbamoylamino acid or hydantoin cleavage to avoid. Preferred hydrolases in this regard are chirazyme P1, Chirazym P2, Novozym 539, Subtilisin B. licheniformis, Acylase "Amano" and Lipase hog pancreas. Chirazyme P2, Novozym 539 and Subtilisin are particularly noteworthy B. licheniformis still by the yields achievable with it on carbamoyl amino acids out.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach auch ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren aus N-Carbamoylaminosäuren oder Hydantoinen, welches sich dadurch auszeichnet, dass die Umsetzung einen Verfahrensschritt umfasst, bei dem ein N-Carbamoylaminosäureamid in Gegenwart einer Hydrolase umgesetzt wird.Object of the present invention is therefore also a process for the production of amino acids N-carbamoyl amino acids or Hydantoins, which is characterized by the fact that the implementation comprises a process step in which an N-carbamoylamino acid amide is reacted in the presence of a hydrolase.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren aus N-Carbamoylaminosäureamiden, wobei die Umsetzung der N-Carbamoylaminosäureamiden zu ihren N-Carbamoylaminosäuren und/oder die Umsetzung der N-Carbamoylaminosäuren zu ihrer freien Aminosäure enantioselektiv verläuft und wobei die Umsetzung einen Verfahrensschritt umfasst, bei dem ein N- Carbamoylaminosäureamid in Gegenwart einer Hydrolase umgesetzt wird.The invention also relates to the invention is a process for the production of amino acids from N-carbamoylamino acid amides, wherein the conversion of the N-carbamoylamino acid amides to their N-carbamoylamino acids and / or the implementation of the N-carbamoylamino acids their free amino acid is enantioselective and wherein the implementation comprises a process step in which an N-carbamoyl amino acid amide is reacted in the presence of a hydrolase.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf einen Ganzzellkatalysator aufweisend ein kloniertes Gen kodierend für eine Hydrolase, die zur erfindungsgemäßen Reaktion befähigt ist, ein kloniertes Gen kodierend für eine Carbamoylase und ein kloniertes Gen kodierend für eine Hydantoninase und optional ein kloniertes Gen kodierend für eine Hydantoinracemase.The invention further relates encoding a cloned gene on a whole cell catalyst for one Hydrolase necessary for the reaction according to the invention capable is a cloned gene coding for a carbamoylase and a cloned gene coding for a hydantoninase and optionally a cloned gene coding for a hydantoin racemase.

Als rec-Mikroorganismen können hierfür im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommenden Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen herangezogen werden. Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10- oder HB101.In principle, rec microorganisms can do this all the specialist for organisms that are suitable for this purpose, e.g. Yeasts like Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, prokaryotes, such as E. coli, Bacillus subtilis or eukaryotes such as mammalian cells, Insect cells are used. E. coli strains are preferred for this Purpose to use. The most preferred are: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10 or HB101.

Vorzugsweise wird ein Organismus wie in der DE10155928 genannt als Wirtsorganismus eingesetzt.Preferably an organism as in the DE10155928 called used as a host organism.

Der Vorteil eines derartigen Organismus ist die gleichzeitige Expression aller Polypeptidsysteme, womit nur noch ein rec-Organismus für die erfindungsgemäße Reaktion vom Hydantoin zur Aminosäure angezogen werden muss.The advantage of such an organism is the simultaneous expression of all polypeptide systems, with which just a rec organism for the reaction of the invention from hydantoin to amino acid must be tightened.

Um die Expression der Polypeptide im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten abzustimmen, können die entsprechenden codierenden Nukleinsäuresequenzen auf unterschiedlichen Plasmiden mit unterschiedlichen Kopienzahlen untergebracht und/oder unterschiedlich starke Promotoren für eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise eine Akkumulation einer Zwischenverbindung nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE19920712 ).In order to coordinate the expression of the polypeptides with regard to their conversion rates, the corresponding coding nucleic acid sequences can be accommodated on different plasmids with different copy numbers and / or promoters of different strengths can be used for differently strong expression of the nucleic acid sequences. With enzyme systems matched in this way, an accumulation of an intermediate compound advantageously does not occur and the reaction under consideration can proceed at an optimal overall speed. However, this is well known to the person skilled in the art (Gellissen, G .; Piontek, M .; Dahlems, U .; Jenzelewski, V .; Gavagan, JW; DiCosimo, R .; Anton, DL; Janowicz, ZA (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M .; London, M .; Dohmen, J .; Dahlems, U .; Gellissen, G .; Strasser, AW; DE19920712 ).

