DE10236711A1 - Typing genes that contain polymorphic microsatellite loci, useful for identifying predisposition to disease, by amplification and determining length of amplicons - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Typisierungsverfahren für Gene, die mindestens einen Mikrosatellitenlocus aufweisen, ein Verfahren zur Ermittlung von Markern in Genen, die Mikrosatellitenloci enthalten, bezüglich der Prädisposition von Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Prädiagnostik von Erkrankungen, die mit Genen assoziiert sind, welche einen oder mehrere Mikrosatellitenloci aufweisen.The present invention relates to a typing procedure for Genes that have at least one microsatellite locus, a method for the determination of markers in genes which contain microsatellite loci with respect to the predisposition of diseases as well as a method for the pre-diagnosis of diseases, that are associated with genes that have one or more microsatellite loci exhibit.
Genanalysen sind meist auf DNA-Varianten innerhalb von Populationen oder Familien gerichtet. Mikrosatelliten sind übliche Kandidaten für solche Untersuchungen. Jedoch wurde angenommen, dass sie im Mittel etwa alle 10 bis 50 kBp in DNA und nur selten innerhalb von Genen auftreten (vgl. bspw. Schlötterer 2000).Genetic analyzes are mostly based on DNA variants targeted within populations or families. microsatellite are common Candidates for such investigations. However, it was believed to be on average about every 10 to 50 kbp in DNA and rarely within genes occur (see e.g. Schlötterer 2000).
Bei vielen Genen, die mit Erkrankungen assoziiert sind, sind keine oder nur wenige Polymorphismen bekannt und diese erlauben meist keine schnelle (d.h. effiziente) Typisierung. Ein Beispiel hierfür sind die unter der Bezeichnung Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) zusammengefaßten degenerativen Erkrankungen des Nervensystems bei Mensch und Tier, die durch einen ungewöhnlichen Erregertyp verursacht werden. Erreger derartiger Enzephalopathien, bspw. Scrapie (Schaf, Erkrankung seit über 250 Jahren bekannt), Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE; Rind), Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD; Mensch) oder verwandter Eigen enthalten im wesentlichen keine Nukleinsäuren (weder DNA noch RNA), sondern dürften vielmehr auf Grund ihres Proteinbestandteils infektiösen Charakter haben. Diesem Erregertyp wurde die Bezeichnung „Prion" (proteinaceous infectious particles, Prusiner 1982) gegeben.With many genes related to diseases associated, no or only a few polymorphisms are known and these usually do not allow fast (i.e. efficient) typing. An example of this are those known as transmissible spongiform encephalopathies (TSE) summarized degenerative diseases of the nervous system in humans and animals, by an unusual Pathogen type are caused. Pathogen of such encephalopathies, For example, scrapie (sheep, disease known for over 250 years), bovine Spongiform encephalopathy (BSE; cattle), Creutzfeldt-Jakob disease (CJD; human) or related Eigen essentially do not contain any nucleic acids (neither DNA or RNA), but rather have an infectious character due to their protein component. this The pathogen type was called "Prion" (proteinaceous infectious particles, Prusiner 1982).
Charakteristisch für TSE-Erkrankungen ist eine Inkubationszeit von mehreren Monaten bis einigen Jahren mir einer nachfolgenden klinischen Symptomatik, bspw. Anzeichen von Unruhe, Bewegungsstörungen, wie bspw beim Schaf ein traberartiger Gang auf den Vorderbeinen. Im Falle von Scrapie treten darüber hinaus Sensibilitätsstörungen (starker Juckreiz, der durch Scheuem zu Vliesschäden führt) auf. Die körperliche Verfassung infizierter Tiere oder von CJD-Patienten verschlechtert sich dramatisch, bis diese nach wenigen Wochen nicht mehr in der Lage sind, Nahrung aufzunehmen.Characteristic of TSE diseases is an incubation period of several months to a few years with subsequent clinical symptoms, e.g. signs of restlessness, movement disorders, like For example, a trotter-like walk on the front legs of the sheep. in the Cases of scrapie occur over it furthermore sensitivity disorders (stronger Itching, which leads to damage to the fleece due to abrasion). The physical Condition of infected animals or of CJD patients worsened dramatically until after a few weeks it is no longer in the Are able to ingest food.
TSE-Erkrankungen sind horizontal von Tier zu Tier übertragbar. Injektion eines Extrakts aus dem Gehirn eines erkrankten Tieres in ein gesundes Tier führt zur Infektion mit nachfolgender Manifestation der typischen klinischen Symptome. Daß Nukleinsäuren keine wesentliche Bedeutung für die Infektion besitzen können, wurde im Falle von Scrapie durch Experimente mit Scrapie-Hirnextrakten nachgewiesen, die infektiös blieben, obwohl sie zuvor mit UV-Licht sowie mit kurzwelliger ionisierender Strahlung behandeh wurden. Hierdurch werden regelmäßig Nucleinsäuren geschädigt oder zerstört (Prusiner 2000). Auf Grund dieser und ähnlicher Experimente wurden anderweitige Hypothesen zur Natur des Krankheitserregen von TSE in den Hintergrund gedrängt, bspw die Virinohypothese (Bruce und Dickinson 1987), die besagt, dass das eigentliche Pathogen eine Nucleinsäure ist, die vom PrPSc lediglich eingeschlossen wird. Dies gilt auch für die andere Annahme (z. B. Dron und Manuelidis 1996), dass konventionelle Viren eine Rolle spielen oder ggf. eine veränderte Genexpression ursächlich ist.TSE diseases can be transmitted horizontally from animal to animal. Injection of an extract from the brain of a diseased animal into a healthy animal leads to infection with subsequent manifestation of the typical clinical symptoms. In the case of scrapie, the fact that nucleic acids can have no essential significance for the infection was demonstrated by experiments with scrapie brain extracts which remained infectious, even though they had previously been treated with UV light and with short-wave ionizing radiation. This regularly damages or destroys nucleic acids (Prusiner 2000). Based on these and similar experiments, other hypotheses regarding the nature of the pathogen of TSE have been pushed into the background, e.g. the virino hypothesis (Bruce and Dickinson 1987), which states that the actual pathogen is a nucleic acid that is only included by the PrP Sc . This also applies to the other assumption (e.g. Dron and Manuelidis 1996) that conventional viruses play a role or that an altered gene expression may be the cause.
Das für das Prior-Protein codierende Gen (PrP-Gen) wurde im Genom aller untersuchten Säuger gefunden. Sein Produkt, das zelluläre Prionprotein (PrPC), wird insbesondere in Nervenzellen, aber auch in Zellen der Placenta exprimiert. Sog. „Knockout"-Mäuse, bei denen das PrP-Gen genetisch eliminiert oder abgeschaltet war, zeigten dagegen keinen phänotypischen Befund nach Injektion infektiösen Materials (Büeler et al. 1992, 1993). Die Funktion des PrP (bspw. Cu-Transport, Signalübertragung) ist allerdings noch nicht abschließend geklärt.The gene coding for the Prior protein (PrP gene) was found in the genome of all mammals examined. Its product, the cellular prion protein (PrP C ), is expressed especially in nerve cells, but also in cells of the placenta. So-called. "Knockout" mice, in which the PrP gene was genetically eliminated or switched off, showed no phenotypic finding after injection of infectious material (Büeler et al. 1992, 1993). The function of the PrP (e.g. Cu transport, signal transmission) has not yet been finally clarified.
Die Übertragung von TSE erfolgt vermutlich durch eine Isoform des normalen zelleigenen PrPC, die als PrPSc bezeichnet wird (Prusiner 1998). Die beiden Formen unterscheiden sich in ihrer Konformation, also in der Art ihrer räumlichen Faltung. Fourier-Tiansformations-Infrarot Spektroskopie mit hoch aufgereinigtem PrPC ließ auf einen hohen Anteil an α-Helix schließen, wohingegen PrPSc, also die infektiöse Form, einen großen Anteil an β-Faltblatt- Struktur aufweist (Pan et al. 1993, Caughey et al. 1991, Gasset et al. 1993). Das PrPSc kann sich im Wirtstier vermehren, indem es die Konformationsumkehr von PrPC zu PrPSc katalysiert und eine Kaskade mit Dominoeffekt auflöst. Hierdurch entsteht massenhaft agglomerationsfähiges PrPSc, das nicht durch Proteinase K abgebaut werden kann (Proteaseresistenz). Im Ergebnis bilden sich amyloidartige Ablagerungen Die Pathogenität der Erreger ist in der Störung und Beeinträchtigung des Nervengewebes begründet.TSE is probably transmitted by an isoform of the normal cell's own PrP C , which is referred to as PrP Sc (Prusiner 1998). The two forms differ in their conformation, i.e. in the way they are spatially folded. Fourier tiansformation infrared spectroscopy with highly purified PrP C indicated a high proportion of α-helix, whereas PrP Sc , i.e. the infectious form, has a large proportion of β-sheet structure (Pan et al. 1993, Caughey et al. 1991, Gasset et al. 1993). The PrP Sc can multiply in the host animal by catalyzing the conformational reversal from PrP C to PrP Sc and dissolving a cascade with a domino effect. This results in PrP Sc capable of agglomeration, which cannot be broken down by proteinase K (resistance to proteases). As a result, amyloid-like deposits form. The pathogenicity of the pathogens is due to the disturbance and impairment of the nerve tissue.
Insgesamt wurden im Stand der Technik
erhebliche Bemühungen
unternommen, um Erkenntnisse zum Aufbau und zur Funktion des PrP-Gens
bzw PrP-Proteins bei Tier und Mensch zu gewinnen So wurde bspw das
PrP-Gen des Schafs 1998 von Lee et al. sequenziert. Die 31412 Bp
lange Sequenz ist in GenBank unter der Zugriffsnummer U67922 abgelegt.
Das PrP-Gen des Schafs (
Die 5'-UTR der vom ovinen PrP-Gen
codierten mRNA wird von den Exons 1, 2 und 3 kodiert und besteht
aus insgesamt 160 Bp (
Das Protein PrP beim Schaf besteht
aus 256 Aminosäuren,
einschließlich
des 24 Aminosäuren
umfassenden Signalpeptids. Auffällig
sind die 5 Wiederholungen eines meist 8 Aminosäuren umfassenden Motivs (Octapeptid)
ab Position 54 (
Im Stand der Technik sind mindestens 11 polymorphe Positionen im ovinen PrP-Gen bekannt (Tab. 1). Bei allen untersuchten Tieren wurde stets jeweils nur eine Abweichung vom Wildtyp gefunden, d. h eine mutierte Position Da die Aminosäure Glycin an Position 171 sowohl durch Arginin als auch durch Histidin substituiert sein kann, gibt es insgesamt 12 verschiedene allelische Varianten des ovinen PrP-Gens.In the prior art at least 11 polymorphic positions in the ovine PrP gene known (Tab. 1). at all animals examined were always only one deviation found of the wild type, d. h a mutated position Since the amino acid glycine substituted at position 171 with both arginine and histidine there are a total of 12 different allelic variants of the ovine PrP gene.
Die Übertragung von TSE gelingt nur, wenn eine Homologie zwischen dem PrP des Spenders und dem PrP des Wirtes vorhanden ist, die Aminosäuresequenzen also eine Mindestübereinstimmung besitzen (Wilkens 1997). Man spricht in diesem Zusammenhang bei Übertragungen zwischen Spezies von „Speziesbarriere" und bei Übertragungen innerhalb einer Spezies von „Polymorphismusbarriere". Die genetische Prädisposition spieh also bei der Übertragung der Erkrankung und deren Pathogenese eine wesentliche Rolle (vgl. auch Manson et al. 2000). Ausgeprägte Auswirkungen von DNA-Varianten innerhalb des PrP-Gens wurden beim Menschen beim Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (Hsiao et al. 1989) und der erblichen Creutzfeld-Jakob-Krankheit (Palmer et al. 1991) festgestellt.The transmission of TSE succeeds only if there is homology between the donor's PrP and the PrP of the host is present, that is, the amino acid sequences have a minimum match own (Wilkens 1997). In this context one speaks in the case of transmissions between species of "species barrier" and in transmissions within a species of "polymorphism barrier". The genetic predisposition so spit on the broadcast the disease and its pathogenesis play an essential role (see also Manson et al. 2000). pronounced Effects of DNA variants within the PrP gene have been observed in humans in Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome (Hsiao et al. 1989) and the hereditary Creutzfeld-Jakob disease (Palmer et al. 1991).
Drei der 11 polymorphen Positionen im Schaf-PrP (Codon 136: Valin oder Alanin, Codon 154: Histidin oder Arginin und Codon 171: Glutamin oder Histidin oder Arginin) wurden bei Untersuchungen der Assoziationen mit der Scrapie-Inkubationszeit einbezogen (Belt et al. 1995, Hunter et al. 1996). Für die Beschreibung der Haplotypen werden Kombination aus 3 Buchstaben verwendet (z. B. VRQ: Valin (V) an Position 136, Arginin (R) an Position 154 und Glutamin (Q) an Position 171). Da immer nur maximal eine Position gegenüber dem Wildtyp als mutiert gefunden wurde, treten insgesamt 5 Haplotypen mit den folgenden Bezeichnungen auf: VRQ, ARQ (Wildtyp), ARH, AHQ und ARR.Three of the 11 polymorphic positions in sheep PrP (codon 136: valine or alanine, codon 154: histidine or Arginine and Codon 171: glutamine or histidine or arginine) were when examining the associations with the scrapie incubation period included (Belt et al. 1995, Hunter et al. 1996). For the description of the Haplotypes are a combination of 3 letters (e.g. VRQ: valine (V) at position 136, arginine (R) at position 154 and Glutamine (Q) at position 171). Since only one position at a time compared to the Wild type when mutated was found, a total of 5 haplotypes occur with the following names: VRQ, ARQ (wild type), ARH, AHQ and ARR.
Aufgrund der Genotypisierung von zahlreichen an Scrapie erkrankten Tieren aus verschiedenen Rassen in verschiedenen Ländern wird davon ausgegangen, dass die Haplotypen VRQ und ARQ mit einer erhöhten Empfänglichkeit gegenüber Scrapie einhergehen. Dagegen zeigten Tiere mit dem PrP-Genotyp ARR/ARR, mit Ausnahme eines Falles in Japan, keine Anzeichen einer Scrapie-Erkrankung. Die selteneren Haplotypen AHQ und ARH werden hinsichtlich der Scrapie-Suszeptibilität als einem mittleren Bereich angehörig eingeordnet.Due to the genotyping of numerous animals from various breeds suffering from scrapie in different countries it is assumed that the haplotypes VRQ and ARQ with a increased responsiveness across from Scrapie go hand in hand. In contrast, animals with the PrP genotype ARR / ARR also showed Except for one case in Japan, no signs of scrapie disease. The rarer haplotypes AHQ and ARH are considered one in terms of scrapie susceptibility in the middle area classified.
Durch Kombination der 5 oben genannten Haplotypen erhält man 15 verschiedene Genotypen. Die schottische "Scrapie-Information Group" (Dawson et al. 1998) teilte diese 15 Genotypen unter Berücksichtigung der Rasse in 5 verschiedene Risikogruppen (R1 bis R5) ein (Tab. 2).By combining the 5 above Maintains haplotypes you have 15 different genotypes. The Scottish Scrapie Information Group "(Dawson et al. 1998) shared these 15 genotypes taking into account the breed into 5 different risk groups (R1 to R5) (Tab. 2).
Die Frequenzen der ORF-Varianten im PrP-Gen bei 15 Rassen wurden von Drögemüller et al. (2001) angegeben Die beobachteten Varianten des PrP-Gens waren stark rassenspezifisch. So kamen z. B. in der Rasse Texel mit Ausnahme von AHQ/AHQ alle 15 Genotypen vor, während in manchen Rassen nur zwei oder drei Genotypen beobachtet wurden In den Rassen Deutsches Weißkopf, Deutsches Schwarzkopf und Bleu du Maine hatten mehr als 50% der Tiere den Genotyp ARR/ARR. In vielen Rassen, wie Merinoland und Gotland, war dieser Genotyp nicht vertreten Der bei diesen Rassen relativ häufig auftretende Genotyp ARQ/AHQ war in den Rassen Deutsches Weißkopf, Deutsches Schwarzkopf und Bleu du Maine nicht zu beobachte.The frequencies of the ORF variants In the PrP gene in 15 breeds, Drögemüller et al. (2001) The observed variants of the PrP gene were highly race-specific. So came z. B. in the Texel breed with the exception of AHQ / AHQ all 15 genotypes before, during only two or three genotypes were observed in some breeds In the breeds German Whitehead, Deutsches Schwarzkopf and Bleu du Maine had more than 50% of the Animals of the ARR / ARR genotype. In many breeds, such as Merinoland and Gotland, this genotype was not represented in those breeds relatively common Genotype ARQ / AHQ was in the breeds Deutsches Weißkopf, Deutsches Not to watch Schwarzkopf and Bleu du Maine.
Während beim Schaf somit immerhin Anhaltspunkte für einen Zusammenhang von Krankheitsinzidenz und ORF-Polymorphismen gefunden werden konnten, erklären diese jedoch nicht vollständig die Scrapie-Verteilung und Rasse-spezifische Unterschiede (O'Doherty et al. 2000). Andererseits konnten im Fall von BSE (Rind) bisher keine (Hunter et al. 1994) bzw. nur geringe (Neibergs et al. 1994) Beziehungen zwischen PrP-Polymorphismen und der BSE-Inzidenz aufgezeigt werden Es wurden keine Aminosäuresubstitutionen im bovinen PrP gefunden, und eine stille Mutation und ein variables Repeat Motiv, das für ein Octapeptid im PrP codiert, sind bisher die einzigen bekannten Veränderlichkeiten im bovinen PrP-Gen.While in sheep, at least, there is evidence for a connection between disease incidence and ORF polymorphisms could be found, but these do not fully explain the Scrapie distribution and breed-specific differences (O'Doherty et al. 2000). On the other hand, so far in the case of BSE (cattle) none (Hunter et al. 1994) or only minor ones (Neibergs et al. 1994) Relationships between PrP polymorphisms and the BSE incidence. There were no amino acid substitutions found in bovine PrP, and a silent mutation and a variable Repeat motif that for an octapeptide encoded in the PrP are the only known so far variabilities in the bovine PrP gene.
Wie zuvor dargelegt, ist der Genotyp für das Infektionsrisiko mit TSE von größter Bedeutung. Hieraus ergibt sich die Notwendigkeit, den Genotyp bei Tier und Mensch frühzeitig zu bestimmen, um das Infektionsrisiko abschätzen zu können Im Falle der Tierzucht bildet darüber hinaus die Einteilung der Genotypen in Risikoklassen (Tab. 2) die Basis für Zuchtprogramme. Dabei soll für die Tierzucht unter einer schrittweisen Eliminierung von PrP-Allelen, die mit einer sehr hohen Scrapie-Suszeptibilität assoziert sind, auf Tiere mit dem resistenten Genotyp ARR/ARR gezüchtet werden (Drögemüller und Distl 2001).As stated earlier, the genotype is for the Infection risk with TSE is paramount. Hence the need for the genotype in animal and Man early To be determined in order to assess the risk of infection In the case of animal breeding educates about it In addition, the division of the genotypes into risk classes (Tab. 2) base for Breeding programs. It is said for animal breeding with gradual elimination of PrP alleles, associated with very high scrapie susceptibility to animals are bred with the resistant genotype ARR / ARR (Drögemüller and Distl 2001).
Mit der Untersuchung zu der genetischen Prädisposition des Erkrankungsrisikos für Schafe mit bestimmten Genotypen bzw. Haplotypen des auf Chromosom 13 lokalisierten PrP-Gens wurde eine Möglichkeit für züchterische Maßnahmen, wie Selektionsentscheidungen geschaffen Drei eng gekoppelte Polymorphismen in den Codons 136, 154 und 171 mit 5 bekannten Haplotypausprägungen (VRQ, ARQ, AHQ, ARH, ARR) zeigen eine enge Beziehung zur Erkrankungsrate (Inkubationszeit) mit Scrapie (Dawson et al. 1998). Die Untersuchung im PrP-Gen an den entsprechenden Positionen macht jedoch eine aufwendige Sequenzierung erforderlich, deren Kosten in 2001 in Deutschland bei ca. 50 DM pro Tier lagen.With the investigation of the genetic predisposition of the disease risk for sheep with certain genotypes or haplotypes of the PrP gene located on chromosome 13, a possibility for breeding measures, such as selection decisions, was created. Three closely coupled polymorphisms in codons 136, 154 and 171 with 5 known Haplotype forms (VRQ, ARQ, AHQ, ARH, ARR) show a close relationship to the disease rate (incubation period) with scrapie (Dawson et al. 1998). However, the examination in the PrP gene at the corresponding positions makes it complex sequencing required, the costs in 2001 in Germany were about 50 DM per animal.
Demnach erfolgt die Genotypisierung bei Tier und Mensch im Stand der Technik durch Sequenzierung, ein Verfahren, das relativ teuer und zeitaufwendig ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr, solche Verfahren zur Verfügung zu stellen, die eine einfachere, schnellere und insbesondere kostengünstigere Genotypisierung bei Mensch und Tier erlauben. Des weiteren ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren anzugeben, die es ermöglichen, in mit Erkrankungen, z.B. TSE, zusammenhängenden Genen Marker für eine Suszeptbilität für derartige Erkrankungen aufzufinden und diese für eine schnelle und kostengünstige Prädiagnostik einzusetzen.The genotyping is carried out accordingly in animals and humans in the prior art by sequencing Process that is relatively expensive and time consuming. Task of It is now the present invention to provide such methods make the genotyping easier, faster and, in particular, cheaper allow in humans and animals. Furthermore, it is the task of the present Invention to provide methods that make it possible to deal with diseases, e.g. TSE, related Genes markers for a susceptibility for such Find diseases and these for quick and inexpensive prediagnostics use.
Diese Aufgaben werden durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.These tasks are carried out by the in the claims featured embodiments solved the present invention.
Insbesondere wird unter einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Typisierung eines Gens, das einen oder mehrere polymorphe Mikrosatellitenloci aufweist, in einem Individuum bereitgestellt, umfassend die Schritte:
- (a) Amplifizieren mindestens eines DNA-Bereichs des zu typisierenden Gens durch PCR mit entsprechend der Größe des DNA Bereichs ausgewählten Primern, wobei der DNA-Bereich mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus enthält und als Matrize eine Probe des Individuums dient, enthaltend eine DNA, die mindestens einen Abschnitt des Gens mit dem/den polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci umaßt, und
- (b) Ermitteln der Länge des Amplifikats/der Amplifikate von Schritt (a).
- (a) Amplification of at least one DNA region of the gene to be typed by PCR with primers selected according to the size of the DNA region, the DNA region containing at least one polymorphic microsatellite locus and serving as a template a sample of the individual containing a DNA which contains at least encompasses a portion of the gene with the polymorphic microsatellite locus / loci, and
- (b) determining the length of the amplificate (s) from step (a).