Die Herstellung des Ganzellkatalysators kann im Prinzip nach dem Fachmann bekannten Maßnahmen erfolgen (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham). Bezüglich der allgemeinen Vorgehensweise (PCR, Klonierung, Expression etc.) sei auch auf folgende Literatur und das dort zitierte verwiesen: Universal GenomeWalker^TM Kit User Manual, Clontech, 3/2000 und dort zitierte Literatur; Triglia T.; Peterson, M. G. und Kemp, D.J. (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham.The production of the Ganzellkatalysators can (made in principle according to the expert known measures Sambrook, J .; Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, ^2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New. York; Balbas, P. and Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E. coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, RL and Denhardt, D. T (eds) (1988 ), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham). With regard to the general procedure (PCR, cloning, expression, etc.), reference is also made to the following literature and the literature cited therein: Universal GenomeWalker ^™ Kit User Manual, Clontech, 3/2000 and the literature cited therein; Triglia T .; Peterson, MG and Kemp, DJ (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J .; Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, ^2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York;. Rodriguez, RL and Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham.

Für die Anwendung können die betrachteten Polypeptide (Enzyme) des erfindungsgemäßen Verfahrens in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes Enzym verwendet werden. Weiterhin können diese Polypeptide auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.For the application, the polypeptides (enzymes) under consideration of the method according to the invention can be used in free form as homogeneously purified compounds or as an enzyme produced recombinantly. Furthermore, these polypeptides can also be used as part of an intact guest organism or in conjunction with the digested and arbitrarily highly purified cell mass of the Host organism.

Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern – Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378).Possible is also the use of the enzymes in immobilized form (Sharma B.P .; Bailey L.F. and Messing R.A. (1982), Immobilisiert Biomaterialization - techniques and applications, Angew. Chem. 94, 836-852). This is advantageously done immobilization by lyophilization (Paradkar, V. M .; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori, T .; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M .; Adlercreutz, P .; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active form in toluene, biocatalysis 6, 291-305). Lyophilization in is very particularly preferred Presence of surfactant Substances such as Aerosol OT or polyvinyl pyrrolidone or polyethylene glycol (PEG) or Brij 52 (diethylene glycol mono-cetyl ether) (Kamiya, N .; Okazaki, S.-Y .; Goto, M. (1997) Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, biotechnol. Tech. 11, 375-378).

Äußerst bevorzugt ist die Immobilisierung an Eupergit^®, insbesondere Eupergit C^® und Eupergit 250L^® (Röhm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000), 10(1-3), 157-176).Immobilization on Eupergit ^® , in particular Eupergit C ^® and Eupergit 250L ^® (Röhm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E .; Kraemer, DM Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000), 10 (1-3), 157-176).

Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an Ni-NTA in Kombination mit dem His-Tag (Hexa-Histidin) ergänzten Polypeptid (Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Bornhorst, Joshua A.; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology (2000), 326, 245-254).Immobilization is also preferred on Ni-NTA in combination with the His tag (hexa-histidine) supplemented polypeptide (Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Bornhorst, Joshua A .; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology (2000), 326, 245-254).

Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383).The use as CLECs is also conceivable (St. Clair, N .; Wang, Y.-F .; Margolin, A.L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383).

Durch diese Maßnahmen kann es gelingen aus Polypeptiden, welche durch organische Solventien instabil werden, solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln bzw. ganz in Organik arbeiten können.With these measures it can succeed Polypeptides that become unstable due to organic solvents, to generate those in mixtures of aqueous and organic solvents or can work entirely in organic matter.

Die erfindungsgemäßen enzymatischen Reaktionen können in gepufferte Lösung durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Reaktion bei pH-Werten zwischen 5 und 10, besonders bevorzugt zwischen 6,5 und 8,5 durchgeführt.The enzymatic reactions according to the invention can in buffered solution carried out become. The reaction is preferred at pH values between 5 and 10, particularly preferably carried out between 6.5 and 8.5.