Das erfindungsgemäße Genotypisierungsverfahren beruht auf der an sich bekannten Tatsache, daß im Genom von Eukaryoten Abschnitte auftreten, die vergleichsweise kurz sind und aus mehrfach wiederholten Sequenzmotiven bestehen. Die Zahl der Wiederholungen (auch als engt „Repeats" bezeichnet) des Motivs kann sich bei diesen mit "Mikrosatelliten" bezeichneten Abschnitten von Individuum zu Individuum unterscheiden. Mit der Zahl der Wiederholungen ändert sich daher auch die Länge des jeweiligen Mikrosatellitenlocus. Sind bei einer bestimmten Spezies die Anzahl von Sequenzmotivwiederholungen und somit die Länge des Mikrosatellitenlocus zwischen Individuen oder auch Rassen unterschiedlich, wird der Mikrosatellitenlocus als "polymorph" bezeichnet. Um daher Mikrosatellitenloci zur Typisierung einzelner Gene heranzuziehen, ist es daher zunächst zur Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens erforderlich, daß das zu typisierende, d.h. auf die Zugehörigkeit zu einer Gruppe bezüglich einer bestimmten Eigenschaft hin zu analysierende Gen mindestens einen Mikrosatellitenlocus, vorteilhafterweise mehrere Mikrosatellitenloci aufweist, der/die sich in ihrer Länge zwischen verschiedenen Individuen einer Spezies unterscheidet/unterscheiden, d.h. polymorph ist/sind.The genotyping method according to the invention is based on the fact that in the genome of eukaryotes there are sections occur that are comparatively short and consist of repeated sequence motifs consist. The number of repetitions (also called narrow "repeats" of the motif can be "microsatellites" differentiate designated sections from individual to individual. With the number of repetitions changes therefore also the length of the respective microsatellite locus. Are with a certain species the number of sequence motif repeats and thus the length of the Microsatellite locus different between individuals or races, the microsatellite locus is called "polymorphic". So therefore To use microsatellite loci for typing individual genes, therefore it is initially on the applicability of the typing method according to the invention required that the to be typed, i.e. on belonging to a group with respect to a specific property to be analyzed for at least one gene Microsatellite locus, advantageously several microsatellite loci which has a length between different Differentiates / distinguishes individuals of a species, i.e. polymorphous is / are.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens wird somit die Länge und damit indirekt die Anzahl der Wiederholungen des Sequenzmotivs des jeweiligen polymorphen Mikrosatellitenlocus bestimmt. Hierzu wird erfindungsgemäß für jeden Mikrosatellitenlocus ein diesen Locus umfassender Abschnitt bzw. Bereich der das zu typisierende Gen enthaltenden DNA, welcher den zu analysierenden Mikrosatellitenlocus umfaßt, mittels PCR vervielfältigt, d.h. amplifiziert.In the first step of the genotyping method according to the invention becomes the length and thus indirectly the number of repetitions of the sequence motif of the respective polymorphic microsatellite locus determined. For this according to the invention for everyone Microsatellite locus a section comprising this locus or Region of the DNA containing the gene to be typed, which the microsatellite locus to be analyzed, amplified by PCR, i.e. amplified.
Selbstverständlich ist dabei von einer Probe des jeweiligen Individuums auszugehen, die eine entsprechende DNA enthält, die mindestens einen Abschnitt des zu typisierenden Gens mit dem oder den polymorphen Mikrosatellitenlocus oder -loci umfaßt.Of course, one of them Sample of each individual to go out with a corresponding Contains DNA, the at least a section of the gene to be typed with the or the polymorphic microsatellite locus or loci.
Die Amplifikation erfolgt erfindungsgemäß durch PCR (engl. „polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion), wobei entsprechend dem jeweiligen zu vervielfältigenden DNA-Abschnitt bzw. -bereich ausgewählte Primer (kurze DNA-Oligonukleotide als Startermoleküle) eingesetzt werden. Die Technik der PCR ist einem Fachmann wohl bekannt und bspw. in Griffin und Griffin 2001 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt vollumfänglich in die vorliegende Erfindung eingeschlossen ist. Bei dieser Vorgehensweise dient somit die bereits vorstehend dargelegte Probe des Individuums als Matrize, spezifischerweise die darin enthaltene DNA. Die Amplifikation mittels PCR hat die für diese Methode charakteristischen Vorteile, insbesondere eine hohe Geschwindigkeit und die Tatsache, daß selbst geringste Mengen an Proben-DNA benötigt werden, wobei letztendlich ein einziges den entsprechenden Abschnitt des Gens enthaltendes DNA-Molekül ausreicht.The amplification takes place according to the invention by PCR (“polymerase chain reaction, polymerase chain reaction), whereby according to the each to be reproduced DNA section or area selected Primer (short DNA oligonucleotides used as starter molecules) become. The technique of PCR is well known to a person skilled in the art and described, for example, in Griffin and Griffin 2001, their disclosure content in this regard full is included in the present invention. With this approach the sample of the individual already presented above thus serves as a template, specifically the DNA it contains. The amplification by means of PCR this method characteristic advantages, especially a high Speed and the fact that even the smallest amounts of Sample DNA needed be, ultimately, a single section of the gene containing DNA molecule sufficient.
Ganz allgemein können als Probenquellen sämtliche DNA-haltigen Materialien des jeweiligen Individuums eingesetzt werden. Dazu zählen bspw Blut, Serum, Sekrete, wie Schweiß, Ejakulat usw., Synovialflüssigkeit, Fruchtwasser, Exkremente, Liquor usw. Es können aber auch einzelne Zellen oder Fragmente davon, bspw. einzelne Hautzellen, Haarwurzelzellen, die sich vorzugsweise an ausgerissenen bzw. -gefallenen Haaren befinden, usw verwendet werden.In general, all can be used as sample sources DNA-containing materials of the respective individual are used. These include e.g. blood, serum, secretions such as sweat, ejaculate etc., synovial fluid, Amniotic fluid, excrement, cerebrospinal fluid, etc. It can also be single cells or fragments thereof, for example individual skin cells, hair root cells, that are preferably on torn or fallen hair, etc. are used.
Der Ausdruck „Gen, das einen oder mehrere Mikrosatellitenloci aufweist" bedeutet, daß der betreffende Abschnitt des Genoms, der das zu typisierende Gen enthält, mindestens einen Mikrosatellitenlocus enthält, wobei dieser Abschnitt insbesondere Exon- und Intron-Bereiche des Gens sowie mit dem Gen zusammenhängende, insbesondere mit diesem vererbte, 5'- und 3'-Bereiche, bspw. solche Bereiche, die an der Regulation des betreffenden Gens beteiligt sind, umfaßt.The expression "gene which has one or more microsatellite loci" means that the relevant section of the genome which contains the gene to be typed contains at least one microsatellite locus, this section includes in particular exon and intron regions of the gene and regions which are connected, in particular inherited, 5 'and 3' regions, for example those regions which are involved in the regulation of the gene in question.
Die Größe des amplifizierten DNA-Abschnitts bzw. -bereichs ist erfindungsgemäß nicht besonders eingeschränkt. Für Mikrosatellitenpositionen sind Längen von etwa 50 bis etwa 500 Bp, insbesondere von etwa 50 bis etwa 300 Bp, bevorzugt.The size of the amplified section of DNA according to the invention is not particularly restricted. For microsatellite positions are lengths from about 50 to about 500 bp, especially from about 50 to about 300 Bp, preferred.
Im Schritt (b) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens wird die Länge des im Schritt (a) erhaltenen Amplifikats bzw. der Amplifikate festgestellt. Hierzu wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform vorteilhafterweise eine Elektrophorese, d.h. die Auftrennung der Amplifikate mit Hilfe eines elektrischen Feldes, durchgeführt. Als Trennmedium dient dabei vorzugsweise ein Gel, insbesondere Agarose- oder Polyacrylamidgele, deren Herstellung einem Fachmann geläufig ist; vgl. bspw. Maniatis 2001. Besonders bevorzugt ist insbesondere bei einer Länge der Amplifikate von etwa 50 bis etwa 300 Bp, deren Trennung in Gelen, die eine Auftrennung der Fragmente bis hinunter auf wenige oder gar 1 Bp ermöglichen. Derartige Gele werden bspw. auch bei der Sequenzierung von DNA-Molekülen verwendet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung automatischer Laser-Fluoreszenz-DNA Sequenziergeräte (bspw. A.L.F. von Pharmacia) mit entsprechenden Gelen (bspw. Hydrolink), wobei weiterhin die Verwendung interner und externer Standardfragmente, die im Handel erhältlich sind, oder in einfacher Weise mittels PCR ausgehend von einer bekannten Matrizen-DNA, wie bspw λ-DNA, hergestellt werden können, als Vergleich vorteilhaft ist.In step (b) of the genotyping method according to the invention becomes the length of the amplificate or amplificates obtained in step (a). According to a preferred embodiment advantageously electrophoresis, i.e. the separation of the Amplificates carried out with the help of an electric field. As Separation medium is preferably a gel, in particular agarose or polyacrylamide gels, the production of which is familiar to a person skilled in the art; see. For example, Maniatis 2001. Particularly preferred is a length the amplificates from about 50 to about 300 bp, their separation in gels, the a separation of the fragments down to a few or even Allow 1 bp. Such gels are also used, for example, in the sequencing of DNA molecules. The use of automatic laser fluorescence DNA is particularly advantageous sequencers (e.g. A.L.F. from Pharmacia) with corresponding gels (e.g. Hydrolink), the use of internal and external standard fragments, the commercially available are, or in a simple manner by means of PCR starting from a known Template DNA, such as λ DNA, can be made is advantageous as a comparison.
Erfahrungsgemäß ist die Anzahl der Wiederholungen des jeweiligen Sequenzmotivs ein grober Indikator für den Polymorphiegrad des Mikrosatellitenlocus. Selbstverständlich sind Mikosatellitenloci im allgemeinen umso informativer, d.h. ermöglichen die Einteilung der Indivuen in eine möglichst große Anzahl von Subspezies, je mehr verschiedene Mikosatellitenloci-Ausprägungen vorhanden sind, d.h. je mehr die Anzahl der Sequenzmotivwiederholungen im Mikrosatellitenlocus zwischen den einzelnen Individuen schwankt. Demgemäß ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn der bzw. die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci ein Sequenzmotiv aufweist aufweisen, das mindestens dreimal, mehr bevorzugt mindestens viermal, besonders bevorzugt mindestens fünfmal, wiederholt wird. Als Beispiele können polymorphe Mikrosatellitenloci genannt werden, die aus folgenden Konsensussequenzen ausgewählt sind: (ATA)7, (GA)7, (GT)28, (AGG)4, (AC)5, (TTTGT)5, (TA)7, (TC)5, (TAAA)12, (ATTTT)12, (TTTC)18, (CA)18, (CAGTT)4, (AGC)5, (GA)5, (TTTGT)4, (TCAGT)4, (TTCAG)4, (ACTGA)3, (ACTGA)4, (CA)12, (ATC)4, (T)25, (TTG)5, (T)2 9, (CAA)3, (TTCAG)3, (AGTG)4, (CAC)5, (AAAACA)4, (ACC)4, (ATCAG)5, (AC)3, (CTG)5, (GTT)5, (T)15, (CAA)4 und (AC)4.Experience has shown that the number of repetitions of the respective sequence motif is a rough indicator of the degree of polymorphism of the microsatellite locus. Of course, microsatellite loci are generally all the more informative, that is, the more individual microsocial loci are available, the more the number of sequence motif repetitions in the microsatellite locus fluctuates between the individual, the more the number of subspecies can be categorized. Accordingly, it is preferred according to the invention if the polymorphic microsatellite locus / loci has a sequence motif which is repeated at least three times, more preferably at least four times, particularly preferably at least five times. Polymorphic microsatellite loci which are selected from the following consensus sequences can be mentioned as examples: (ATA) 7 , (GA) 7 , (GT) 28 , (AGG) 4 , (AC) 5 , (TTTGT) 5 , (TA) 7 , (TC) 5 , (TAAA) 12 , (ATTTT) 12 , (TTTC) 18 , (CA) 18 , (CAGTT) 4 , (AGC) 5 , (GA) 5 , (TTTGT) 4 , (TCAGT) 4 , (TTCAG) 4 , (ACTGA) 3 , (ACTGA) 4 , (CA) 12 , (ATC) 4 , (T) 25 , (TTG) 5, (T) 2 9 , (CAA) 3 , (TTCAG) 3 , (AGTG) 4 , (CAC) 5 , (AAAACA) 4 , (ACC) 4 , (ATCAG) 5 , (AC) 3 , (CTG) 5 , (GTT) 5 , (T) 15 , (CAA) 4 and (AC) 4 .
Grundsätzlich läßt sich das erfindungsgemäße Typisierungsverfahren bei allen Genen durchführen, die mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus aufweisen. Dessen bzw. deren Sequenz und Position im zu typisierenden Gen kann einerseits bereits bekannt sein. Andererseits kann bzw können der/die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erst ermittelt werden.Basically, the typing method according to the invention can be perform on all genes that have at least one polymorphic microsatellite locus. Whose or their sequence and position in the gene to be typed can on the one hand already known. On the other hand, the polymorphic (s) Microsatellite locus / loci in a preferred embodiment of the method according to the invention be determined.
Vorzugsweise wird die Identifizierung
des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci wie folgt durchgeführt:
In
einem ersten Schritt (A) wird das zu typisierende Gen nach Mikrosatellitenloci
durchmustert, d.h. gescreent. Dazu ist im allgemeinen eine genomische
Sequenz des betreffenden Gens erforderlich, die mindestens einen Mikrosatellitenlocus
aufweist, Genomische Sequenzinformationen sind bezüglich einer
Vielzahl von Genen im Stand der Technik bekannt und insbesondere
in den Datenbanken von GenBank und des EMBL unter entsprechenden
Zugriffsnummern hinterlegt. Ist bspw. lediglich eine cDNA-Sequenz
verfügbar
oder auch nur EST-Sequenzen, ist es selbstverständlich einem Fachmann mit Hilfe
der gängigen
molekularbiologischen Verfahren möglich, die erforderliche genomische
Sequenzinformation zu gewinnen; siehe hierzu auch Maniatis et al. 2001.
Das Durchmustern der genomischen Sequenz nach Mikrosatellitenloci
erfolgt vorzugsweise mit entsprechend ausgelegten Computerprogrammen.
Als Beispiele geeigneter Software können die Programme etandem
aus dem Programmpaket EMBOSS (von HGMP-RC, London, Sputnik (Abijian
1994) und Software RepeatMasker (Smit und Green, http:://ftp.genome.washington.edu/cgibin/repeatmasker)
genannt werden. Andererseits ist es selbst dann, wenn bei einem
zu typisierenden Gen einer bestimmten Spezies nur sehr wenig oder
auch überhaupt
keine Sequenzinformation vorliegt, möglich, auch dieses Gen zu typisieren,
bzw. darin befindliche polymorphe Mikrosatellitenloci zu ermitteln,
wenn bei einer anderen Spezies die Gensequenz in ausreichendem Maß bekannt
ist und auch darin befindliche Mikrosatellitenloci identifiziert
wurden In diesem Fall können,
mit der Maßgabe,
daß eine
ausreichende Sequenzhomologie bezüglich des zu typisierenden Gens
zwischen den Spezies besteht, bspw. die bei der Spezies, bei dem
hinreichend Sequenzinformation zur Verfügung steht, verwendete Primer
auch bei der im Zuge der Typisierung des unbekannten Gens der anderen Spezies
durchzuführende
Amplifikation der entsprechenden DNA-Abschnitte verwendet werden.
In diesem Fall ist daher auch die Ermittlung von polymorphen Mikrosatellitenloci
in einem Gen, bei dem nur eine unvollständige oder auch überhaupt
keine (genomische) Sequenz vorliegt, möglich, ohne dieses Gen nach
Mikrosatellitenloci an sich zu durchmustern.The identification of the polymorphic microsatellite locus / loci is preferably carried out as follows:
In a first step (A), the gene to be typed is screened for microsatellite loci, ie screened. This generally requires a genomic sequence of the gene in question which has at least one microsatellite locus. Genomic sequence information relating to a large number of genes is known in the prior art and is in particular stored in the databases of GenBank and the EMBL under corresponding access numbers. For example, if only one cDNA sequence is available or only EST sequences, it is of course possible for a person skilled in the art to obtain the required genomic sequence information using the conventional molecular biological methods; see also Maniatis et al. 2001. The genomic sequence is preferably screened for microsatellite loci using appropriately designed computer programs. As examples of suitable software, the programs can be found in the program package EMBOSS (from HGMP-RC, London, Sputnik (Abijian 1994) and software RepeatMasker (Smit and Green, http :: //ftp.genome.washington.edu/cgibin/repeatmasker) On the other hand, even if there is very little or no sequence information at all for a gene to be typed from a certain species, it is possible to also type this gene or to determine polymorphic microsatellite loci located therein, if in another species the gene sequence is known to a sufficient extent and microsatellite loci located therein have also been identified. In this case, with the proviso that there is sufficient sequence homology with regard to the gene to be typed between the species, for example that of the species, sufficient sequence information is available is used, primer also used in the course of typing the unknown gene of the other S Specification to be performed amplification of the corresponding DNA sections can be used. In this case, it is therefore also possible to determine polymorphic microsatellite loci in a gene with only an incomplete or no (genomic) sequence at all, without screening this gene for microsatellite loci per se.
In einem (weiteren) Schritt (B) werden analog zum vorstehenden Schritt (a) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens die bei der Durchmusterung des Gens erhaltenen Mikrosatellitenloci entsprechende DNA-Bereiche (jeweils ein DNA-Abschnitt bzw. -bereich pro erhaltenem Mikrosatellitenlocus) bei einer Mehrzahl von Individuen des das zu typisierende Gen enthaltenden Organismus durch PCR amplifiziert, d.h. vervielfältigt. Bezüglich der Amplifikation gelten im übrigen die bereits vorstehend für den Schritt (a) des obigen Typisierungsverfahrens dargelegten Ausführungen.In a (further) step (B) analogous to the above step (a) of the invention Genotyping method the microsatellite loci obtained during the screening of the gene corresponding DNA areas (one DNA section or area per microsatellite locus obtained) in a plurality of individuals of the organism containing the gene to be typified amplified by PCR, ie amplified. With regard to the amplification, the statements made above for step (a) of the above typing method also apply.
Im nächsten Schritt (C) wird – analog zum Schritt (b) des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens – die Länge des Amplifikats bzw der Amplifikate ermittelt, die bei jedem Individuum erhalten wurden Für die Längenbestimmung der Amplifikate gelten im übrigen die obigen Ausführungen bezüglich Schritt (6) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens entsprechend Zusätzlich zur Ermittlung der Länge der erhaltenen Amplifikate bei jedem Individuum oder auch alternativ dazu kann erfindungsgemäß auch eine Sequenzierung des jeweiligen Amplifikats oder auch eines Abschnitts davon, der jedoch mindestens den Mikrosatellitenlocus selbst enthalten muß, durchgeführt werden. Geeignete Sequenzierungsverfahren sind einem Fachmann wohl bekannt und können insbesondere mittels automatisierter Sequenzierungsgeräte (z.B. A.L.F. von Pharmacia) realisiert werden.In the next step (C) - analog to step (b) of the typing method according to the invention - the length of the Amplificate or the amplificates determined in each individual were obtained for the length determination the rest of the amplificates apply the above statements in terms of Step (6) of the genotyping method according to the invention accordingly additional to determine the length of the amplificates obtained for each individual or alternatively according to the invention, a Sequencing of the respective amplificate or a section of which, however, contain at least the microsatellite locus itself must be performed. Suitable sequencing methods are well known to a person skilled in the art and can in particular by means of automated sequencing devices (e.g. A.L.F. by Pharmacia).
Schließlich werden die Längen der Amplifikate zwischen den Individuen bzw die erhaltenen Nukleotidsequenzen miteinander verglichen Somit wird im letzten Schritt (D) der oder die Mikrosatellitenlocus/loci ermittelt, dessen bzw deren Amplifikat(e) eine zwischen den Individuen unterschiedliche Länge aufweist/aufweisen oder dessen bzw. deren Nukleotidsequenz(en) zwischen den Individuen unterschiedlich ist/sind. Diese zwischen den Individuen unterschiedlichen Mikrosatellitenloci (bezüglich denen daher verschiedene Allele existieren) sind somit polymorph. Wie berets vorstehend dargelegt, können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens die unterschiedlichsten Gene typisiert werden Voraussetzung ist lediglich, daß das zu typisierende Gen mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus enthält. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Typisierungsverfahren bei Genen angewandt, die direkt oder indirekt mit der Ausprägung eines nachteiligen oder aber vorteilhaften Merkmals eines Organismus assoziiert sind. Hinsichtlich der nachteiligen Ausprägung eines Merkmals sind hier insbesondere Gene zu nennen, die mit einer Erkrankung oder anderen medzinisch oder wirtschaftlich (bspw bei (Nutz-) Tieren) bedeutsamen Merkmalen assoziiert sind Spezifische Beispiele von derartigen Genen sind PrP (BSE-Erkrankungen, wie Scrapie beim Schaf, BSE beim Rind, Creutzfeld-Jakob-Krankheit beim Menschen), CFTR (zystische Fibrose), Gene, die mit Stoffwechselerkrankungen bei Mensch und Tier assoziiert sind, wie α-Manosidose, Pompe-Krankheit, Zitrullinämie und Bovine Leukozytäre Adhäsionsdefizienz beim Rind (jeweils ein defektes Gen, dessen Varianten auf DNA-Niveau unterscheidbar sind), Stressanfälligkeit (Malignes Hyperthermie Syndrom) beim Schwein (RYR1-Gen, Variante T), Gene, die Milchproteine, Hormone oder Transkriptionsfaktoren kodieren usw Auch bezüglich des Organismus, dessen jeweiliges Gen typisiert werden soll, bestehen erfindungsgemäß keinerlei Einschränkungen, da in allen eukaryotischen Genen Mikrosatellitenloci zu finden sind. Aufgrund wirtschaftlicher bzw wissenschaftlicher Überlegungen sind als bevorzugte Beispiele von Organismen u.a. Mensch, Affe, Pferd, Schaf, Rind, Schwein, Ziege, Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Hund, Katze und Huhn zu nennen.Finally, the lengths of the Amplificates between the individuals or the nucleotide sequences obtained compared with each other So in the last step (D) the or the microsatellite locus / loci determined, its or its amplificate (s) has / have a different length between the individuals or its nucleotide sequence (s) differ between individuals is / are. These microsatellite loci differ between individuals (in terms of which therefore have different alleles) are polymorphic. As already explained above, using the typing method according to the invention the most diverse genes are typed prerequisite just that the gene to be typed at least one polymorphic microsatellite locus contains. The typing method according to the invention is preferred applied to genes that directly or indirectly with the expression of a disadvantageous or advantageous feature of an organism associated are. With regard to the disadvantageous expression of a feature are here especially to mention genes associated with a disease or other important from a medical or economic point of view (e.g. in (farm) animals) Traits are associated with specific examples of such genes are PrP (BSE diseases, such as scrapie in sheep, BSE in cattle, Creutzfeld-Jakob disease in humans), CFTR (cystic fibrosis), Genes associated with metabolic disorders in humans and animals are like α-manosidosis, Pompe disease, citrullinemia and Bovine leukocytic adhesion deficiency in cattle (each a defective gene, its variants at the DNA level are distinguishable), susceptibility to stress (Malignant hyperthermia syndrome) in pigs (RYR1 gene, variant T), genes, milk proteins, hormones or transcription factors encode and so on of the organism whose respective gene is to be typed none according to the invention Limitations, because microsatellite loci can be found in all eukaryotic genes. Due to economic or scientific considerations are preferred examples of organisms and others. Man, monkey, Horse, sheep, cattle, pig, goat, mouse, rat, rabbit, guinea pig, To name dog, cat and chicken.