Als vorteilhaft haben sich Enzym : Substrat Verhältnisse (bezogen auf das Gewicht) von über 1 : 10, bevorzugt von über 2 : 10, erwiesen.Enzyme have proven to be advantageous : Substrate ratios (by weight) of over 1:10, preferably from over 2:10.

Im folgenden werden einige exemplarische Ausführungsbeispiele beschrieben.The following are some examples embodiments described.

Allgemeines:General:

Sämtliche Enzyme sind frei erhältlich (beziehbar bei Roche, Amano, Fluka oder Novozymes).All Enzymes are freely available (available from Roche, Amano, Fluka or Novozymes).

Die Analyse der Reaktionsprodukte erfolgte durch HPLC. Dazu wurde die HPLC HP 1100 verwendet, als Säule wurde eine Waters terra tm benutzt. Zur Probenzubereitung wurden 100μl Reaktionslösung mit 900μl H₂O versetzt. Eluiert wurde mit H₂O/Acetonitril/TFA = 985/15/1, 0,1ml/min, 25°C. Die Messung erfolgte bei 220nm. Als interner Standard wurde Tryptophan verwendet.The reaction products were analyzed by HPLC. The HPLC HP 1100 was used for this, and a Waters terra tm was used as the column. For the sample preparation, 100μl reaction solution was mixed with 900μl H ₂ O. Elution was carried out with H ₂ O / acetonitrile / TFA = 985/15/1, 0.1 ml / min, 25 ° C. The measurement was made at 220nm. Tryptophan was used as the internal standard.

Beispiel 1: Enzymatische Umsetzung von N-CarbamoylmethioninamidenExample 1: Enzymatic Implementation of N-carbamoylmethionine amides

In einem GC-Fläschen mit Magnetführer wurden 0,5ml N-Carbamoylmethioninamid (10 mg/ml) in Natriumphosphatpuffer (50mM , pH7,5) gegeben und mit 1 N. NaOH auf 7,5 eingestellt. Nach Zugabe von 5mg des jeweiligen Enzyms wurde bei 22°C für 24 Stunden gerührt und anschließend mittels HPLC-Mehtode analysiert. Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst Tabelle 1: Ausbeute und Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung von Carbamoylmethioninamid

0.5 ml of N-carbamoylmethioninamide (10 mg / ml) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.5) was placed in a GC vial with a magnetic guide and adjusted to 7.5 with 1 N. NaOH. After the addition of 5 mg of the respective enzyme, the mixture was stirred at 22 ° C. for 24 hours and then analyzed using a HPLC method. The results of the enzymatic reactions are summarized in Table 1 Table 1: Yield and enantioselectivity of the enzymatic conversion of carbamoylmethioninamide

Beispiel 2: Überprüfung der Hydantoinase-AktivitätExample 2: Checking the Hydantoinase activity

Von besonderem Interesse sind die Enzyme, die keine zusätzliche Hydantoinaseaktivität enthalten. Denn eine solche Nebenaktivität führt in Gegenwart des Hydantoins, dem Edukt des Gesamtprozesses, zu einer unselektiven und nicht kontrollierten Hydantoinspaltung. Die störende Hydantoinaseaktivität wurde überprüft in einer Mischung aus Methioninhydantoin und Carbamoylmethioninamid im Verhältnis 83:17 (abk. MTEH).They are of particular interest Enzymes that have no additional hydantoinase contain. Because such a side activity leads in the presence of hydantoin, the educt of the overall process, to an unselective and not controlled Hydantoinspaltung. The disturbing hydantoinase was checked in one Mixture of methionine hydantoin and carbamoylmethioninamide in the ratio 83:17 (abb. MTEH).