Aufgrund der Verfügbarkeit vielfältiger Sequenzinformationen und der Bedeutsamkeit bei Populationsstudien, ist ein besonders bevorzugtes Zielgen der erfindungsgemäßen Verfahren das bereits oben beschriebene PrP-Gen, welches mit TSE-Erkrankungen, die bei Menschen sowie anderen Säugerspezies auftreten, in Zusammenhang steht. Insbesondere wird das erfindungsgemäße Genotypisierungsverfahren auf das PrP-Gen des Menschen angewandt, wobei das bzw. die Sequenzmotiv(e) des/der polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci aus folgenden Konsensussequenzen ausgewählt sind: (ATA)7, (GA)7, (GT)28, (AGG)4, (AC)5, (TTTGT)5, (TA)7, (TC)5, (TAAA)12, (ATTTT)12, (TTTC)18 und (CA)18.Due to the availability of diverse sequence information and the importance in population studies, a particularly preferred target gene of the method according to the invention is the PrP gene already described above, which is associated with TSE diseases which occur in humans and other mammalian species. In particular, the genotyping method according to the invention is applied to the human PrP gene, the sequence motif (s) of the polymorphic microsatellite locus / loci being selected from the following consensus sequences: (ATA) 7 , (GA) 7 , ( GT) 28 , (AGG) 4 , (AC) 5 , (TTTGT) 5 , (TA) 7 , (TC) 5 , (TAAA) 12 , (ATTTT) 12 , (TTTC) 18 and (CA) 18 .
Besonders bevorzugt sind die Konsensussequenzen (ATA)7, (GA)7, (GT)28, (TAAA)12, (ATTTT)12 und (CA)18.The consensus sequences (ATA) 7 , (GA) 7 , (GT) 28 , (TAAA) 12 , (ATTTT) 12 and (CA) 18 are particularly preferred.
Weiterhin ist es hinsichtlich des PrP-Gens des Menschen bevorzugt, wenn der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens die Nukleotide 3621 bis 3641, 25415 bis 25428, 39450 bis 39505, 50315 bis 50326, 58346 bis 58385, 72392 bis 72416, 78300 bis 78313, 92615 bis 92624, 108429 bis 108476, 116907 bis 116966, 125528 bis 125599 und/oder 147980 bis 148015 gemäß GenBank Zugriffsnummer AL133396 umfaßt/umfassen. Insbesondere sind zur erfindungsgemäßen Genotypisierung DNA-Bereiche zur Amplifikation gemäß Schritt (a) bevorzugt, welche die Nukleotide 3621 bis 3641, 25415 bis 25428, 39450 bis 39505, 108429 bis 108476, 116907 bis 116966 und/oder 147980 bis 148015 gemäß GenBank Zugriffsnummer AL133396 umfassen.Furthermore, it is regarding the Human PrP gene preferred when the amplified DNA region (s) in step (a) of the genotyping method according to the invention nucleotides 3621 to 3641, 25415 to 25428, 39450 to 39505, 50315 to 50326, 58346 to 58385, 72392 to 72416, 78300 to 78313, 92615 to 92624, 108429 to 108476, 116907 to 116966, 125528 to 125599 and / or 147980 to 148015 according to GenBank accession number AL133396 comprises / comprise. In particular, DNA regions are for genotyping according to the invention for amplification according to step (a) preferred which the nucleotides 3621 to 3641, 25415 to 25428, 39450 to 39505, 108429 to 108476, 116907 to 116966 and / or 147980 to 148015 according to GenBank Include access number AL133396.
Bevorzugte Sequenzmotive des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci des PrP-Gens des Rindes weisen die folgenden Konsensussequenzen auf: (CAGTT)4, (TC)5, (AGC)5, (GA)5, (TTTGT)4, (TCAGT)4, (TTCAG)4, (ACTGA)3, (AGTGA)4, (CA)12, (ATC)4, (T)25, (TTG)5, (T)29, (CAA)3, (TTCAG)3, (AGTG)4, (CAC)5, (AAAACA)4, (ACC)4, (ATCAG)5 und (AC)3.Preferred sequence motifs of the polymorphic microsatellite locus / loci of the bovine PrP gene have the following consensus sequences: (CAGTT) 4 , (TC) 5 , (AGC) 5 , (GA) 5 , (TTTGT) 4 , (TCAGT) 4 , (TTCAG) 4 , (ACTGA) 3 , (AGTGA) 4 , (CA) 12 , (ATC) 4 , (T) 25 , (TTG) 5 , (T) 29 , (CAA) 3 , (TTCAG) 3 , (AGTG) 4 , (CAC) 5 , (AAAACA) 4 , (ACC) 4 , (ATCAG) 5 and (AC) 3 .
Besonders bevorzugt sind dabei die Konsensussequenzen (AGC)5, (TTTGT)4, (CA)12, (T)25, (T)29, (TTCAG)3, (AAAACA)4 und (ATCAG)5.The consensus sequences (AGC) 5 , (TTTGT) 4 , (CA) 12 , (T) 25 , (T) 29 , (TTCAG) 3 , (AAAACA) 4 and (ATCAG) 5 are particularly preferred.
Beim PrP-Gen des Rindes werden vorzugsweise DNA-Bereiche amplifiziert, welche die Nukleotide 444 bis 463, 4121 bis 4130, 7615 bis 7629, 19808 bis 19817, 25288 bis 25307, 30633 bis 30652, 32320 bis 32339, 37891 bis 37910, 39943 bis 39957, 44220 bis 44239, 44507 bis 44530, 46259 bis 46278, 48409 bis 48420, 50471 bis 50495, 53219 bis 53233, 54990 bis 55018, 60452 bis 60460, 62703 bis 62717, 64685 bis 64700, 66178 bis 66192, 68762 bis 68785, 68926 bis 68937, 72474 bis 72498 und/oder 74333 bis 74340 gemäß GenBank Zugriffsnummer AJ298878 umfassen. Mehr bevorzugt umfassen die amplifizierten DNA-Bereiche des PrP-Gens des Rindes die Nukleotide 7615 bis 7629, 25288 bis 25307, 44507 bis 44530, 50471 bis 50495, 54990 bis 55018, 62703 bis 62717, 68762 bis 68785 und/oder 72474 bis 72498 gemäß GenBank Zugriffsnummer AJ298878.In the bovine PrP gene, DNA regions which comprise the nucleotides are preferably amplified 444 to 463, 4121 to 4130, 7615 to 7629, 19808 to 19817, 25288 to 25307, 30633 to 30652, 32320 to 32339, 37891 to 37910, 39943 to 39957, 44220 to 44239, 44507 to 44530, 46259 to 46278, 48409 to 48420, 50471 to 50495, 53219 to 53233, 54990 to 55018, 60452 to 60460, 62703 to 62717, 64685 to 64700, 66178 to 66192, 68762 to 68785, 68926 to 68937, 72474 to 72498 and / or 74333 to 74340 according to GenBank access number Include AJ298878. More preferably, the amplified DNA regions of the bovine PrP gene comprise nucleotides 7615 to 7629, 25288 to 25307, 44507 to 44530, 50471 to 50495, 54990 to 55018, 62703 to 62717, 68762 to 68785 and / or 72474 to 72498 according to GenBank accession number AJ298878.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim zu typisierenden Gen um das PrP-Gen des Schafs. Vorzugsweise weisen dabei die polymorphen Mikrosatellitenloci die folgenden Sequenzmotive (Konsensussequenzen) auf: (CAGTT)4, (TC)5, (AGC)5, (GA)5, (TTTGT)4, (TCAGT)4, (ACTGA)3, (ACTGA)4, (CA)12, (CTG)5, (ATC)4, (GTT)5, (TTG)5, (T)15, (CAA)3, (CAA)4, (TTCAG)3, (AGTG)5, (CAC)5, (ACC)4 und (AC)4. Besonders bevorzugt sind Mikrosatellitenloci im PrP-Gen des Schafs mit den Konsensussequenzen (GA)5, (TTTGT)4, (CA)12, (GTT)5, (T)15 und (CAA)4.According to a further preferred embodiment, the gene to be typed is the PrP gene of the sheep. The polymorphic microsatellite loci preferably have the following sequence motifs (consensus sequences): (CAGTT) 4 , (TC) 5 , (AGC) 5 , (GA) 5 , (TTTGT) 4 , (TCAGT) 4 , (ACTGA) 3 , ( ACTGA) 4 , (CA) 12 , (CTG) 5 , (ATC) 4 , (GTT) 5 , (TTG) 5 , (T) 15 , (CAA) 3 , (CAA) 4 , (TTCAG) 3 , ( AGTG) 5 , (CAC) 5 , (ACC) 4 and (AC) 4 . Microsatellite loci in the sheep's PrP gene with the consensus sequences (GA) 5 , (TTTGT) 4 , (CA) 12 , (GTT) 5 , (T) 15 and (CAA) 4 are particularly preferred.
Bei der erfindungsgemäßen Typisierung des Schaf-PrP-Gens umfassen die gemäß obigem Schritt (a) amplifizierten DNA-Bereiche die Nukleotide 301 bis 320, 590 bis 613, 1033 bis 1047, 2477 bis 2496, 4651 bis 4662, 6627 bis 6641, 9433 bis 9447,11277 bis 11291,16748 bis 16756,18100 bis 18119,19372 bis 19386, 21383 bis 21398, 22853 bis 22867, 25422 bis 25433, 25580 bis 25591 und/oder 30168 bis 30175 gemäß GenBank Zugriffsnummer U67922, sowie sieben weitere genomische DNA-Bereiche, die 5' der in U57922 offenbarten Sequenz gelegen sind und für die kein GenBank-Eintrag exisitiert. Besonders bevorzugt amplifizierte DNA-Bereiche des Schaf-PrP-Gens umfassen die Nukleotide 590 bis 613, 6627 bis 6641, 11277 bis 11291 und/oder 25422 bis 25433 gemäß GenBank-Zugriffsnummer U67922, sowie sieben weitere genomische DNA-Bereiche, die 5' der in U67922 offenbarten Sequenz gelegen sind und für die kein GenBank-Eintrag exisitiert.In the typing according to the invention of the sheep PrP gene include those amplified according to step (a) above DNA regions the nucleotides 301 to 320, 590 to 613, 1033 to 1047, 2477 to 2496, 4651 to 4662, 6627 to 6641, 9433 to 9447.11277 to 11291.16748 to 16756, 18100 to 18119, 19372 to 19386, 21383 to 21398, 22853 to 22867, 25422 to 25433, 25580 to 25591 and / or 30168 to 30175 according to GenBank Accession number U67922, as well as seven other genomic DNA areas, the 5 'of the sequence disclosed in U57922 are located and for which none GenBank entry exists. DNA regions of the sheep PrP gene are particularly preferably amplified include nucleotides 590 to 613, 6627 to 6641, 11277 to 11291 and / or 25422 to 25433 according to GenBank accession number U67922, as well as seven other genomic DNA regions, the 5 'of are located in U67922 sequence and for which no GenBank entry exists.
Unter dem Gesichtspunkt der Genotypisierung wird somit erfindungsgemäß die Verwendung von Mikrosatelliten zur Typisierung von Genen bereitgestellt. Dabei werden erstmalig insbesondere im PrP-Gen von Mensch, Rind und Schaf Mikrosatelliten bereitgestellt, die sich zwischen den Individuen der einzelnen Spezies unterscheiden, d.h. polymorph sind, also bezüglich dieser Mikrosatellitenloci mehrere verschiedene Allele existieren.From the point of view of genotyping is thus the use according to the invention provided by microsatellites for typing genes. there are for the first time in particular in the PrP gene of humans, cattle and sheep Microsatellites deployed between the individuals of the individual species, i.e. are polymorphic Microsatellite loci several different alleles exist.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt der folgenden Erfindung wird das vorstehend beschriebene Genotypisierungsverfahren in einem Verfahren verwendet, das geeignet ist, Mikrosatelliten Marker für die Prädisposition eines Individuums bezüglich einer Erkrankung zu ermitteln, wobei die Erkrankung mit einem Gen assoziiert ist, das einen oder mehrere polymorphe Mikrosatellitenloci aufweist.From another point of view The following invention uses the genotyping method described above used in a process that is suitable for microsatellites Markers for the predisposition of an individual regarding to determine a disease, the disease with a gene is associated with one or more polymorphic microsatellite loci having.
In einem ersten Schritt (i) dieses Identifizierungsverfahrens wird das entsprechende Gen bei einer Mehrzahl von Individuen gemäß dem vorstehend beschriebenen Typisierungsverfahren typisiert. Hinsichtlich besonderer Ausführungsformen dieses Typisierungsverfahrens wird auf die vorstehenden Ausführungen unter dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung verwiesen Von jedem der Mehrzahl von Individuen ist dabei bspw. bekannt, daß es die Erkrankung, bspw. vorstehend genannte Erkrankungen, aufweist oder nicht. Zusätzlich oder alternativ dazu kann, bspw. aus im Stand der Technik bekannten Untersuchungen der jeweiligen Erkrankung mit anderen genetischen Markern, bspw. ORF-Polymorphismen, Restriktionsfragmentlängen Polymorphismen usw., von jedem einzelnen Individuum der Mehrzahl von Individuen bekannt sein, daß das jeweilige Individuum einen bestimmten Prädispositionsgrad für die Erkrankung aufweist. Ein spezifisches Beispiel für eine derartige Beziehung zwischen bekannten genetischen Markern und dem Prädispositionsgrad einer Erkrankung kann der vorstehend beschriebene ORF-Polymorphismus im ovinen PrP-Gen genannt werden (vgl. Tab. 1 und 2). Vorzugsweise werden im Schritt (i) mindestens 100, besonders bevorzugt 500 oder mehr Individuen genotypisiert.In a first step (i) this The corresponding gene identification procedure is used in a majority of individuals according to the above typing method described typed. Regarding special embodiments this typing procedure is based on the above referred to in the first aspect of the invention by everyone the majority of individuals know, for example, that it is the Disease, for example diseases mentioned above, or Not. In addition or alternatively, for example from examinations known in the prior art the respective disease with other genetic markers, e.g. ORF polymorphisms, restriction fragment length polymorphisms, etc., from be known to every single individual of the plurality of individuals, that this each individual has a certain degree of predisposition to the disease having. A specific example of such a relationship between known genetic markers and the degree of predisposition a disease can be the ORF polymorphism described above in the ovine PrP gene (see Tables 1 and 2). Preferably in step (i) at least 100, particularly preferably 500 or genotyped more individuals.
In einem weiteren Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens für Mikrosatelliten Marker werden die Genotyhäufigkeiten für jeden polymorphen Mikrosatellitienlocus bei den Individuen, von denen bekannt ist, daß sie erkrankt sind oder nicht bzw. einen bestimmten Prädispositionsgrad für die Erkrankung aufweisen, bestmmmt.In a further step (ii) of the identification method according to the invention for microsatellite markers become the genotype frequencies for each polymorphic microsatellite locus in the individuals, of which is known that they are ill or not or a certain degree of predisposition for the Have disease, determined.
Schließlich wird im letzten Schritt (iii) festgestellt, bei welchen der polymorphen Mikrosatellitenloci eine aufgrund der im vorherigen Schritt (ii) bestimmten Genotyphäufigkeiten die größte statistische Signifikanz für das Merkmal "krank" bzw. "nicht krank" bzw. für den bekannten bestimmten Prädispositionsgrad besteht. Wird bspw. eine Ausprägung des polymorphen Mikrosatellitenlocus ausschließlich bei gesunden, d.h. an der betreffenden Erkrankung nicht leidenden Individuen gefunden und ist somit die Häufigkeit dieses Genotyps, d.h. dieses Allels, bei nicht erkrankten Individuen erhöht bzw. besonders hoch, wird der betreffende polymorphe Mikrosatellitenlocus als Marker für eine fehlende Prädisposition für die Erkrankung geeignet sein und somit ausgewählt werden. Im Gegensatz dazu wird eine Ausprägung, d.h. ein Allel, eines Mikrosatellitenlocus, welche ausschließlich oder gehäuft bei erkrankten Individuen angetroffen wird als Mikrosatelliten-Marker für eine erhöhte Prädisposition für die betreffende Erkrankung ausgewählt werden. Zwischen diesen Extremen, d.h. ausschließlich bei gesunden oder ausschließlich bei erkrankten Individuen auftretende Ausprägungen, sind selbstverständlich auch Zwischenstufen, die dennoch mit einem bestimmten Prädispositionsgrad korrelieren, möglich. Der bestimmte Prädispositinsgrad kann, wie vorstehend bereits dargelegt, auch erfindungsgemäß aufgrund anderer genetischer Marker, die bekanntermaßen mit einem bestimmten Prädispositionsgrad korrelieren, in Beziehung gebracht werden. Als Beispiel sei hier wiederum der im ovinen PrP-Gen bekannte ORF-Polymorphismus genannt. Beim im Stand. der Technik bekannten ORF-Polymorphismus im ovinen PrP-Gen kann aufgrund der Genotypisierung von zahlreichen an Scrapie erkrankten Schafen verschiedener Rassen und in verschiedenen Ländern davon ausgegangen werden, daß die ORF-Allele (ORF: engt „open reading frame", offenes Leseraster, d.h. Varianten in Protein codierenden Genbereichen) VRQ und ARQ mit einer stark erhöhten Scrapie-Empfänglichkeit verbunden sind. Dagegen zeigten Tiere mit dem Genotyp ARR/ARR eine besonders hohe Scrapie-Resistenz (mit Ausnahme einer Beobachtung in Japan wurde bei Schafen mit dem Genotyp ARR/ARR niemals eine Scrapie-Erkrankung festgestellt). Die anderen beschriebenen ORF-Allele werden bezüglich der Scrapie-Empfänglichkeit dazwischen angeordnet (vgl. Dawson et al. 1998, Bunter et al. 2000).Finally, in the last step (iii) it is determined in which of the polymorphic microsatellite loci there is the greatest statistical significance for the characteristic “sick” or “not sick” or for the known specific degree of predisposition on the basis of the genotype frequencies determined in the previous step (ii) , If, for example, an expression of the polymorphic microsatellite locus is found exclusively in healthy individuals, ie individuals who do not suffer from the disease in question, and the frequency of this genotype, ie this allele, is increased or particularly high in non-diseased individuals, the polymorphic microsatellite locus in question is used as a marker be suitable for a lack of predisposition to the disease and thus be selected. In contrast, a variant, ie an allele, of a microsatellite locus that is found exclusively or frequently in diseased individuals is selected as a microsatellite marker for an increased predisposition to the disease in question. Between these extremes, ie from Finally, in the case of healthy manifestations or those occurring exclusively in diseased individuals, intermediate stages are of course also possible, which nevertheless correlate with a certain degree of predisposition. As already explained above, the specific degree of predisposition can also be related to the invention on the basis of other genetic markers which are known to correlate with a specific degree of predisposition. As an example, the ORF polymorphism known in the ovine PrP gene may be mentioned here. In the case of the ORF polymorphism in the ovine PrP gene known in the prior art, it can be assumed on the basis of the genotyping of numerous sheep of various breeds from various breeds and in different countries that the ORF alleles (ORF: narrowed “open reading frame”, open reading frame, ie variants in protein coding gene regions) VRQ and ARQ are associated with a greatly increased susceptibility to scrapie, whereas animals with the genotype ARR / ARR showed a particularly high scrapie resistance (with the exception of one observation in Japan, sheep with the Genotype ARR / ARR never found a scrapie disease.) The other ORF alleles described are arranged in terms of scrapie susceptibility (see Dawson et al. 1998, Bunter et al. 2000).
Desweiteren liegen die vorstehend beschriebenen polymorphen Mikrosatellitenpositionen beim ovinen PrP-Gen im Bereich dieses Gens (mit der Maßgabe, daß das ovine PrP-Gen keine Insertionen gegenüber dem bovinen PrP-Gen in diesem Bereich aufweist, ist der am weitesten 5' gelegene Mikrosatellitenlocus ist nur 29 kBp von Exon 1 entfernt; der am weitestens in 3' gelegene Mikrosatellitenlocus liegt sogar im Exon 3) und ihre Vererbung ist daher sehr eng mit derjenigen der ORF-Varianten gekoppelt. Daher werden sich Kopplungsbrüche derart selten ereignen, daß sie sich innerhalb von Rassen nicht beobachten lassen. Somit kann ausgehend von den statistisch hervorragend abgesicherten ORF-Genotypisierungen in Verbindung mit deren Kopplung mit den polymorphen Mikrosatellitenpositionen im Schaf-PrP-Gen mit Sicherheit auf eine Assoziation der Mikrosatelliten-Varianten mit der Scrapie-Resistenz oder -Suszeptibilität geschlossen werden, die in gleicher Größenordnung wie die zu den ORF-Varianten liegt. Dies wird durch die im nachfolgenden Ausführungsbeispiel 3 gefundene direkte experimentelle Evidenz bestätigt. Das Beispiel des ovinen PrP-Gens läßt sich selbstverständlich auf andere genetische Marker in anderen Genen und anderen Organismen sinngemäß übertragen, was einem Fachmann keinerlei theoretische oder experimentelle Schwierigkeiten bereiten wird.Furthermore, the above are described polymorphic microsatellite positions in the ovine PrP gene in the region of this gene (with the proviso that the ovine PrP gene has no insertions across from which has the bovine PrP gene in this area is the farthest 5 'microsatellite locus is only 29 kbp from exon 1; the microsatellite locus furthest in 3 'is even located in exon 3) and their inheritance is therefore very close to that of the ORF variants coupled. Therefore, coupling breaks will be like this seldom happen that they cannot be observed within races. Thus, outgoing from the statistically excellent verified ORF genotyping in conjunction with their coupling to the polymorphic microsatellite positions in the sheep PrP gene with certainty on an association of the microsatellite variants with the scrapie resistance or susceptibility that are in same order of magnitude how it is with the ORF variants. This is explained in the following embodiment 3 direct experimental evidence found confirmed. The example of the ovine PrP gene can be Of course to other genetic markers in other genes and other organisms transferred analogously, which has no theoretical or experimental difficulties for a person skilled in the art will prepare.
Bezüglich der Organismen und Gene, bei denen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ermittlungsverfahrens Mikrosatelliten-Marker identifiziert werden sollen, bestehen daher keinerlei Einschränkungen. Bevorzugte Organismen bzw. Gene sind vorstehend hinsichtlich des Genotypisierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ausführlich dargelegt.Regarding organisms and genes, in which with the aid of the inventive detection method microsatellite markers there are therefore no restrictions to be identified. Preferred organisms or genes are above in terms of The genotyping method of the present invention is detailed.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prädiagnostik von Erkrankungen. Die Erkrankungen sind dabei mit einem Gen assoziiert, das mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus aufweist. Das Prädiagnostik Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt zunächst wiederum einen Typisierungsschritt (1), der mit Hilfe des vorstehend definierten Genotypisierungsverfahrens durchgeführt wird. Dabei wird das Gen eines zu untersuchenden Individuums bezüglich eines oder mehrerer Mikrosatellitenlocus/loci, der/die ein Marker für den Prädispositionsgrad bezüglich der jeweiligen Erkrankung ist sind, typisiert. In einem weiteren Schritt (2) wird dann der erhaltene Genotyp mit dem diesem Genotyp zugewiesenen Prädispositionsgrad bezüglich der Erkrankung verglichen.Another aspect of the present The invention relates to a method for the pre-diagnosis of diseases. The diseases are associated with a gene that at least has a polymorphic microsatellite locus. The pre-diagnosis The method of the present invention initially again comprises a typing step (1) using the genotyping method defined above carried out becomes. The gene of an individual to be examined is related to a or more microsatellite locus / loci, which is a marker for the degree of predisposition in terms of the respective disease is typed. In another Step (2) then becomes the genotype obtained with that genotype assigned predisposition level in terms of compared to the disease.
Bevorzugt werden die Mikrosatelliten-Marker bei diesem Prädiagnostikverfahren mit Hilfe des oben beschriebenen Identifizierungsverfahrens ermittelt. Somit gelten bezüglich der Gene, Organismen usw. die oben unter dem jeweiligen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung dargelegten Ausführungen.The microsatellite markers are preferred in this pre-diagnostic procedure determined using the identification procedure described above. Thus, regarding of genes, organisms, etc., from the point of view above embodiments of the present invention.
Das erfindungsgemäße Prädiagnostikverfahren wird insbesondere zur TSE-Prädiagnostik eingesetzt, wobei besonders das humane PrP-Gen, das bovine PrP-Gen sowie das ovine PrP-Gen bevorzugt sind Bei der Prädiagnostik des humanen PrP-Gens werden geeigneterweise polymorphe Mikrosatellitenloci eingesetzt, die eines der Sequenzmotive aufweisen, die vorstehend bezüglich des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens angegeben sind Bevorzugte amplifizierte DNA-Bereiche bei der TSE-Diagnostik beim Menschen sind ebenfalls oben unter dem Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens angegeben. Im Fall des Rinder-PrP-Gens werden polymorphe Mikrosatellitenloci bevorzugt, welche die vorstehend hinsichtlich des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens angegebenen Sequenzmotive aufweisen. Dabei bevorzugt amplifizierte DNA-Bereiche umfassen die vorstehend hinsichtlich des Typisierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung definierten Positionen. Bei der Scrapie-Prädiagnostik (PrP-Gen des Schafs) werden vorteilhafterweise polymorphe Mikrosatellitenloci mit Sequenzmotiven verwendet, deren Konsensussequenzen ebenfalls vorstehend beim Typisierungsverfahren aufgelistet sind. Hinsichtlich bevorzugter Positionen derartiger Mikrosatellitenloci im Schaf-PrP-Gen, die geeigneterweise bei der zunächst durchgeführten Genotypisierung im erfindungsgemäßen Prädiagnostik-Verfahren amplifiziert werden, wird ebensfalls auf die obigen Ausführungen zum Typisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwiesen.The prediagnostic method according to the invention is particularly useful for TSE prediagnostics used, especially the human PrP gene, the bovine PrP gene as well as the ovine PrP gene are preferred in prediagnostics of the human PrP gene are suitably polymorphic microsatellite loci used, which have one of the sequence motifs, the above in terms of the typing method according to the invention Preferred amplified DNA regions for TSE diagnostics are specified in humans are also above from the point of view of the typing method according to the invention specified. In the case of the bovine PrP gene, polymorphic microsatellite loci are used preferred which the above with regard to the typing method according to the invention have specified sequence motifs. Preferably amplified DNA regions include those above regarding the typing procedure positions defined by the present invention. With scrapie prediagnostics (Sheep PrP gene) are advantageously polymorphic microsatellite loci used with sequence motifs, their consensus sequences also are listed above in the typing procedure. Regarding preferred positions of such microsatellite loci in the sheep PrP gene, which suitably at first conducted Genotyping in the prediagnostic method according to the invention are amplified, is also based on the above statements on Typing methods of the present invention are referenced.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend beschriebenen Figuren und Tabellen näher erläutert:The present invention is accomplished by the figures and tables described below are explained in more detail:
In
In
In
In
In
In den
Eine Besonderheit war bei Locus S24
zu beobachten. Bei 25 Merinolandschafen trat ein Fragment mit der
Länge 152
auf, entweder in Kombination mit 144 oder 147 (
Auf die im Anhang beigefügten Tabellen 1 bis 24 wird an den entsprechenden Stellen der vorliegenden Beschreibung bezog genommen. In diesen Tabellen werden die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Prinzipien und die gemäß den nachfolgenden Ausführungsbeispielen erhaltenen Ergebnisse widergegeben.On the tables attached in the appendix 1 to 24 are used at the appropriate points in the present description related. In these tables, those of the present invention underlying principles and according to the following embodiments results obtained.
In der Tab. 1 sind die im PrP-Gen des Schafs gefundenen Aminosäure-Polymorphismen zusammengefasst (nach Hunter 2000, ergänzt).Tab. 1 shows the PrP gene amino acid polymorphisms found in sheep summarized (after Hunter 2000, supplemented).
Tab. 2 stellt die Risikoeinteilung (Risk) aufgrund der Aminosäure-Polymorphismen in den Positionen 136, 154 und 171 des Schaf-PrP dar, wie sie von der „Scrapie-Information-Group" (Dawson et al. 1998) vorgenommen wurde.Tab. 2 shows the risk classification (Risk) due to the amino acid polymorphisms in positions 136, 154 and 171 of the sheep PrP as described by the "Scrapie Information Group" (Dawson et al. 1998) was made.
In der Tab. 3A sind die Daten von 24 Mikosatellitenloci mit 3 oder mehr Motivwiederholungen dargestellt, die im bovinen PrP-Gen gefunden wurden Tab. 3B zeigt die entsprechenden Daten der 23 aufgefundenen Mikrosatellitenloci im PrP-Gen des Schafs. 9 für die bovine DNA spezifische Primerpaare wurden auch mit Schaf-DNA als Matrize getestet, um den bisher nicht publizierten Bereich der Schaf-Sequenz (etwa 44 kBp) zu analysieren Mittels dieser Vorgehensweise konnten im Schaf-PrP-Gen 7 Mikrosatellitenloci identifiziert werden Im DNA-Bereich, in welchem sowohl für Schaf als auch für Rind Sequenzinformationen in GenBank zur Verfügung stehen, wurden bei 13 von 16 der im Schaf untersuchten Loci homologe Mikrosatellitenmotive in der bovinen DNA-Sequenz gefunden Diese Motive umfaßten 4-5 Wiederholungen, in den meisten Fällen allerdings mit unterschiedlichen Sequenzen Mononukleotidrepeats, die im Intron 1 und 2 des Rinder-Gens sowie im Intron 2 des Schaf-Gens gefunden wurden, zeigten 15 und mehr Wiederholungen.Table 3A shows the data from 24 microsatellite loci with 3 or more repetitions of motifs, those found in the bovine PrP gene Tab. 3B shows the corresponding Data from the 23 microsatellite loci found in the sheep's PrP gene. 9 for the Bovine DNA-specific primer pairs were also used as sheep DNA Matrix tested to the previously unpublished area of the sheep sequence (approx. 44 kBp) could be analyzed using this procedure 7 microsatellite loci are identified in the sheep PrP gene in which both for Sheep as well for Sequence information available in GenBank was found at 13 of 16 of the loci examined in sheep have homologous microsatellite motifs found in the bovine DNA sequence. These motifs included 4-5 Repetitions, in most cases but with different sequences of mononucleotide repeats, those in introns 1 and 2 of the bovine gene and in intron 2 of the sheep gene were found to show 15 and more repetitions.
Die Tab. 4 zeigt eine Zusammenstellung
der Ergebnisse einer Analyse alleler PrP-Mikrosatelliten-DNA Varianten im bovinen
(Tab. 4A) und ovinen (Tab. 4B) PrP-Gen Es wurden bei etwa 30% der
analysieren Loci allele Varianten erhalten Wie in Tab. 4 zusammengefaßt, zeigten
beim Rind 4 der 8 variablen Mikrosatellitenloci 2 Allele, und 2
Loci waren hoch variant (6 bzw. 10 Allele). Die Daten für das Schaf-Gen
in Tab. 4B zeigen einen Locus mit 2 Allelen, 2 Loci mit 3 Allelen
und 3 Loci mit 4 und mehr Allelen Einige der Varianten wurden nur
in einer Rasse gefunden (9 von 31 Allelen beim Riad und 2 von 22
Allelen beim Schaf), während
die anderen Varianten in mehr als einer Rasse auftreten Die DNA-Sequenzen
alleler Fragmente zeigten Unterschiede in verschiedenen Positionen,
zuwerfen sogar innerhalb eines bestimmten Allels (vgl. Tab. 4 und
Tab. 5 stellt die als polymorph festgestellten Mikrosatellitenloci beim bovinen (Tab. 5A) und ovinen (Tab. 5B) PrP-Gen zusammen Bei 6 der polymorhen Mikrosatellitenloci des Rindes sowie bei alles 6 polymorphen Mikrosatellitenloci des Schafs wurde eine Frequenz des häufigsten Allels von < 0,95 festgestellt. Insgesamt wurde ein Heterozygotiegrad von > 0,10 bei 11 der insgesamt in beiden Spezies gefundenen 14 polymorphen Loci beobachtet.Tab. 5 shows those found to be polymorphic Microsatellite loci for bovine (Tab. 5A) and ovine (Tab. 5B) PrP gene together In 6 of the polymorphic microsatellite loci in cattle as well as all 6 polymorphic microsatellite loci of the sheep a frequency of the most common Alleles of <0.95 detected. Overall, a degree of heterozygosity of> 0.10 was found in 11 of the total 14 polymorphic loci found in both species were observed.
In Tab. 6 sind Vergleichsdaten der
Mikrosatellitenloci von bovinen und ovinen Genen dargestellt. Danach
können
nicht nur im PrP-Gen von Schaf und Rind sondern auch in anderen
Genen dieser Spezies Mikrosatellitenloci lokalisiert werden. Im
Mittel wurden 1,12 Mikrosatellitenloci pro 1 kBp DNA in den 8 analysierten Genen
erhalten Die Ergebnisse gemäß Tab. 6
sind in der vorstehend beschriebenen
Tab. 7 zeigt die im humanen PrP-Gen ermittelten Mikrosatellitenloci, von denen 5 mehr als 1 Allel in 18 untersuchten gesunden Freiwilligen zeigten. Bei diesen lag die Frequenz des vorherrchernden Allels bei < 0,95. Der beobachtete Grad der Heterozygozität schwankte zwischen 0,11 und 0,83. Des weiteren sind die PCR-Bedingungen bezgl. Anlagerungstemperatur und MgCl2-Konzentration sowie die verwendeten Primer angegeben.Table 7 shows the microsatellite loci determined in the human PrP gene, of which 5 showed more than 1 allele in 18 healthy volunteers examined. The frequency of the predominant allele was <0.95. The observed degree of heterozygosity varied between 0.11 and 0.83. The PCR conditions with regard to the addition temperature and MgCl 2 concentration and the primers used are also given.
In Tab. 8 sind die Anzahl der im nachstehenden Ausführungsbeispiel 3 untersuchten Schafe und deren ORF-Genotypen dargestellt.Tab. 8 shows the number of below embodiment 3 examined sheep and their ORF genotypes are shown.
In Tab. 9 sind die PCR-Ansätze zur Amplifikation der Mikrosatellitenloci S11, S24 und S15 im PrP-Gen des Schafs angegeben, Tab.10 gibt das dabei ausgeführte PCR-Programm wider und Tab.11 zeigt die Sequenzen der verwendeten Primer.The PCR approaches are shown in Table 9 Amplification of microsatellite loci S11, S24 and S15 in the PrP gene of the Sheeps specified, Tab. 10 shows the PCR program carried out and Tab. 11 shows the sequences of the primers used.
In der Tab. 12 sind die Laufbedingungen bei der Elektrophorese angegeben, die zur Trennung der Mikrosatellitenloci-Amplifikate durchgeführt wurde.Table 12 shows the running conditions specified in the electrophoresis, which is used to separate the microsatellite loci amplicons carried out has been.
In den Tab. 13 bis 15 sind Angaben zur Sequenzierung von klonierten PCR-Produkten zusammengefasst, die sich bei der Amplifikation des Mikrosatellitenlocus S24 des PrP-Gens des Schafs ergaben.Tables 13 to 15 contain information summarized for the sequencing of cloned PCR products, which is involved in the amplification of the microsatellite locus S24 of the PrP gene of the sheep revealed.
In der Tab. 16 sind die mittels Elektrophorese
bzw. Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse der Fragmentlängenanalyse
des Mikrosatellitenlocus S24 des Schaf-PrP-Gens angegeben (vgl.
auch die vorstehend beschriebenen
Die Allelhäufigkeiten und -Frequenzen der polymorphen Mikrosatellitenloci im PrP-Genbereich zu den 8 untersuchten Schafrassen werden in der Tab. 17 dargestellt. Für Locus S11 wurde die allele Fragmentlänge 152 als häufigstes Allel festgestellt mit geringster Allelfrequenz 0,54 in der Rasse Suffolk und höchster Frequenz 0,93 in den Rassen Merinoland und Schwarzkopf. Eine weitere hohe Allelfrequenz konnte in der Rasse Suffolk für die allele Fragmentlänge 158 mit 0,45 ermittelt werden Alle weiteren Frequenzen zu diesem Locus lagen für die einzelnen Rassen zwischen 0,007 (4 Beobachtungen zu Fragmentlänge 154 für Rasse Merinoland) und 0,149 (26 Beobachtungen zu Fragmentlänge 158 für Milchschaf).The allele frequencies and frequencies the polymorphic microsatellite loci in the PrP gene area for the 8 sheep breeds examined are shown in Tab. 17. For Locus S11 the allele Fragment length 152 as the most common Allele found in race with lowest allele frequency 0.54 Suffolk and highest Frequency 0.93 in the Merinoland and Schwarzkopf breeds. Another high allele frequency was 158 in the Suffolk breed for the allele fragment length are found to be 0.45. All other frequencies to this locus were for the individual races between 0.007 (4 observations on fragment length 154 for race Merinoland) and 0.149 (26 observations on fragment length 158 for milk sheep).
Von den 5 allelen Fragmentlängen zu Locus S11 wurden nur die Fragmentlängen 150 und 152 in allen 8 Rassen detektiert Die Fragmentlänge 154 zeigte sich nur in der Rasse Merinoland.Of the 5 allelic fragment lengths too Locus S11 was only fragment lengths 150 and 152 in all 8 Breeds detected The fragment length 154 was only seen in the Merinoland breed.
Die Auszählung der allelen Fragmentlängen zu
Locus S24 erfolgte in vereinfachter Form Zu diesem Locus wurden
Fragmentlängen
detektiert, die nicht eindeutig dem Locus (3er Repeat) zuzuordnen
waren, bzw. die über
Sequenzierung einer Interpretation zugänglich gemacht werden sollen.
Es handelt sich um die Fragmentlänge
146 (6 Beobachtungen über
alle Rassen) codiert zu 147 und die Fragmentlänge 152 (25 Beobachtungen in
der Rasse Merinoland, die nur in Kombination mit 144 bzw. 147 auftrat
und in 15 Beobachtungen als 3. Peak detektiert wurde (
Der Mikrosatellitenlocus S15 zeigte 3 allele Fragmentlängen mit dem häufigsten Fragment 179 in allen Rassen und Frequenzen zwischen 0,57 (Rasse Gotland) und 0,98 (Rasse Dorper). Die Fragmentlänge 182 war in allen Rassen mit geringen Frequenzen zwischen 0,008 (1 Beobachtung zu Rasse Suffolk) und 0,192 (33 Beobachtungen zu Rasse Milchschaf) vertreten. Noch seltener zeigte sich das Fragment 173, das in 4 Rassen fehlte und mit Frequenzen zwischen 0,016 (2 Beobachtungen zu Rasse Suffolk) und 0,286 (4 Beobachtungen zu Rasse Gotland) vorkam.The microsatellite locus S15 showed 3 allelic fragment lengths with the most common Fragment 179 in all races and frequencies between 0.57 (race Gotland) and 0.98 (Dorper breed). The fragment length 182 was in all races with low frequencies between 0.008 (1 observation for breed Suffolk) and 0.192 (33 observations on breed dairy sheep). Yet fragment 173, which was missing in 4 races, was less common with frequencies between 0.016 (2 observations on the Suffolk breed) and 0.286 (4 observations on the Gotland breed) occurred.
Häufigkeiten und Frequenzen zu den Aminosäurevarianten der PrP-Genotypen sind in Tab. 18 aufgelistet. Für die allelen Ausprägungen an Codon 136 (Kennzeichnung ORF1) konnten für die Aminosäure Alanin (A) für die einzelnen Rassen Frequenzen zwischen 0,885 und 1,0 festgestellt werden. Die Aminosäure Valin (V), in der Literatur mit hohem Risiko für Scrapieanfälligkeit bei Tieren mit dieser Ausprägung angegeben, konnte nur mit geringen Frequenzen bis 0,115 (Rasse Isle de France) beobachtet werden, wobei in den Rassen Gotland und Milchschaf kein Tier mit dieser Variante auftrat.frequencies and frequencies for the amino acid variants of the PrP genotypes are listed in Table 18. For allelic forms Codon 136 (ORF1 label) could be used for the amino acid alanine (A) for the individual breeds found frequencies between 0.885 and 1.0 become. The amino acid Valine (V), in the literature with a high risk of scrapie susceptibility in animals with this expression specified, could only be used with low frequencies up to 0.115 (Isle of de France) are observed, being in the Gotland and dairy sheep breeds no animal appeared with this variant.
Die allele Variante Histidin (H) war an Codon 154 (Kennzeichnung ORF2) in sehr geringer Anzahl vertreten (höchste Frequenz 0,258 in Milchschaf). Diese Aminosäureausprägung fehlte in allen Rassen, ausser Milchschaf (46 Beobachtungen), Merinoland (40 Beobachtungen) und Texel (1 Beobachtung). Die Aminosäure Arginin (R) wurde an dieser Position mit Frequenzen über 0,74 festgestellt.The allelic variant histidine (H) was present in very small numbers on codon 154 (ORF2 marking) (highest Frequency 0.258 in dairy sheep). This amino acid expression was missing in all breeds, except milk sheep (46 observations), Merinoland (40 observations) and Texel (1 observation). The amino acid arginine (R) was found on this Position with frequencies above 0.74 found.
An Codon 171 (Kennzeichnung ORF3) konnten für die 8 Rassen 3 allele Ausprägungen festgestellt werden. Die Aminosäure Histidin (H) trat in sehr geringer Frequenz auf mit Ausnahme der Rasse Texel, Frequenz 0,21 (30 Beobachtungen). Diese Aminosäureausprägung konnte mit einer Beobachtung nur noch in der Rasse Merinoland festgestellt werden. Die Ausprägungen Glutamin (Q) und Arginin (R) waren in den Rassen mit sehr unterschiedlichen Frequenzen vertreten Glutamin in der Rasse Gotland mit 20 Beobachtungen (100%), Arginin in der Rasse Schwarzkopf mit 70 Beobachtungen (80%).At codon 171 (ORF3 marking) could for the 8 races 3 allelic forms be determined. The amino acid Histidine (H) occurred at a very low frequency with the exception of Texel breed, frequency 0.21 (30 observations). This amino acid expression could observed with one observation only in the Merinoland breed become. The characteristics Glutamine (Q) and arginine (R) were very different in the races Frequencies represent glutamine in the Gotland breed with 20 observations (100%), Arginine in the Schwarzkopf breed with 70 observations (80%).
Die beobachteten Heterozygotiegrade (D.C.: direct count estimate) und die unverzerrten Heterozygotieschätzwerte (unb: unbiased estimate) der 3 Mikrosatellitenloci und 3 ORF-Loci einschließlich der mittleren Hetrozygotiegrade werden in Tab. 19 dargestellt.The observed degrees of heterozygosity (DC: direct count estimate) and the undistorted heterozygosity Deep estimation values (unb: unbiased estimate) of the 3 microsatellite loci and 3 ORF loci including the mean degrees of hetrozygoty are shown in Table 19.
Für den Mikrosatellitenlocus S11 konnte der geringste beobachtete Heterozygotiegrad bei der Rasse Dorper mit 0,13 und der höchste bei der Rasse Suffolk mit 0,50 festgestellt werden. Bei dem Mikrosatellitenlocus S24 war der geringste beobachtete Heterozygotiegrad 0,231 bei der Rasse Isle de France und der höchste bei der Rasse Suffolk mit 0,594 zu erkennen. Zu dem Mikrosatellitenlocus S15 lagen die Werte zwischen 0,044 bei der Rasse Dorper und 0,714 bei der Rasse Gotland. Der geringste mittlere beobachtete Heterozygotiegrad mit 0,157 wunde bei der Rasse Schwarzkopf und der höchste bei der Rasse Gotland mit 0,571 festgestellt. Die Beobachtungswerte zeigten bei allen Rassen geringe, nicht signifikante Abweichungen zu den Erwartungswerten.For the microsatellite locus S11 was the lowest observed degree of heterozygosity in the Dorper breed at 0.13 and the highest in the Suffolk breed be found to be 0.50. The microsatellite locus S24 was the lowest observed degree of heterozygosity in the breed, 0.231 Isle de France and the highest at the Suffolk breed can be recognized with 0.594. To the microsatellite locus In S15 the values were between 0.044 for the Dorper breed and 0.714 for the Gotland breed. The lowest mean observed degree of heterozygosity with 0.157 wound in the Schwarzkopf breed and the highest in the Gotland breed found at 0.571. The observation values showed in all Breeds small, insignificant deviations from the expected values.
Im unteren Teil der Tab. 19 werden die Heterozygotiegrade der ORF-Loci gezeigt. Der höchste Heterozygotiegrad beim Locus ORF1 war bei der Rasse Isle de France zu beobachten mit 0,231. Zu ORF2 wurden bei der Rasse Milchschaf 0,315 und zu ORF3 bei der Rasse Texel 0,662 jeweils die höchsten Heterozygotiegrade festgestellt. Häufig traten nur homozygote Tiere bei den ORF-Loci in den einzelnen Rassen auf (Gotland und Milchschaf bei ORF1, Dorper, Gotland Ile de France, Schwarzkopf und Suffolk bei ORF2 und Gotland bei ORF3).In the lower part of tab. 19 the heterozygosity of the ORF loci is shown. The highest degree of heterozygosity at the Locus ORF1 was observed with the breed Isle de France with 0.231. The ORF2 was 0.315 for the milk sheep breed and ORF3 the highest levels of heterozygosity were found for the Texel breed 0.662. Frequently only homozygous animals occurred at the ORF loci in the individual breeds on (Gotland and milk sheep at ORF1, Dorper, Gotland Ile de France, Schwarzkopf and Suffolk on ORF2 and Gotland on ORF3).
Der Locus S11 ist mit 5 Allelen der am höchsten polymorphe Locus in der Untersuchung. Bei der Prüfung der Genotyphäufigkeiten der Miknosatellitenloci auf Gleichgewichtssituation (Hardy-Weinberg-Gleichgewicht) in den untersuchten Rassen (Tab. 20) konnten keine Abweichungen festgestellt werden.The locus S11 is the with 5 alleles the highest polymorphic locus in the investigation. When checking the genotype frequencies the micro satellite loci on the equilibrium situation (Hardy-Weinberg equilibrium) There were no deviations in the examined breeds (Tab. 20) be determined.
Bei dem Locus S24 mit den Allelen 144 und 147 waren die heterozygoten Tiere in allen Rassen überrepräsentiert. Der Genotyp 144/147 trat über die Rassen gerechnet mit 23 Beobachtungen (267 beobachtet, 244 erwartet) zu häufig auf. Dies führte jedoch in keiner Rasse zu einer signifikanten Abweichung der Genotyphäufigkeiten von einer Gleichgewichtssituation.At the Locus S24 with the alleles 144 and 147, the heterozygous animals were overrepresented in all breeds. The genotype 144/147 was transferred the breeds counted 23 observations (267 observed, 244 expected) too often on. This resulted however, in no breed there was a significant difference in genotype frequencies from an equilibrium situation.