In einem GC-Fläschen mit Magnetführer wurden 0,5ml einer 17:83-Mischung aus N-Carbamoylmethioninamid und Methioninhydantoin (10 mg/ml) in Natriumphosphatpuffer (50mM pH7,5) gegeben und mit 1 N. NaOH auf 7,5 eingestellt. Nach Zugabe von 5mg des jeweiligen Enzyms wurde bei 22°C für 24 Stunden gerührt und anschließend mittels HPLC-Methode analysiert. Die Ergebnisse der Umsetzung sind in Tabelle 2 zusammengefasst.In a GC vial with a magnetic guide 0.5ml of a 17:83 mixture of N-carbamoylmethioninamide and methionine hydantoin (10 mg / ml) in sodium phosphate buffer (50mM pH7.5) and with 1 N. NaOH set to 7.5. After adding 5mg of each Enzyme was at 22 ° C for 24 Hours stirred and subsequently analyzed using the HPLC method. The results of the implementation are summarized in Table 2.

Tabelle 2: Ausbeute Carbamoylmethionin bei Verwendung von reinem Carbamoyl methioninamid als Substrat sowie mit MTEH als Substrat.

Table 2: Yield of carbamoylmethionine when using pure carbamoyl methioninamide as substrate and with MTEH as substrate.

Es wird deutlich, dass bei den Enzymen Subtilisin B. subtilis, Chirazym P1 lyo, Acylase I und Lipase Candida antartica noch eine große Hydantoinase Aktivität besitzen.It becomes clear that with the enzymes Subtilisin B. subtilis, Chirazym P1 lyo, Acylase I and Lipase Candida antartica still a big one Hydantoinase activity have.

Beispiel 3: Optimierung der Enzym-Substrat-Verhältnissen für die enzymatische selektive Hydrolyse der Amidgruppe von N-CarbamoylmethioninamideExample 3: Optimization the enzyme-substrate ratios for the enzymatic selective hydrolysis of the amide group of N-carbamoylmethioninamide

In einem GC-Fläschen mit Magnetführer wurden 0,5ml N-Carbamoylaminosäureamid der jeweiligen Konzentration in Natriumphosphatpuffer (50mM , pH7,5) gegeben und mit 1 N. NaOH auf 7,5 eingestellt. Nach Zugabe der jeweiligen Menge an Chirazym P2 wurde bei 22°C für 3 Tage gerührt und anschließend mittels HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.In a GC vial with a magnetic guide 0.5 ml of N-carbamoylamino acid amide the respective concentration in sodium phosphate buffer (50mM, pH7.5) given and adjusted to 7.5 with 1N NaOH. After adding the respective Amount of chirazyme P2 was at 22 ° C for 3 days touched and subsequently analyzed by HPLC. The results are summarized in Table 3.

Tabelle 3: Selektive Hydrolyse der Amidgruppe von N-Carbamoylmethioninamid mit Chirazym P2 unter verschiedenen Bedingungen.

Table 3: Selective hydrolysis of the amide group of N-carbamoylmethioninamide with Chirazym P2 under different conditions.

Beispiel 4: Enzymatische Selektive Hydrolyse der Amidgruppe verschiedener N-CarbamoylaminosäureamideExample 4: Enzymatic Selective hydrolysis of the amide group of various N-carbamoylamino acid amides

In einem GC-Fläschen mit Magnetführer wurden 0,5ml N-Carbamoylaminosäureamid (10 mg/ml) in Natriumphosphatpuffer (50mM , pH7,5) gegeben und mit 1 N. NaOH auf 7,5 eingestellt. Nach Zugabe von 5mg Chirazym P1 bzw. Chirazym P2 wurde bei 22°C für 24 Stunden gerührt und anschließend mittels HPLC analysiert.In a GC vial with a magnetic guide 0.5 ml of N-carbamoylamino acid amide (10 mg / ml) in sodium phosphate buffer (50mM, pH7.5) and with 1 N. NaOH set to 7.5. After adding 5 mg of Chirazym P1 or Chirazyme P2 was at 22 ° C for 24 Hours stirred and subsequently analyzed by HPLC.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.The results are in Table 4 summarized.

Tabelle 4: Selektive Hydrolyse der Amidgruppe von N-Carbamoyl-aminosäure-amid mit Chirazym P1 von verschiedenen Aminosäuren.

Table 4: Selective hydrolysis of the amide group of N-carbamoyl-amino acid amide with Chirazym P1 of different amino acids.