Der Locus S15 zeigte bei 3 auftretenden Allelen mit den seltenen Allelen 173 und 182 keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium (HWE) in einer der Rassen.The locus S15 showed 3 appearing Alleles with the rare alleles 173 and 182 no deviation from Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) in one of the breeds.
Hinsichtlich der Prüfung der Genotypbeobachtungen der ORF-Loci konnte zu dem Locus ORF1 (Codon mit den Aminosäure-Varianten A (Alanin) und V (Valin)) in keiner Rasse eine Abweichung vom HWE festgestellt werden (Tab. 21). Her traten auch nur in den Rassen Dorper und Texel nennenswerte V Beobachtungen auf, wobei nur ein Schaf der Rasse Texel homozygot mit V/V erkannt wurde. Beim Locus ORF2 (Codon 154 mit den Aminosäure-Varianten H (Histidin) und R (Arginin) mit sehr geringem H-Anteil beobachtet in den Rassen Merinoland, Milchschaf und Texel (1 Beobachtung) zeigte sich ebenfalls keine signifikante Abweichung vom HWE. Eine Unterrepräsentation der Heterozygoten konnte bei Milchschaf erkannt werden.Regarding the examination of the Genotype observations of the ORF loci could lead to the ORF1 locus (codon with the amino acid variants A (alanine) and V (valine)) did not differ from the HWE in any race are determined (Tab. 21). They only came here in the races Dorper and Texel made notable V observations, with only one Sheep of the Texel breed was recognized homozygously with V / V. At the locus ORF2 (Codon 154 with the amino acid variants H (histidine) and R (arginine) with very low H content observed in the breeds Merino country, milk sheep and Texel (1 observation) were also found no significant deviation from the HWE. An underrepresentation the heterozygote could be recognized in milk sheep.
Der ORF3-Locus (Codon 171 mit Aminosäure-Varianten H, R und Q (Glutamin) zeigte in der Rasse Merinoland eine signifikante Abweichung (P < 0,05) vom HWE mit bedeutsamer Unterrepräsentation des Typs Q/R (14 Beobachtungen zu wenig). In der Rasse Suffolk trat dieser Typ mit 6 Beobachtungen (nicht signifikant abweichend vom HWE) zu häufig auf.The ORF3 locus (codon 171 with amino acid variants H, R and Q (glutamine) were significant in the Merinoland breed Deviation (P <0.05) from HWE with significant underrepresentation of type Q / R (14th Too few observations). This guy joined the Suffolk breed 6 observations (not significantly different from HWE) too often.
Die seltene Ausprägung H (Histidin) war fast ausschließlich in der Rasse Texel vertreten und zeigte keine Auffälligkeit in den Frequenzen.The rare form H (histidine) was almost exclusively represented in the Texel breed and showed no abnormality in the frequencies.
In den Tab. 22 bis 24 ist die Assoziation der Mikrosatellitenloci zu den Scrapie-Risikogruppen dargestellt (zur Definition der Risikogruppen (Merkmal Risk) vgl. Tab. 2)The association is shown in Tab. 22 to 24 the microsatellite loci for the scrapie risk groups (for the definition of risk groups (characteristic risk) see Tab. 2)
Bei der Varianzanalyse mit Modell 1 (Signifikanzen und Bestimmtheitsmaße; vgl. hierzu die diesbezüglichen Ausführungen im nachstehenden 3. Ausführungsbeispiel) zu Rassen mit Tierzahlen > 60 ergab sich folgendes. In der Rasse Merino konnte über die Mikrosatellitenloci nur ein Anteil von 7,6 % an der phänotypischen Varianz des Merkmals Risk (Tab. 22) erklärt werden, wobei die Loci S11 und S15 keinen Anteil beitrugen. In Tab. 8 ist zu erkennen, dass die Rasse Merinoland bezüglich der Risikoeinteilung hauptsächlich in den Stufen 3 und 4 anzutreffen war (90,5 % der Beobachtungen) und somit eine geringe phänotypische Varianz bezüglich des untersuchten Merkmals zeigte.When analyzing variance with a model 1 (Significance and measures of certainty; see also the relevant versions in the third embodiment below) to breeds with animal numbers> 60 the following resulted. In the Merino breed, the Microsatellite loci only accounted for 7.6% of the phenotypic Variance of the Risk characteristic (Table 22) can be explained, with the Loci S11 and S15 contributed no share. In table 8 you can see that regarding the Merinoland breed risk assessment mainly was found in levels 3 and 4 (90.5% of the observations) and thus a little phenotypic Variance regarding of the examined feature showed.
Für die Rasse Milchschaf, Suffolk und Texel konnten dagegen Bestimmtheitsmaße für Modell 1 mit Weiten > 75 % ermittelt werden, wobei in allen Rassen S24 mit hohem Signifikanzlevel Anteil an der Varianz des Merkmals Risk hatte.For the breed milk sheep, Suffolk and Texel, on the other hand, were able to measure the model 1 with widths> 75 % are determined, with S24 with a high level of significance in all breeds Had a share in the variance of the risk characteristic.
Schließlich ergaben sich folgende Schätzwerte zu Merkmal Risk aus der Analyse mit Modell 1 zu den berücksichtigten Mikrosatellitenloci. Die Analysen zu den einzelnen Rassen (Tab. 23) ergaben für den Locus S24 für Tiere mit Genotyp 147/147 im Vergleich zu Tieren mit dem Genotyp 144/144 eine eindeutige Erhöhung des Merkmals Risk mit höchster Differenzierung in der Rasse Suffolk bei den beiden Homozygottypen mit einer erwarteten Trennschärfe von ca. 2,7 in der Risikodifferenz. Bei dem Locus S11 zeigte sich ein höhrerer Merkmalswert Risk bei Tieren mit dem Allel 150, besonders gut zu erkennen bei der Rasse Texel. Hierzu lagen jedoch nur Heterozygotbeobachtungen vor.Finally the following resulted estimates for characteristic risk from the analysis with model 1 to the considered Microsatellite loci. The analyzes of the individual breeds (Tab. 23) resulted in the Locus S24 for Animals with genotype 147/147 compared to animals with the genotype 144/144 a clear increase in Characteristic risk with the highest Differentiation in the Suffolk breed between the two homozygous types with an expected selectivity of about 2.7 in the risk difference. The locus S11 showed up a higher one Characteristic value risk in animals with the allele 150, particularly good too recognize the Texel breed. However, there were only heterozygous observations in front.
Der Locus S15 zeigt zu den einzelnen Rassen uneinheitliche Assoziationsgrößen für die verschiedenen Genotypen. Auffällig war eine Risikoerhöhung in der Rasse Texel, feststellbar für Tiere, die mit dem Allel 173 auftraten.The Locus S15 points to the individual Breeds inconsistent association sizes for the different genotypes. showy was an increase in risk in the Texel breed, detectable for animals with the allele 173 occurred.
In Tab. 24 sind die untersuchten Mikrosatellitenloci innerhalb ORF-Genotypen aufgelistet, wobei innerhalb dieser Klassen die Mikrosatellitenloci in der Sortierreihenfolge S24, S11, S15 nach Genotyp erfolgte. Innerhalb dem mit geringstem Erkrankungsrisiko assoziierten ORF-Typ ARR/ARR mit 76 Beobachtungen in 6 Rassen zeigten alle Tiere die gleiche Genotypkombination der 3 Mikrosatellitenloci S24, S11, S15 mit 144/144, 152/152 und 179/179. Diese Homozygotausprägung an den drei Loci kam im gesamten Datenmaterial mit 188 Beobachtungen vor mit anteilsmäßig abnehmender Tendenz bis zur Risikostufe 4 mit 47 Beobachtungen (20% von 233 Beobachtungen in dieser Stufe). In Risikostufe 5 war diese Genotypkombination nicht vertreten Die Risikostufe 2 konnte mit 16 Beobachtungen in den Rassen Merinoland und Milchschaf ermittelt werden, einmal wurde sie in der Rasse Texel beobachtet.The examined ones are in Table 24 Microsatellite loci listed within ORF genotypes, with within of these classes the microsatellite loci in the sort order S24, S11, S15 by genotype. Within that with the least Disease risk associated ORF type ARR / ARR with 76 observations in 6 breeds showed all animals the same genotype combination of the 3 Microsatellite loci S24, S11, S15 with 144/144, 152/152 and 179/179. This homozygous expression At the three loci there were 188 observations in the entire data material in front with proportionately decreasing Trend up to risk level 4 with 47 observations (20% of 233 Observations at this stage). This genotype combination was at risk level 5 not represented Risk level 2 could with 16 observations in the Merinoland and milk sheep breeds were once identified observed them in the Texel breed.
Dies deutet darauf hin, dass die Aminosäureausprägung H (Histidin) an Codon 154 vorwiegend in diesen beiden Rassen manifestiert ist, was auch in dem ORF-Typ ARQ/AHQ in Risikoklasse 3 mit 53 Beobachtungen eine Bestätigung fand Die restlichen zwei ORF-Typen mit H an Position 154 (AHQ/ARH, AHQ/VRQ waren in den vorliegenden Daten nicht vertreten. Auffällig war das seltene Auftreten des Genotyps 144/144 in S24 mit nur 4 aus 70 Beobachtungen zu ORF-Typen mit H an Position 154. Der ORF-Typ ARR/ARQ Risikostufe 3 mit 165 Beobachtungen festgestellt in allen Rassen war nach ARQ/ARQ am zweithäufigsten vertreten mit 29% von 573 Gesamtbeobachtungen (alle Beobachtungen mit Informationen zu allen 3 Mikrosatellitenloci und zum ORF-Genotyp). Zu diesem ORF-Typ konnte noch ein hoher Anteil der Genotypkombination der Mikrosatelliten mit 144/144, 152/152, 179/179 mit 62 Beobachtungen (37,6%) festgestellt werden. Innerhalb dieses Typs traten auch erstmals zu Locus Sil die Allele 150, 154 und zu Locus S15 das Allel 182 jeweils in sehr geringer Frequenz auf. Der ORF-Typ ARR/ARH, Risikostufe 3 mit 10 Beobachtungen zeigt an Codon 171 die seltene Ausprägung H (Histidin). ORF-Typen mit dieser Aminosäure wurden in den vorliegenden Daten bis auf eine Ausnahme in der Rasse Merino nur in der Rasse Texel festgestellt (s. auch ORF-Typen ARH/ARH und ARQ/ARH in Risikostufe 4 und ARH/VRQ in Risikostufe 5). Insgesamt zeigten 24 Tiere diese Ausprägung wobei eine eindeutige Zuordnung zu bestimmten Genotypen der Mikrosatellitenloci nicht festgestellt werden konnte. Der ORF-Typ ARQ/AHQ Stufe 3 (s. auch ARR/AHQ und AHQ/AHQ nur vertreten in den Rassen Merinoland und Milchschaf war bis auf die oben erwähnte Besonderheit nicht weiter auffällig. Der ORF-Typ ARQ/ARQ (Wildtyp) Risikostufe 4 mit 209 Beobachtungen (36,5% des gesamten Datenmaterials) vertreten in alles Rassen, zeigte bezüglich S24 eine starke Häufung des Genotyps 147/147 mit 34% der Beobachtungen innerhalb dieses Typs. Dieser Genotyp war in den Risikostufen 1 bis 3 nur mit 4% vertreten. Zu Locus S11 war eine bedeutsam höhere Frequenz des Allels 150 mit 7% innerhalb dieses ORF-Typs gegenüber 2% innerhalb der Risikostufen 1 bis 3 feststellbar. Der Locus S15 zeigte eine signifikante Erhöhung der Frequenz des Allels 182 mit 12,7% der Beobachtungen gegenüber dem geringen Auftreten von 2,3% innerhalb der Risikostufen 1 bis 3.This indicates that the Amino acid expression H (histidine) at codon 154 is predominantly manifested in these two races, which is also in the ORF type ARQ / AHQ in risk class 3 with 53 observations a confirmation found the remaining two ORF types with H at position 154 (AHQ / ARH, AHQ / VRQ were in the present Data not represented. showy was the rare occurrence of genotype 144/144 in S24 with only 4 from 70 observations on ORF types with H at position 154. The ORF type ARR / ARQ risk level 3 with 165 observations found in all After ARQ / ARQ, breeds were the second most represented with 29% of 573 total observations (all observations with information on all 3 microsatellite loci and the ORF genotype). About this ORF type could still use a high proportion of the genotype combination of the microsatellites 144/144, 152/152, 179/179 with 62 observations (37.6%) become. Within this type, Locus Sil also appeared for the first time alleles 150, 154 and locus S15 allele 182 each in very low frequency. The ORF type ARR / ARH, risk level 3 with 10 Observations on codon 171 show the rare expression H (histidine). ORF types with this amino acid were in the present data with one exception in the breed Merino found only in the Texel breed (see also ORF types ARH / ARH and ARQ / ARH in risk level 4 and ARH / VRQ in risk level 5). All in all 24 animals showed this expression with a clear assignment to certain genotypes of the microsatellite loci could not be determined. The ORF type ARQ / AHQ level 3 (see ARR / AHQ and AHQ / AHQ also only represented in the Merinoland breeds and milk sheep was no further apart from the above-mentioned peculiarity striking. The ORF type ARQ / ARQ (wild type) risk level 4 with 209 observations (36.5% of all data) represented in all races, showed in terms of S24 a strong cluster of genotype 147/147 with 34% of the observations within this Type. This genotype was only 4% in risk levels 1 to 3 represented. At locus S11 a significantly higher frequency of the allele was 150 with 7% within this ORF type compared to 2% within the risk levels 1 to 3 detectable. The Locus S15 showed a significant increase in the Frequency of the allele 182 with 12.7% of the observations compared to that low occurrence of 2.3% within risk levels 1 to 3.
Die Allele 150 zu Locus S11 und 182 zu Locus S15 traten in den nachfolgenden Risikostufen mit V (Valin) an Position 136 mit noch höheren Anteilen auf (28% Anteil für Allel 150 und 26% Anteil für Allel 182). Der Locus S24 zeigte in der höchsten Risikostufe jedoch keine Auffälligkeit bezüglich der Frequenzen der Mikrosatellitengenotypen.Alleles 150 to locus S11 and 182 to locus S15 occurred in the following risk levels with V (valine) at position 136 with even higher ones Shares on (28% share for Allel 150 and 26% share for Allele 182). However, the Locus S24 did not show any in the highest risk level conspicuity in terms of the frequencies of the microsatellite genotypes.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert:The present invention is accomplished by the following examples explained in more detail:
Ausführungsbeispiel 1:Example 1:
Materialien und MethodenMaterials and methods
Analise von Mikrosatelitenmotiven: Genomische DNA-Sequenzen der das PrP-Protein codierenden Gene sind in GenBank (Zugriffsnummern: U67922 für Schaf und AJ298878 beim Rind) verfügbar und wurden auf Mikrosatellitenmotive unter Verwendung der Software etandem des EMBOSS-Programmpakets (HGMP-RC, London) abgesucht. das Motivgrößenfenster betrug 2 bis 25 Nukleotide und nur solche Mikrosatellitenmotive mit mindestens 3 Wiederholungen (Repeats) und 90% Homologie wurden ausgewertet. Weitere Mikrosatellitenloci wurden mittels des Sputnik-Programms (Abajian 1994), dem Programm RepeatMasker (Smit und Green, zugänglich unter http://fdp.genome.washington.edu/cgibin/RepeatMasker) und der bei Lee et al. (1998) angegebenen Informationen gefunden Wurde ein Mikrsatellitenmotiv nur in einer Spezies identifiziert, wurde die DNA-Sequenz der anderen Spezies durch eine Gegenüberstellung verglichen und der homologe Bereich hinsichtlich des gleichen Mikrosatellitenmotivs überprüft. Alle Sequenzgegenüberstellungen wurden mit dem Programm GeneDoc durchgeführt, das unter der URL http://www psc.ecu/biomed/genedoc zugänglich ist.Analysis of microsatellite motifs: Genomic DNA sequences of the genes encoding the PrP protein in GenBank (accession numbers: U67922 for sheep and AJ298878 for cattle) available and were made on microsatellite motifs using the software etandem of the EMBOSS program package (HGMP-RC, London) searched. the Motive size window was 2 to 25 nucleotides and only such microsatellite motifs with at least 3 repeats (repeats) and 90% homology evaluated. Additional microsatellite loci were created using the Sputnik program (Abajian 1994), the RepeatMasker program (Smit and Green, accessible at http://fdp.genome.washington.edu/cgibin/RepeatMasker) and the one at Lee et al. (1998) information found was a microsatellite motif Only identified in one species was the DNA sequence of the other Species through a comparison compared and the homologous area checked for the same microsatellite motif. All Sequence comparisons were carried out with the GeneDoc program, which can be found at http: // www psc.ecu / biomed / genedoc accessible is.
Tiere und Proben: Blutproben wurden von 11 Schafrassen (3 Tiere pro Rasse: Awassi, Changthangi, Dorper, Hu, Merinoland, Milchschaf, Gotland, Schwarzkopf, Shkodrane, Texel, White Karaman) und 8 Rinderrassen (4 Tiere pro Rasse: Busa, Holstein-Schwarzbunte, Jersey, Südanatolisches Rotvieh, Simmental, Nanjing-Rind, Nguni, Yerli Kara) gesammelt.Animals and Samples: Blood samples were taken of 11 sheep breeds (3 animals per breed: Awassi, Changthangi, Dorper, Hu, Merinoland, Milchschaf, Gotland, Schwarzkopf, Shkodrane, Texel, White Karaman) and 8 cattle breeds (4 animals per breed: Busa, Holstein-Schwarzbunte, Jersey, South Anatolian Red cattle, Simmental, Nanjing beef, Nguni, Yerli Kara) collected.
Herstellung genomischer DNA: DNA wurde aus EDTA stabillisiertem Blut durch Chlorophorm-Phenol Extraktion oder unter Verwendung von Isolienrugskits (NucleonBAcc2, Pharmacia, Freiburg, oder Nucleo Spin Blood Quick Pure, Macherey-Nagel, Düren) isoliert. Die Qualität der DNA wurde mittels Elektrophorese in 1% Agarose-Gelen und durch photometrischen Test bei 260/280 nm überprüft. Das erhaltene DNA-Material wurde in sterilem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) bei –80 °C gelagert.Production of genomic DNA: DNA was stabilized from EDTA blood by chlorophore phenol Extraction or using Isolierrugskits (NucleonBAcc2, Pharmacia, Freiburg, or Nucleo Spin Blood Quick Pure, Macherey-Nagel, Düren) isolated. The quality of the DNA was checked by electrophoresis in 1% agarose gels and by photometric test at 260/280 nm. The DNA material obtained was stored in sterile TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) at -80 ° C.
Primer: Die Primersequenzen wurden unter Verwendung der Primer 3-Software (Rozen und Skletsky 1998) konstruiert und von Roth (Karlsruhe) syntethisiert, wobei pro Locus ein fluoreszierender Primer bereitgestellt wurde.Primer: The primer sequences were using the Primer 3 software (Rozen and Skletsky 1998) constructed and synthesized by Roth (Karlsruhe), whereby per locus a fluorescent primer was provided.
PCR: E3 wurde ein Standard Protokoll {anfängliche Denaturierung für 5 min bei 94 °C gefolgt von 30 Zyklen jeweils mit 1 min bei 55 °C, 1 min bei 72 °C und 1 min bei 94 °C, und eine letzte Extension für 15 min bei 72 °C) verwendet, wobei die Reaktion in einem Volumen von 20 μl durchgeführt wurde mit 0,15 mM Primer, 200 mM von jedem dNTP, 100 ng genomischer DNA, 1,5 mM MgCl2 und 0,5 Einheiten Taq Polymerase (bezogen von Rotte, Karlsruhe). Die Effizienz und Spezifität der PCR wurde durch Veränderung der MgCl2-Konzentration (von 1,5 bis 4,5 mM) zusammen mit der Anlagerungstemperatur (48-65 °C) in einem Gradienten-Thermocycler optimiert. Die Primer und weitere PCR-Bedingungen, die für die Fragment-Analyse gemäß Ausführungsbeispiel 1 verwendet wurden, sind in der Tab. 3 angegeben.PCR: E3 became a standard protocol {initial denaturation for 5 min at 94 ° C followed by 30 cycles each with 1 min at 55 ° C, 1 min at 72 ° C and 1 min at 94 ° C, and a final extension for 15 min at 72 ° C.), the reaction being carried out in a volume of 20 μl with 0.15 mM primer, 200 mM of each dNTP, 100 ng genomic DNA, 1.5 mM MgCl 2 and 0.5 units of Taq polymerase (obtained from Rotte, Karlsruhe). The efficiency and specificity of the PCR was optimized by changing the MgCl 2 concentration (from 1.5 to 4.5 mM) together with the annealing temperature (48-65 ° C) in a gradient thermal cycler. The primers and further PCR conditions that were used for the fragment analysis according to embodiment 1 are given in Table 3.
Fragmentlängenanalyse: Unter Verwendung eines automatischen Laser-Fluorreszenz-DNA-Sequenziergeräts (A.L.F. Pharmacia) mit 5% Hydrolink Gelen wurden die PCR-Produkte (jeweils 0,5 μl) zusammen mit internen (99-198 Nukleotide) und externen (80-353 Nukleotiden) Standard-Fragmenten (hergestellt durch PCR mit λ-DNA als Matrize) analysiert. Vor dem Beladen des Gels wurden die Fragmente denaturiert (2 min bei 90 °C und dann Eiskühlung). Die Elektrophorese wurde in 0,6 % TBE-Puffer bei 1500 Volt, 45 mA und 50 °C durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mittels der AlleleLinks-Software (Pharmacia, Freiburg) durchgeführt. Fragment length analysis: using of an automatic laser fluorescence DNA sequencer (A.L.F. Pharmacia) with 5% Hydrolink gels were used to combine the PCR products (0.5 μl each) with internal (99-198 nucleotides) and external (80-353 nucleotides) Standard fragments (produced by PCR using λ-DNA as a template) were analyzed. Before loading the gel, the fragments were denatured (2 min at 90 ° C and then ice cooling). Electrophoresis was performed in 0.6% TBE buffer at 1500 volts, 45 mA and 50 ° C performed. The Data analysis was carried out using the AlleleLinks software (Pharmacia, Freiburg).
Klonierung von PCR-Produkten: Zur Sequenzierung separater Allele wurden 0,067 pmol gereinigtes PCR-Produkt mit dem End-Conversionsmix (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) behandelt und in den mit EcoRV verdauten pT7-Blue-Vektor mit stumpfen Enden ligiert. Es wurde eine Hitzeschocktransformation von NovaBlue-E.coli-Wirtszellen gemäß den Anweisungen des Herstellen durchgeführt. Positive Klone wurden mittels Blau-Weiß-Screening identifiziert und hinsichtlich der korrekten Insertgrößen durch Vektor-PCR (stromaufwärtiger Primer. 5'-TAATACGACTCACTATAGGG3'; stromabwärtiger Primer. 5'-TTGTAAAACGACGGCCAGTG3') und eine Elektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel überprüft.Cloning of PCR products: Zur Sequencing of separate alleles were 0.067 pmol purified PCR product treated with the end conversion mix (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) and in the EcoTV digested pT7 blue vector with blunt ends ligated. Heat shock transformation from NovaBlue E. coli host cells according to the instructions of manufacturing. Positive clones were identified by blue and white screening and in terms of the correct insert sizes Vector PCR (upstream Primers. 5'-TAATACGACTCACTATAGGG3 '; downstream primer. 5'-TTGTAAAACGACGGCCAGTG3 ') and checked electrophoresis on a 1.5% agarose gel.
Insertpräparation und DNA-Sequenzierung: Matrizen-DNA wurde ausgehend von den weißen Klonen durch Vektor-PCR erzeugt und mit dem Cycle Pure KIT (Peglab, Erlangen) gereinigt. Beide DNA-Stränge wurden von MWG-Biotech (Ebersberg) sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden unter Verwendung der Programme Chromas (http://www:technelysium.com.au) und GeneDoc (http://www:psc.edu/biomed/genedoc) analysiert. Die Ergebnisse wurden mittels Sequenzierung verifiziert, die mit dem Thermo Sequenase Primer Cycle Kit (Pharmacia, Freiburg) durchgeführt und dem A.L.F. DNA Sequenziergerät analysiert und mit dem A.L.F. Win Softwarepaket (Pharmacia, Freiburg) ausgewertet.Insert preparation and DNA sequencing: Template DNA was drawn from the white clones by vector PCR generated and cleaned with the Cycle Pure KIT (Peglab, Erlangen). Both strands of DNA were sequenced by MWG-Biotech (Ebersberg). The sequences obtained were created using the Chromas program (http: // www: technelysium.com.au) and GeneDoc (http: // www: psc.edu/biomed/genedoc). The Results were verified using sequencing using the Thermo Sequenase Primer Cycle Kit (Pharmacia, Freiburg) and the A.L.F. DNA sequencer analyzed and with the A.L.F. Win software package (Pharmacia, Freiburg) evaluated.
Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel
1 konnten 24 Mikrosatellitenloci im bovinen und 23 im ovinen PrP-Gen
identifiziert werden Aus den Resultaten, die in den
Anzazahl von Mikrosatellitenloci in genomischer DNA: Es wurden im Mittel 1 Mikrosatellitenlocus pro 0,9 kBp DNA innerhalb der codierenden Genbereiche und den flankierenden Regionen erhalten Diese Frequenz wurde auch für andere codierende Gene beobachtet und ist wesentlich großer als im Stand der Technik dokumentiert (vgL bspw Schlötterer 2000). Diese überrasehende Differenz kann daraus resukieren, daß im Stand der Technik die Informationen über Mikrosatellitenpositionen in DNA meist durch ein Screening von Bibliotheken genomischer DNA-Elemente mit Mikrosatellitenmotiven erhalten werden und daher die Anzahl von Repeatmotiven im Genom unterschätzt wurde.Number of microsatellite loci in genomic DNA: An average of 1 microsatellite locus per 0.9 kBp DNA within the coding gene areas and the flanking Preserving regions This frequency was also observed for other coding genes and is much bigger as documented in the state of the art (vgL e.g. Schlötterer 2000). This surprising one Difference can result from the fact that in the prior art the information about Microsatellite positions in DNA mostly through screening of libraries genomic DNA elements with microsatellite motifs can be obtained and therefore the number of repeat motifs in the genome was underestimated.
Funktion von Mikrosatelliten in codierenden Genen: Wiederholte Motive innerhalb von Genen sind seit langem bekannt. Mikrosatellitenloci innerhalb von Exons deuten auf sich wiederholende Codons hin. Regulatorische DNA-Sequenzen können sogar ein Muster von Mikrosatelliten mit noch höherer Dichte aufweisen, da bspw. Response-Elemente oft wiederholte Nukleotide einschließen und Varianten bei der Genregulation funktionell bedeutsam werden (Wales et aL 1990, Tripathi und Brahmachari 1991, 1995). Bei einigen Mikrosatelliten wurde eine Beteiligung bei humanen genetischen Eben berichtet (O'Hara 2000, Nadir et al. 1996, Murata 2001) und gelegentlich verschlechterten sich die beobachteten Symptome mit einer Erhöhung der Anzahl von Wiederholungen (engl. "repeat expansion"). Christopher et al. (2000) beschreiben einen Fall von "repeat expansion" in einer transkribierten nicht codierenden Sequenz, die eine Dysfunktion der Genexpression hervorruft. Daher ist anzunehmen, daß die im PrP-Gen gefundenen Mikrosatellitenmotive für die Genexpression bedeutsam sind und die Varianten Loci anzeigen, die mit der Auslösung der PrP-Akkumulation in infizierten Zellen zusammenhängen.Function of microsatellites in coding Genes: Repeated motifs within genes have been known for a long time. Microsatellite loci within exons indicate repetitive Codons. Regulatory DNA sequences can even be a pattern of microsatellites with even higher ones Have density, since response elements, for example, often repeat nucleotides lock in and variants in gene regulation become functionally significant (Wales et al 1990, Tripathi and Brahmachari 1991, 1995). With some Microsatellites have been involved in human genetic levels reported (O'Hara 2000, Nadir et al. 1996, Murata 2001) and occasionally the observed symptoms worsened with an increase in Number of repetitions. Christopher et al. (2000) describe a case of "repeat expansion" in one transcribed non-coding sequence that shows dysfunction which causes gene expression. It can therefore be assumed that the PrP gene found microsatellite motifs significant for gene expression and show the loci variants that are triggered by the PrP accumulation in infected cells.
Ewolutionsstabilität von Mikrosatellitenmotiven: Die hohe intragene Variabilität, die durch Mikrosatellitenloci hervorgerufen wird, kann die Evolution eukaryotischer Gene stimulieren. Es wunde festgestellt, daß Mikrosatelliten im PrP-Gen von Mensch und Maus stark unterschiedlich sind (Li et al. 1996). Überraschenderweise wurden in der vorliegenden Erfindung jedoch in den nah miteinander verwandten Spezies Rind und Schaf ähnliche Positionen der Mikrsatellitenloci gefunden, die trotz einer allelen Variabilität innerhalb der Spezies stabil waren. Diese Variabilität führt zu Genen, die bezüglich mehr als einem Locus polymorph sind ("Heteroallele", wodurch neue Allele durch intragene Rekombination erzeugt werden können. In diesen Fällen können Varianten von einzelnen Loci, die sich während der Evolution als erfolgreich erwiesen haben, rekombiniert werden, was dann neue funktionelle, möglicherweise überlegene Allele ergibt.Evolutionary stability of microsatellite motifs: The high intragenic variability caused by microsatellite loci can stimulate the evolution of eukaryotic genes. It was found that microsatellites in the PrP gene of humans and mice are very different (Li et al. 1996). Überraschenderwei However, in the present invention, similar positions of the microsatellite loci were found in the closely related species cattle and sheep, which positions were stable despite allelic variability within the species. This variability results in genes that are polymorphic with respect to more than one locus ("heteroalleles", whereby new alleles can be generated by intragenic recombination. In these cases, variants of individual loci that have proven successful during evolution can be recombined , which then results in new functional, possibly superior alleles.
Zusammenhang zwischen Struktur und Polymorphismus von Mikrosatellitenloci: Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Mikrosatelliten mit einer hohen Anzahl von Wiederholungen einen größeren Polymorphismus aufweisen, als diejenigen Loci mit weniger Wiederholungen. Beispielsweise waren nur 4 von 25 Mikrosatellitenloci mit 4 oder weniger Wiederholungen polymorph, im Vergleich zu 10 von 18 Mikrosatellitenloci mit 5 und mehr Wiederholungen Diese Erhöhung des Polymorphismus mit der Anzahl von Wiederholungen unterstreicht im Stand der Technik beschriebene Ergebnise (vgl. bspw Schlötterer 2000).Relationship between structure and Polymorphism of microsatellite loci: According to the invention, it was found that that microsatellites with a high number of repetitions a greater polymorphism than loci with fewer repetitions. For example were only 4 out of 25 microsatellite loci with 4 or fewer repeats polymorphic, compared to 10 out of 18 microsatellite loci with 5 and more repetitions this increase underlines the polymorphism with the number of repetitions Results described in the prior art (see, for example, Schlötterer 2000).
Allelverteilung. Es wurden Mikrosatellitensequenzen in genetisch unterschiedlichen Rassenvon Rind und Schaf untersucht, um soviele Allele wie möglich zu identifizieren. Bei 32 Rindern (aus 8 verschiedenen Rassen) wurden 8 polymorphe Loci (von 24 untersuchten Loci) identifiziert. Die Anzahl polymorpher Mikrosatellitenloci (6 von 23), die beim Schaf (33 Individuen aus 11 Rassen) gefunden wurden, war ähnlich der Anzahl beim Rind, allerdings wurden beim Schaf mehr Allele gefunden, die gleichnmäßig zwischen den Rassen verteilt waren Diese Ergebnisse korrespondieren mit ORF-Daten, bei denen nur eine Variante im Oktapeptid-Motiv und ein stiller SNP im bovinen PrP-ORF festgestellt wurde, während beim ovinen PrP-ORF 11 Aminosäuresubstitutionen bekannt sind. Die Variabilität des ORF- Polymorphismus ist jedoch selbst beim Schaf begrenzt, da die Aminosäuresubstitutionen der relevanten Codons (136, 154 und 171) nur in 5 verschiedenen Haplotypen auftreten Die in der vorliegenden Erfindung dargestellten Mikrosatellitenallele stellen im Vergleich dazu sehr viel mehr Haplotypea bereit und eignen sich daher hervorragend zur Typisierung einzelner Individuen bezüglich des PrP-Gens.Allele distribution. There were microsatellite sequences examined in genetically different breeds of cattle and sheep, by as many alleles as possible to identify. In 32 cattle (from 8 different breeds) were 8 polymorphic loci (from 24 examined loci) identified. The Number of polymorphic microsatellite loci (6 out of 23) found in sheep (33 individuals from 11 races) was found to be similar to that Number in cattle, but more alleles were found in sheep, which evenly between were distributed among the races These results correspond to ORF data, where only one variant in the octapeptide motif and a silent one SNP was found in the bovine PrP-ORF, while in the ovine PrP-ORF 11 amino acid substitutions are known. The variability the ORF polymorphism is limited even in sheep because the amino acid substitutions of the relevant codons (136, 154 and 171) only in 5 different Haplotypes Occur Those depicted in the present invention In comparison, microsatellite alleles represent much more haplotypea ready and are therefore ideal for typing individuals Individuals regarding of the PrP gene.
Verwendung von Mikrosatelliten-Markern in Verbindung mit ORF-Varianten: Beim Rind sind nur wenige polymorphe Stellen im PrP-Gen für dessen Typisierung verfügbar (Bunter 2000). Da keine informative Marker im PrP-Gen im Stand der Technik bekannt sind, konnte bisher keine detaillierte Untersuchung des Zuammenhangs zwischen BSE-Diposition und der Genvariabilität durchgeführt werden Die neuen Mikrosatellitenloci werden daher zur weiteren genetischen Untersuchung von BSE verwendbar sein, insbesondere sind sie zur Prädiagnostik bezüglich dieser Erkrankung verwendbar. Beim Schaf wurden 3 der polymorphen Mikrosatellitenloci zusammen mit den ORF-Varianten verwendet, um mehr als 600 Tiere verschiedener Rassen zu untersuchen, was im nachfolgenden Ausführungsbeispiel 3 beschrieben ist.Use of microsatellite markers in connection with ORF variants: In cattle only a few are polymorphic Jobs in the PrP gene for its typing available (Bunter 2000). As there are no informative markers in the PrP gene in the state of the Technology are known, no detailed investigation has so far been possible the relationship between BSE diposition and gene variability The new microsatellite loci are therefore becoming more genetic Examination of BSE can be used, in particular they are used for pre-diagnosis in terms of usable for this disease. In the sheep, 3 of the polymorphs Microsatellite loci used together with the ORF variants to study more than 600 animals of different breeds, what follows embodiment 3 is described.
Zusammenfassend wurden im vorliegenden Ausführungsbeispiel 1 Mikrosatellitenloci innerhalb von Genen unter Verwendung von GenBank-Sequenzen des bovinen und ovinen PrP-Gens analysiert. Diese Vorgehensweise dient der Durchmusterung einer größeren Anzahl polymorpher DNA-Marker pro Gen. Diese Vorgehensweise wurde anhand des PrP-Gens durchgeführt, kann jedoch auf andere eukariotische Gene zwanglos überragen werden. Bei der Betrachtung von Mikrosatelliten mit mindestens 3 Wiederholungen, wurden 24 Loci im bovinen und 23 im ovinen PrP-Gen identifiziert. Etwa 30% der Loci waren innerhalb der Spezies polymorph. Von 32 Rindern aus 8 genetisch verschiedenen Rassen traten 4 polymorphe Mikrosatelliten in 2, 1 Mikrosatellit mit 3, 1 Mikrosatellit mit 4, 1 Mikrosatellit mit 6 Allelen und 1 Mikrosatellit mit 10 Allelen auf. Die Daten von 33 Schafen aus 11 genetisch verschiedenen Rassen zeigten einen Locus mit 2 Allelen, 2 Loci mit 3 Allelen und 3 Loci mit 4 und mehr Allelen Es wurde festgestellt, daß Mikrosatellitenloci mit mindestens 5 Wiederholungen einen höheren Polymorphiegrad aufweisen, als diejenigen mit 4 oder weniger Wiederholungen Beim Rind wurden 9 der 31 Allele nur in einer Rasse gefunden, beim Schaf waren es 2 von 22 Allelen. Häufigkeiten des vorherrschenden Allels von < 0,95 wurden bei 6 Mikrosatellitenloci im Rind sowie bei 6 Mikrosatellitenloci am Schaf beobachtet. In 35 von 41 Vergleichen ergab die Fragementlängenanalyse mit einem automatischen DNA Sequenziergerät eine um 1 bis 3 Nukleotide kürzere Länge als mit der Sequenzierung. Die Abweichungen der gemessenen molekularen Größe können mit Sekundärstrukturen erklärt werden, die durch Mikrosatellitenmotive gebadet werden, welche die elektrophoretische Mobilität des Fragments beeinflussen Allele DNA-Fragmente unterschieden sich nicht nur in den Mikrosatellitenloci sondern auch in deren flankierenden Bereichen. Im Mittel trat ein Mikrosatellitenlocus in 8 Genen von Rind und Schaf etwa alle 0,9 kBp auf, wobei in PrP-Exons die Dichte der Mikrosatellitenloci höher ist. Mikrosatellitenloci innerhalb von Genen können funktionell bei der Expression bedeutsam sein und können daher mit der PrP-Akkumulation in TSE-infizierten Zellen zusammenhängen Die intragene Variabilität, die durch Mikrosatellitenloci hervorgerufen wird, kann die Evolution eurokariotischer Gene stimulieren Die erfindungsgemäßen intragenen polymorphen Mikrosatellitenloci erlauben insbesondere den Einsatz in der Prädiagnostik.In summary, the present embodiment 1 microsatellite loci within genes using GenBank sequences of the bovine and ovine PrP gene was analyzed. This approach is used to screen a large number of polymorphic DNA markers per gene This procedure was carried out using the PrP gene, can however, can be easily transmitted to other eukaryotic genes. When considering from microsatellites with at least 3 repetitions, 24 loci identified in the bovine and 23 in the ovine PrP gene. About 30% of the Loci were polymorphic within the species. Out of 32 cattle out of 8 genetically different races occurred 4 polymorphic microsatellites in 2.1 microsatellite with 3.1 microsatellite with 4.1 microsatellite with 6 alleles and 1 microsatellite with 10 alleles. The data from 33 sheep from 11 genetically different breeds showed a locus with 2 alleles, 2 loci with 3 alleles and 3 loci with 4 and more alleles It has been found that microsatellite loci have a higher degree of polymorphism with at least 5 repetitions, than those with 4 or fewer repetitions in cattle 9 of the 31 alleles were found only in one breed, in sheep they were 2 out of 22 alleles. frequencies of the predominant allele of <0.95 were at 6 microsatellite loci in cattle and at 6 microsatellite loci observed on the sheep. The fragment length analysis resulted in 35 of 41 comparisons with an automatic DNA sequencer by 1 to 3 nucleotides shorter Length as with sequencing. The deviations of the measured molecular Size can with secondary structures explained which are bathed by microsatellite motifs which the electrophoretic mobility of the fragment affect alleles DNA fragments differed not only in the microsatellite loci but also in their flanking ones Areas. On average, a microsatellite locus occurred in 8 genes Cattle and sheep appear approximately every 0.9 kbp, the density in PrP exons the microsatellite loci higher is. Microsatellite loci within genes can be functional in expression be and can be significant hence with the PrP accumulation in TSE-infected cells. The intragenic variability caused by Microsatellite Loci is evoked, the evolution of Eurocariotic Stimulate genes The intragenic polymorphs according to the invention Microsatellite loci particularly allow use in prediagnostics.
Ausführungsbeispiel 2:Example 2:
Die im Ausführungsbeispiel 1 dargelegten Verfahren wurden ebenfalls auf das humane PrP-Gen angewandt. Dabei wurden 12 Mikrosatellitenloci identifiziert, bei 5 davon trat bei 18 gesunden Personen mehr als 1 Allel auf (Tab. 71. Somit können auch beim Menschen polymorphe Mikrosatellitenloci zur Typisierung des PrP-Gens verwendet werden, um Allele aus denen sich eine TSE-Prädisposition des Trägen ergibt, zu diagnostizieren. Die Träger bestimmter Allele können dann beispielsweise ihre Lebensgewohnheiten, insbesondere Essgewohnheiten, auf die Prädisposition einstellen.The methods set out in Example 1 were also based on the human PrP gene looking. 12 microsatellite loci were identified, 5 of which had more than 1 allele in 18 healthy people (Table 71). Polymorphic microsatellite loci can therefore also be used in humans to typify the PrP gene to identify alleles that predispose to a TSE The carriers of certain alleles can then, for example, adjust their lifestyle, in particular eating habits, to the predisposition.
Ausführungsbeispiel 3:Example 3:
Es wurden 3 der im Ausführungsbeispiel
1 gefundenen Mikrosatellitenloci im Bereich des Prionprotein codierenden
Gens (PrP-Gen) auf Polymorphie in verschiedenen Schafrassen geprüft. Für die Untersuchung des
Probenmaterials wurde das in
Das erhobene Datenmaterial umfasste 8 Schafrassen mit 623 Tieren aus 47 Herden, für die Blutproben gesammelt worden waren. Bei 573 Schafen konnten alle 3 Mikrosatellitenloci eindeutig typisiert werden.The data collected included 8 breeds of sheep with 623 animals from 47 flocks, collected for blood samples had been. In 573 sheep, all 3 microsatellite loci be clearly typed.
Materialien und Methodenmaterials and methods
Tiere, Proben und Voruntersuchungen: In den Versuch wurden 623 Schafe aus acht verschiedenen Rassen und zwei Kreuzungsgruppen einbezogen (Tab. 8). Von allen Schafen waren Blutproben beschafft und aus diesen gDNA isoliert worden. Aus der gDNA waren für den ORF des PrP-Gens die Genotypen bestimmt worden (Tab. 8). Nach dem Ergebnis der ORF-Genotypisierung wurden die Schafe in Risikoklassen (Tab. 2) bezüglich der Erkrankungswahrscheinlichkeit für Scrapie eingeteilt.Animals, samples and preliminary examinations: In the trial, 623 sheep from eight different breeds and two crossing groups included (Tab. 8). Of all the sheep were Blood samples were obtained and isolated from this gDNA. From the gDNA were for the ORF of the PrP gene, the genotypes were determined (Table 8). To the result of ORF genotyping were the sheep in risk classes (Tab. 2) with regard to the likelihood of illness for scrapie assigned.
Labormaterial: Für die Experimente wurden die
nachfolgend aufgeführten
Chemikalien oder Reagenzien bzw das nachfolgend aufgeführte Material
eingesetzt:
Agarose, Sea Kem® LF,
FMC Bioprodukts, Rockland, Maryland, USA
Alconox, Aldrich,
Deisenhofen
Ammoniumpersulfat (APS), Pharmacia, Freiburg
Ampicillin,
Serva, Heidelberg
Bacto-agar, Difco, Detroit, USA
Bindesilan,
Pharmacia, Freiburg
Borsäure,
Merck, Darmstadt
Cellulose-Nitrat Filter SM 113 (Porengröße 0,45 μm), Sartorius,
Göttingen
Desoxynukleotid
Triphosphat (dNTP-Mix, PEQLAB, Erlangen
Dextranblau, Pharmacia,
Freiburg
DNA-Längenstandard,
Gene RulerTM 100 Bp DNA Ladder Plus, MBI
Fermentas, St. Leon-Rotte
Essigsäure, Merck,
Darmstadt
Ethanol, Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid, Serva,
Heidelberg
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Merck, Darmstadt
Ficoll
400TM, Pharmacia, Freiburg
Formamid, Sigma, Deisenhofen
H2O (steril) ROTI®SOLV
HPLC Roth, Karlsruhe
Harnstoff, Gibco, Eggenstein
Hydrolink
Long Ranger Gel Solution, Serva, Heidelberg
IPTG, Roth, Karlsruhe
Isopropanol,
Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid, Merck, Darmstadt
Kimwipes,
Kimberly-Clark, Koblenz
N,N,N',N',-tetramethylethylendiamed
(TEMED), Serva, Heidelberg
Perfectly Blunt Cloning Kit für pT7Blue,
Novagen, Schwalbach
Pipettenspitzen, Rotte, Karlsruhe
QIAquick
Gel Extraction Kit and PCR Purification Kit, QIAGEN, Hilden
Reaktionsgefäße (0,2
ml), PEQLAB, Erlangen
(0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml), Eppendorf, Hamburg
Sodiumdodecylsulfat
(SDS), Sigma, Deisenhofen
Taq-DNA-Polymerase mit 10fach Reaktionspuffer
und MgCl2, Eppendorf, Hamburg
Terazakiplatten
(MikroSample plate 60 wells), Pharmacia, Freiburg
Tetracycline,
Serva, Heidelberg
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris),
Merck, Darmstadt
Tryptone, Difco, Detroit
Yeast extract,
Difco, Detroit
X-Gal, Roth, KarlsruheLaboratory material: The chemicals or reagents listed below or the materials listed below were used for the experiments:
Agarose, Sea Kem ® LF, FMC organic product, Rockland, Maryland, USA
Alconox, Aldrich, Deisenhofen
Ammonium persulfate (APS), Pharmacia, Freiburg
Ampicillin, Serva, Heidelberg
Bacto-agar, Difco, Detroit, USA
Bindesilan, Pharmacia, Freiburg
Boric acid, Merck, Darmstadt
Cellulose nitrate filter SM 113 (pore size 0.45 μm), Sartorius, Göttingen
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP mix, PEQLAB, Erlangen
Dextran blue, Pharmacia, Freiburg
DNA length standard, Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus, MBI Fermentas, St. Leon-Rotte
Acetic acid, Merck, Darmstadt
Ethanol, Merck, Darmstadt
Ethidium bromide, Serva, Heidelberg
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Merck, Darmstadt
Ficoll 400TM, Pharmacia, Freiburg
Formamid, Sigma, Deisenhofen
H 2 O (sterile) ROTI ® SOLV HPLC Roth, Karlsruhe
Urea, Gibco, Eggenstein
Hydrolink Long Ranger Gel Solution, Serva, Heidelberg
IPTG, Roth, Karlsruhe
Isopropanol, Roth, Karlsruhe
Potassium chloride, Merck, Darmstadt
Kimwipes, Kimberly-Clark, Koblenz
N, N, N ', N', - tetramethylethylenediamed (TEMED), Serva, Heidelberg
Perfectly Blunt Cloning Kit for pT7Blue, Novagen, Schwalbach
Pipette tips, Rotte, Karlsruhe
QIAquick Gel Extraction Kit and PCR Purification Kit, QIAGEN, Hilden
Reaction tubes (0.2 ml), PEQLAB, Erlangen
(0.5 ml, 1.5 ml, 2 ml), Eppendorf, Hamburg
Sodium dodecyl sulfate (SDS), Sigma, Deisenhofen
Taq DNA polymerase with 10-fold reaction buffer and MgCl 2 , Eppendorf, Hamburg
Terazaki plates (MikroSample plate 60 wells), Pharmacia, Freiburg
Tetracycline, Serva, Heidelberg
Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris), Merck, Darmstadt
Tryptone, Difco, Detroit
Yeast extract, Difco, Detroit
X-Gal, Roth, Karlsruhe
Für
die Herstellung der folgenden Lösungen
und Puffer wurde Aqua bidest. (hergestellt durch Ultrafiltration, < 16 MΩ⋅cm ) verwendet.