Somit kann gezeigt werden, dass neben Methionin auch andere N-Carbamoylamide weiterer Aminosäuren mit sehr guten Ausbeuten und Selektivitäten mit dem beanspruchten Verfahren umsetzbar sind.It can thus be shown that in addition to Methionine also with other N-carbamoylamides of other amino acids very good yields and selectivities with the claimed process are feasible.

Claims

Process for the preparation of N-carbamoylamino acids, characterized in that N-Carbamo ylamino acid amides is reacted in the presence of a hydrolase.

A method according to claim 1, characterized in that the hydrolases used from the classes of proteases, lipases, Amidases or acylases selected are.

Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that that the proteases used are serine proteases or alkaline endoproteinases are.

Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that that proteases selected from the group Chirazyme P1 or P2, Novozyme 539, Subtilisin, Chymotrypsin or acylases selected from the group Acylase "Amano" and Acylase I Porcine Kidney or lipases selected from the group Lipase candida antarctica, Lipase hog pancreas, Lipase A "Amano" and Lipase AK "Amano" 20 are used.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that N-carbamoylamino acid amides of the formula (I) are reacted,

where X and Y for a radical selected from the group H-, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-O-, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl, (C ₅ -C ₁₄ ) aryl-O- and R ¹ and R ² independently of one another are selected from the group of H-, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-, R'O-, R'O- Alkyl (C ₁ -C ₁₀ ), (C ₁ -C ₁₀ ) alkyl-O-, R'S, R'S alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, (C ₁ -C ₁₀ ) alkyl -S-, R'R''N-, R'R''N-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-NR'-, R'OOC-, R 'OOC-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, (C ₁ -C ₁₀ ) -alkyl-COO-, (R'R''N-) (R''' N-) CNR '''' - , (R'R''N-) (R '''N-)C-NR''''- alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, R'R''NCO-, R'R'' NCO-alkyl- (C ₁ -C ₁₀ ) -, (C ₅ -C ₁₄ ) aryl-, R'O-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl-O -, R 'S-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl-S-, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl-NR'-, R'R''N -Aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, R'OOC-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, (C ₅ -C ₁₄ ) -aryl-COO-, (R'R''N -) ( R '''N =) C-NR''''aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) -, R'R''NCO-aryl- (C ₅ -C ₁₄ ) radicals, where R' , R '', R ''',R''''independently of one another for a (C ₁ -C ₁₀ ) -Al can be alkyl or a (C ₅ -C ₁₄ ) aryl radical and in which the radicals X, Y, R ¹ , R ² , R ', R'',R''', R '''' or can be substituted several times and where alkyl can be a linear, branched or cyclic radical, it also being possible for one or two carbon atoms to be replaced by heteroatoms from the group consisting of nitrogen, sulfur and oxygen and for up to four substituents to be eliminated, so that a mono- or di-unsaturated radical is present and where aryl is an aromatic radical, where one to three carbon atoms can be replaced by heteroatoms from the group nitrogen, sulfur or oxygen, so that a heteroaromatic radical is present.

A method according to claim 5, characterized in that N-carbamoylamino acid amides of the formula (I) wherein R ^{1 is} an alanine, arginine, aspartic, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine , Leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, tyrosine or valine residue and R ^{2 represents} a hydrogen, are implemented.

A method according to claim 5 or 6, characterized in that N-carbamoylamino acid amides of the formula (I), wherein Y is H, methyl, ethyl and / or X is H, methyl, ethyl.

Process for the production of amino acids N-carbamoyl amino acids or Hydantoins characterized in that the implementation by a Method step according to one of claims 1 to 7.

Process for the production of amino acids N-Carbamoylaminosäureamiden, the reaction of the N-carbamoylamino acid amides to their N-carbamoylamino acids and / or the implementation of the N-carbamoylamino acids their free amino acid is enantioselective characterized in that the implementation is a procedural step according to one of the claims 1 to 7 comprises.

Use of hydrolases for the production of N-carbamoylamino acids or amino acids from their N-carbamoylamino acid amides.

Whole cell catalyst comprising a cloned gene coding for a hydrolase capable of reacting according to claim 1, a cloned gene coding for a carbamoylase and a cloned gene coding for a hydantoninase and optionally a cloned gene coding for a hydantoin racemase.