Die Aufbewahrung erfolgte, wenn nicht anders angegeben, bei +4 °C.
APS-Stammlösung: 10
% (w/v) in H2O gelöst; –20 °C
Bindesilan-Stammlösung: 40
ml Ethanol; 98%ig (v/v); 150 μl
Bindesilan; RT
Bindesilan-Lösung:
800 μl Bindesilan-Stammlösung, 200 μl Essigsäure; 10%ig
(v/v); RT
Hydrolinkgellösung
(5%): 6 ml 50%iges Hydrolink 25,2 g Harnstoff; 3,6 ml 10 × TBE; ad
60 ml H2O; 200 μl APS (10 %); 50 μl TEMED
Ladepuffer:
50 ml Formamid; 5 g Mischionenaustauscher, 6 mg/ml Dextranblau;
1ml EDTA (1M); pH 8,3; –20 °C
10 × TBE-Puffer:
1 M Tris-HCl 830 mM Borsäure;
10 mM EDTA; pH 8,2; RT
Stoppuffer: 250 mM EDTA; 10 % (w/v)
Ficoll 400TM; 1 % (w/v) SDS; 0,05 % (w/v) Bromphenolblau
Ethidiumbromid
Lösung:
500 μg Ethidiumbromid/ml
H20 LB-Medium 10 g Trypton; 5 g Yeast Extrakt
5 g NaCl; 14 g Agar; ad 1 l H2O; autoclaved
Ampicilin:
50 mg/m1 H2O; –20 °C
IPTG: 0,2 M IPTG; –20 °C
Tetracyclin:
5 mg/ml Ethanol; –20 °C
X-gal:
10 % X-gal in Dimethylformamid; –20 °CAqua bidest was used to prepare the following solutions and buffers. (produced by ultrafiltration, <16 MΩ⋅cm) used. Unless otherwise stated, storage was at +4 ° C.
APS stock solution: 10% (w / v) dissolved in H 2 O; -20 ° C
Binding silane stock solution: 40 ml ethanol; 98% (v / v); 150 ul bindesilane; RT
Binding silane solution: 800 μl binding silane stock solution, 200 μl acetic acid; 10% (v / v); RT
Hydrolink gel solution (5%): 6 ml 50% hydrolink 25.2 g urea; 3.6 ml 10X TBE; ad 60 ml H 2 O; 200 ul APS (10%); 50 ul TEMED
Loading buffer: 50 ml formamide; 5 g mixed ion exchanger, 6 mg / ml dextran blue; 1 ml EDTA (1M); pH 8.3; -20 ° C
10 × TBE buffer: 1 M Tris-HCl 830 mM boric acid; 10 mM EDTA; pH 8.2; RT
Stop buffer: 250 mM EDTA; 10% (w / v) Ficoll 400TM; 1% (w / v) SDS; 0.05% (w / v) bromophenol blue
Ethidium bromide solution: 500 μg ethidium bromide / ml H 2 0 LB medium 10 g tryptone; 5 g yeast extract 5 g NaCl; 14 g agar; ad 1 l H 2 O; autoclaved
Ampicilin: 50 mg / ml H 2 O; -20 ° C
IPTG: 0.2 M IPTG; -20 ° C
Tetracycline: 5 mg / ml ethanol; -20 ° C
X-gal: 10% X-gal in dimethylformamide; -20 ° C
Als Geräte oder Vorrichtungen kamen
zum Einsatz:
DNA-Sequenzierautomat: A.L.F. (Automated Laser
Fluorescence) DNA-Sequenzer mit ALTWin und AlleleLinks Software,
Pharmacia, Freiburg
Elektrophoresekammern: DNA-Sub-CellTM (15 × 15 cm),
BioRad, München
Pipetten:
Eppendorf „Research",
Hamburg Gilson, „Pipetman",
Villien-le-Bel, Frankreich
Reinstwasseranlage: Barnstead E-Pure,
Barnstead, Dubuque, USA
Thermocycler: PTG-200 mit Gradientenfunktion,
MJ Research, Watertown, USA
Zentrifugen: J6 B-Zentrifuge, Beckman,
München;
Tischzentrifuge
Biofuge A (Rotor 1386), Heraeus Sepatech, OsterodeThe following were used as devices or devices:
DNA sequencer: ALF (Automated Laser Fluorescence) DNA sequencer with ALTWin and AlleleLinks software, Pharmacia, Freiburg
Electrophoresis chambers: DNA-Sub-CellTM (15 × 15 cm), BioRad, Munich
Pipettes: Eppendorf "Research", Hamburg Gilson, "Pipetman", Villien-le-Bel, France
Ultrapure water system: Barnstead E-Pure, Barnstead, Dubuque, USA
Thermal cycler: PTG-200 with gradient function, MJ Research, Watertown, USA
Centrifuges: J6 B centrifuge, Beckman, Munich;
Benchtop centrifuge Biofuge A (Rotor 1386), Heraeus Sepatech, Osterode
Amplifikation der Mikrosatelliten durch PCR: In den eigenen Untersuchungen wurden PCR-Ansätze (Tab. 9), ein PCR-Programm (Tab. 10) und Primer (Tab. 11) benutzt, die in Vorarbeiten für die Loci etabliert worden waren.Amplification of the microsatellites by PCR: In our own investigations, PCR approaches (Tab. 9), a PCR program (Tab. 10) and primers (Tab. 11) used the in preparatory work for the loci had been established.
Agarosegel-Elektrophorese von PCR-Produkten: Zur Herstellung der Agarosegele wurden 2 g Agarose und 100 ml 1×TAE-Puffer in der Mikrowelle bis zum Lösen der Agarose erhitzt, mit 20 μl Ethidiumbromid versetzt und in die Gelkammer gegossen. Der Slotformer wurde sofort danach eingesetzt. Ca. 30 min später wurde er entfernt und das Gel in die Elektrophoresekammer gelegt, welche mit 1×TAE Puffer gefüllt war. 5 μl PCR-Produkte wurden mit 2 μl Stopppuffer gemischt und in die Taschen pipettiert. Der Auftrennungsvorgang dauerte ca. 40 min. Danach wurde das Gel unter UV-Licht betrachtet. Das Ergebnis wurde durch Vergleich mit dem Macker abgelesen.Agarose gel electrophoresis of PCR products: To prepare the agarose gels, 2 g of agarose and 100 ml of 1 × TAE buffer were used in the microwave until loosened the agarose is heated with 20 μl Ethidium bromide was added and poured into the gel chamber. The slotformer was used immediately afterwards. Approximately 30 minutes later it was removed and that Gel was placed in the electrophoresis chamber using 1 × TAE buffer filled was. 5 μl PCR products were with 2 ul Stop buffer mixed and pipetted into the pockets. The separation process continued approx. 40 min. The gel was then viewed under UV light. The The result was read by comparison with the maker.
Fragmentlängen-Analyse mit dem A.L.F.-DNA-Sequenzierautomaten:
Die Auftrennung der PCR-Produkte
erfolgte in 5%igen Hydrolinkgelen mit Hilfe des A.L.F.-Sequenzierautomaten.
Die Steuerung der Elektrophoreseläufe wurde über das Programm "ALFWin Instrument
Control", die anschließende
Auswertung mit der Software "AlleleLinks" durchgeführt Der
Sequenzierautomat besteht aus einer Elektrophorese- und einer Detektionseinheit.
Diese enthielt einen Laser und 40 Photodioden, die über den
einzelnen Gelspuren angeordnet sind Da die Vorwärtsprimer der PCR und damit
auch die Amplifikate fluoreszenzmarkiert waren, wurden diese angeregt,
wenn sie in Höhe
des Lasen vorbei wanderten. Dies führte zu einem elektrischen
Signal in den Photodioden, das digitalisiert und im angeschlossenen
Computer gespeichert wurde. Die Berechnung der Fragmentlängen der
einzelnen Allele erfolgte auf Basis der internen (99/198 Bp) bzw.
externen (zusätzlich
80/160 Bp) Längenstandards,
wobei das Programm AlleleLinks die Zeit Messwerte in Bp umrechnete
und eine Darstellung der Fluoreszenzsignale als Pherogramm ermöglichte
(
Bei der Herstellung der Hydrolink-Gele wurde nach den Angaben des A.L.F: Herstellers Pharmacia, Freiburg, verfahren. Nach einer Reinigung der Glasplatten mit dem fluoreszenzfreien Spülmittel Alconox, H2O und 98%igem Ethanol mit anschließender Lufttrocknung wurde der obere Bereich mit Bindesilan bestrichen, um die Geltaschen zu befestigen. Danach wurden die Platten mit Abstandshaltern und Lichtkopplern zu einer Gelkammer zusammengebaut. Für die Gellösung wurden 60 ml filtrierte (Membran mit 0,45 μm-Poren) und entgaste (6 min) Long Ranger Hydrolink Gellösung mit 200 μl APS und 50 μl TEMED versetzt. Die gut gemischte Lösung wurde mithilfe einer 60-ml-Spritze luftblasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen. Ein Kamm, der in die Gelkammer geschoben wurde, diente zum Ausformen der Geltaschen. Nach ca. 90 min war das Gel bei RT polymerisiert und konnte in den Sequenzierautomaten eingebaut werden. Nachdem das Gel 50 °C erreicht hatte, wurde der Kamm vorsichtig entfernt. Nach dem Einbau des Gels wurde 0,6 × TBE-Puffer in die Elektrodenbehälter gegeben und das Gel mit Probenmaterial beladen. Die Gele wurden dreimal verwendet und die Geltaschen zwischendurch mit TBE-Puffer ausgespült. Beim ersten Mal wurden präzisere Ergebnisse erzielt als bei den folgenden zwei LäufenThe Hydrolink gels were produced in accordance with the instructions of ALF: Manufacturer Pharmacia, Freiburg. After cleaning the glass plates with the fluorescence-free washing-up liquid Alconox, H 2 O and 98% ethanol and subsequent air drying, the upper area was coated with binding silane in order to fix the gel pockets. The plates were then assembled with spacers and light couplers to form a gel chamber. For the gel solution, 60 ml of filtered (membrane with 0.45 μm pores) and degassed (6 min) Long Ranger Hydrolink gel solution were mixed with 200 μl APS and 50 μl TEMED. The well-mixed solution was poured between the glass plates free of air bubbles using a 60 ml syringe. A comb that was pushed into the gel chamber, was used to shape the gel pockets. After approx. 90 min the gel was polymerized at RT and could be installed in the automatic sequencers. After the gel reached 50 ° C, the comb was carefully removed. After the gel had been installed, 0.6 × TBE buffer was added to the electrode container and the gel was loaded with sample material. The gels were used three times and the gel pockets were rinsed out with TBE buffer in between. The first time gave more precise results than the following two runs
Zur Probenvorbereitung und -auftragung wurden in einer Terazakiplatte je nach PCR-Ausbeute 0,1–4 μl DNA mit 1 μl einer Mischung aus Längenstandards und Stopppuffer vermischt (Star wurde 1 μl DNA eingesetzt). Die Proben wurden dann für 2 min bei 80 °C denaturiert und anschließend auf Eis gestellt. Nach Auspülen der Geltaschen mit TBE-Puffer wurden die vorbereiteten Proben hineinpipettiert.For sample preparation and application were in a Terazaki plate depending on the PCR yield 0.1-4 ul DNA with 1 ul of a mixture of length standards and stop buffer mixed (star was used 1 ul DNA). Samples were then for 2 min at 80 ° C denatured and then put on ice. After rinsing The prepared samples were pipetted into the gel pockets with TBE buffer.
Die Laufbedingungen für die Elektrophorese wurden unter Verwendung der ALFWin Instrument Control Software eingegeben und sind in Tab. 12 aufgelistet.The running conditions for electrophoresis were entered using the ALFWin Instrument Control software and are listed in Tab. 12.
Klonierung: Bei den Fragmentlängenanalysen traten beim Locus 524 unerwartete Fragmente auf. Um zu analysieren, ob im PCR-Produkt auch der DNA-Abschnitt des erwarteten Mikrosatelliten vorliegt, wurden einzelne Abschnitte der DNA-Moleküle sequenziert. Zu diesem Zweck erfolgte zuvor eine Klonierung mit dem "Perfectly Blunt Cloning Kit" in folgenden experimentellen Schritten:
- – Herstellung der PCR-Produkte (Locus S24) der ausgewählten Tiere (ca. 10 ng in 100 μl Lösung).
- – Reinigung der PCR-Produkte mit PCR-Purification-Kit um ca. 50 μl PCR-Produkt-Lösung zu erhalten.
- – Prüfung der DNA-Produkte auf Agarosegel hinsichtlich ihrer Qualität (saubere Banden ohne Nebenprodukte) und Quantität.
- – End-Convenion-Reaktion: Inkubation von 2 μl kondeasiertem PCR-Produkt als Template in 2 μl Wasser und 5 μl End-Conversion Mix. 30 min bei RT ruhen lassen. Inaktivierung der Mischung ca. 5 min bei 75 °C, Abkühlung 2 min auf Eis, abschließende Zentrifugation.
- – Ligation in den Vektor: 1 μl pT7Blue Blunt Vektor und 1 μl T4 DNA-Ligase wurden eingesetzt, vorsichtig gemischt und danach 1-2 h inkubiert.
- – Transformation in E. coli: 2 μl Mischung wurden in das aufgetaute "Nova Blue Single cells"-Aliquot pipettiert, danach vorsichtig gemischt und als Suspension 5 min auf Eis gelagert. Danach wurde die Suspension 35 s auf Wärmeblöcken mit einer Temperatur von 42 °C erwärmt und dann für 2 min auf Eis gelegt. 300 μl SOC-Medium wurden dazupipettiert und auf Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden 24 h bei 38 °C im Wärmeschrank inkubiert.
- – Selektion der rekombinanten Klone mittels Blue-White-Screening: Die Ligationsstelle des Vektors befand sich im LacZ-Gen, das in Gegenwart von IPTG eine Blaufärbung der Kolonie bewirkte. Beim Einbau rekombinanter DNA wurde die Gensequenz unterbrochen, und die betroffenen Kolonien blieben weiß. Diese weißen Kolonien wurden mit Pipettenspitzen gepickt und in 50 μl Wasser suspendiert. Die Pipettenspitzen wurden auf eine beschriftete Platte getupft, um jeweils eine Reservekolonie herzustellen.
- - Production of the PCR products (Locus S24) of the selected animals (approx. 10 ng in 100 μl solution).
- - Cleaning of the PCR products with the PCR purification kit to obtain approx. 50 μl PCR product solution.
- - Examination of the DNA products on agarose gel with regard to their quality (clean bands without by-products) and quantity.
- - End-Convenion-Reaction: Incubation of 2 μl conditioned PCR product as template in 2 μl water and 5 μl end-conversion mix. Let it rest at RT for 30 min. Inactivate the mixture for approx. 5 min at 75 ° C, cool for 2 min on ice, then centrifugation.
- - Ligation into the vector: 1 μl pT7Blue Blunt vector and 1 μl T4 DNA ligase were used, mixed carefully and then incubated for 1-2 h.
- - Transformation in E. coli: 2 μl mixture were pipetted into the thawed "Nova Blue Single cells" aliquot, then mixed carefully and stored on ice for 5 min as a suspension. The suspension was then heated for 35 s on heating blocks at a temperature of 42 ° C. and then placed on ice for 2 min. 300 μl of SOC medium were pipetted in and spread on agar plates. The plates were incubated for 24 hours at 38 ° C in an oven.
- - Selection of the recombinant clones by means of blue-white screening: the ligation site of the vector was in the LacZ gene, which in the presence of IPTG caused the colony to turn blue. When recombinant DNA was inserted, the gene sequence was interrupted and the affected colonies remained white. These white colonies were picked with pipette tips and suspended in 50 ul water. The pipette tips were spotted on a labeled plate to create a reserve colony.
Sequenzierung von DNA-Inserts der rekombinanten Vektormoleküle: Die Bakterienzell-Suspensionen wurden für 15 min auf 99 °C erhitzt, um die Bakterien abzutöten, danach zentrifugiert und gevortext. Dann erfolgte eine PCR bei der die DNA im Reaktionsprodukt als Matrize und die Primer T7 und U19 benutzt wurden (Tab. 13 bis 15).Sequencing of DNA inserts recombinant vector molecules: The bacterial cell suspensions were heated to 99 ° C. for 15 min. to kill the bacteria then centrifuged and vortexed. Then a PCR was carried out at the the DNA in the reaction product as a template and the primers T7 and U19 were used (Tab. 13 to 15).
Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese geprüft. Die Klone, deren PCR-Produkte die erwartete Länge aufwiesen, wurden mit dem fluoreszenzmarkierten Primerpaar für den Locus S24 (Tab. 11) amplifiziert und die Produkte auf dem A.L.F. dargestellt. Ein Klon, dessen Fragmentlänge mit der bei der Genotypisierung gemessenen Länge von 152 Bp übereinstimmte, wurde für die Sequenzierung ausgewählt.The PCR products were made using of agarose gel electrophoresis. The clones whose PCR products the expected length with the fluorescence-labeled primer pair for the locus S24 (Tab. 11) amplified and the products on the A.L.F. shown. A clone whose fragment length matched the length of 152 bp measured during genotyping, was for selected the sequencing.
Ein 100 μl-PCR-Ansatz wurde mit den Primern T7 und U19 hergestellt, um eine ausreichende Menge an Template für die Sequenzierreaktion zu bekommen. Die Länge und die Konzentration der PCR-Produkte wurde noch einmal auf einem Agarosegel geprüft. Es folgte die Aufreinigung der PCR-Produkte mit dem "PCR-Purification Kit". Danach wurden die Proben sequenziert.A 100 ul PCR approach was performed with the primers T7 and U19 made a sufficient amount of template for the sequencing reaction to get. The length and the concentration of the PCR products was checked again on one Agarose gel tested. This was followed by the purification of the PCR products with the "PCR Purification Kit ". The samples were then sequenced.
Statistische Auswertung: Für die Frequenzanalyse der Mikrosatelliten und ORF-Daten wurde das Programmpaket BIOSYS-1, Version 17 (Swofford und Selander 1989) verwendet.Statistical evaluation: For frequency analysis the program package BIOSYS-1, the microsatellites and ORF data, Version 17 (Swofford and Selander 1989) used.
Für
die Mikrosatellitenloci und PrP-Genloci wurden bei kodominantem
Erbgang die Allelfrequenzen nach folgender Formel berechnet: mit:
pi:
Frequenz des i-ten Allels,
AiAi, AiAj:
Häufigkeit
des Genotyps mit den Allelen i bzw. j,
i, j: Indizes der Allele,
k:
Anzahl der Allele eines Locus,
N: Anzahl der untersuchten Individuen.For the co-dominant inheritance, the allele frequencies for the microsatellite loci and PrP gene loci were calculated using the following formula: With:
p i : frequency of the i-th allele,
A i A i , A i A j : frequency of the genotype with alleles i and j,
i, j: indices of the alleles,
k: number of alleles of a locus,
N: Number of individuals examined.
Die erwarteten Heterozygotiegrade
einer Population für
einen Locus mit k Allelen wurden mit Hilfe des unverzerrten Schätzen (unbiased
estimate, NEI 1978) nach folgender Formel berechnet: mit:
hl:
Erwarteter Heterozygotiegrad des Locus l,
pi:
Frequenz des i-ten Allels,
N: Zahl der untersuchten Individuen.The expected degrees of heterozygosity of a population for a locus with k alleles were calculated using the undistorted estimate (unbiased estimate, NEI 1978) according to the following formula: With:
h l : expected degree of heterozygosity of locus l,
p i : frequency of the i-th allele,
N: number of individuals examined.
Abweichungen der Genotyphäufigkeiten vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht wurden mit dem gepoolten χ2-Test geprüft. Aufgrund geringer Beobachtungszahlen zu einzelnen Genotypen (N < 5) mit dem Problem der Signifikanzüberschätzung bei geringen Genotyperwartungswerten im χ2-Test werden im Poolverfahren drei Genotypenklassen (i, ii, iii) gebildet:
- i Homozygote Genotypen mit dem häufigsten Allel,
- ii alle heterozygoten Genotypen mit dem häufigsten Allel,
- iii alle homo- und heterozygoten Genotypen ohne das häufigste Allel.
- i homozygous genotypes with the most common allele,
- ii all heterozygous genotypes with the most common allele,
- iii all homo- and heterozygous genotypes without the most common allele.
Multifaktorielles Varianzanalysemodell
mit Berücksichtigung
der 3 untersuchten Mikrosatellitenloci (Statistikpaket SAS, V 6.12,
GLM-Prozedur)
mit:
Yijkl: Merkmalwert
(Risikoklasse für
Scrapieerkrankung) des Tieres ijkl,
μ: Populationsdurchschnitt,
S11i: fixer Effekt des i-ten S11-Genotyps,
S24j: fixer Effekt des j-ten S24-Genotyps,
S15k: fixer Effekt des k-ten S15-Genotyps,
eijkl: Restfehler.
(nachfolgend werden
die zu den Allelen genannten Fragmentlängen ohne die Längeneinheit
Bp angegeben).Multifactorial analysis of variance model taking into account the 3 microsatellite loci examined (SAS statistical package, V 6.12, GLM procedure)
With:
Y ijkl : characteristic value (risk class for scrapie disease) of the animal ijkl,
μ: population average,
S11 i : fixed effect of the i-th S11 genotype,
S24 j : fixed effect of the jth S24 genotype,
S15 k : fixed effect of the kth S15 genotype,
e ijkl : residual error.
(The fragment lengths given for the alleles are given below without the length unit Bp).
Im Ausführungsbeispiel 3 wurden drei der im Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen informativen polymorphen Mikrosatelliten, nämlich S11, S15 und S24, in Schafrassen Baden-Württembergs genauer analysiert und auf ihre Assoziation mit den drei für die Scrapie-Empfänglichkeit bedeutsämen ORF-Varianten hin untersucht.In embodiment 3, three the in the embodiment 1 obtained informative polymorphic microsatellite, namely S11, S15 and S24, analyzed in more detail in the breeds of Baden-Württemberg and their association with the three for scrapie susceptibility bedeutsämen ORF variants examined.
Um für große Tierzahlen ein kostengünstiges Verfahren entwickeln zu können, wurde der PrP-Genbereich auf polymorphe Mikrosatellitenloci gescreent (vgl. 1. Auführungsbeispiel). Aus 6 geeigneten Mikrosatelliten wurde eine Auswahl von 3 gut zu amplifizierenden Loci getroffen, für die mit großer Wahrscheinlichkeit ein kodominanter Erbgang anzunehmen war. Es wurde der Polymophiegrad dieser Loci innerhalb von Schafrassen Baden-Württembergs untersucht, um auf der Grundlage einer Prüfung der Beziehungen zu den aus Voruntersuchungen ermittelten ORF-Genotypen und den daraus abgeleiteten Rissklassen mit Hilfe der gefundenen polymorphen Mikrosatellitenloci Aussagen über- die Scrapie-Erkrankungsanfälligkeit treffen zu können.To be an inexpensive for large numbers of animals To be able to develop processes the PrP gene region was screened for polymorphic microsatellite loci (see 1st performance example). A selection of 3 from 6 suitable microsatellites was good amplifying loci hit, with a high probability a codominant inheritance was to be assumed. It became the degree of polymophy this loci within sheep breeds of Baden-Württemberg examined to based on an exam the relationships to the ORF genotypes determined from preliminary examinations and the derived crack classes with the help of the found polymorphic microsatellite loci statements about the scrapie susceptibility to be able to meet.
Bei der Analyse der Genotypen traten keine Nebenprodukte, keine Slippage-Effekte und keine bevorzugte Amplifikationen auf. Bis auf zwei Ausnahmen konnten alle Fragmentlängen eindeutig jeweils einem locusspezifischen Allel zugeordnet werden.When analyzing the genotypes occurred no by-products, no slippage effects and no preferred Amplifications on. With two exceptions, all fragment lengths were clear each assigned to a locus-specific allele.
Die erste Ausnahme bildete die Fragmentlänge 146 beim Locus S24, die in insgesamt 6 Fällen bei den Rassen Schwarzkopf, Gotland und Suffolk auftrat. Die Eindeutigkeit der verschiedenen Fragmentlängen 146 und 147 wurde zum einen durch Wiederholung des PCR- Auftrag auf verschiedenen Gelen sicher gestellt, als auch durch Anordnung von Tieren mit Allel 146 und 147 in aufeinander folgenden Spuren eines Geles. Dabei könnte eine Fragmentlängendifferenz um den präzisen Wert 1, bei gleichzertiger interner Markerausrichtung nicht auf Spureffekte zurückgeführt werden. Ob es sich bei Fragment 146 um ein sehr seltenes zusätzliches Allel handelt, lässt sich nur durch Sequenzierung nachweisen Dieses könnte z. B. durch eine Deletion einer Base außerhalb des eigentlichen Mikrosatellitenbereichs aus dem Allel mit der Fragmentlänge 147 entstanden sein.The first exception was the fragment length 146 at Locus S24, which occurred in a total of 6 cases with the breeds Schwarzkopf, Gotland and Suffolk. The uniqueness of the different fragment lengths 146 and 147 was ensured on the one hand by repeating the PCR application on different gels, and also by arranging animals with alleles 146 and 147 in successive traces of a gel. A fragment length difference around the precise value 1 could not be attributed to track effects if the internal marker alignment was performed at the same time. Whether fragment 146 is a very rare additional allele can only be demonstrated by sequencing. B. by deleting one Base outside the actual microsatellite area from the allele with the fragment length 147.
Die zweite Ausnahme betraf die Fragmentlänge 152,
die bei 25 Merinoschafen beobachtet wurde. Dieses Allel trat niemals
homozygot sondern nur in Kombination mit dem Allel 144, dem Allel
147 oder diesen beiden Allelen zusammen auf. In den 15 Fällen, in
denen 3 Peaks gleichzeitig beobachtet wurden, hatten diese stets
vergleichbare Amplituden. Durch Klonierung und anschließende Sequenzierung
des Allels 152 wurde gezeigt, dass dieses hinsichtlich der Mikrosatellitensequenz
mit dem Allel 147 identisch ist (
Die Informationsgehalte der 3 Mikrosatellitenloci zeigten für 4 der 8 betrachteten Rassen (Gotland, Suffolk, Milchschaf und Texel) mittlere Heterozygotiegrade > 0,35 (Tab. 19). Für die Rassen Dorper, Merinoland, Ile de France und Schwarzkopf lagen die Werte zwischen 0,16 und 0,23. Für die ORF-Loci lagen die Informationgehalte durchweg geringer und zeigten für die mittleren Heterozygotiegrade Werte zwischen 0,0 für Gotland und 0,29 für die Rasse Texel. Diese verhältnismässig geringen Informationsgehalte korrespondierten mit geringen Beobachtungszahlen von Tieren mit hohem Erkrankungsrisiko. Mit anderen Worten, Genotypen mit geringem Risiko haben sich in den Populationen durchgesetzt, ohne dass die mit hohem Risiko behafteten ganz verschwunden sind. Dies kann darauf zurückruführen sein, dass ungünstige PrP-Genotypen auch günstige Funktionen in der Entwicklung eines Tieres bewirken, z. B. Fruchtbarkeit oder Resistenz gegen andere Erreger.The information content of the 3 microsatellite loci showed for 4 of the 8 breeds considered (Gotland, Suffolk, dairy sheep and Texel) mean degrees of heterozygosity> 0.35 (Tab. 19). For the breeds Dorper, Merinoland, Ile de France and Schwarzkopf were the values between 0.16 and 0.23. The information content was for the ORF loci consistently lower and showed for the mean degrees of heterozygosity between 0.0 for Gotland and 0.29 for the Texel breed. These are relatively small Information content corresponded to low observation numbers of animals with a high risk of disease. In other words, having genotypes low risk have prevailed in the populations without that those at high risk have completely disappeared. This may be due to that unfavorable PrP genotypes also cheap Cause functions in the development of an animal, e.g. B. Fertility or resistance to other pathogens.
Die Prüfung der Genotyphäufigkeiten auf Gleichgewichtssituation ergab beim χ2-Test nur für den Locus ORF3 und nur für die Rasse Merinoland eine signifikante Abweichung vom HWE mit der Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05. Dabei kann die auffällige Überrepräsentation der homozygoten Tiere vermutlich mit durchschnittlich höherem Inzuchtkoeffizient erklärt werden, wobei jedoch zur Prüfung ausreichende Verwandtschaftsdaten nicht vorlagen.The examination of the genotype frequencies for equilibrium situation revealed a significant deviation from the HWE with the probability of error p <0.05 only for the ORF3 locus and only for the Merinoland breed in the χ 2 test. The conspicuous overrepresentation of homozygous animals can probably be explained with an average higher inbreeding coefficient, but there was insufficient family data available for testing.
Die varianzanalytischen Ergebnisse mit Modell 1 (Tab. 22) mit Berücksichtigung der 3 Mikrosatellitenloci als fixe Faktoren zeigten eine nahezu einheitliche Zuordnung positiver bzw. negativer Effekte zu einzelnen Genotypen in den verschiedenen getrennt untersuchten Schafrassen. Die Differenzen der geschätzten Mittelwerte zeigten jedoch bedeutsame Unterschiede. In allen 4 analysierten Rassen mit Tierzahlen > 60 übernahm der Locus S24 den höchsten Anteil an der erklärten Varianz mit Signifikanzlevel p < 0,001 (F-Test, Tab. 22). Dieser Locus zeigte einheitlich den Homozygottyp 144/144 mit geringerem Erkrankungsrisiko als den Homozygottyp 147/147 (Tab. 23). Die Unterscheidung dieser beiden Genotypen bezüglich des erwarteten Erkrankungsschlüsselwertes variierte von 0,5 in der Rasse Merino bis 2,8 in der Rasse Suffolk. Die bezüglich dieses Locus heterozygoten Tiere lagen in der Risikoeinschätzung jeweils annähernd in der Mitte zwischen den Homozygottypen. Der große Unterschied in der geschätzten Mittelwertsdifferenz war mit großer Wahrscheinlichkeit auf rassenspezifische ORF-Ausprägungen und auf unterschiedliche Assoziationsgrössen der Genotypen des Mikrosatellitenlocus zu diesem untersuchten Merkmal zurückzuführen.The variance analysis results with model 1 (Tab. 22) with consideration the 3 microsatellite loci as fixed factors showed an almost Uniform assignment of positive or negative effects to individual genotypes in the different sheep breeds examined separately. The differences the estimated However, mean values showed significant differences. Analyzed in all 4 Breeds with animal numbers> 60 took over Locus S24 the highest Share in the declared Variance with level of significance p <0.001 (F test, Tab. 22). This locus consistently showed the homozygous type 144/144 with a lower risk of disease than the homozygous type 147/147 (Tab. 23). The distinction between these two genotypes with regard to expected disease key value varied from 0.5 in the Merino breed to 2.8 in the Suffolk breed. The regarding this locus heterozygous animals were in the risk assessment nearly in the middle between the homozygous types. The big difference in the estimated The difference in mean values was very likely to be on breed-specific ORF characteristics and on different association sizes of the genotypes of the microsatellite locus attributed to this investigated characteristic.
Der Locus S11 zeigte in der Varianzanalyse nur in den Rassen Milchschaf und Texel einen bedeutsamen Einfluss auf das über ORF-Haplotypen konstruierte Merkmal mit ausgeprägter Risikoerhöhung für Tiere mit dem Allel 150 in der Rasse Texel. Dieses Allel war in der Rasse Milchschaf für eine Prüfung nicht ausreichend häufig vertreten, dagegen zeigte sich in dieser Rasse ein um den Schlüsselwert 1 höheres Risiko für Tiere mit dem Allel 156 gegenüber Tieren mit dem Allel 158 an diesem Locus.The locus S11 showed in the analysis of variance only a significant influence in the breeds milk sheep and Texel on the over Characterized by ORF haplotypes with pronounced risk increase for animals with the allele 150 in the Texel breed. This allele was in the breed Milk sheep for an exam not often enough represented, however, showed in this race about the key value 1 higher Risk to animals with the allele 156 opposite Animals with the allele 158 at this locus.
Zu dem Locus S15 konnte nur in der Rasse Texel eine bedeutsame Risikoerhöhung für Tiere mit dem Allel 173 erkannt werden. Korrespondierend dazu war der Informationsgehalt zu diesem Locus in den Rassen Merinoland, Milchschaf und Suffolk sehr gering.The Locus S15 could only be found in the Texel breed recognized a significant risk increase for animals with the allele 173 become. Corresponding to this was the information content on this Locus in the breeds Merinoland, milk sheep and Suffolk very low.
Aufgrund der hier festgestellten Assoziation zum gegebenen Risk-Code könnte eine Selektion von Schafen nach Mikrosatellitengenotypen mit den Ausprägungen 144/144 zu S24, 152/<156>, <150> zu S11 und 179/<173> zu S15 mit Aussicht auf Minimierung des Scrapieerkrankungsrisikos empfohlen werden (o gibt auszuschliessende Allele an). Diese Auswahl würde im vorliegenden Datenmaterial jedoch 47 ORF-Wildtypbeobachtungen (ARQ/ARQ mit Risk 4 einschließen Dies ist ein Indiz dafür, dass ein oder zwei weitere informative Mikrosatelliten zu einem Ausschlussverfahren auf genetischem Niveau beitragen sollten, wenn die Aussagefähigkeit einer Genotypkombination aus Mikrosatellitenloci ausschließlich auf der Basis der ORF-Risikoverschlüsselung geprüft wird.Because of the here Association with the given risk code could be a selection of sheep according to microsatellite genotypes with the characteristics 144/144 to S24, 152 / <156>, <150> S11 and 179 / <173> to S15 with a view are recommended to minimize the risk of scrapie disease (o indicates alleles to be excluded). This selection would in the present However, 47 ORF wild type observations (ARQ / ARQ with risk Include 4 This is an indication that one or two more informative microsatellites into one Elimination procedures at the genetic level should contribute if the meaningfulness a genotype combination of microsatellite loci only the basis of ORF risk coding checked becomes.
Die Ergebnisse des Auführungsbeispiels
3 kennen demnach wie folgt zusammengefasst werden:
Die ORF-Genotypen
zeigten in den Schafrassen nur geringe Informationsgehalte mit Werten
zwischen 0,0 und 0,29 für
die mittleren Heterozygotiegrade, was über die Rassen betrachtet einen
Wert von 0,164 ergab. Dennoch konnten für das Gesamtmaterial 13 von
insgesamt 15 in der Literatur angegebenen ORF-Genotypausprägungen gefunden
werden, mit ca. 65% der Beobachtungen zu den Genotypen ARQ/ARQ (Wildtyp)
und ARR/ARQ. Die seltene Ausprägung
V (Valin) an Codon 136 mit hoher Scrapieerkrankungsanfälligkeit
war in dieser Untersuchung nur mit einer Allelfrequenz von knapp
3% über
die Rassen betrachtet vertreten.The results of performance example 3 can therefore be summarized as follows:
The ORF genotypes showed only low information levels in the sheep breeds with values between 0.0 and 0.29 for the middle degrees of heterozygosity, which resulted in a value of 0.164 for the breeds. Nevertheless, 13 of a total of 15 ORF genotypes reported in the literature were found for the total material, with approx. 65% of the observations for the ARQ / ARQ (wild type) and ARR / ARQ genotypes. The rare expression V (valine) on codon 136 with a high susceptibility to scrapie disease was only represented in this study with an allele frequency of just under 3% across the breeds.
Für die 3 untersuchten Mikrosatellitenloci konnten in den einzelnen Rassen mittlere Heterozygotiegrade von 0,16 bis 0,57 mit einem Mittelwert von 0,31 über die Rassen ermittelt werden, wobei der Locus S24 in allen Rassen außer Gotland den höchsten Informationsgehalt zeigte.For the 3 examined microsatellite loci could in each Breeds mean degrees of heterozygosity from 0.16 to 0.57 with a mean from 0.31 about the breeds are determined, with the Locus S24 in all breeds except Gotland the highest Showed information content.
Die innerhalb ORF-Typisierung sortierten Mikrosatellitengenotypen zeigten in der Risikostufe 1 eine einheitliche Ausprägung mit der Genotypkombination 144/144, 152/152 und 179/179 für die Loci S24, S11 und S15. In den höheren Risikoklassen traten jeweils mehrere Genotypkombinationen auf. In diesen Klassen war eine diskrete Zuordnung bestimmter Mikrosatellitengenotypen zu den ORF-Genotypen nicht möglich, dennoch ließen sich eindeutige Häufungen bestimmter Allele in den Risikoabstufungen feststellen.The sorted within ORF typing Microsatellite genotypes showed a uniform risk level 1 shaping with the genotype combination 144/144, 152/152 and 179/179 for the loci S24, S11 and S15. In the higher ones Risk classes occurred in several genotype combinations. In these classes were a discrete assignment of certain microsatellite genotypes not possible for the ORF genotypes, still let clear clusters identify certain alleles in risk levels.
In der varianzanalytischen Prüfung der Assoziationen der Genotypen zu dem aus den ORF-Typen konstruierten Risikomerkmal konnten hoch signifikante Beziehungen festgestellt werden. In den Auswertungen zu den Rassen mit mehr als 60 Beobachtungen hatte der Locus S24 ausnahmslos den höchsten Anteil an der erklärten Varianz Die Schätzwerte wiesen den Homozygottyp 144/144 in jeder Rasse mit hochsignifikant geringerem Erkrankungsrisiko aus als den Typ 147/147, während die heterozygoten Tiere in den Schätzwerten dazwischen lagen.In the variance analysis test of Associations of the genotypes with the risk characteristic constructed from the ORF types could highly significant relationships are found. In the evaluations the Locus S24 had to the breeds with more than 60 observations the highest without exception Share in the declared Variance The estimates showed the homozygous type 144/144 in each race with a significantly lower number Disease risk out as the type 147/147, while the heterozygous animals in the estimates in between lay.
Für eine hohe Präzisierung der Aussage zur Erkrankungsanfälligkeit für Scrapie wäre nach dem vorliegenden Ausführungsbeispiel die Einbeziehung weiterer informativer Mikrosatellitenloci sowie eine Assoziationsstudie mit erkrankten und nicht erkrankten Schafen wünschenswert.For a high degree of precision the statement on susceptibility to illness for scrapie would be after the present embodiment the inclusion of further informative microsatellite loci as well an association study with diseased and non-diseased sheep desirable.
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AbkürzungenAbbreviations
Im Rahmen der vorliegenden Patentanmeldung
wurden die folgenden Abkürzungen
verwendet:
A.L.F. Automated Laser Fluorescence (Sequenzierautomat)
APS
Ammoniumpersulfat
BovB DNA-Repeat-Familie aus der Klasse SINE
(Short Intenpersed Elements)
Bov-tA2/-tA3 DNA-Repeats aus der
Familie BovA, Klasse SINE (Short Interspersed Elements)
Bp
Basenpaare
BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie
CJD
Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
gDNA
genomische DNA
HWE Hardy-Weinberg-Equlibrium
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopysnosid
LacZ-Gen
Gen der β-Galactosidase
mRNA
Messenger-RNA
MS Mikrosatellit
ORF Open reading frame
PCR
Polymerasekettenreaktion
PrP Prionprotein
PrP-Gen Prionprotein
codierendes Gen
RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
Taq
DNA-Polymerase von dem Bakterium Thermus aqaticus
TBE Puffer
aus TRIS, Borsäure
und EDTA
TEMED N,N,N',N',-Tetramethylethylendiamid
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TSE Transmissible Spongiforme
Enzephalopathie
UTR Untranslated Region
Anhang Tab.
1: Aminosäure-Polymorphismen
im PrP-Gen des Schafs (nach Hunter (2000), ergänzt)
Tab.
2: PrP-Genotypeneinteilung in Risikogruppen beim Schaf (Merkmal
Risk; Dawson et al 1998) Tab.
3A: Mikrosatellitenloci im bovinen PrP-Gen Tab.
3B: Mikrosatellitenloci im ovinen PrP-Gen The following abbreviations have been used in the context of the present patent application:
ALF Automated Laser Fluorescence
APS ammonium persulfate
BovB DNA repeat family from the class SINE (Short Intenpersed Elements)
Bov-tA2 / -tA3 DNA repeats from the BovA family, class SINE (Short Interspersed Elements)
Bp base pairs
BSE Bovine Spongiform Encephalopathy
CJD Creutzfeldt-Jakob disease
DNA deoxyribonucleic acid
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
gDNA genomic DNA
HWE Hardy-Weinberg equilibrium
IPTG isopropyl-β-D-thiogalactopysnoside
LacZ gene β-galactosidase gene
mRNA messenger RNA
MS microsatellite
ORF Open reading frame
PCR polymerase chain reaction
PrP prion protein
PrP gene Prion protein coding gene
RNA ribonucleic acid
RT room temperature
Taq DNA polymerase from the bacterium Thermus aqaticus
TBE buffer made from TRIS, boric acid and EDTA
TEMED N, N, N ', N', - tetramethylethylenediamide
Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane
TSE transmissible spongiform encephalopathy
UTR Untranslated Region Appendix Table 1: Amino acid polymorphisms in the PrP gene of sheep (after Hunter (2000), supplemented) Tab. 2: PrP genotype classification in risk groups in sheep (characteristic Risk; Dawson et al 1998) Table 3A: Microsatellite loci in the bovine PrP gene Tab. 3B: Microsatellite loci in the ovine PrP gene
Anmerkungen zu den Tabellen 4A und
4B:
a R: GenBank-Referenz; bovine
Motive werden für
Loci ohne GenBank-Information beim Schaf verwendet (S01 bis S06);
A, B, usw: gefundene Allele.
b GenBank
Zugriffsnummer
c mit dem A.L.F.-Sequenziergerät ermittelte
Fragmentlängen
d aufgrund der Ergebnisse der DNA-Sequenzierung
berechnete Fragmentlängen
e (R): Mikrosatellitensequenz identisch mit
GenBank
f –: keine Sequenzdaten; k.D.:
keine Differenz im Vergleich mit der DNA-Sequenz in GenBank; Del.:
Deletion; Ins.: Insertion; SNP: Einzelnukleotidpolymorphismus; *:
Es sind nicht alle Varianten angegeben oder zusätzliche Varianten sind nicht
sicher
g Die Rassen sind angegeben,
falls ein Allel nur in einer Rasse gefunden wurde. Für einen
Locus beträgt
die Summe der Allele weniger als 2n Tiere, wenn nicht alle Proben
eine spezifische PCR Amplifikation erlaubten.
Tab.
5: Polymorphiewerte der untersuchten PrP-Mikrosatellitenloci
Tab.
8: Anzahl untersuchter Schafe und deren ORF-Genotypen
Tab.
9: PCR-Ansätze
für die
Loci S11, S24 und S15 Tab.
10: PCR-Programm für
die Loci S11, S24 und S15 Tab.
11 Primer für
die Loci S11, 524 und S15 Tab.
12: Laufbedingungen für
die Elektrophorese Tab.
13: PCR-Programm zur Sequenzierung der DNA-Inserts Tab.
14: PCR-Ansatz zur Sequenzierung der DNA-Inserts Tab.
15: Primer für
die Sequenzierung der DNA-Inserts
Tab.
16: Fragmentlängen
des Locus S24
Tab.
20: Beobachtete und erwartete Genotypfrequenzen zu den Mikrosatellitenloci
der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE Tab.
20: Beobachtete und erwartete Genotypfrequenzen zu den Mikrosatellitenloci
der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE (Fortsetzung Tab.
21: Beobachtete und erwartete Genotyphäufigkeiten zu den ORF-Loci
der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE Tab.
21: Beobachtete und erwartete Genotyphäufigkeiten zu den ORF Loci
der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE (Fortsetzung) Tab.
22: F-Werte, Signifikanzen und Bestimmtheitsmaße für Merkmal Risk zu 4 analsierten
Rassen mit Beobachtungen > 60
(Auswertung gemäß Modell
1) Tab.
23: Beziehungen zwischen Mikrsatellitenloci und dem Merkmal Risk
(vgl. Tab. 2; Auswertung getrennt nach Rassen gemäß Modell
1) Tab.
24: Beobachtungszahlen der Mikrosatellitenkombinationen innerhalb
ORF-Typ Notes on Tables 4A and 4B:
a R: GenBank reference; bovine motifs are used for loci without GenBank information in sheep (S01 to S06); A, B, etc.: alleles found.
b GenBank access number
c Fragment lengths determined with the ALF sequencer
d fragment lengths calculated based on the results of DNA sequencing
e (R): microsatellite sequence identical to GenBank
f -: no sequence data; kD: no difference compared to the DNA sequence in GenBank; Del .: Deletion; Ins .: insertion; SNP: single nucleotide polymorphism; *: Not all variants are specified or additional Variants are not certain
g The breeds are indicated if an allele was found in only one breed. For a locus the sum of the alleles is less than 2n animals, if not all samples allowed a specific PCR amplification. Table 5: Polymorphism values of the investigated PrP microsatellite loci Tab. 8: Number of sheep examined and their ORF genotypes Tab. 9: PCR approaches for the Loci S11, S24 and S15 Tab. 10: PCR program for Loci S11, S24 and S15 Tab. 11 Primer for the Loci S11, 524 and S15 Tab. 12: Running conditions for electrophoresis Table 13: PCR program for sequencing the DNA inserts Tab. 14: PCR approach for sequencing the DNA inserts Tab. 15: Primer for sequencing the DNA inserts Tab. 16: Fragment lengths of locus S24 Tab. 20: Observed and expected genotype frequencies for the microsatellite loci of the examined sheep breeds with a check for HWE Tab. 20: Observed and expected genotype frequencies for the microsatellite loci of the sheep breeds examined with a check for HWE (continued Tab. 21: Observed and expected genotype frequencies for the ORF loci of the examined breeds with testing for HWE Tab. 21: Observed and expected genotype frequencies for the ORF loci of the examined sheep breeds with a check for HWE (continued) Tab. 22: F values, significance and certainty measures for characteristic risk of 4 analized breeds with observations> 60 (evaluation according to model 1) Tab. 23: Relationships between microsatellite loci and the characteristic risk (see Tab. 2; evaluation separated by race according to model 1) Tab. 24: Observation numbers of the microsatellite combinations within ORF type
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